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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA

INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA

Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo

EFECTIVIDAD DE EXTRACTOS VEGETALES EN EL MANEJO DE LA MONILIASIS (Moniliophthora roreri) DEL CACAO

(Theobroma cacao L.) EN MÉXICO

Sustentante:

MC. SANDRA ISABEL RAMÍREZ GONZÁLEZ

DIRECTOR DR. ORLANDO LÓPEZ BÁEZ

Trabajo sometido a consideración del Tribunal Evaluador como requisito al Grado de Doctora en Ciencias Naturales para el Desarrollo, con énfasis en Sistemas de Producción Agrícolas

Universidad Nacional Heredia, Costa Rica

2013

2

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA

UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA

Sustentante:

MC. SANDRA ISABEL RAMÍREZ GONZÁLEZ

TRIBUNAL EXAMINADOR:

_____________________________________ Dr. Orlando López Báez

Universidad Autónoma de Chiapas – México Director de Tesis

____________________________________ Dr. Tomás de Jesús Guzmán

Instituto Tecnológico de Costa Rica Asesor

___________________________________ Dra. Sayra Munguía Ulloa

Universidad Nacional de Costa Rica Asesora

___________________________________ Dr. Willy Soto Acosta

Representante del SEPUNA

___________________________________ Dr. Freddy Araya Rodríguez

Coordinador General del DOCINADE

Universidad Nacional. Heredia. Costa Rica 2013

3

DEDICATORIA

A Dios …. por que sin él nada puede pasar en mi vida.

A mi familia ….. por su apoyo, paciencia y todo el cariño que me dan.

A mis dos grandes amores Orlando y Carolina…. Gracias por su comprensión y amor y por ser mi soporte y mi

inspiración para ser mejor cada día.

4

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de Costa Rica, el Instituto Tecnológico de Costa Rica, y la Universidad Nacional a Distancia Costa Rica, por su invaluable esfuerzo y la oportunidad que nos han brindado con la creación y puesta en Marcha del Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, un gran aporte para el desarrollo de nuestros países Latinoamericanos. A mis Profesores del DOCINADE, gracias por sus enseñanzas y los grandes aportes que me brindaron en mi formación. A la Universidad Autónoma de Chiapas, la Fundación Produce Chiapas y los productores de cacao, por su apoyo en la realización de esta investigación. Al Dr. Freddy Araya Rodríguez, Coordinador General del DOCINADE. Gracias por su apoyo y gestión enfrente del programa.

Al Dr. Orlando López Báez, Director de la Tesis, gracias por su apoyo y sus grandes enseñanzas, las cuales me han permitido lograr esta meta tan importante en mi vida. Al Dr. Tomás de Jesús Guzmán, Asesor de la Tesis, de quien desde el inicio del Doctorado y a pesar de la distancia he recibido un gran apoyo y entusiasmo, gracias por sus enseñanzas y por la gran labor que ha realizado en el DOCINADE que nos ha permitido a muchos cursar un Doctorado. A la Dra. Sayra Munguía Ulloa, Asesora de la Tesis, gracias por su apoyo en el transitar del doctorado y en el desarrollo de la Tesis, pilar fundamental del DOCINADE y de quien siempre recibí comentarios oportunos para lograr culminar esta meta. Al Dr. Guillermo Pinieres Carrillo, Profesor de la Universidad Nacional Autónoma de México y del DOCINADE, gracias por su disponibilidad y apoyo en el desarrollo de la tesis. Al Dr. Benjamín Velasco Bejarano, Profesor del DOCINADE y Director del Laboratorio Nacional de Prevención y Control del Dopaje-CONAD, por su invaluable apoyo en la realización de los análisis fitoquímicos. A la M.Sc. Martha Beatriz Ramírez, Profesora de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, por su asesoría y apoyo en el desarrollo de la Tesis. A la QFB. Julieta Méndez Ramírez, Asistente del Laboratorio de Cacao de la UNACH, gracias por tu gran apoyo y colaboración en el desarrollo de la tesis.

5

INDICE GENERAL

Página DEDICATORIA iii AGRADECIMIENTO iv ÍNDICE GENERAL v ÍNDICE DE CUADROS viii ÍNDICE DE FIGURAS x ÍNDICE DE ANEXOS xii RESUMEN xv SUMMARY xvi INTRODUCCIÓN xvii CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO 1 1.1. Antecedentes 2 1.2. Planteamiento y definición del problema 5 1.3. Justificación 6 1.3.1. Magnitud del problema 6 1.3.2. Trascendencia del problema 7 1.4. Alcances de la investigación 8 1.5. Objetivos 9 1.5.1. Objetivo General 9 1.5.2. Objetivos Específicos 9 1.6. Supuestos o Hipótesis 9 CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO 11

2.1. El cacao, origen, distribución e importancia mundial 12

2.2. El cacao en México 13 2.2.1. Situación actual del cacao en México 15 2.3. La moniliasis del cacao 17 2.3.1. Origen y dispersión 17 2.3.2. Importancia económica de la moniliasis del cacao 17 2.3.3. Clasificación Taxonómica 19 2.3.4. Etiología 20 2.3.5. Sintomatología 20 2.3.6. Ciclo del hongo 21 2.3.7. Epidemiología 22 2.3.7.1. Fuentes de inóculo 22 2.3.7.2. Condiciones ambientales favorables a la enfermedad 23 2.3.7.3. Diseminación de Moniliophthora roreri 25 2.3.8. Tecnologías generadas para el manejo de la moniliasis 25 2.4. Los extractos de plantas y su poder para el manejo de problemas fitosanitarios

27

2.4.1. Metabolitos Secundarios 29 CAPITULO 3. METODOLOGIA

32

3.1. Diseño de la investigación 33

6

3.2. Ubicación geográfica 34 3.3. Materiales 34 3.3.1. Material biológico 34 3.3.2. Material de Laboratorio 34 3.4. Métodos 35 3.4.1. Obtención de extractos vegetales 35 3.4.1.1. Presurizado 35 3.4.1.2. Hidrolato por destilación 35 3.4.1.3. Fermentado aeróbico 35 3.4.1.4. Fermentado anaeróbico 35 3.4.2. Aislamiento del patógeno 36 3.4.3. Trabajo en condiciones de laboratorio 36 3.4.3.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar

36

3.4.3.2. Método de discos de papel 38 3.4.3.3. Método de disco de papel Kirby-Bauer 39 3.4.3.4. Determinación del medio para la formación y germinación de conidias de monilia

40

3.4.3.5. Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de conidias de M. roreri

40

3.4.4. Trabajo en condiciones de campo 42 3.4.4.1. Determinación del ciclo de la enfermedad 42 3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación 45 3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles de cacao

47

3.4.5. Caracterización fitoquímica de los extractos 49 CAPÍTULO 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

51

4.1. Fase 1. Trabajo en condiciones de laboratorio 52 4.1.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar

52

4.1.1.1. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

56

4.1.2. Evaluación de extractos sobre M. roreri mediante el método de discos de papel

65

4.1.2.1. Determinación de un control químico 65 4.1.3. Evaluación de los extractos sobre M. roreri mediante el método de discos de papel Kirby-Bauer

66

4.1.3.1. Determinación de un control químico 66 4.1.4. Determinación del medio para la germinación de conidias de monilia

69

4.1.5 Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de conidias de M. roreri

71

4.2. Fase 2. Trabajo en condiciones de campo 74 4.2.1. Determinación del ciclo de la enfermedad 74 4.2.1.1. Síntomas y signos de la moniliasis en frutos inoculados con M. roreri

74

4.2.1.2. Porcentaje de la ocurrencia de síntomas y signos desarrollados por la inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao

76

7

4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M. Roreri

77

4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación 81 4.2.2.1. Incidencia de M. roreri 81 4.2.2.2. Severidad externa ocasionada por la inoculación de M. Roreri

82

4.2.2.3. Severidad interna ocasionada por la inoculación de M. Roreri

84

4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles de cacao

87

4.2.3.1. Incidencia de la enfermedad 87 4.2.3.2. Producción de cacao 92 4.3. Análisis económico 94 4.4. Análisis de los compuestos de los extractos 99 CONCLUSIONES

111

RECOMENDACIONES 113 BIBLIOGRAFÍA 114 ANEXOS 124

8

INDICE DE CUADROS

Página

Cuadro 1. Tratamientos a evaluar. 36 Cuadro 2. Comparación de tres Métodos de evaluación de la

efectividad reguladora de extractos de plantas y productos de síntesis química sobre el crecimiento de M. roreri. 68

Cuadro 3. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre la cantidad de conidias totales de M. roreri. 70

Cuadro 4. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre la cantidad de conidias germinadas de M. roreri. 70

Cuadro 5. Tiempo de aparición de síntomas y signos en frutos de cacao inoculados con M. roreri. 75

Cuadro 6. Porcentaje de ocurrencia de síntomas y signos desarrollados por la inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao. 77

Cuadro 7. Índice de severidad interna en frutos inoculados con M. roreri. 78

Cuadro 8. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del Índice de Severidad Externa del efecto de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri. 84

Cuadro 9. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del Índice de Severidad Interna del efecto de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri. 86

Cuadro 10. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao. 91

Cuadro 11. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto en la producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri, en una plantación comercial. 94

Cuadro 12. Costo de labores culturales desarrolladas en una hectárea de cacao del Clon UNACH 130. 95

Cuadro 13. Costo de aplicación por hectárea de los tratamientos sobre el clon de cacao UNACH 130. 97

Cuadro 14. Ingresos por venta de semillas de cacao seco producido en cada uno de los tratamientos aplicados sobre el Clon UNACH 130.

97

Cuadro 15. Análisis económico de cada uno de los tratamientos aplicados sobre el Clon UNACH 130. 99

9

Cuadro 16. Comparación de los tiempos de retención (TR) y porcentaje de abundancia obtenidos en GC-MS de los extractos de canela y clavo. 100

Cuadro 17. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada por el equipo de GC-MS del hidrolato de canela. 100

Cuadro 18. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada por el equipo de GC-MS del Hidrolato de clavo. 102

10

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Conidióforos de M. roreri aislados de frutos infectados en plantaciones de Pichucalco, Chiapas – México.

20

Figura 2. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre el crecimiento de M. roreri.

52

Figura 3. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri.

53

Figura 4. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre la formación de conidias de M. roreri.

55

Figura 5. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre la formación de conidias de M. roreri.

55 Figura 6. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C.

zeylanicum sobre el crecimiento de M. roreri.

56 Figura 7. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P.

dioica sobre el crecimiento de M. roreri.

57 Figura 8. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S.

aromaticum sobre el crecimiento de M. roreri.

58 Figura 9. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O.

vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri.

59 Figura 10. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C.

zeylanicum sobre la producción de conidias de M. roreri.

60 Figura 11. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P.

dioica sobre la producción de conidias de M. roreri.

60 Figura 12. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S.

aromaticum sobre la producción de conidias de M. roreri.

62 Figura 13. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O.

vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre la producción de conidias de M. roreri.

63 Figura 14. Efecto de los tratamientos sobre la formación de

conidias de M. roreri.

72 Figura 15. Efecto de los tratamientos sobre la germinación de


73 Figura 16. Síntomas y signos presentes en frutos de cacao

infectados con Moniliophthora roreri.

77 Figura 17. Ciclo de M. roreri sobre clon UNACH 130, en

condiciones de Tapachula, Chiapas – México.

80 Figura 18. Efecto de extractos vegetales sobre la Incidencia de M.

roreri en cacao por inoculación artificial.

82 Figura 20. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y

compuesto mineral sobre la severidad externa producida por M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial.


compuesto mineral sobre la severidad interna producida por M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial.

85 Figura 22. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y

11

pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en chilillos de cacao.

88

Figura 23. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre mazorcas de cacao.


compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre frutos de cacao.

89 Figura 25. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y

pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en una plantación de cacao.


compuesto mineral sobre la producción de cacao.

93 Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes

solventes.

104 Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes

solventes.

105 Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del

hidrolato de canela: Aldehído cinámico.

107 Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del

hidrolato de clavo: Acetato de eugenol.

108 Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del

hidrolato de clavo. 110

12

INDICE DE ANEXOS

Página Anexo 1. Produccion Mundial de cacao. 125 Anexo 2. Producción de cacao en México. 125 Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del

50% (v/v) sobre el crecimiento de M. roreri.

125 Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango

múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre el crecimiento de M. roreri.

126 Anexo 5. Análisis de varianza para extractos a concentración del

50% (v/v) sobre la formación de conidias de M. roreri.


múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre la formación de conidias de M. roreri.

127 Anexo 7. Análisis de varianza para extractos a cuatro

concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.


múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentración sobre el crecimiento de M. roreri.

128 Anexo 9. Análisis de varianza para extractos de clavo, jengibre,

orégano y maguey, a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.


múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de clavo, jengibre, orégano y maguey, evaluados a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.

129 Anexo 11. Análisis de varianza para extractos de canela y

pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la formación de conidias de M. roreri.


múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de canela y pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la producción de conidias de M. roreri.

130 Anexo 13. Análisis de varianza para extractos a cuatro

concentraciones sobre la formación de conidias de M. roreri.


múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentraciones sobre la producción de conidias de M. roreri.

132 Anexo 15. Análisis de varianza de productos de síntesis química

sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de disco de papel.


múltiple de Tukey (P<0,05) para productos de síntesis química evaluados sobre la producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de papel.

133

13

Anexo 17. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante el método de Disco de papel.


múltiple de Tukey (P<0,05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de papel.

134 Anexo 19. Análisis de varianza de productos de síntesis química

sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de Disco de papel Kirby-Bauer.


múltiple de Tukey (P<0.05) para productos de síntesis química evaluados sobre la producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de papel Kirby-Bauer.

135 Anexo 21. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales

sobre el crecimiento de M. roreri mediante el método de Disco de papel Kirby-Bauer.


múltiple de Tukey (P<0.05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de papel Kirby-Bauer modificado.

136 Anexo 23. Análisis de varianza (Anova), del efecto de medios

con sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número de conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 72 horas.

137 Anexo 24. Análisis de varianza (Anova), del efecto medios con

sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número de conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 72 horas.

138 Anexo 25. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los

hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 96 horas.

139 Anexo 26. Comparación de medias por la prueba de Rango

múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de conidias de M. roreri.


hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 96 horas.


múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de conidias germinadas de M. roreri.

141 Anexo 29. Análisis de varianza (Anova), del Porcentaje de

incidencia de M. roreri del efecto de la aspersión de hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao inoculados.


múltiple de Tukey del Porcentaje de Incidencia de M. roreri en frutos de cacao asperjados con hidrolatos de

14

clavo, canela y pimienta. 141 Anexo 31. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad

Externa (ISE) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

142 Anexo 32. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad

Interna (ISI) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

142 Anexo 33. Porcentaje de mazorcas afectadas con M. roreri por

tratamiento y sus índices de severidad interna (ISI) y externa (ISE) luego de 60 días de la inoculación artificial con 9 x 104 conidias*mL-1. Tapachula, Chiapas – México.


hidrolatos de canela, clavo y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao.

143 Anexo 35. Análisis de varianza (Anova), del efecto en la

producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri, en una plantación comercial.

143 Anexo 36. Análisis de sensibilidad de los tratamientos para

diferentes niveles de rendimiento de cacao.

144

15

RESUMEN

La moniliasis causada por Moniliophthora roreri, es señalada como la enfermedad más devastadora que afecta al cacao (Theobroma cacao L.), está presente en 11 países de sur y centro américa; ingresó a México en el 2005, dejando a su paso pérdidas superiores al 50% de la producción, el abandono y derribo de plantaciones. Entre las alternativas desarrolladas para su manejo resaltan prácticas culturales, aspersiones de fungicidas de síntesis química, y la resistencia genética. En ésta investigación se planteó como alternativa “Desarrollar y caracterizar extractos vegetales con efectividad en el manejo de M. roreri, los cuales puedan incorporarse en un sistema de producción orgánica de cacao en México”. Se estudiaron extractos obtenidos de: Pimienta dioica L., Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L, Origanum vulgare L., Tradescantia spathacea Swartz y Cinnamomum zeylanicum Nees. La investigación se realizó en el periodo 2008-2012, en tres fases: la primera en laboratorio, realizando la selección y determinación de la concentración mínima inhibitoria de los extractos obtenidos. En la segunda fase se probaron los mejores extractos, en una plantación monoclonal ubicada en el Municipio de Tapachula, Chiapas. En la tercera etapa mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS) se determinaron los posibles componentes de aquellos extractos que mostraron la mejor efectividad contra el patógeno. Los resultados obtenidos muestran que todas las plantas evaluadas poseen metabolitos con capacidad para inhibir en mayor o menor grado el desarrollo del hongo. En ensayos In vitro, el hidrolato resultó ser la mejor forma de obtención de extractos, seguido por el presurizado y la fermentación aeróbica. Los hidrolatos de canela, clavo y pimienta fueron los que mostraron la mayor inhibición bajo los tres métodos evaluados; en medio líquido inhibieron la multiplicación y la germinación de las conidias del hongo. Tanto en frutos inoculados como en la plantación comercial con incidencia natural de 69,6% de M. roreri, los hidrolatos de clavo y canela al 20% mostraron la mayor efectividad, permitiendo obtener el 98% de frutos sanos y un incremento en la producción entre un 800 y un 1000%, con respecto al testigo. El análisis económico, resultó en una relación Beneficio/Costo mayor a 2 y una rentabilidad del 127,95% y 138% para los hidrolatos de clavo y canela respectivamente, lo que indica una alta viabilidad técnica y económica para incorporarlos dentro de un plan de manejo de la enfermedad. Para el hidrolato de canela se identificaron 17 compuestos siendo los mayoritarios el aldehído cinámico (74,08%), eugenol (6,8%) y acetato de cinamilo (5,18%); mientras que para el hidrolato de clavo los compuestos mayoritarios son el Acetato de Eugenol (58,95%) y el Eugenol (15,96%).

16

SUMMARY

Monilia pod rot caused by Moniliophthora roreri, is the most devastating disease affecting cocoa (Theobroma cacao L.), is present in 11 countries in South and Central America, It’s arrived in Mexico in 2005, causing losses exceeding 50% of harvest, abandonment and deforestation by demolition of plantations. Among the alternative studied for the monilia control are the cultural practice, chemical fungicide sprays, and the natural genetic resistance. The goal in this research was, develop and characterize plant extracts effective against M. roreri, which can be incorporated into a system of organic cocoa production in Mexico.In this study investigated extracts obtained from Pimienta dioica L. Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L. Origanum vulgar L. Tradescantia spathacea Swartz and Cinnamomum zeylanicum Nees. The research was achieved on the 2008- 2012 period, in three phases: the first on in vitro assays, in order to make a screening and determination the minimum inhibitory concentration (MIC) of the best extracts and the extraction method. The selection criterion was the regulation of the growth and sporulation of M. roreri. The second phase consist of field test of the selected extracts, using a clonal commercial plantation of cacao, the criterion for evaluation was the effectiveness and the economic analysis of the treatments with plant extracts performed as foliar application. The third phase with chromatography and spectrophotometric analysis (GC-MS) identified possible compounds of those extracts that showed the best effectiveness against the pathogen. With regard to the best way of obtaining extracts, the hidrolato was the most efficient and best regulatory effect on M. roreri, followed by pressurized and aerobic fermentation. The results showed that all plants evaluated possess metabolites with ability to inhibit a greater or lesser degree fungal growth. The hydrolato extracts of C. zeylanicum, S. aromaticum and P. dioica showed the greatest inhibition of conidia germination and multiplication of M. roreri in liquid medium. In field conditions, both fruits with artificial inoculation of M. roreri as commercial plantation under natural incidence of 69.6% of M. roreri, the S. aromaticum and C. zeylanicum hodrolatos at 20% concentration showed high effectiveness in control of monilia disease. Treatment with these products yielded 98% of healthy fruits and increased cocoa production by 800% by 1000%, compared with the control. Economic analysis, resulted in a rate benefit / cost greater than 2 and a return tax of 127.95% and 138% of S. aromaticum and C. zeylanicum extracts respectively, indicating a high technical and economic feasibility to incorporate these treatments into a management plan of moniliasis on cocoa plantation, in either a traditional or organic management. For the C. zeylanicum hidrolato 17 compounds have been identified to be the major cinnamic aldehyde with 74.08% with 6.8% eugenol and cinnamyl acetate with 5.18%, while the majority compounds of hidrolato of S. aromaticum resulted eugenol acetate (58.95%) and eugenol (15.96%).

17

INTRODUCCION

El cultivo del cacao (Theobroma cacao L.) desde la época prehispánica ha

tenido gran relevancia para la dieta humana, hoy en día es la materia prima para

la chocolatería y para algunos productos farmacéuticos.

A nivel mundial, se cultiva principalmente en 13 países de los cuales Costa de

Marfil, Camerún, Ghana, Malasia, Indonesia y Brasil, de los cuales se obtiene

el 80% de la producción. Se estima que más de 20 millones de personas

dependen directamente de este cultivo para subsistir y que el 90% de la

producción es cosechada de minifundios (menor de 5 ha). México hace un

aporte del 0,6% a la producción mundial de cacao, procedente de 61,344.25

ha., de plantaciones ubicadas en los estados Tabasco, Chiapas, Oaxaca y

Guerrero (Servicio de información Agroalimentaria y pesquera - SIAP de la

Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación -

SAGARPA, 2011).

Es importante destacar que el cacao tiene amplias perspectivas para

desarrollarse en Tabasco y Chiapas, especialmente bajo las normas de

producción orgánica. Existen expectativas a corto y mediano plazo en la

demanda de cacao orgánico en el ámbito mundial, dado el aumento en los

últimos años en el consumo de chocolates y derivados del cacao, así como la

apertura de nuevos mercados y los sobre precios, circunstancias que motivan a

fomentar la producción de este cultivo bajo sistemas de producción orgánica.

Por otra parte, las plantaciones de cacao constituyen agroecosistemas que por

su estructura y función se asemejan al ecosistema tropical húmedo, se

considera por lo tanto que en los estados de Chiapas y Tabasco el cacao

posee un alto valor ecológico, contribuyendo a la conservación de los recursos

naturales del trópico.

La enfermedad fungosa denominada moniliasis del cacao (Moniliophthora

roreri) es uno de los más graves problemas fitosanitarios que enfrentan los

18

productores de cacao, ya que ocasiona pérdidas totales de la cosecha. Este

patógeno de reciente entrada a México, esta ocasionando que los productores

abandonen o derriben las plantaciones al no lograr producción alguna,

situación que pone en peligro la cacaocultura Mexicana.

Es de hacer notar que hasta el momento, las investigaciones orientadas al

manejo orgánico de esta enfermedad son escasas y por lo tanto se carece de

tecnologías eficientes para su manejo.

Diversas investigaciones han mostrado el potencial que posee el uso de

extractos plantas dentro del manejo orgánico de problemas fitosanitarios dada

su alta efectividad, buena aceptación de los productores hacia su uso, bajos

costos del insumo y reducido o nulo impacto ambiental. De esta manera es

factible que el uso de extractos vegetales puede ser una buena alternativa

para el manejo el hongo M. roreri que afecta el cacao.

Es por ello que esta investigación pretende desarrollar y caracterizar extractos

vegetales que tengan efectividad en el manejo de M. roreri, los cuales puedan

incorporarse en un sistema de producción orgánica de cacao en México, para

lo cual se plantea el estudio del efecto regulador de extractos obtenidos de las

plantas: Pimienta dioica L., Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L,

Origanum vulgare L., Tradescantia spathacea Swartz y Cinnamomum

zeylanicum Nees., sobre el patógeno causante de la moniliasis del cacao.

La investigación se llevó a cabo en tres fases: la primera en condiciones de

laboratorio con el fin de hacer una selección y la determinación de la

concentración mínima inhibitoria de los extractos obtenidos de las seis plantas

bajo cuatro formas de extracción. Esta selección se realizó tomando como

criterio el efecto en la regulación del crecimiento y esporulación de M. roreri. La

segunda fase consistió en probar los mejores extractos seleccionados en la

primera fase, en condiciones de campo utilizando para ello una plantación de

cacao y seleccionar así los extractos con la mejor efectividad. La tercera fase

permitió mediante pruebas fitoquímicas determinar los posibles componentes

de los extractos que mostraron la mejor acción contra el patógeno.

19

CAPÍTULO 1.

INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO

20

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO

1.1. Antecedentes

Se cree que el cacao se originó en las cabeceras de la Cuenca del Amazonas y

que en tiempos antiguos una población natural de Theobroma cacao se

diseminó por toda la parte Central de la zona Amazónica-Guayana, hacia el

Oeste y al Norte, llegando hasta el Sur de México y que estas dos poblaciones

se desarrollaron en formas separadas geográficamente por el Istmo de

Panamá. La primera de ellas, constituyó el grupo de los llamados Forastero -

Amazónico y el segunda grupo denominado Criollo, el cual tiene buena

aceptación en el mercado dadas sus altas calidades organolépticas (Foniap,

1993; Moreno, L. et al., 1983; Ruiz, 2003; Castillo, 2003).

En la actualidad, este árbol se cultiva comercialmente en Asía y Oceanía;

Centro y sur América y África, con una participación mundial con respecto a

la producción del 12,5%, 12,7 y 74,8% respectivamente. La mayor parte del

cacao destinado al comercio internacional se cultiva en África, siendo Costa

de Marfil el mayor productor y el cacao de Ghana el de mayor calidad

(International Cocoa Organization – ICCO, 2011).

Para México el cacao más que un producto alimenticio, representa una

tradición, un gran legado cultural por preservar y una gran fuente de riquezas

naturales, así como fuente generadora de empleos. En la actualidad están

sembradas 61,344.25 ha., ubicadas en cuatro estados, generando más de ocho

millones de jornales al año, con una contribución de 27,173.61 toneladas, el

rendimiento promedio reportado para el año 2010 fue de 320 kg/ha (SIAP,

2011).

El cultivo del cacao en México ha sido manejado principalmente por pequeños

productores, los cuales dependen casi exclusivamente de la mano de obra

familiar para atender las plantaciones, quienes además tienen bajo nivel

educativo y poca capacidad económica de reinvertir en sus plantaciones.

21

Los bajos rendimientos que presenta la cacaocultura actual de México es

generada en gran medida por la presencia de plantaciones viejas de más de 40

años, material genético de bajos rendimientos y susceptible a plagas y

enfermedades, bajo o nulo manejo cultural y presencia de una gran diversidad

de problemas fitosanitarios.

Las anteriores condiciones han originado alta incidencia de plagas y

enfermedades, de tal manera que para manejarlas se hace uso

fundamentalmente y muchas veces de manera indiscriminada de productos de

síntesis química, sin que ejerzan el control esperado sobre organismos

fitoparásitos provocando a la vez deterioro ambiental. Esta situación se agudiza

en un tipo de ecosistema tropical como en el que se encuentra el cacao, de

gran diversidad biológica y elevados recursos hídricos, además de que se

afecta la salud de los productores y consumidores del ecosistema cacao y se

aumentan los costos de producción (Estrada, 2010).

Dentro de la diversidad de problemas fitosanitarios presentes en el cultivo del

cacao, los principales con los ocasionados por los hongos: Phytophthora

palmivora, Colletrotrichum gloesporioides y Moniliophthora roreri; éste último

patógeno produce la denominada moniliasis del cacao, enfermedad que

ingreso a México a principios del año 2005 y cuyo primer reporte se dio en el

norte del estado de Chiapas y en la actualidad ya está presente en las

plantaciones de los estados de Tabasco (primer productor de cacao de México)

y Chiapas (Torres de la Cruz, 2010).

La moniliasis tiene su centro de origen en Colombia y se ha diseminado a

países productores de cacao de Sur y Centro América (Phillips-Mora, 2006),

dejando a su paso el derribo de gran número de hectáreas sembradas,

abandono de plantaciones, bajas considerables de la producción, aumento de

costos de producción y por consecuencia baja rentabilidad del cultivo,

empobrecimiento de los productores y deterioro ambiental, problemática que ya

se está viviendo en México.

22

El ingreso de la moniliasis al territorio azteca tambaleó la producción ya que

este hongo que ataca directamente a los frutos ocasionó pérdidas totales de la

producción en muchas de las regiones de producción en los estados de

Chiapas y Tabasco. En el Anexo A se pueden apreciar los datos de la

evolución del cultivo del cacao durante la última década, en la que se resalta

como antes del ingreso de la moniliasis (2004) el área sembrada era de

81964.11 ha, la cual se redujo en un 23,51% a un año de su ingreso y para el

año 2010 en un 25,15%. De la misma manera la producción antes del ingreso

de este patógeno a territorio mexicano era de 43974.52 toneladas, la cual se

redujo en un 17,30% a un año de su ingreso, en el año 2010 en un 38,20% y

en el 2011 se redujo en 50,95%; en tanto que el rendimiento por hectárea se ha

reducido en un 18,5% (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera

SIAP, 2011).

Esta situación ha originado que mientras para el año 2004 el precio de la

tonelada de cacao era de USD$ 1382.48, en seis años el precio ha aumentado

el 108,5% (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera -SIAP, 2011),

debido a la reducción del área cultivada, de la producción y de los

rendimientos. Pese a los esfuerzos realizados por los Gobiernos de los

principales estados productores de cacao, es evidente el gran impacto

ocasionado por el ingreso de esta enfermedad.

En el caso de los dos principales estados productores de cacao las

plantaciones forman parte de las cuencas de dos de los ríos más importantes

de México que son el Grijalva y el Usumacinta. Dado el alto impacto de la

enfermedad los productores en medio de la desesperación por no tener

producción y por consecuencia ingresos están optando por el derribo de las

plantaciones para cambiar de cultivo principalmente a pastos y maíz, lo cual de

seguir así estaría amenazando el sistema de captación y amortiguamiento y

reserva que representan los cultivos de cacao incluyendo la gran diversidad de

árboles de sombra, generando así un problema ambiental de graves

consecuencias.

23

Las alternativas que se han estudiado para el manejo de la moniliasis han

demostrado que se requiere de un manejo cultural basado fundamentalmente

en bajar el porte de los árboles, así como podas de formación y saneamiento

permanentemente, recolección y manejo eficiente, oportuno y adecuado de

frutos enfermos, así como manejo de los árboles de sombra (López, 2006a;

Federación Nacional de Cacaoteros, 2004).

Se han realizado diversas investigaciones utilizando aplicaciones de fungicidas

de síntesis química, las cuales han demostrado que pueden permitir un buen

nivel de control del patógeno, sin embargo se elevan los costos de la

producción y se ocasiona deterioro ambiental. Otra alternativa que se esta

estudiando es la resistencia genética pero sin que hasta el momento se tengan

resultados masificables (Sánchez, et al., 2003; Merchán, 1980; Barros, 1982;

Suárez, 1982; González et al., 1984; Brenes, 1983; Arguello, 2000, Torres de

la Cruz, 2010).

El uso de extractos vegetales ha demostrado en diversas investigaciones ser

un insumo de gran efectividad para manejar diversos problemas fitosanitarios,

sin embargo se requieren más investigaciones que permitan generar opciones

eficientes, fácilmente implementables por el productor y económicamente

viables, así como de llevar a cabo estudios para determinar los metabolitos

secundarios que ejercen actividad sobre los microorganismos fitopatógenos y

que contribuyan en el avance del conocimiento de esta alternativa de control.

1.2. Planteamiento y definición del problema

Teniendo en cuenta las grandes pérdidas ocasionadas en el cultivo del cacao

por la presencia de la moniliasis y que en México no se han realizado

investigaciones para realizar un manejo orgánico de esta enfermedad, se

plantea el siguiente problema de investigación.

¿Es posible que mediante la aplicación de extractos vegetales de Pimienta

dioica L., Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L, Origanum

24

vulgare L., Tradescantia spathacea Swartz, Cinnamomum zeylanicum Nees se

reduzca la incidencia de la moniliasis en plantaciones de cacao de México?

El mercado de productos orgánicos durante los últimos años ha venido en

aumento dado los beneficios de este tipo de agricultura y el cacao no se

escapa de esta tendencia, el cual además tiene un sobreprecio; sin embargo la

producción de este tipo no alcanza a abastecer el consumo, haciendo de este

mercado un potencial para los productores de cacao en México. Es por ello que

los dos principales estados productores de cacao (Tabasco y Chiapas) están

incentivando a este tipo de producción, pero desafortunadamente falta

investigación sobre un manejo de la moniliasis del cacao mediante alternativas

de producción orgánica que permitan generar tecnologías para apoyar la

reconversión hacia la producción orgánica de cacao o mantener las ya

existentes.

Dentro de la agricultura orgánica existen diversas alternativas para el manejo

de problemas fitosanitarios entre las cuales están el control biológico, manejo

cultural, diversificación y uso de extractos de plantas, entre otros.

El estudio del uso de extractos de plantas para el manejo de problemas

fitosanitarios se practica desde hace siglos con buenos resultados y con gran

aceptación por parte de los productores, haciendo de esta alternativa de

manejo de enfermedades una buena opción dentro de la producción orgánica,

por su bajo o nulo impacto ambiental, bajo costo y gran efectividad.

Dada la gran diversidad de plantas y de sus respuestas a diversos problemas

de plagas en cultivos, existe un gran vacío de conocimientos acerca de esta

alternativa de manejo en cultivos como el cacao y que pudieran ser una buena

opción para el combate de M. roreri.

1.3. Justificación

1.3.1. Magnitud del problema. Para el año 2004 estaban sembradas en

México 81,964.11 ha, ubicadas en cinco estados, las cuales eran susceptibles

25

de ser afectadas por la enfermedad denominada moniliasis del cacao. Para el

año 2005 se realizó el primer reporte de la presencia de esta enfermedad en el

norte del estado de Chiapas y para el 2006 ya se dieron reportes de la

afectación de plantaciones en la región de la “Chontalpa”, principal área

productora del estado de Tabasco y para finales del mismo año se encontró la

enfermedad en el municipio de Tuzantán perteneciente a otra de las zonas más

importantes como lo es la del Soconusco en el estado de Chiapas. A la fecha el

hongo ya se encuentra disperso en las principales áreas de producción de

cacao en México, lo cual ha causado reducción del 25,15% en el área de

siembra, del 50,95% en la producción nacional y de 18,5%, en el rendimiento

por hectárea, después del ingreso de esta enfermedad a territorio mexicano

hace seis años.

Para los estados de Tabasco y Chiapas (México), el cacao es un cultivo

estratégico, por su repercusión social, económica y ecológica, en el año 2000,

éste cultivo generaba más de ocho millones de jornales al año los cuales se

han reducido dado el gran impacto que tiene la enfermedad, además buena

parte de la población de cacaocultores son pequeños productores que basan

su sustento en este cultivo de tal manera que al no tener producción, el ingreso

de estas familias se ve amenazado aumentando con ello la migración de la

población rural y la desintegración familiar.

1.3.2. Trascendencia del problema. Dado que la afectación de la enfermedad

puede llegar al 100% de pérdidas de la producción, y la baja capacidad

económica de los productores para darle manejo a su plantación, éstos por una

parte están optando por abandonarlas incentivando de esta manera la

diseminación de la enfermedad, y por otra parte, están derribando las

plantaciones para cambiar de cultivo o actividad principalmente a maíz o

pastizales para implementar la ganadería bovina, lo cual ambientalmente afecta

el sistema de captación y amortiguamiento y reserva que representan los

cultivos de cacao incluyendo la gran diversidad de árboles de sombra y de la

fauna y flora asociada a este cultivo, generando así un problema ambiental de

graves consecuencias a mediano plazo, así como la pérdida de germoplasma

26

de cacao de éstas regiones, las cuales poseen el legendario cacao criollo de

gran aceptación por parte del mercado chocolatero dada sus buenas

características organolépticas.

De otra parte, los bajos o nulos ingresos que tienen los productores con cacao

afectado por monilia, hacen que ellos salgan a buscar otras fuentes de

ingresos, incentivando así la migración de los pobladores rurales a otros

lugares del país o a Estados Unidos, generando el abandono de las zonas

rurales, desintegración familiar y escasez de mano de obra en etapa activa.

Teniendo en cuenta los buenos beneficios que trae consigo la producción de

tipo orgánico, los dos principales estados productores de cacao: Tabasco y

Chiapas, están incentivando este tipo de producción de tal manera que ya

existen plantaciones de cacao certificadas y en proceso de transición con

mercados que les dan un sobre precio, pero con el ingreso de la enfermedad y

la falta de alternativas de manejo bajo este sistema de producción hace

tambalear la economía de este sistema productivo y con ello los ingresos de

los productores y sus condiciones de vida.

1.4. Alcances de la investigación A continuación se presentan los alcances de esta investigación: Económico: Se da una nueva opción económicamente rentable para el manejo

de la moniliasis del cacao tanto para sistemas de producción convencional

como para sistemas de tipo orgánico.

Social: Dado que la producción de cacao la realizan principalmente pequeños

productores y es una actividad familiar, el manejo de la moniliasis mediante el

uso de extractos vegetales permitirá a los productores que opten por este tipo

de manejo obtener una mayor producción y si ingresan a mercados

especializados podrían obtener mayor ingreso económico, lo cual repercutiría

en la mejora de su calidad de vida, arraigo a su población, generación de

empleos y con ellos reducción de la migración.

27

Científico: Los resultados de la investigación permitirán generar conocimiento

acerca del potencial de extractos de plantas en el manejo de fitoparásitos, uso

de extractos de plantas como alternativa al manejo de la moniliasis del cacao,

así como avanzar en el estudio de sistemas de producción orgánica y de

manejo ecológico de la moniliasis del cacao en México.

1.5. Objetivos 1.5.1. Objetivo General

Desarrollar y caracterizar extractos vegetales que tengan efectividad en el

manejo de Moniliophthora roreri, en el cultivo de cacao (Theobroma cacao L.)

en México, con el fin de incorporarlos en un sistema de producción orgánica.

1.5.2. Objetivos Específicos

1. Determinar in vitro la forma de obtención de extractos a partir de seis

plantas con efectos biofungicidas sobre M. roreri.

2. Determinar la concentración mínima inhibitoria de los extractos de

plantas seleccionadas con mayor efectividad en la regulación del

crecimiento y desarrollo del hongo Moniliophthora roreri, en condiciones

de laboratorio.

3. Establecer la eficiencia en condiciones de plantaciones de cacao de

extractos vegetales sobre Moniliophthora roreri.

4. Determinar la factibilidad económica del uso de extractos vegetales para

el manejo orgánico de la moniliasis del cacao.

5. Realizar la caracterización fitoquímica del extracto que ejerza en campo

mayor efectividad de control sobre M. roreri.

1.6. Supuestos o Hipótesis

1. La aplicación de extractos de plantas reduce la incidencia de la

moniliasis en plantaciones de cacao.

28

2. La implementación de un manejo orgánico integral incorporando

extractos vegetales resulta eficiente técnica, económica y

ambientalmente en el manejo orgánico de la moniliasis del cacao.

3. La forma de obtención influye en el efecto antifungico del extracto sobre

M. roreri.

29

CAPÍTULO 2.

MARCO TEÓRICO

30

CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO

2.1. El cacao, origen, distribución e importancia mundial.

El cacao (Theobroma cacao L.) es una planta ancestral que ha llegado a tener

gran importancia cultural, ecológica y económica. En la época precolombina la

semilla se utilizaba para obtener una bebida la cual fue considerada como

alimento de los dioses y de ahí su nombre genérico científico theo = dios y

broma = alimento; y fue usado por los Mayas, Aztecas y otros grupos como

moneda. Su centro de origen fue la cuenca del río Amazonas, dispersándose

hasta el sur de México donde en la actualidad se encuentra uno de las mayores

reservas de germoplasma y del legendario cacao criollo (Estrada, 2010).

Según la Organización Internacional del Cacao (OCCO, 2011), el cultivo se ha

extendido, desde la colonización española, a otros países que hoy son líderes

en la producción mundial. Se cultiva principalmente en 13 países, Costa de

Marfil, Ghana, Nigeria y Camerún en el continente Africano aportan el 74,8% de

la cosecha mundial, que significan 3,18 millones de toneladas para el período

estimado de cosecha 2010-2011. También es cultivado en países de Asía y

Oceanía los cuales aportan el 12,5% de la producción y el restante 12,7% en el

continente americano donde los mayores productores son Brasil y Ecuador,

seguidos de República Dominicana, Colombia, Perú, México, Venezuela.

Con relación a la superficie destinada al cultivo de cacao en el mundo, ésta se

encuentra alrededor de los 7 millones de hectáreas. El 70% de esta área se

ubica en África, el 20% en América y el 8% en Asia. El rendimiento de la

producción de cacao a nivel mundial alcanza un valor promedio de 0,51 t/ha.

Asia presenta el mayor rendimiento a nivel mundial con 0,8 t/ha., seguido de

África con 0,53 t/ha y finalmente América con un rendimiento de 0,3 t/ha. Los

países con mayores rendimientos son Granada y Madagascar los cuales son

superiores a 0,95 t/ha, Indonesia y Malasia con rendimientos mayores a 0,8

t/ha. El Salvador, Santa Lucía y Bolivia con rendimientos entre 1,0 y 0,73 t/ha

en promedio.

31

Se estima que más de 20 millones de personas dependen directamente de

este cultivo para subsistir y que el 90% de la producción es cosechada de

minifundios (menor de 5 ha) (ICCO, 2011).

Durante los últimos años se ha querido aumentar la productividad de los

cultivos y para ello se ha hecho uso del mejoramiento genético, de fertilizantes

y principalmente de fungicidas e insecticidas, ya que se calcula que alrededor

del 30% de la producción mundial se pierde a causa de plagas y

enfermedades. Desafortunadamente el cultivo del cacao en América Latina

atraviesa por un grave problema causado por la diseminación de enfermedades

tales como escoba de bruja (Moniliophthora pernisiosa) y la moniliasis, esta

última de ingreso reciente en México ha producido efectos devastadores

llegando a generar pérdidas que superan el 90% de la producción (Palencia,

2003; Pinzón, 2004; Federación Nacional de cacaoteros, 2004; Arias, 2007).

2.2. El cacao en México

El cacao, como cultivo es nativo de México y en la actualidad están plantadas

61,344.25 ha ubicadas en los estados de Tabasco, Chiapas, Guerrero y

Oaxaca. El SIAP de la SAGARPA (2011) reporta que el estado de Tabasco

cuenta con la mayor superficie sembrada, con el 67,25%, seguido de Chiapas

con el 32,32%, y el área restante se ubica en los estados de Oaxaca y

Guerrero.

En el Contexto Internacional, actualmente México se encuentra dentro de los

20 principales países productores y con mayor superficie en el mundo ya que

con 23 mil toneladas aporta el 0,6% de la producción mundial de cacao según

el ICCO para el período de cosecha 2010-2011 (ICCO, 2011). Sin embargo

está considerado entre los países de bajo consumo, con 2,5 kg. per cápita al

año (Fideicomisos Instituidos en Relación a la Agricultura- FIRA, 2004).

En el caso del rendimiento, según el SIAP de la SAGARPA para el año 2011,

reporta 0,35 t/ha, es importante señalar que los países con mayores

rendimientos (Granada, Madagascar, Indonesia, Malasia, El Salvador, Santa

32

Lucía y Bolivia) tienen rendimientos reportados entre 0,73 y 1,0 t/ha en

promedio.

Los dos principales estados productores Tabasco y Chiapas tienen plantadas

60,744.33 ha., con unas 21,18 mil toneladas de grano, sin embargo, la

característica de cacao fino y aromático, ubica a México en un lugar

preponderante, sobre los grandes productores en el mundo debido a la calidad

de su materia prima usada principalmente para la chocolatería fina. El cacao

producido abastece parcialmente a 213 empresas, de las cuales ocho de éstas

dominan lo que se conoce como mercado de volumen o el gran mercado:

Nestlé y Pepsico, que en conjunto manejan el 59% del cacao nacional. La

mayoría de las empresas pertenecen a la Asociación Nacional de Fabricantes

de Chocolate, Dulces y similares que en conjunto procesan 67231 toneladas de

cacao anualmente. (Hernández, et al.,. 2010) y la disminución de la producción

nacional obliga a la importación de materia prima, lo cual afecta a la industria

nacional. Con respecto al mercado de exportación, principalmente se

abastecen mercados de Estados Unidos y Europa (SAGARPA, 2003).

Se estima que al cierre de 2008, el volumen de exportaciones de México de

este producto haya alcanzado las 103,017 toneladas, lo cual representaría una

disminución de 35,7% respecto al 2007. Los principales productos exportados

son el cacao en polvo con adición de azúcar u otro edulcorante (31%), las

barras de cacao con un peso superior a 2 kg (31%) y el chocolate y otras

preparaciones con cacao (15%) (Financiera Rural, 2012).

Dada la extensión de las plantaciones, la gran biodiversidad presente en ellas y

el número de productores que dependen de este cultivo, el cacao constituye

uno de los pilares de la conservación ambiental y sustentabilidad de los

recursos naturales, así como de uno de los cultivos estratégicos para esta parte

del territorio mexicano.

Por otra parte, las plantaciones de cacao constituyen agroecosistemas que por

su estructura y función se asemejan al ecosistema tropical húmedo, se

33

considera por lo tanto que el cacao posee un alto valor ecológico contribuyendo

a la conservación de los recursos naturales del trópico (Salgado, 2006).

Además el 69% de las plantaciones de cacao se ubica en terrenos de

pequeños propietarios y el 31% restante en terrenos del sector social; el

tamaño medio de la superficie cultivada con cacao es de 3 ha por productor,

con un rango que varia de 1 a 50 ha, según datos reportados para el Estado de

Chiapas (Toledo, 2003, Ruiz, 2003). Según Hernández, et al., (2010),

aproximadamente 46000 productores y 197100 personas dependen de manera

directa e indirecta de éste cultivo, generándose poco más de 2 millones de

jornales al año (SAGARPA, 2003).

2.2.1. Situación actual del cacao en México: El cultivo del cacao en México

ha sido manejado principalmente por pequeños productores, los cuales

dependen casi exclusivamente de la mano de obra familiar para atender las

plantaciones, quienes además tienen bajo nivel educativo y poca capacidad

económica de reinvertir en sus plantaciones.

Trabajos realizados en el 2006 por la Universidad Autónoma de Chiapas,

determinaron que el 73% del cacao que se cultiva en el estado de Chiapas es

por tradición y el 27% lo han sembrado los productores por considerar que el

cacao es rentable y les permite obtener ganancias. El 65% de los productores

heredó la plantación de su papá, y esto refleja la explotación tradicional del

cultivo de cacao en las regiones productoras del Estado de Chiapas.

Dado que México es una confederación de estados, los programas de los

gobiernos estatales han sido diferentes y con variados resultados, en el caso

de Tabasco se ha dado últimamente apoyo al proceso de beneficio del cacao

con el montaje de plantas fermentadoras, buscando con ello mejorar la calidad

de éste proceso, mientras que en el Estado de Chiapas se han hecho trabajos

para la renovación de plantaciones.

En los dos principales estados productores Chiapas y Tabasco, las densidades

de las plantaciones son bajas (600 árboles/ha), utilizan materiales genéticos de

34

baja calidad, realizan usualmente un inadecuado manejo de las plantaciones,

con plantas que van de los 6 a los 7 metros de altura, existe un alto número de

plantaciones viejas con más de 30 años y algunas de ellas están abandonadas.

A lo anterior se suma la alta incidencia de enfermedades e insectos plaga,

principalmente Mancha negra (Phytophthora palmivora), Antracnosis

(Colletotrichum gloesporioides) y recientemente Monilia (M. roreri).

Diferentes programas gubernamentales han realizado esfuerzos por

proporcionar material vegetativo para la renovación de las miles de hectáreas

existentes, así como brindar capacitación; sin embargo los esfuerzos realizados

son lentos y no permiten visualizar un repunte importante en la producción.

Uno de los factores tal vez más limitantes detectados, es la escasez de

técnicos y profesionales capacitados en la producción de cacao, así como de

las escasas instituciones e investigaciones realizadas en este sector

productivo, sustentadas principalmente en el Instituto Nacional de

Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias - INIFAP, la Universidad

Autónoma de Chiapas y el Colegio de Posgraduados (Estrada, 2010).

Desde el punto de vista ecológico el cacao está situado principalmente en tres

regiones que alimentan a los principales ríos que abastecen de agua tanto para

consumo como para generación de energía mediante plantas hidroeléctricas.

Además se tiene el reporte de la existencia de una gran biodiversidad existente

en las plantaciones de cacao, algunas de ellas plantadas bajo selva y otros con

diversidad de árboles para que les generen sombra. Esto hace que el cultivo de

cacao tenga una gran repercusión en el ciclo hidrológico, en la conservación de

la biodiversidad regional, en la captura de carbono y la regulación de ciclos

biológicos de diversas especies.

Se sabe que los cacaotales mantienen una diversidad de aves, murciélagos,

mamíferos no voladores e invertebrados (especialmente hormigas) similar a la

35

de los bosques naturales y superior a la de los habitas agrícolas más

intervenidos (Salgado, 2006).

2.3. La moniliasis del cacao

2.3.1. Origen y dispersión: Durante muchos años se afirmó que la moniliasis

inició en el año 1914 en Ecuador (Ampuero, 1967; Barros, 1980), pero

recientes estudios realizados por Phillips-Mora et al., (2006) mencionan que el

origen de esta grave enfermedad se dio en Colombia hacia el año 1800; desde

entonces se ha dispersado a 11 diferentes países sur y centro americanos

productores de cacao: Colombia, Ecuador en 1917 (Rorer, 1918), Venezuela

en 1941 (Muller, 1941), Perú en 1950 (McLaughlin, 1950) , Panamá en 1956

(Orellana, 1956), Costa Rica en 1978 (Enríquez y Suarez, 1978), Nicaragua en

1980 (López y Enríquez, 1980), Honduras en 1997 (Porras y Enríquez, 1998),

Guatemala en 2002 (Phillips-Mora y Wikilson, 2007), Belice en el 2004 (Phillips-

Mora et al., 2006b) y finalmente ingresó a México en el año 2005 (Phillips-

Mora et al., 2006a), ocasionando a su paso pérdidas superiores al 50% de la

producción y al abandono del cultivo por miles de productores a lo largo del

continente americano, lo cual ha ocasionado efectos negativos en la

comunidad de cacaocultores y en estos agroecosistemas.

La moniliasis es producida por el hongo Moniliophthora roreri (Cif. & Par),

basidiomiceto del orden Agaricales, familia Marasmiaceae. Trabajos realizados

por Phillips (2006), con la ayuda de genética molecular, mostraron que existen

cinco variedades del hongo de la moniliasis, todos con origen colombiano,

algunos son endémicos ya que nunca salieron de ese país, pero otros, a través

del movimiento de material de siembra, se esparcieron por otros países de

América. Así, los cultivos de Colombia, Perú y Bolivia hoy se ven amenazados

por una variedad de la moniliasis distinta a la que acabó con el cultivo en

Panamá, Costa Rica y que se ha dispersado hasta cultivos del sur de México,

detectada a principios del año 2005.

2.3.2. Importancia económica de la moniliasis del cacao: La enfermedad

denominada moniliasis del cacao ocasiona pérdidas en rendimiento de acuerdo

36

con las condiciones ambientales, el manejo del cultivo, las medidas de control

que se apliquen y las variedades cultivadas. En plantaciones ubicadas en

zonas húmedas, con poca tecnificación y sin control, es frecuente observar

pérdidas superiores al 90%. Sin embargo, bajo condiciones culturales óptima

de manejo, control y germoplasma mejorado, los daños disminuyen

considerablemente, y esta situación genera una alternativa para el desarrollo

del cultivo del cacao en áreas infestadas por la enfermedad.

En Colombia, donde el hongo apareció inicialmente en Tumaco y en el golfo de

Urabá, disminuyó el rendimiento de los cultivos de cacao entre el 30 y 70%, el

país cuenta con unas 100.000 hectáreas sembradas y produce 36.000

toneladas anuales, volumen que no abastece a la industria local, por lo que la

industria procesadora debe importar alrededor de 30.000 toneladas anuales.

(Domínguez, 2007). En Colombia, Barros (1980) y Campuzano (1980) indican

que las pérdidas por la enfermedad fluctúan alrededor del 40% de la

producción nacional.

Se conoce que la moniliasis y la escoba de bruja causaron un grave perjuicio

en la industria del cacao en el Ecuador en 1933 (en ese entonces uno de los

mayores productores a nivel mundial), donde las exportaciones bajaron de

47.000 Toneladas a 10.800 Toneladas, Ampuero (1967) señala además que

las pérdidas estimadas fueron desde un 15 hasta un 80%, en las diversas

regiones productoras.

En Perú, desde su primer reporte, en Bagua Grande, departamento de

Amazonas, en 1988, esta enfermedad se ha diseminado prácticamente a todas

las áreas productoras de cacao en el país, según lo ha podido establecer el

Ministerio de Agricultura y servicio nacional de sanidad agraria del Perú; sin

embargo, la superficie cacaotera aumentó a unas 60.000 hectáreas, de las

cuales 30.000 están en producción (Ministerio de Agricultura y Servicio

Nacional de Sanidad Agraria del Perú).

Por otra parte, en Costa Rica, Enríquez y Suárez (1978) y Enríquez y

colaboradores (1979) mencionan que la producción nacional en 1978 fue de

9,500 toneladas por año; sin embargo debido a la presencia de la enfermedad

http://searchmiracle.com/text/search.php?qq=MBA

37

el rendimiento se redujo en 1982 a 3,500 toneladas. Funcionarios del Centro

Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE) reportan que por

culpa de la enfermedad, de las 20.000 hectáreas sembradas en 1978 en ese

país centroamericano, quedan en la actualidad unas 1.200 ha, porque los

productores erradicaron los cultivos para sembrar plátano, banano y tubérculos.

Se tiene el reporte que en cinco años de ingresada la enfermedad la

producción cayó 72% y las exportaciones 96% (Programa Cooperativo en

Investigación y Tecnología Agrícola para la Región Norte, 2005).

En Honduras la producción de cacao en 1997, antes de la llegada de la

moniliasis fue de 4,500 toneladas de cacao, en 2003 por efecto de la moniliasis

la producción tan solo alcanzó 900 toneladas (Programa Cooperativo en

Investigación y Tecnología Agrícola para la Región Norte, 2005).

En el caso de México la voz de alerta sobre la presencia de la moniliasis del

cacao se dio en marzo de 2005, por funcionarios de la Universidad Autónoma

de Chiapas. Este primer reporte fue en el municipio de Pichucalco, Ranchería

Zaragoza del estado de Chiapas. A partir de esta localidad se empezó a

diseminar a municipios cercanos y llegando hasta plantaciones del estado de

Tabasco; a finales del año 2006 se detectó en el municipio de Tuzantán y en

mayo del 2007 se reportó ya en plantaciones de Huehuetán pertenecientes al

Soconusco, otra de las regiones de mayor producción de cacao del estado

Chiapas y poseedores del legendario cacao criollo del Soconusco, hoy en día

esta presente en las principales regiones productoras de cacao de México

(Phillips-Mora, 2006, Estrada, 2010, Torres de la Cruz, 2010).

2.3.3. Clasificación Taxonómica: De acuerdo con Galindo y Enríquez (1985)

el organismo causante de la enfermedad fue descrito morfológicamente en

1933 por Ciferri y Parodi, quienes lo clasificaron como un hongo imperfecto, de

la clase deuteromicete, orden Moniliasis, género Monilia y especie roreri. Sin

embargo, en 1978, Evans y colaboradores y más tarde Pudrí (1986)

presentaron evidencias de que el hongo posee características propias de un

basidiomiceto y proponen su ubicación taxonómica como del Phylum: Hongos

38

mitospóricos, Clase: Hyfomycetes, Orden: Moniliales, Familia: Moniliacea,

Género: Moniliophthora y Especie: M. roreri (Cif. & Par).

2.3.4. Etiología: Thorold (1975), Kranz y colaboradores (1978) y Evans et al.,

(1978) describen que el hongo posee hifa hialina, septada, septa sin

conexiones de gancho pero con doliporo, de 1,5 a 5 milimicras de ancho. Las

conidias son de formación basal, su forma varia de globosa a elipsoidal; son

hialinas, forman cadenas de 4 a 10 conidias y miden de 7 a 10 de ancho por 9

a 14 milimicras de largo.

Los conidióforos son más o menos verticales, ligeramente ramificados y

ocasionalmente aislados y erectos. Algunas veces trifurcados, hialinos,

pluriseptados, con una constricción en la septa y miden de 9 a 50 milimicras de

longitud (Figura 1).

Figura 1. Conidióforos de M. roreri aislados de frutos infectados en plantaciones de Pichucalco, Chiapas – México. Fuente Autora.

2.3.5. Sintomatología: Las investigaciones desarrolladas han permitido

determinar que los síntomas varían con la edad del fruto al momento de la

infección, y la velocidad de desarrollo está influenciada por las condiciones

ambientales, básicamente la temperatura y la humedad ambiental.

En condiciones naturales, la moniliasis ataca únicamente a los frutos, en

cualquier etapa de desarrollo, y al infectar los frutos menores de dos meses y

medio de edad, continúa su crecimiento aparentemente normal y luego

desarrolla protuberancias o tumefacciones de los tejidos del exocarpo, con una

39

coloración más clara y brillante que el resto de la mazorca. Después del

desarrollo de las protuberancias ocurre la muerte del chilillo.

Cuando los frutos infectados han completado la mitad o más de su desarrollo,

el síntoma más característico de la enfermedad es una mancha de color

marrón, oscuro y con borde irregular, denominado “mancha chocolate”, que se

manifiesta inicialmente en forma de pequeñas manchas aceitosas. Estas

manchas, crecen rápidamente hasta tornarse de color café oscuro,

frecuentemente rodeadas de un halo amarillento y pueden llegar a cubrir

totalmente la mazorca, dando la apariencia de una pudrición; el necrosamiento

del tejido va del interior al exterior. Otro síntoma externo es la maduración

prematura de las mazorcas afectadas, que se manifiesta por una coloración

amarillenta de distribución irregular (López, et al., 2006).

2.3.6. Ciclo del hongo: Galindo y Enríquez (1983) indican que la fuente de

inóculo conocida capaz de producir infecciones son los conidios. El origen de

éstos para desarrollar una nueva infección define dos ciclos de vida del hongo:

Primario y secundario.

En el primer caso el inóculo llega a una mazorca sana procedente de un fruto

con infección reciente sobre el cual se ha desarrollado un estroma esporulante.

En el segundo caso, las esporas proceden de frutos infectados y momificados

en ciclos anteriores que permanecen en el árbol durante mucho tiempo.

Es posible que se sucedan ciclos primarios alternativos para el origen del

inóculo, como es la ocurrencia de la fase sexual del hongo o la posibilidad de

que el hongo permanezca infectando otras partes de la planta de cacao, o bien

que los conidios permanezcan en dormancia de una estación a otra.

Una vez desarrollados, los conidios son diseminados por los animales, los

insectos, el viento, la lluvia o el movimiento de los frutos esporulando durante la

labor de cosecha.

40

La espora germina y penetra la mazorca en todos los estados de crecimiento.

La penetración ocurre directamente a través de la epidermis y ocasionalmente

a través de los estomas, sin que sea necesaria la presencia de heridas.

Suárez (1980) describe que la penetración se realiza mediante uno a cinco

tubos germinativos que se extiende sobre la epidermis y produce las hifas de

infección. Estas hifas pueden observarse, después de ocho horas, creciendo

intercelularmente debajo de la epidermis; más tarde desarrollando los

conidióforos y conidios dentro de la corteza de la mazorca.

El período desde el inicio de la infección hasta la aparición de las manchas

color café varía con la edad del fruto atacado; se conoce que el fruto es más

susceptible en sus primeras etapas de desarrollo. En frutos que tienen entre

uno y dos meses de edad, la aparición de síntomas ocurre entre 30 a 45 días

después de la infección, mientras que en aquellos con edad mayor, los

síntomas aparecen entre 60 y 90 días.

A los tres o nueve días siguientes a la aparición de las manchas se forma el

estroma y tres o cuatro días después, aparecen las fructificaciones

reproductivas o esporas.

2.3.7. Epidemiología

2.3.7.1. Fuentes de inóculo: En cada región, las plantaciones sin manejo

agronómico y donde no se practica ninguna medida de control sanitario,

constituyen la principal fuente de la enfermedad y de donde se dispersa a otras

plantaciones. En el cacao debido a la producción permanente de mazorcas y la

presencia de microclimas favorables a la enfermedad, se produce una gran

cantidad de inóculo y muchos frutos son infectados.

Dentro de cada plantación, los frutos infectados, adheridos a las plantas

constituyen la fuente única y permanente de estructuras infectivas del hongo.

Se ha determinado que en estos frutos, el patógeno produce sus esporas por

periodos prolongados.

41

La cantidad de inóculo que se forma en una mazorca esporulante es abundante

y su máxima intensidad ocurre entre los primeros días. Al respecto,

Campuzano (1980) indica que un cm2 de micelio esporulante puede producir un

total de 45 millones de esporas y una mazorca completamente infectada está

en capacidad de producir 700 millones de esporas infectivas. Porras (1984)

cuantificó que la capacidad de liberación de conidios de frutos esporulantes fue

máxima en el primer mes, con un promedio de 546 mil conidios por mazorca,

pero se redujo después de dos meses.

Se ha observado una relación inversa entre la humedad relativa y la capacidad

de liberación de conidios, según lo señalan González (1982), quienes

cuantificaron 166 mil conidios por hora por mazorca en días soleados y secos y

43 mil conidios por hora por mazorca en días húmedos. El mismo autor (1984)

concluyó que a niveles superiores del 80% de humedad relativa, la liberación

de conidios es muy reducida.

Porras (1982) determinó que la mayor cantidad de esporas en el aire ocurrió

durante el día, reduciéndose considerablemente en la noche, especialmente

durante las horas de la madrugada.

Los quebraderos y lugares donde se colocan la cáscara de los frutos

cosechados, constituye una importante fuente de inoculo. Sirven de sustrato

para que M. roreri pueda desarrollarse, esporular e infectar frutos sanos,

ocasionando nuevas infecciones.

2.3.7.2. Condiciones ambientales favorables a la enfermedad: Las

condiciones ambientales que propician la infección y el desarrollo de la

epidemia, generalmente ocurren en la temporada de lluvias. Las esporas

requieren de agua o de una humedad relativa cercana al 100% para su

germinación. El crecimiento vegetativo requiere de una temperatura de 24 a

26°C y el desarrollo favorable de la enfermedad se sucede a una temperatura

entre 22 a 30 °C. Por encima o por debajo de estos valores, la agresividad de

la infección se reduce.

42

De acuerdo con Suárez (1979) una alta humedad relativa (mayor del 80%) y

temperaturas cercanas a los 22°C favorecen la germinación de los conidios, en

cambio Campuzano (1980) cuantificó la mayor germinación de esporas a una

temperatura de 20°C y una humedad relativa del 100%.

Dentro de las plantaciones, las condiciones que favorecen alta humedad y por

lo tanto el desarrollo de la moniliasis, son el drenaje deficiente del suelo,

plantas muy altas y con exceso de sombra y sin la ejecución de labores

culturales, especialmente la poda, la regulación de la sombra y el control de las

malas hierbas.

La magnitud del daño y la diseminación de la enfermedad dependen, en gran

medida, de las condiciones ambientales existentes en cada región. En

Colombia, Merchán (1980) indica que en áreas con períodos de sequía

relativamente largos, con precipitación media inferior a 1500 mm y humedad

relativa menor del 80%, el grado de incidencia de la enfermedad no sobrepasa

el 60% de los frutos atacados; mientras que, en áreas de precipitación mayor a

los 2000 mm y humedad relativa ambiental del 90%, la incidencia puede

alcanzar el 95% de frutos infectados. El mismo autor encontró una correlación

positiva entre la incidencia de la moniliasis y la cantidad de lluvia ocurrida dos o

tres meses atrás. Según Porras (1982) una correlación similar fue observada

por Desrosiers y colaboradores en 1951 – 1954 entre la incidencia de la

enfermedad y la lluvia caída cuatro meses antes.

Jorgensen (1970) considera que la incidencia de la moniliasis en Pichilingue y

Costa del Pacifico en Ecuador, está directamente relacionada con la cantidad

de precipitación cuando los frutos son jóvenes.

Suárez (1980) describe que en Ecuador la moniliasis es más grave en los

lugares próximos a la Cordillera de los Andes, donde las pérdidas alcanzan del

85 al 90%, y en años y lugares de máxima precipitación, las pérdidas promedio

se elevan del 50 al 80%.

43

2.3.7.3. Diseminación de Moniliophthora roreri: Las esporas de M. roreri se

diseminan fácilmente; debido a que las esporas del hongo son secas, éstas se

desprenden fácilmente al golpear los frutos o por efecto del viento y de las

gotas de lluvia. Esto se repite continuamente, liberándose una gran cantidad de

esporas infectivas que al llegar a frutos sanos desarrollan la enfermedad.

El hombre, al transportar frutos o semillas procedentes de áreas infectadas a

las áreas libres, también ha jugado un papel importante en la diseminación de

la moniliasis. De esta forma es probable que el patógeno se haya dispersado a

diferentes regiones cacaoteras, superando barreras geográficas naturales. En

otros materiales, como costales, herramientas de trabajo, etc., es posible que

se transporten esporas, las cuales podrían producir infecciones en caso de

llegar a frutos en condiciones ambientales favorables (López, et al., 2006).

2.3.8. Tecnologías generadas para el manejo de la moniliasis: El manejo de

esta enfermedad se basa en la integración de prácticas agronómicas como son

la tecnificación, la reducción del inóculo primario, la siembra de clones de alta

productividad, y la implementación permanente de prácticas de saneamiento y

de manejo cultural.

Los factores ambientales son determinantes para la germinación y desarrollo

de las esporas. Por esta razón, las prácticas orientadas a la reducción del agua

sobre la superficie de los frutos o la disminución de la humedad dentro de la

plantación, ayudan a reducir la intensidad de la enfermedad.

De esta manera las prácticas culturales son hasta el momento las que han

brindado mejores resultados tanto en la reducción de la incidencia de la

enfermedad como en los costos del manejo de la misma, se recomienda el

remover del árbol los frutos afectados en cualquier estado de desarrollo y

dejarlos en el piso tapados con hojarasca.

Otras prácticas están relacionadas con el tratamiento de los quebraderos y

residuos de cosecha, el derribo de plantaciones abandonadas o sin manejo, la

mejora del sistema de drenaje, la regulación de la sombra, la cual no debe

44

sobrepasar el 50% y la realización de podas de los árboles del cacao bajando

el porte de los mismos a 3 m.

Se recomienda el reemplazo total de plantaciones muy viejas y poco

productivas con material genético de alto rendimiento, así como suministrarles

fertilizantes o abono orgánico.

Para el control de la moniliasis del cacao han sido probados en diversos

lugares fungicidas de síntesis química; sin embargo, los resultados no son del

todo satisfactorios o son inconsistentes de año a año. Otro punto que se

cuestiona son las altas frecuencias de aplicación y el costo de los productos ya

que resulta a menudo antieconómico para el cacaotero (Meza y León, 1972;

Sánchez, et al., 2003; Merchán, 1980 y Barros, 1982). De acuerdo con las

Investigaciones realizadas en Ecuador y en Costa Rica (Suárez, 1979;

González, 1982) los fungicidas Bravo 500 (i.a.Clorotalonil) y Macuprax (i.a.

mancozeb 80%) son promisorios en el combate de esta enfermedad, Torres de

la Cruz (2010) reporta que una sola aplicación de Azoxystrobin (250 g.i.a.ha-1)

a frutos menores de dos meses de edad y después tres aplicaciones de

hidróxido de cobre son efectivos en la reducción de la incidencia de la

enfermedad.

En la actualidad se evalúan cepas nativas de hongos y bacterias para su

manejo, los resultados en laboratorio muestran buena eficiencia de control, sin

embargo falta mayor desarrollo de los mismos (Evans, 1999; Rodríguez, 2005).

El uso de la resistencia genética se inició desde que se detectó la enfermedad

Sánchez (1982), por medio de clones clasificados como resistentes; trabajos

recientes desarrollados en Costa Rica por Phillips, 2004 reportan más de 100

clones, los cuales están siendo probados en diversos ambientes, pero sin que

hasta la fecha se haya masificado su uso. Además, aun es necesario estudiar

si esta resistencia es heredable, así como el mecanismo de transmisión de los

clones a las descendencias híbridas, y por otra parte, si éstas resultan de buen

rendimiento y calidad organoléptica (Brenes, 1983; Arguello, 2000; Palencia,

2003; Phillips, 2004, Pinzón, 2004, Phillips, 2006).

45

2.4. Los extractos de plantas y su poder para el manejo de problemas

fitosanitarios.

La humanidad tuvo conocimiento de las virtudes toxicológicas, farmacológicas

y alucinógenas de las plantas con mucha anterioridad a su real descubrimiento

por la fitoquímica.

Los plaguicidas naturales han sido usados en la agricultura como una

alternativa para el manejo de problemas fitosanitarios, los que comprenden:

fungicidas, fungistáticos, insecticidas, antialimentarios, inhibidores de

crecimiento, hormonas juveniles de muda, deterrentes de la oviposición,

atrayentes, repelentes y disuasores. Estos pueden constituirse en buenos

modelos para el desarrollo de productos sintéticos análogos o ser usados como

ingredientes activos si están disponibles en abundancia (Ayyangar y

Nagasampagi, 1993, citados por Vergara, 1997).

La importancia de las plantas, se debe a que contienen principios activos en

algunos de sus órganos, los cuales, extraídos en forma adecuada y

administrados en dosis suficientes, producen efectos curativos que permiten el

manejo de microorganismos fitopatógenos y de insectos – plaga en los cultivos.

El estudio de los componentes de las plantas medicinales se centra en las

sustancias que ejercen una acción farmacológica sobre los seres vivos. Los

principios activos de las plantas pueden ser sustancias simples (como

alcaloides) o bien mezclas complejas (resinas, aceites esenciales, etc.). Los

compuestos más comunes son los azúcares y heterósidos, que pueden ser

glucósidos, galactósidos, etc. Otros componentes activos de las plantas son

alcaloides, lípidos, gomas, mucílagos, principios amargos, taninos, aceites

esenciales, resinas, bálsamos, oleorresinas, ácidos orgánicos, enzimas y

vitaminas. Los principios vegetales que ejercen acción farmacológica

generalmente son los producidos por la planta en su metabolismo secundario.

Para Vergara (1997), las especies de plantas que pueden ser utilizadas para

obtener extractos con poder plaguicida, deben poseer las siguientes

46

características: ser perennes, ocupar poco espacio y necesitar de poco agua y

fertilizantes; no destruirse cada que se obtienen sus partes para elaborar

extractos, que no se conviertan en maleza ni traigan plagas de cultivos y que

además posean usos complementarios. Los extractos crudos de estas

especies podrían obtenerse con tecnologías sencillas, ser de fácil consecución

y ambientalmente seguros sin que ocasionen problemas ecológicos.

Según Godfrey (1994), los productos naturales han jugado un papel

significativo en el descubrimiento de nuevos fungicidas y bactericidas, ya sea

por aplicación directa de los productos obtenidos de las plantas o desarrollo de

análogos en los que se les optimiza propiedades biológicas o físicas. El uso de

fungicidas naturales se remonta a agricultores romanos quienes usaron varios

extractos en el control de infecciones fúngicas en sus cultivos.

Los productos naturales pueden ser explorados en varias vías en el desarrollo

de nuevos fungicidas para la agricultura. Los extractos pueden ser usados

como un extracto crudo para aplicación directa a los cultivos. Alternativamente

una vez purificado el ingrediente activo puede ser formulado en mezclas o

puede ser usado con productos sintéticos. Cuando un producto natural tiene

una actividad insuficiente se le realiza una semisíntesis o modificación química,

con el propósito de optimizar sus propiedades, reducir la fitotoxixidad e

incrementar la fotoestabilidad. Por último el ingrediente activo del producto

natural puede ser la base para la síntesis de otras moléculas para la

formulación de pesticidas de síntesis química (Godfrey, 1994).

Para Ramírez, (2006) la elaboración de extractos debe ser basado en el uso de

técnicas simples y fácilmente reproducibles por los productores, utilizando

métodos como el de infusión, extracción con alcohol o fermentación, entre

otros.

Existen diversas investigaciones que demuestran el potencial de los extractos

de plantas en el manejo de problemas fitosanitarios ocasionados por hongos,

tal es el caso del control de mildeo polvoso (Sphaeroteca panosa var. rosae) en

rosa en condiciones de invernadero, con el lixiviado del raquis del plátano al

47

5% (Álvarez et al., 2002). Se evaluaron 20 extractos hidroalcoholicos (hojas,

raíces, tallos, botones florares, frutos) pertenecientes a 13 familias para el

control de sigatoka (Mycosphaerrela fijiensis) en plátano, de los cuales ocho

presentaron buen nivel de control (Arciniegas et al., 2002).

Trabajos realizados en condiciones de laboratorio y campo por Miño y

Uricohechea (2001), Velosa et al., (2003) y Gutiérrez et al., (2003),

demuestran como la forma de extracción de una misma planta puede variar el

efecto de control del moho gris (Botrytis cinerea Pers. Ex. Fr.) en el cultivo de

mora (Rubus glaucus Benth), siendo las mejores el purin, presurizado e

hidrolato y que las mejores plantas para el manejo de éste patógeno fueron la

canela y el ajo.

Investigaciones desarrolladas por La-Rotta y Avila, (2002) y Ramírez y Avila

(2002), establecieron que los hidrolatos de uchuva (Physalis peruviana),

hierbamora (Solanum nigrum) y sauco (Sambucus nigra), al 2, 5 y 10%

respectivamente ejercen un buen nivel de control de Cladosporium sp. y

Stemphylium sp. en cebolla de bulbo (Allium cepa) y para Sclerotium cepivorum

la mezcla de hidrolatos de manzanilla (Matricaria chamomilla), hierbamora

(Solanum nigrum) y eucalipto (Eucalipto globulus) fue una de las mejores.

2.4.1. Metabolitos Secundarios: Un gran porcentaje de los principios activos

de plantas está comprendido dentro de los llamados productos naturales o

metabolitos secundarios (alcaloides, esteroides, terpenoides, flavonoides, etc.),

que son compuestos químicos de estructura relativamente compleja que no

tienen utilidad aparente para el ser que los sintetiza, y de distribución más

restringida y más característica de fuentes botánicas específicas, que los

llamados metabolitos primarios o productos bioquímicos que presentan una

utilidad definida y que son comunes a todos los seres vivos (proteínas, ácidos

grasos, polisacáridos, etc.). La clasificación de los metabolitos secundarios

puede hacerse de acuerdo a su estructura, a su bioformación, a la fuente de

producción y a su acción biológica.

48

La mayoría de los agentes alelopáticos son metabolitos secundarios derivados

de las rutas acetato- mevalonato o del ácido shikimico. Provienen de la ruta

metabólica del acetato- melovato: terpenos, esteroides, ácidos orgánicos

solubles en agua, alcoholes de cadena lineal, aldehídos alifáticos, cetonas,

ácidos grasos insaturados, insaturados simples, ácidos grasos de cadena

larga, poliacetilenos, naftoquinonas, antroquinonas, quinonas complejas y

floroglucidos. Provienen de la vía metabólica del shikímico: fenoles simples, el

ácido benzoico y sus derivados, el ácido cinámico y sus derivados, cumarinas,

sulfuros, glicósidos, alcaloides, cianhidrinas y algunos derivados de quinonas y

taninos hidrolizables y condensados. Existen también compuestos como los

flavonoides en cuya síntesis participan metabolitos de las dos rutas.

Las concentraciones de estos compuestos en los tejidos varían según el ritmo

de la biosíntesis, almacenamiento y degradación. También son afectados por

los balanceos internos de reguladores de crecimiento vegetal y otros factores

bióticos y abióticos (Samprieto 2002; Hoss 1999).

Para Lindsey (1989), la importancia biotecnológica de los metabolitos

secundarios es triple: primero puede tratarse de compuestos químicos de valor

comercial, segundo una serie de ellos son tóxicos y deben eliminarse de los

alimentos; y tercero, podría actuar como agentes protectores, utilizados por la

planta contra agentes patógenos e insectos y animales herbívoros. Un gran

número de compuestos químicos importantes desde el punto de vista comercial

derivan directamente de material comercial y se trata casi invariablemente de

metabolitos secundarios, con frecuencia difíciles de sintetizar químicamente. La

aplicación de estos productos puede clasificarse en cinco grupos: fármacos,

aromas, perfumes, pigmentos y plaguicidas.

Para Pedrozo (2006), en los agroecosistemas, las plantas están expuestas a

factores bióticos y abióticos con los cuales han co-evolucionado. La presión de

selección ejercida por estos factores a lo largo del proceso evolutivo provocó el

desarrollo, en los mismos vegetales, de numerosas rutas biosintéticas a través

de las cuales producen y acumulan en sus órganos una gran variedad de

49

metabolitos secundarios, muchos de los cuales juegan un importante papel en

interacciones complejas entre organismos vivos (efectos aleloquímicos) en el

entorno natural.

50

CAPITULO 3.

METODOLOGÍA

51

CAPITULO 3. METODOLOGÍA

3.1. Diseño de la investigación

En el siguiente esquema se aprecian los pasos que se siguieron para el

cumplimiento de los objetivos planteados, los cuales se desarrollaron en tres

fases.

RECOLECCIÓN DE MATERIAL VEGETAL

OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

AISLAMIENTO DE Moniliophthora roreri

MULTIPLICACIÓN In vitro de Moniliophthora roreri

SCREENING DE LABORATORIO

SELECCIÓN DE MEJORES EXTRACTOS

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MINIMA INHIBITORIA (CMI)

PRUEBAS DE CAMPO PARA DETERMINAR EFECTIVIDAD DE EXTRACTOS SELECCIONADOS

PRUEBAS FITOQUIMICAS PARA DETERMINACIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO DEL EXTRACTO SELECCIONADO

EN CAMPO

SELECCIÓN MEJORES EXTRACTOS Y CMI

52

3.2. Ubicación geográfica

La primera fase de la investigación se desarrolló en el Laboratorio de

Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma

de Chiapas en Huehuetán, Chiapas – México; en la cual se realizaron pruebas

para la determinación in vitro de la efectividad de los extractos, y determinar su

concentración mínima inhibitoria (CMI).

3.3. Materiales

3.3.1. Material biológico

Las plantas evaluadas fueron las siguientes:

Nombre Científico Nombre común

Parte utilizada

Familia

Pimienta dioica L. Pimienta Semilla

Myrtaceae Hoja

Zingiber officinale Roscoe Jengibre Rizoma Zingiberáceas

Cinnamomum zeylanicum Nees

Canela Hoja

Lauraceae Astilla

Syzygium aromaticum L Clavo Hoja

Myrtaceae Semilla

Origanum vulgare L. Orégano Parte aérea Labiateae

Tradescantia spathacea Swartz

Maguey Hojas Commelinaceae

Patógeno evaluado: Moniliophthora roreri. 3.3.2. Material de Laboratorio Autoclave, cámara de flujo laminar, destilador de agua, equipo para obtención

de hidrolatos, microscopio, cámara fotográfica, hemacitómetro, estufa, agitador

magnético, cajas de petri, erlemeyers, beakers, barras de vidrio, medio Papa –

Dextrosa – Agar (PDA), agar, jugo de verduras V8 , jugo de la cáscara del

fruto de cacao, agua destilada, bolsas de tela, sala de cultivos climatizada.

53

3.4. Métodos

3.4.1. Obtención de extractos vegetales

3.4.1.1. Presurizado: Proceso de extracción que consiste en hacer cocer el

material vegetal en una olla de presión para la obtención de un caldo vegetal.

Se colocó dentro de una olla a presión 300 g. de material vegetal fresco

finamente picado en 1 litro de solvente que consistió de una solución de agua

destilada. Se tapó herméticamente y se sometió a calor por un periodo de 15

minutos sin permitir la salida del vapor, se dejó enfriar sin quitar la tapa y

posteriormente se filtró.

3.4.1.2. Hidrolato por destilación: Para el proceso de extracción se utilizó 3

kg de material vegetal fresco bien picado y macerado en 10 litros de solvente

que consistió de una solución de agua. Para la obtención del extracto se

empleó un destilador adaptado para obtención de extractos. El material vegetal

se colocó dentro de la marmita del destilador junto con el solvente, se tapó

herméticamente para hacer el proceso de extracción continuo mediante la

aplicación de calor y presión constante, el vapor es conducido a un

condensador y mediante enfriamiento con agua corriente se obtuvo el

Hidrolato.

3.4.1.3. Fermentado aeróbico: Se colocó el material vegetal (300 gramos)

finamente picado en un recipiente de vidrio adaptado como biofermentador y se

le agregó un litro de agua destilada. La mezcla se revolvió todos los días para

que se oxigene y fermente, hacia el día 14 se filtró.

3.4.1.4. Fermentado anaeróbico: En su elaboración se emplearon 300

gramos de materia fresca en un litro de agua destilada. El material finamente

picado es colocado en un recipiente de vidrio cerrado herméticamente,

adaptado para el proceso de biofermentación con una válvula de seguridad

para salida de gases. El proceso de fermentación duró 14 días, tiempo después

del cual el extracto se obtuvo por filtración del compuesto.

54

3.4.2. Aislamiento del patógeno.

El hongo M. roreri se obtuvo de muestras de tejido enfermo colectado en

plantaciones de cacao de productores del municipio de Pichucalco del estado

de Chiapas, para lo cual se colectaron frutos enfermos de donde fue aislado el

hongo y cultivado en condiciones de laboratorio, en cajas de petri de plástico

estéril de 60 mm de diámetro en medio de cultivo compuesto por papa-

dextrosa-agar (PDA) marca Difco®.

3.4.3. Trabajo en condiciones de laboratorio

3.4.3.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar

Montaje de ensayo al 50% de concentración. Se realizó un ensayo

exploratorio en la que cada extracto se añadió de manera individual al medio

de cultivo, a una concentración del 50% (volumen/volumen); una vez preparado

el medio con el extracto se procedió a la inoculación del hongo, fueron

mantenidos en sala de cultivo bajo condiciones controladas de 23oC +/- 2 oC.

Se incluyó como testigos; uno absoluto en el cual el hongo fue cultivado en el

medio original (PDA) sin ningún control y otro testigo mineral en el cual se

incorporó el polisulfuro de calcio al 10%. El total de tratamientos fueron 38 y se

presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. TRATAMIENTOS EVALUADOS

Nombre Científico Parte a utilizar

Forma de extracción Codificación del

tratamiento

Pimienta dioica L.

Semilla

Hidrolato T1

Presurizado T2

F. aeróbico T3

F. anaeróbico T4

Hoja

Hidrolato T5

Presurizado T6

F. aeróbico T7

F. anaeróbico T8

Zingiber officinale Roscoe

Rizoma

Hidrolato T9

Presurizado T10

F. aeróbico T11

F. anaeróbico T12

Cinnamomum Hoja Hidrolato T13

55

zeylanicum Nees Presurizado T14

F. aeróbico T15

F. anaeróbico T16

Astilla

Hidrolato T17

Presurizado T18

F. aeróbico T19

F. anaeróbico T20

Syzygium aromaticum L

Hoja

Hidrolato T21

Presurizado T22

F. aeróbico T23

F. anaeróbico T24

Semilla

Hidrolato T25

Presurizado T26

F. aeróbico T27

F. anaeróbico T28

Origanum vulgare L. Parte aérea

Hidrolato T29

Presurizado T30

F. aeróbico T31

F. anaeróbico T32

Tradescantia spathacea Swartz

Hojas

Hidrolato T33

Presurizado T34

F. aeróbico T35

F. anaeróbico T36

Testigo Absoluto PDA T37

Testigo Mineral Polisulfuro de calcio

T38

El efecto inhibitorio se cuantificó mediante el crecimiento cada 24 horas del

diámetro del micelio del patógeno, midiendo para ello el crecimiento presentado

por el hongo dentro de cada placa petri, durante 12 días. También se cuantificó

la producción de esporas, para ello se realizó un raspado superficial del hongo,

y se realizó un lavado de este raspado con agua y se empleó la dilución

apropiada hasta lograr contarlas en la cámara de Neubauer y se empleó la

siguiente fórmula para determinar el número de esporas por mililitro:

No esporas/ml = No. esporas contadas * dilución * 2500.

La unidad experimental fue constituida por una caja de petri y los tratamientos

fueron distribuidos en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones.

Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, a los datos

obtenidos se realizó un análisis de varianza y la prueba de comparación de

medias de Tukey al 5%.

56

Determinación de la concentración mínima inhibitoria

Los extractos que presentaron inhibición total del crecimiento y desarrollo del

patógeno, se utilizaron para los ensayos correspondientes a la etapa en la

que se determinó la concentración mínima inhibitoria; estos productos fueron

evaluados a concentraciones del 40, 30, 20 y 10%.

Se preparó el medio de cultivo con PDA al cual se añadió cada uno de los

extractos a las concentraciones a estudiar, posteriormente se realizó la

inoculación del patógeno.

Como variable indicadora del efecto inhibitorio se midió cada 24 horas el

diámetro de crecimiento del micelio del patógeno durante 12 días también se

cuantificó la producción de esporas mediante el uso de la cámara de conteo de

esporas Neubauer, tal como se describió anteriormente.

Los tratamientos fueron distribuidos en un diseño completamente al azar con

cinco repeticiones cada uno; la unidad experimental consistió de una caja de

petri. En todas las pruebas se incluyó un testigo absoluto y uno químico (i.a.

polisulfuro de calcio). Para determinar los efectos de los tratamientos

estudiados, a los datos obtenidos se les practicó un análisis de varianza y la

prueba de comparación de Tukey al 5%.

3.4.3.2. Método de discos de papel. Con el fin de poder tener un control de

tipo químico, para la realización de las pruebas mediante el Método de discos

de papel se probaron seis productos de síntesis química, con reportes de

actividad sobre hongos algunos de ellos con reporte sobre el género Monilia y

otros sobre la especie roreri. Los productos probados fueron los siguientes:

57

PRODUCTO COMERCIAL INGREDIENTE ACTIVO DOSIS DEL FABRICANTE

Ziram granuflo® Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn 76% 5 g/L

Tamis® Carbamida 21% 5 mL/L

Eco 720® Clorotalonil 54% 5 mL/L

Barrida® Clorotalonil 72% 5 g/L

Ridomil gold Bravo 76.5 PH®

Clorotalonil + Metalaxil 1.5 g/L

Ranman® Cyanoimidazole 1 mL/L

El método de discos de papel es una prueba cualitativa, en la cual se usaron

cajas de petri de 100 mm con medio PDA donde se realizó la siembra en el

centro de cada caja de un disco del hongo previamente cultivado en medio

PDA y con un tiempo de incubación de 8 días; a una distancia de 3 cm del

disco con hongo se colocaron los discos de celulosa de grosor 9 mm y 7 mm

de diámetro previamente impregnados con cada uno de los extractos, por caja

petri se colocaron las cuatro formas de extracción por cada planta y un testigo

químico. Se dejó en incubación en sala de cultivo bajo condiciones controladas

de 23°C +/- 2°C y se realizó la lectura de los halos de inhibición que se

presentaron en torno a los discos de papel que contenían las muestras. Se

utilizaron cuatro repeticiones por tratamiento. El testigo químico fue Ziram® con

i.a. ditiocarbamato de Zn.

Para el caso de las pruebas para determinación del control químico se usaron

discos de papel Whatman No. 2 de 7 mm de diámetro y cajas petri de 50 mm.

3.4.3.3. Método de disco de papel Kirby-Bauer: Se preparó el medio de

cultivo PDA y se mantuvo en baño María a 45°C, se inoculó la solución

homogeneizada del hongo M. roreri y se vertió 15 mL en placas petri de 100

mm. Una vez solidificado el medio, se colocaron discos de celulosa de grosor 9

mm y de 7 mm de diámetro impregnados con los extractos sobre el medio a un

radio de 30 mm del centro de la caja, posteriormente se incubó a 23°C.

Después de 24 horas de incubación cada placa fue examinada. El testigo

químico fue Ziram® con i.a. ditiocarbamato de Zn.

58

Para el desarrollo del método de disco de papel Kirby-Bauer también se

realizaron pruebas para la determinación del control químico, para este caso se

usaron discos de papel Whatman No. 2 de 7 mm de diámetro y cajas petri de

50 mm.

Para la interpretación de los resultados respecto a la actividad del extracto

(propuesto por Monks et al., (2002)), se establecen las siguientes categorías

interpretativas para los diámetros de las zonas de inhibición:

(-) No hay actividad

(+) Actividad leve o débil (diámetro entre 7 -11 mm)

(++) Actividad moderada (diámetro entre 11-16mm)

(+++) Actividad fuerte (diámetro mayor a 16 mm)

3.4.3.4. Determinación del medio para la formación y germinación de

conidias de monilia. Para determinar el mejor medio para la germinación de

conidias de M. roreri, se evaluaron tres medios de cultivo: agua destilada

estéril, agua destilada estéril con sucrosa al 2% y agua destilada estéril con

extracto de cacao. Para su realización se emplearon tubos de ensayo en los

cuales se agregaron los medios correspondientes y se esterilizaron, una vez

fríos en cámara de flujo laminar se agregó tween 80 al 0,01% y se realizó el

raspado del hongo de una placa de petri de 60 mm (de 12 días de crecimiento),

para cada uno de los tubos. Cada una de estas soluciones se llevaron a

dilución de 1x10-2, para realizar la lectura del número de conidias totales y el

número de conidias germinadas en el microscopio en la cámara Neubauer,

realizando lecturas a las 12, 24, 48 y 72 horas.

3.4.3.5. Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de

conidias de M. roreri. Para este propósito se preparó una solución madre que

contenía 80 mL de agua destilada estéril y 20 mL de extracto de cacao, se

tomaron conidias jóvenes de M. roreri previamente cultivadas en seis placas

petri en medio agar-extracto de cacao- jugo V8 de 12 días de edad, las cuales

fueron raspadas y lavadas con una parte de la solución madre a la cual se le

agregó tween 80 al 0,01% y su contenido agregado a la solución madre, la cual

59

se homogenizó con un ayuda de agitador magnético por una hora. Una parte

se agregó en cuatro tubos de ensayo a los cuales previamente se les había

vertido la concentración correspondiente al tratamiento a evaluar y otra parte a

otros cuatro tubos con agua destilada que correspondieron al testigo absoluto.

Los tubos de ensayo que contenían estas suspensiones fueron incubados a

25ºC en oscuridad y cada 24 horas se realizó diluciones de 1x10-2 para poder

hacer la lectura en el microscopio con la ayuda de una cámara de Neubauer y

contabilizar el número de esporas totales y las germinadas de las 12, 24, 48, 72

y 96 horas.

Variables:

Las variables que se evaluaron fueron: número de conidias totales y número de

conidias germinadas, empleando para su cálculo las siguientes fórmulas:

Conidias totales = No. Conidias totales *2500*Dilución.

Conidias germinadas = No. Conidias germinadas *2500*Dilución.

Tratamientos:

Los tratamientos evaluados fueron seis, hidrolatos de canela corteza al 50%,

clavo semilla al 50% y pimienta semilla al 50%, polisulfuro de calcio 50%, Ziram

i.a. ditiocarbamato de zinc al 5 mg/mL y un testigo absoluto consistente en

agua destilada.

Diseño Experimental:

Se empleó un diseño experimental completamente al azar con seis

tratamientos. Cada tratamiento tuvo cuatro repeticiones y en cada repetición se

realizaron tres lecturas. La unidad experimental fue un tubo de ensayo. Para

determinar si existieron diferencias significativas en cada uno de los

tratamientos se realizó el análisis de varianza y se aplicó la prueba de

comparaciones de medias de Tukey al nivel de significancia de 5%, cuando

existió diferencia significativa. Los datos fueron procesados en el programa

SPSS versión 13.0 para Windows.

60

3.4.4. Trabajo en condiciones de campo

La fase 2 de la investigación comprendió tres ensayos en condiciones de

campo, los ensayos se realizaron en el periodo de noviembre de 2008 a

diciembre de 2009. Ensayo 1, consistente en la determinación del ciclo de la

enfermedad, y los Ensayos 2 y 3 destinados a evaluar el efecto de los extractos

vegetales sobre la incidencia de M. roreri en cacao; los tres ensayos se

realizaron sobre una plantación monoclonal (clon UNACH 130) de cacao,

ubicada a 14° 52’ 33.4’’ de latitud norte y 92° 21’ 28.8’’ de longitud oeste, a una

altitud de 47 m, en el municipio de Tapachula, estado de Chiapas, México.

El clon registra las siguientes características:

PARAMETROS Clon UNACH 130

Cacao real del soconusco

Rendimiento 6 kg/planta/año

Mazorcas por kilo 18

Semillas por Kilo 732

Peso promedio por grano 1,37 g

% de Testa 12,5 %

Contenido de grasa 50,5 %

pH 5,53

Semillas

Largo 2,22 cm

Ancho 1,32 cm

Diámetro 0,83 cm

3.4.4.1. Determinación del ciclo de la enfermedad. Para la realización de

este ensayo se obtuvieron frutos de cacao por polinización artificial; los cuales

fueron inoculados con M. roreri a diferentes edades de desarrollo de los frutos

(1, 2, 3, 4 y 5 meses de edad después de la polinización), determinando sobre

ellos los días en que se presentaron los síntomas y signos de la enfermedad.

Se realizó la polinización manual de flores de cacao recién abiertas, con la

finalidad de tener frutos de la misma edad. Inmediatamente después de la

polinización, se protegieron las flores con frascos de plástico, para asegurar

que los frutos fueran producto de la polinización manual y no de la natural.

Permitiendo así asegurar la misma edad de todos los frutos y que no hubiera

infección alguna por M. roreri, antes de la inoculación manual. A los ocho días

61

de la polinización se retiraron los frascos de plástico y se procedió a realizar el

embolsado de cada uno de los frutos, con bolsas de polietileno, esto para evitar

que los frutos se contaminaran con esporas del medio ambiente.

Se preparó el inoculo (conidias) de M. roreri a partir de mazorcas provenientes

del campo en estado de mancha, éstas se lavaron, desinfectaron por 10

minutos en una solución de hipoclorito de calcio al 10% y se colocaron a

esporular en una cámara húmeda ubicada en el laboratorio. Una vez que la

mazorca esporuló y las conidias alcanzaron la madurez (coloración crema),

éstas se colectaron por gravedad en cajas de Petri colocadas en la base de la

cámara (Merchán, 1991).

Para determinar la concentración de inóculo presente en una aguja de

disección, se realizaron 10 conteos, disolviendo las conidias adheridas a la

punta de una aguja de disección en 200 ml de agua destilada con 2 gotas de

Tween 80 al 0,1% esta solución se llevó a agitación por un tiempo aproximado

de 10 minutos. En la cámara de Neubauer se determinó la concentración

promedio de esta solución.

Se realizó la inoculación de M. roreri en frutos de uno, dos, tres, cuatro y cinco

meses de edad; utilizando conidias secas adheridas a la punta de una aguja de

disección (9 x 104 conidias/mL), las cuales se depositaron en una zona de dos

centímetros cuadrados de la zona previamente marcada con esmalte y

humedecida con agua estéril. Posterior a la inoculación los chilillos fueron

protegidos en una cámara húmeda constituida por una bolsa de polietileno y

una toalla de papel empapada con agua estéril, con el propósito de humedecer

el ambiente interno y favorecer la germinación de las esporas; la toalla de papel

se retiró dos días después cortando uno de los extremos de la bolsa y con

ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se marcó para facilitar el

seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la aparición de los síntomas

iniciales y finales en el ensayo (Adaptado de la metodología de Merchán,

1981).

62

Variables cuantificadas:

Fueron síntomas, signos e índice de severidad interna, la toma de datos se

realizó todos los días a partir del primer mes de inoculación, hasta que terminó

el ensayo.

Síntomas. Son manifestaciones visibles; éstas resultan de la interacción

entre los mecanismos del ataque del patógeno y los mecanismos de

defensa del hospedante y de los efectos fisiológicos de la enfermedad

(Arauz, 1998). Para el caso de M. roreri se cuantificó la presencia y días

en que aparecieron gibas, manchas mosaico, decoloración y mancha

aceitosa.

Signos. Manifestaciones del patógeno discernibles a simple vista; entre

los signos comúnmente asociados a una enfermedad, están las

estructuras reproductoras o vegetativas del hongo (Arauz, 1998). Se

cuantificó la presencia y los días en que su manifestaron tanto el Inicio

de la esporulación (esporas - polvo blanco) y las esporas maduras

(polvo color crema).

Índice de severidad interna. A los seis meses de edad todos los frutos

fueron cosechados, se abrieron longitudinalmente, agrupado según cada

mes de inoculación y se evaluó el daño ocasionado en el interior de los

frutos, por M. roreri. Para determinar la severidad interna de los frutos se

utilizó la escala propuesta por Sánchez et al., (1987), donde mide el

porcentaje de área necrosada desarrollada por M. roreri, así: grado 0=

0%; 1=1-20%; 2= 21-40%; 3= 41-60%; 4= 61-80%; 5=100%. Esta

variable muestra la capacidad de daño interno que puede causar el

hongo en la mazorca afectando los granos.

La unidad de muestreo fueron 10 frutos inoculados con M. roreri por

cada mes de edad de los frutos, donde cada fruto fue una repetición, es

un ensayo de tipo descriptivo.

63

3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación. Para

desarrollar este ensayo se realizó la polinización artificial de las flores del clon

UNACH 130, con la finalidad de obtener frutos de la misma edad y sin

incidencia de monilia, para lo cual se tomaron flores abiertas y se les quitaron

los pétalos y se unieron sus anteras con el estigma de la flor también abierta

que estaba en el árbol, luego se colocó un dispositivo plástico para aislar la flor

y se esperó a su desarrollo; posteriormente se preparó el inoculo de M. roreri

según la metodología descrita por Merchán, (1991).

Sobre frutos de una edad cercana a los 70 días se realizó la aspersión de cada

uno de los extractos y del polisulfuro de calcio y se cubrieron con una bolsa de

polietileno y se colocó una toalla húmeda por espacio de tres días, luego se

destapó y se realizó la inoculación de M. roreri, utilizando conidias secas

adheridas a punta de una aguja de disección (9 x 104 conidias/mL), las cuales

se depositaron en una zona de dos centímetros cuadrados de la zona

previamente marcada con esmalte y humedecida con agua estéril. Posterior a

la inoculación los chilillos fueron protegidos en una cámara húmeda constituida

por una bolsa de polietileno y una toalla de papel empapada con agua estéril,

con el propósito de humedecer el ambiente interno y favorecer la germinación

de las esporas; la toalla de papel se retiró dos días después cortando uno de

los extremos de la bolsa y con ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se

marcó para facilitar el seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la

aparición de los síntomas iniciales y finales en el ensayo.

A otro grupo de frutos se realizó la inoculación de M. roreri con la metodología

ya descrita y un día después se realizó la aspersión de los tratamientos

manteniendo la cámara húmeda.

Tratamientos:

Se probaran los extractos de clavo, canela y pimienta en forma de hidrolatos,

así como el polisulfuro de calcio, tanto antes como después de la inoculación

del hongo, y se incluyó un testigo sin inocular y uno inoculado con M. roreri.

64

Descripción de Tratamientos Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación

Tratamiento Dosis Aplicación antes inoculación

Clavo semilla hidrolato 20%

Canela corteza hidrolato 30%

Pimienta semilla hidrolato 30%

Polisulfuro de calcio 10%

Aplicación después inoculación

Clavo semilla hidrolato 20%

Canela corteza hidrolato 30%

Pimienta semilla hidrolato 30%


Testigo sin inoculación (aplicación solo agua)

Testigo inoculado

Evaluación: Para finalizar el ensayo, 80 días después de la inoculación, se

realizó un muestreo destructivo de las mazorcas de cada tratamiento con el

propósito de medir las variables incidencia, severidad externa (SE) y severidad

interna (SI).

Incidencia: porcentaje de frutos enfermos en relación al total de frutos

inoculados.

Severidad externa: esta basada en la apariencia externa del fruto y los

signos del patógeno, utilizando la escala: grado 0=fruto sano, 1= jiba;

2=mosaico; 3= mancha (necrosis); 4= micelio hasta un 25% de la mancha;

5= micelio en más del 25% de la mancha (Adaptado de Brenes, 2003). Esta

variable mide el nivel de daño externo causado por el hongo y su habilidad

para producir propágalos.

Severidad interna: basada en el porcentaje de necrosis interna observada

en el fruto cuando este cortado longitudinalmente y medido con relación a la

escala desarrollada por Sánchez, et al., 1982. Donde: grado 0= cero área

necrosada; 1=1-20% del área necrosada; 2= 21-40% área necrosada; 3=

41-60% área necrosada; 4= 61-80% área necrosada; 5=100% área

necrosada. Esta variable muestra la capacidad de daño interno que puede

causar el hongo en la mazorca afectando los granos.

65

Diseño experimental:

Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y 10

repeticiones, siendo la unidad experimental un fruto para un total de 40 frutos

para el ensayo.

Análisis estadístico:

Los datos de Índice de severidad interna (ISI) y de Índice de severidad externa

(ISE) fueron transformados mediante la fórmula (valor+0,5)1/2. Para determinar

si existieron diferencias significativas en cada uno de los tratamientos se realizó

el análisis de varianza y se aplicó la prueba de comparación de medias de

Tukey al nivel de significancia de 5%, cuando existió diferencia significativa.

Los datos fueron procesados en el programa SAS para Windows 9.0.

3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en

árboles de cacao.

Acondicionamiento del sitio Experimental: Para el acondicionamiento de los

árboles del Clon UNACH 130 correspondientes al área de estudio se llevaron a

cabo las siguientes labores; limpia, poda, eliminación de frutos enfermos por

moniliasis y otras enfermedades, y trazado de la parcela experimental.

Aplicación de extractos: Cada uno de los extractos fue mezclado con agua

para completar el volumen correspondiente. Las aplicaciones se realizaron

cada 15 días con aspersora manual a todos los árboles de cada una de las

parcelas, en las horas de la mañana.

Tratamientos: Se probaron los extractos seleccionados de la fase 1, hidrolatos

de: clavo, canela y pimienta y el polisulfuro de calcio, los cuales se aplicaron

mediante aspersiones quincenales con el uso de bombas de aspersión de

capacidad de un galón destinadas exclusivamente para esta prueba, además

se incluyó un testigo con manejo cultural y un testigo absoluto al cual no se le

realizó ningún manejo con el fin de apreciar el comportamiento natural de la

66

enfermedad en el lote de ensayo. Los tratamientos y sus dosis se describen a

continuación:

Tratamiento Dosis

Clavo hidrolato 20%

Canela hidrolato 30%

Pimienta hidrolato 30%


Testigo manejo cultural (eliminación semanal de frutos enfermos)

Testigo absoluto

Diseño experimental:

Se utilizó un diseño completamente al azar con cinco repeticiones por

tratamiento y seis tratamientos. La unidad experimental fue de seis árboles

para un total de 30 árboles.

Evaluación

Las variables dependientes se cuantificaron cada 15 días, determinadas a

partir de cada uno de los árboles de cada tratamiento; las variables fueron:

Incidencia de la enfermedad

Para cuantificar esta variable se evaluaron:

Número de chilillos sanos

Número de chilillos enfermos por M. roreri

Número de mazorcas sanas

Número de mazorcas enfermas por M. roreri

Utilizando la fórmula:

% Incidencia= ------------------------------------- Número de frutos enfermos

Número total de frutos

X 100

67

Severidad externa. Se contabilizó tanto en chilillos como en mazorcas

la apariencia externa del fruto y los signos del patógeno, utilizando la

escala: grado 0= fruto sano, 1= giba; 2= mosaico; 3= mancha

(necrosis); 4= micelio hasta un 25% de la mancha; 5= micelio en más

del 25% de la mancha. Esta variable mide el nivel de daño externo

causado por el hongo y su habilidad para producir propágalos.

Severidad interna. Está basada en el porcentaje de necrosis interna

observada en el fruto cuando este se corta longitudinalmente y medido

con relación a la escala desarrollada por Sánchez et al., 1982.

Producción. Para determinar la producción de cacao se determinó

cada ocho días el número y peso total de los frutos sanos cosechados,

así como el peso seco de los granos.

Análisis estadístico:

Los datos obtenidos de incidencia se transformaron mediante la fórmula

arcoseno (porcentaje/100)1/2 y los de ISI e ISE mediante la fórmula (valor

+0,5)1/2; se les realizó un análisis de varianza y prueba de comparación de

medias de Tukey al 5%. Los datos fueron procesados en el programa SAS para

Windows 9.0.

3.4.5. Caracterización fitoquímica de los extractos

El análisis de la caracterización y contenidos de compuestos presentes en los

extractos se realizó mediante cromatografía de gases acoplado a

espectrometría de masas (GC-MS), se realizó en el Laboratorio Nacional de

Prevención y Control del Dopaje-CONADE - México.

Para el estudio de GC-MS se utilizó un Cromatógrafo de Gases (modelo 6890

N) acoplado a un Espectrómetro de Masas (Modelo 5973N) ambos de marca

Agilent Technologies, fabricado en China; equipado con un puerto de inyección

68

slip/splitless (12:1). Columna Agilent 19091A-002, Methyl Siloxane, capilar, con

las siguientes características: largo 25,0 m, diámetro 200,0 µm con un tamaño

de partícula de 0,11 µm, gas de arrastre, Helio, con flujo inicial de 1 mL/min y

luego flujo constante. Volumen de inyección 1 µL. Temperatura inicial 60°C, a

temperatura final de 325°C, Tiempo de corrido 114.67 min.

Para la identificación de los compuestos se compararon con la base de datos

NIST MS 2.0.

Para el hidrolato de clavo se sometió a análisis con cloroformo, diclometano y

metanol y para el hidrolato de canela con éter de petróleo y cloroformo. Una

vez realizado el análisis de Espectrometría de Masas (MS), y considerando la

abundancia de picos entre los solventes de cada hidrolato, se realizó el análisis

GC-MS para el caso del hidrolato de clavo con cloroformo y para canela con

éter de petróleo.

69

CAPÍTULO 4.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

70

CAPÍTULO 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1. Fase 1. Trabajo en condiciones de laboratorio

4.1.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar

Montaje de ensayo al 50% de concentración.

En un primer ensayo se probaron los 36 extractos; los resultados obtenidos con

respecto al efecto de los tratamientos sobre el crecimiento del hongo se

muestran en las Figuras 2 y 3.

Con respecto a la hoja de canela las formas de extracción más efectivas

fueron: hidrolato, presurizado y fermentación aeróbica, ya que inhibieron

totalmente el crecimiento del patógeno, mientras que la fermentación

anaeróbica la redujo en un 77,2% con respecto al testigo absoluto que presentó

el mayor crecimiento con 50 mm, mientras que con la corteza de canela solo el

hidrolato inhibió completamente el crecimiento.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Canela Hoja Canela Asti Pimienta Hoja Pimienta sem TESTIGOABS TESTQUIM

Hidrolato

Presurizado

F.aerobica

F.anaeob

C

R

E

C

I

M

I

E

N

T

O

(mm)

TRATAMIENTOS

Figura 2. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre el crecimiento

de M. roreri.

71

Figura 3. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z.

officinale sobre el crecimiento de M. roreri.

Para el caso de la pimienta tanto para los extractos obtenidos a partir de la hoja

como los de la semilla, las formas de hidrolato y presurizado inhibieron

totalmente al patógeno, mientras que las fermentaciones redujeron el

crecimiento entre un 55 y un 35%.

En el clavo, los extractos elaborados a partir de las hojas que mostraron el

mejor efecto de inhibición del crecimiento de M. roreri fueron el hidrolato y el

presurizado con 100% y 58% de inhibición respectivamente; mientras que para

los preparados a partir de la semilla las cuatro formas de extracción inhibieron

totalmente el desarrollo de M. roreri. Para los extractos de maguey, orégano y

jengibre el hidrolato fue la única forma que inhibió al 100% el crecimiento del

hongo.

Estos resultados son corroborados por el análisis estadístico practicado, ya que

según éste existen diferencias altamente significativas entre tratamientos

(Anexo 3). La prueba de comparación de medias de Rango múltiple de Tukey

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Clavo Hoja Clavo sem Oregano Maguey Jengibre Testigo Abs Testigo

quim

Hidrolato

Presurizado

F.aerobica

F.anaeob

EXTRACTOS DE CLAVO, OREGANO, MAGUEY Y JENGIBRE EN EL

CRECIMIENTO DE M. roreri

C

R

E

C

I

M

I

E

N

T

O

(mm)

TRATAMIENTOS

72

(P<0,05) separó los 16 mejores tratamientos que inhibieron completamente el

crecimiento (canela hoja hidrolato, canela hoja presurizado, canela hoja

fermentación aeróbica, canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato,

pimienta hoja presurizado, pimienta semilla hoja, pimienta semilla presurizado,

clavo hoja hidrolato, clavo semilla hidrolato, clavo semilla presurizado, clavo

semilla fermentación anaeróbica, orégano hidrolato, maguey hidrolato, jengibre

hidrolato) de otro grupo de extractos que permitieron cierta inhibición del hongo

y un tercer grupo que permitió el crecimiento total del patógeno como fueron el

maguey en fermentaciones aeróbica y anaeróbica, así como el testigo absoluto

(Anexo 4).

Con respecto a la producción de conidias es interesante observar como todos

los extractos obtenidos de las hojas y corteza de canela, así como los

procedentes de la pimienta y orégano inhibieron la cantidad de conidias entre

un 98,6 y un 70,64%, a pesar que, como se vio anteriormente, se presentó

formación de micelio, es decir que los extractos muestran actividad

antiesporulante (Figuras 4 y 5). Sin embargo las fermentaciones aeróbica y

anaeróbica de extractos a partir de clavo hoja, maguey y la anaeróbica de

jengibre estimularon la formación de las conidias entre un 18 y un 10%.

El Análisis de varianza indica diferencias altamente significativas entre los

tratamientos, tal como se aprecia en el Anexo 5. La Prueba de Rango múltiple

de Tukey (P<0,05), registra como las cuatro formas de extracción de canela

hoja hidrolato, canela hoja presurizado, canela hoja fermentación aeróbica,

canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato, pimienta hoja presurizado,

pimienta semilla hoja, pimienta semilla presurizado, clavo hoja hidrolato, clavo

semilla hidrolato, clavo semilla presurizado, clavo semilla fermentación

anaeróbica, orégano hidrolato, maguey hidrolato, jengibre hidrolato, canela hoja

anaeróbica, canela corteza presurizado, canela corteza fermentación

anaeróbica, pimienta semilla fermentación aeróbica y el testigo químico,

registraron diferencias con el testigo absoluto (el cual mostró el mayor valor con

34 x107 conidias/mL) y con los demás tratamientos, además del grupo de

extractos que estimularon la producción de conidias (fermentaciones de: clavo

73

hoja anaeróbica, jengibre anaeróbica, maguey anaeróbica, clavo hoja aeróbica,

maguey aeróbica) (Anexo 6).

0

5

10

15

20

25

30

35

Hidrolato

Presurizado

F.aerobica

F.anaeob

C

O

N

I

D

I

A

S

(mL)

X 107

TRATAMIENTOS

Figura 4. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre la formación de conidias de M. roreri.

Figura 5. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z.

officinale sobre la formación de conidias de M. roreri.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Clavo Hoja Clavo sem Oregano Maguey Jengibre Testigo Abs Testigo

quim

Hidrolato

Presurizado

F.aerobica

F.anaeob

C

O

N

I

D

I

A

S

(mL)

X 107

TRATAMIENTOS

74

Los extractos de hoja de canela (hidrolato, presurizado, fermentación aeróbica),

corteza de canela (hidrolato), pimienta hoja (hidrolato y presurizado), pimienta

semilla (hidrolato y presurizado), clavo semilla (hidrolato, presurizado,

fermentación aeróbica y fermentación anaeróbica), y los hidrolato de orégano

maguey y jengibre que presentaron el mejor efecto regulador sobre M. roreri

pasaron a la siguiente prueba con el fin de determinarles la concentración

mínima inhibitoria.

4.1.1.1. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI).

Tal como se aprecia en las figuras 6 y 7, los hidrolatos elaborados a partir de

hojas de canela y de pimienta registraron las CMI más bajas (20% V/V),

seguido por el hidrolato de la canela corteza y la semilla de pimienta con 30% ,

La CMI de los presurizados elaborados con hojas de canela y semilla de

pimienta fue de 40%, mientras que el presurizado procedente de hojas de

pimienta y el fermentado aeróbico de hojas de canela, aún al 40%, presentaron

crecimiento del hongo, lo que indica que su CMI es del 50%.

Figura 6. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C. zeylanicum sobre el crecimiento de M. roreri.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Canela hoja

hidrol

Canela hoja

Presu

Canela hoja

F. ae

Canela astilla

Hidrol

Testigo abs Testigo quim

40

30

20

10

C

R

E

C

I

M

I

E

N

T

O

(mm)

TRATAMIENTOS

75

Figura 7. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P. dioica sobre el crecimiento de M. roreri.

Los anteriores resultados son corroborados con el análisis estadístico

practicado, ya que según este existen diferencias altamente significativas entre

tratamientos (Anexo 7). La Prueba de comparación de medias de Rango

múltiple de Tukey (P<0,05) (Anexo 8), agrupa a las concentraciones que

inhibieron completamente el crecimiento del patógeno (40, 30 y 20% de canela

hoja hidrolato, la de 40% del extracto de canela hoja presurizado, las de 40 y

30% de canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato 40, 30 y 20%, pimienta

semilla hidrolato al 40 y 30% y pimienta semilla presurizado al 40% y el testigo

químico) del resto de tratamientos incluido el testigo absoluto, siendo estas

concentraciones las que evidencian la CMI para cada extracto.

Con respecto a las extractos de clavo, en la figura 8 se puede apreciar como

para los extractos del botón floral en forma de hidrolato y presurizado a las

concentraciones de 40, 30 y 20% inhibieron completamente el crecimiento

siendo la CMI la de 20%, mientras que para el fermentado aeróbico la CMI fue

del 30% y la de la fermentación anaeróbica requiere del 40% para ser efectiva.

Con respecto a la hoja de clavo en forma de hidrolato en las cuatro

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Pim hoja

hidrol

Pim hoja pres Pim sem

hidro

Pim semilla

presu


40

30

20

10

C

R

E

C

I

M

I

E

N

T

O

(mm)

TRATAMIENTOS

76

concentraciones evaluadas permitió el desarrollo del hongo, por lo que su CMI

es del 50%.

En la figura 9 se muestran los resultados del comportamiento de los hidrolatos

de orégano, maguey y jengibre frente al crecimiento de M. roreri, en el cual se

aprecia como para el caso del jengibre éste a concentraciones del 40 y 30%

inhibe completamente el desarrollo del hongo, siendo la concentración más

baja la considerada como su CMI; mientras que para el orégano y el maguey

se presentó crecimiento en las cuatro concentraciones evaluadas, por lo que su

CMI es del 50%.

Figura 8. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S. aromaticum

sobre el crecimiento de M. roreri.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Clavo hoja

hidrol

Clavo sem

Hidrol

Clavo sem

pres

Clavo sem

F. aer

Clavo sem

F. anae

Testigo abs Testigo

quim

40

30

20

10

C

R

E

C

I

M

I

E

N

T

O

(mm)

TRATAMIENTOS

77

Figura 9. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O. vulgare, T.

spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri. El análisis estadístico practicado, corrobora lo anteriormente mencionado ya

que según éste existe diferencias altamente significativas entre tratamientos

(Anexo 9). La Prueba de comparación de medias de Rango múltiple de Tukey

(P<0.05), señala que los tratamientos que inhibieron completamente el

crecimiento del patógeno muestran diferencias estadísticas con los demás

tratamientos, sin embargo es de resaltar que todas las concentraciones al 10%

y los hidrolatos de maguey y jengibre al 20% no registraron diferencias con el

testigo absoluto, pero si con los demás tratamientos (Anexo 10).

La siguiente variable evaluada fue la producción de conidias, para los

extractos obtenidos de canela los resultados se muestran en la figura 10,

siendo interesante resaltar que para todas las concentraciones evaluadas la

cantidad de conidias fue inferior al testigo absoluto, el cual registró el valor más

alto con 40 x 107 conidias/mL, la CMI siguen siendo las mismas que para el

crecimiento micelial.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Oregano hidrol Maguey hidrol Jengibre hidrol Testigo abs Testigo quim

40

30

20

10

C

R

E

C

I

M

I

E

N

T

O

(mm)

TRATAMIENTOS

78

Figura 10. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C. zeylanicum

sobre la producción de conidias de M. roreri.

Figura 11. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P. dioica sobre

la producción de conidias de M. roreri.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Canela hoja

hidrol

Canela hoja

Presu

Canela hoja

F. ae

Canela astilla

Hidrol


40

30

20

10

C

O

N

I

D

I

A

S

(mL)

X 107

TRATAMIENTOS

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Pim hoja

hidrol

Pim hoja pres Pim sem

hidro

Pim semilla

presu


40

30

20

10

C

O

N

I

D

I

A

S

(mL)

X 107

TRATAMIENTOS

79

Con respecto a los extractos obtenidos de pimienta ninguna concentración de

los cuatro extractos obtenidos de esta planta mostraron efecto de estimulación

en la producción de conidias, al contrario el hidrolato de la semilla registró al

20% una de las cantidades mas bajas de conidias/mL, aún a pesar que registro

crecimiento micelial, al igual que el presurizado de hoja, sin embargo la CMI

siguen siendo las mismas descritas para el crecimiento (Figura 11).

El análisis estadístico practicado, corrobora lo anteriormente mencionado ya



(P<0,05), señala que las concentraciones de 40, 30 y 20% de los hidrolatos de

canela hoja y pimienta hoja; las de 40 y 30% de los hidrolatos de canela

corteza y pimienta semilla y la de 40% de los presurizados de canela hoja y

pimienta semilla, presentaron inhibición total y no mostraron diferencias

estadísticas con pimienta semilla hidrolato 20%, pimienta hoja presurizado

40%, canela hoja presurizado 30% y canela hoja hidrolato 10%, pero si con los

demás tratamientos y todos los tratamientos mostraron diferencias con el

testigo absoluto (Anexo 12).

Los resultados de las CMI del clavo, se aprecian en la figura 12, en la cual se

muestra como el clavo semilla en hidrolato a concentraciones del 40, 30 y 20%

al no registrar crecimiento tampoco mostraron producción de conidias, sin

embargo al 10% presentó formación de conidias siendo un 92.75% más bajo

que el testigo absoluto. Con respecto al clavo botón floral presurizado es un

caso similar al anterior, sin embargo al 10% la reducción en la producción de

conidias fue del 75%; siendo estas dos CMI las más bajas en todos los

tratamientos. La CMI del clavo botón floral en fermentación aeróbica fue del

20%, la de la fermentación anaeróbica al 40% y el hidrolato elaborado de hojas

de canela presentó tanto crecimiento como formación de conidias a las cuatro

concentraciones evaluadas, siendo la del 50% considerada como su CMI.

El análisis estadístico practicado, corrobora lo anteriormente mencionado ya



80

(P<0,05), señala que las concentraciones de 40, 30 y 20% del hidrolato y del

presurizado de clavo, las concentraciones de 40 y 30% del hidrolato de jengibre

y el fermentado anaeróbico de clavo, así como el fermentado anaeróbico al

40%, presentaron inhibición total y mostraron diferencias estadísticas con los

demás tratamientos y todos los tratamientos mostraron diferencias con el

testigo absoluto que fue el tratamiento que registro la mayor cantidad de

conidias (Anexo 14).

Todas las concentraciones de los hidrolatos de orégano, maguey y jengibre

inhibieron la producción de conidias tal como se aprecia en la figura 13, es de

destacar que para el caso del jengibre en las concentraciones de 40 y 30% al

no permitir el crecimiento tampoco presentó formación de conidias, y en las

concentración de 20 y 10% a pesar que creció igual que el testigo absoluto

inhibió en 28,4 y 30,9% respectivamente la producción de estas estructuras.

Para el orégano es interesante como a pesar que mostró crecimiento en todas

las cuatro concentraciones inhibió la formación de conidias entre un 94,15 y

un 35,3% con respecto al testigo absoluto, situación similar sucedió con el

maguey donde los porcentajes de inhibición estuvieron entre un 92,85 – 24,5%.

Figura 12. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S. aromaticum

sobre la producción de conidias de M. roreri.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Clavo hoja

hidrol

Clavo sem

Hidrol

Clavo sem

pres

Clavo sem

F. aer

Clavo sem

F. anae

Testigo abs Testigo

quim

40

30

20

10

C

O

N

I

D

I

A

S

(mL)

X 107

TRATAMIENTOS

81

Figura 13. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O. vulgare, T.

spathacea y Z. officinale sobre la producción de conidias de M. roreri.

Dados los resultados obtenidos, el hidrolato de orégano tiene efecto regulador

de M. roreri, sumándose a los reportes de actividad antibacterial y antioxidante,

así como de tener efecto como un preservativo natural de alimentos (Hersch-

Martínez, et al., 2005; Kulisic, et al., 2004; Nostro et al., 2004). Además, según

Önder et al., (2005) posee propiedades insecticidas sobre B. tabaci y acaricidas

en T. urticae. Para el caso del hidrolato de T. spathacea, muestra un efecto

antiesporulante, resultados que se suman a investigaciones realizadas en

diversas partes del mundo, en las que se han reportado 33 diferentes

actividades biológicas de esta planta, dentro de las que destacan actividades

antivirales, antinflamatorias, antimicrobianas (efecto controlador de infecciones

gastrointestinales causados por Salmonella enteritidis y Shigella flexneri),

bactericidas, fungicidas y últimamente anticancerígenas. Los estudios químicos

de T. spathacea desarrollados por González-Ávila (2003) y Domínguez (2002)

demostraron que esta planta posee compuestos con estructura de tipo

flavónico o flavonoides cuyas propiedades tienen efecto de inhibición en la

formación de tumores, así como que los extractos polares del grupo de las

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Oregano hidrol Maguey hidrol Jengibre hidrol Testigo abs Testigo quim

40

30

20

10

C

O

N

I

D

I

A

S

(mL)

X 107

TRATAMIENTOS

82

cumarinas tienen efecto bactericida sobre Echerichia coli, Salmonella enteritidis

y Shigella flexneri.

Estos resultados coinciden con lo obtenido por Roblero (2003) y Ramírez

(2008), quienes determinaron el efecto inhibitorio de la pimienta sobre P.

palmivora. Por su parte, Ramos et al., (2003), menciona que el aceite esencial

de hojas de pimienta es el eugenol y Kikuzaki et al., (1999) menciona que las

semillas de pimienta contienen entre otros compuestos el eugenol. De acuerdo

con Busquet, et al., (2005) este compuesto ejerce efecto regulador de

microorganismos.

Con respecto a la respuesta presentada por el clavo se aprecia que la hoja y

semilla, en diferentes grados, ejerce efecto reductor del crecimiento y

desarrollo del patógeno, estos resultados concuerdan con Rodríguez (1996),

quien reporta como en condiciones in Vitro el extracto de clavo inhibió

completamente el crecimiento de Colletotrichum sp, aislado de Passiflora

mollissima, así como con Moreira et al., (2005) quienes determinaron que el

clavo ejerce acción bactericida y bacteriostática sobre E. coli. Ponce et al.,

(2003), encontraron en sus investigaciones que el aceite de clavo presenta

actividad antimicrobial y que puede ser usado como agente natural

desinfectante en poscosecha de vegetales.

Nychas (1995) citado por Moreira et al., (2005) reporta como el aceite esencial

de clavo ejerce efecto inhibitorio sobre bacterias y mohos y que los medios por

los cuales estos microorganismos son inhibidos parece que involucra diferentes

modos de acción. Los resultados reportados por Busquet et al., (2005),

sugieren que el aceite extraído de brotes de clavo puede inhibir la peptidolisis

de bacterias ruminales ya que encontraron gran cantidad de N peptídico en los

ensayos realizados in Vitro. Los componentes fenólicos presentes en los

aceites esenciales se conoce que poseen actividad antimicrobial y algunos son

clasificados como sustancias seguras. Dichos compuestos fenólicos de aceites

sensibilizan la bicapafosfolipídica de la membrana de las células, causando un

incremento de la permeabilidad y escape de constituyentes intracelulares

83

vitales o dañando el sistema enzimático bacterial (Singh, Bhunia, & Stroshine

(2002), citados por Moreira et al., (2005).

Estos resultados encontrados para jengibre, coinciden con los reportados por

Nguefack (2004), quien determinó el efecto inhibitorio de Zingiber officinale

sobre aislamientos de tres hongos procedentes de alimentos (Fusarium

moniliforme, Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus), extractos que al igual

fueron obtenidos por destilación y que mostraron inhibición en el crecimiento y

formación de conidias de los tres hongos pero a concentraciones superiores

que la de otras plantas como el Thymus vulgaris, datos similares a los

reportados por Sacchetti et al., (2005), quienes estudiaron el efecto

antimicrobial de 11 plantas sobre levaduras presentes en los alimentos

(Candida albicans, Rhodotorula glutinis, Schizosaccharomyces pombe,

Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lypolitica), los resultados reportados para

el jengibre indican efecto inhibidor de su aceite pero a concentraciones altas,

además referencian que la presencia de fenilpropaniodes en el jengibre podría

ser el compuesto que le de propiedades de control sobre dichas levaduras.

4.1.2. Evaluación de extractos sobre M. roreri mediante el método de

discos de papel.

4.1.2.1. Determinación de un control químico

Para la realización de esta prueba se ensayaron dos dosis una a 20 µL y otra a

50 µL.

Los efectos de los productos de síntesis química sobre el hongo M. roreri,

mostraron efecto negativo para la gran mayoría de ellos, tan solo para el caso

del Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn ®a las dos dosis evaluadas mostró halos

de inhibición, siendo mayor para la dosis de 50 µL con 5,5 mm, mientras que

para la de 20 µL fue de 4 mm. Estadísticamente el análisis de varianza muestra

diferencias altamente significativas (Anexo 15) y la prueba de Tukey muestra

como las dos dosis del compuesto Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn tienen

diferencias con los demás (Anexo 16).

84

Los resultados de la prueba de los extractos de las seis plantas evaluadas

sobre el crecimiento del hongo M. roreri muestran como el orégano, maguey,

jengibre, hoja de pimienta, hoja de clavo y sus cuatro formas de extracción no

mostraron halos de inhibición, mientras que otro grupo conformado por canela

corteza en presurizado, canela hoja en presurizado y fermentado anaeróbico,

clavo botón floral en presurizado, fermentados aeróbico y anaeróbico y el

hidrolato de la semilla de pimenta mostraron actividad moderada con halos de

inhibición que van de 7 a 14,5 mm y el grupo que mostró actividad fuerte es el

conformado por los hidrolatos de corteza y hoja de canela y los botones florales

de clavo, así como el fermentado aeróbico de hojas de canela y el testigo

químico (i.a. Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn), con un rango de 16 a 22,5 mm.

El análisis de varianza muestra diferencias altamente significativas entre los

tratamientos tal como se aprecia en el Anexo 17; los resultados de la prueba de

Tukey se presentan en el Anexo 18, donde el grupo extractos de hidrolatos de

hoja de canela y los botones florales de clavo, así como el fermentado aeróbico

de hojas de canela y el testigo químico muestran diferencias con los demás

extractos, con halos de inhibición de 22,5; 22,5; 21,5 y 22 mm respectivamente,

seguido por el hidrolato de canela corteza con 16 mm, el cual también muestra

diferencia con los demás extractos.

4.1.3. Evaluación de los extractos sobre M. roreri mediante el método de

discos de papel Kirby-Bauer

4.1.3.1. Determinación de un control químico. Para el desarrollo de esta

prueba se probaron dos dosis (20 y 50 µL), a diferencia del método de discos

de papel, en éste se aprecia toda la gama de efectos; según la escala dada por

Monks et al. (2002); el producto Ranman® fue el único que dio negativo,

mientras que los productos Eco 720®, Barrida®, Tamis® y Ridomil® a las dos

dosis evaluadas tuvieron un efecto de actividad débil (< 11 mm), así como el

Ziram® a dosis de 20 µL, mientras que a dosis de 50 µL su actividad se

clasifica como moderada ya que presentó un halo de inhibición de 14 mm.

85

El análisis de varianza practicado reporta diferencias altamente significativas

entre los productos (Anexo 19), la prueba de Tukey corrobora lo anterior ya que

el Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn a dosis de 50 µL muestra diferencias

estadísticas con los demás tratamientos (Anexo 20).

El efecto mostrado por los extractos sobre el hongo M. roreri mediante el

método de Disco de papel Kirby-Bauer, dejan ver como a comparación del

método anterior donde 11 extractos mostraron halos de inhibición, para el caso

de esta metodología tan solo tres lo hicieron y con dimensiones menores,

inclusive las presentadas por el testigo químico. Los extractos que dieron

positivo a esta prueba fueron los hidrolatos de semilla de pimienta, botones

florales de clavo y corteza de canela, con 8, 9 y 15,5 mm, respectivamente,

mientras que el testigo químico registró 16 mm; los promedios de los halos de

inhibición de los tratamientos se pueden apreciar en el Anexo 22.

El análisis de varianza mostró diferencias entre los tratamientos, tal como se

aprecia en el Anexo 21; la prueba de Tukey se muestra en el Anexo 22, siendo

el hidrolato de canela corteza y el testigo químico los tratamientos que

mostraron el mayor halo de inhibición y que presentan diferencias estadísticas

con los demás tratamientos, seguido por el hidrolato de los botones florales de

clavo y luego por el hidrolato elaborado a partir de semilla de pimienta, los

cuales entre si muestran diferencias y con los demás tratamientos, los cuales

no mostraron halos de inhibición.

En el Cuadro 2 se muestra una comparación de resultados de los tres métodos

evaluados (difusión en agar, discos de papel modificado y el de Kirby-Bauer),

para determinar la efectividad de los extractos sobre el hongo M. roreri, así

como de los productos químicos de síntesis evaluados con el fin de determinar

el control químico a emplear para las pruebas mediante los métodos de discos

de papel. Se puede apreciar como tan solo para tres extractos como fueron los

hidrolatos elaborados a partir de corteza de canela, botones florales de clavo y

semilla de pimienta muestran efectos en las tres pruebas, ya que algunos como

los extractos elaborados de hojas de canela mostraron efecto en el método de

86

dilución y en los discos de papel modificado mientras que para el método de

Kirby Bauer no, situación similar se ve con los extractos elaborados de botones

florales de clavo en presurizado y en fermentados aeróbico y anaeróbico.

Otro grupo de extractos como el presurizado de semilla de pimienta, hidrolato

de hoja de clavo y los hidrolato de orégano, maguey y jengibre, solo mostraron

actividad en el método de difusión en agar, pero a altas concentraciones.

Cuadro 2. Comparación de tres Métodos de evaluación de la efectividad reguladora de extractos de plantas y productos de síntesis química sobre el crecimiento de M. roreri.

EXTRACTO

METODO DILUCION

METODOS DE DISCOS DE PAPEL Grados de inhibición

50% CMI Kirby-Bauer modificado DISCOS DE PAPEL

Canela hoja hidrolato I 20 - +++

Canela hoja presurizado I 40 - +

Canela hoja F. Aeróbico I 50 - +++

Canela hoja F. Anaeróbico C 50 - ++

Canela corteza hidrolato I 30 + + ++

Canela corteza presurizado C - +

Canela corteza F. Aeróbico C - -

Canela corteza F. Anaeróbico C - -

Pimienta hoja hidrolato I 20 - -

Pimienta hoja presurizado I 50 - -

Pimienta hoja F. Aeróbico C - -

Pimienta hoja F. Anaeróbico C - -

Pimienta semilla hidrolato I 30 + ++

Pimienta semilla presurizado I 40 -

Pimienta semilla F. Aeróbico C - -

Pimienta semilla F. Anaeróbico C - -

Clavo hoja hidrolato I 50 - -

Clavo hoja presurizado C - -

Clavo hoja F. Aeróbico C - -

Clavo hoja F. Anaeróbico C - -

Clavo flor hidrolato I 20 + +++

Clavo flor presurizado I 20 - ++

Clavo flor F. Aeróbico I 30 - +

Clavo flor F. Anaeróbico I 40 - ++

Orégano hidrolato I 50 - -

Orégano presurizado C - -

Orégano F. Aeróbico C - -

Orégano F. Anaeróbico C - -

Maguey hidrolato I 50 - -

Maguey presurizado C - -

Maguey F. Aeróbico C - -

87

Maguey F. Anaeróbico C - -

Jengibre hidrolato I 30 - -

Jengibre presurizado C - -

Jengibre F. Aeróbico C - -

Jengibre F. Anaeróbico C - -

QUIMICOS

Barrida (clorotalonil 72%) 5g/L C + -

Ziram (ditiocarbamato de Zn) 5 g/L I + + +

Ranman 1mL/L C - -

Tamis (carbamida 54%) 5 mL/L I + -

Eco 720 (Clorotalonil 54%) 5 mL/L C + -

Ridomil (clorotalonil +) 1.5 g/L C + -

C = Crecimiento del patógeno I= Inhibición del crecimiento + Inhibición leve ++ Moderada +++ Fuerte

Teniendo en cuenta las pruebas anteriores se considera que los extractos que

tienen mayor potencial para el control de M. roreri para ser evaluado en

condiciones de campo son los hidrolatos elaborados a partir de la corteza de la

canela, los botones florales de clavo y de las semillas de pimienta.

4.1.4. Determinación del medio para la germinación de conidias de

monilia.

El efecto de los medios con sucrosa al 2%, extractos de cacao y agua sobre la

cantidad de conidias de M. roreri muestran como desde las 12 horas hasta las

72 el medio que contenía el extracto de cacao mostró la mayor cantidad de

conidias, seguido del medio con sucrosa al 2%. Es evidente la alta

especificidad de M. roreri por los nutrientes presentes en el cacao para su

multiplicación ya que desde las 12 horas de evaluación la cantidad de conidias

fue un 79% mayor que el tratamiento con agua destilada, mientras que con el

medio con sucrosa fue del 31%, porcentajes que aumentaron al pasar las horas

con 377,2%, 291,18% y 86,6%, para las 24, 48 y 72 horas respectivamente.

El análisis de varianza realizado registra diferencias altamente significativas

entre los tratamientos a las diferentes horas evaluadas (Anexo 23). En el

Cuadro 3, se corrobora lo anteriormente expuesto, donde el medio con extracto

de cacao registró diferencias estadísticas con referencia a los otros dos

medios; el medio con sucrosa al 2% también mostró diferencias con el medio

con agua destilada en todas las horas evaluadas.

88

Cuadro 3. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey

del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre

la cantidad de conidias totales de M. roreri.

Tratamiento

12 horas Conidias/mL

x106

Tukey*


x106

Tukey*


x106

Tukey*

72 horas

Conidias/mL

x106

Tukey*

Testigo agua

3,17 C 2,07 C 5,22 C 9,05 C

Sucrosa 4,18 B 3,89 B 11,2 B 13,52 B

Cacao 5,69 A 9,88 A 15,2 A 16,89 A

*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes

La cantidad de conidias germinadas de M. roreri en presencia de los tres

medios evaluados muestra un comportamiento similar al efecto en la cantidad

de conidias, es decir que el mayor número se registró en el medio con extracto

de cacao, seguido por el que contenía sucrosa al 2%; los porcentajes de

conidias germinadas del medio con extracto de cacao fueron del 87,1%,

158,62%, 14,88% y 24,1% a las 12, 24, 48 y 72 horas respectivamente.

El análisis de varianza indica diferencias altamente significativas entre los

tratamientos (Anexo 24), y la prueba de Rango múltiple de Tukey se muestra

en el Cuadro 4, indicando la existencia de diferencias del tratamiento de

extracto de cacao con los otros dos medios y el que contenía sucrosa al 2%

también registró diferencias con el Testigo con agua para todas las horas

evaluadas.


del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre

la cantidad de conidias germinadas de M. roreri.

Tratamiento


x106

Tukey*


x106

Tukey*


x106

Tukey*

72 horas

Conidias/mL

x106

Tukey*

Testigo agua

0,481 C 0,290 C 0,853 C 1,684 C

Sucrosa 0,556 B 0,406 B 0,102 B 2,043 B

Cacao 0,900 A 0,750 A 0,127 A 2,090 A


89

4.1.5 Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de


El efecto de los tratamientos sobre la formación de conidias se puede ver en la

Figura 14. Se aprecia como el testigo absoluto presentó las mayores

cantidades de conidias en el transcurso de las horas de evaluación, con valores

entre 115,69 y 98,88 X 106 conidias/mL., mientras que desde las 12 horas de

evaluación los hidrolatos de canela y pimienta y el polisulfuro de calcio

presentaron los valores más bajos de conidias de M. roreri, disminuyendo los

valores en el transcurso de las horas de evaluación; el hidrolato de la corteza

de canela fue el tratamiento que presentó el valor más bajo con 11,89 X 106

conidias/mL (valor registrado a las 96 horas de evaluación), es decir inhibió un

88% la formación de conidias en relación al testigo absoluto; siendo estos tres

tratamientos más efectivos que el testigo químico (Bis- dimetil ditiocarbamato

de Zn) empleado, el cual logró un 23,45% de inhibición en relación al testigo

absoluto a las 96 horas.

Este testigo químico mostró un comportamiento intermedio entre el registrado

por el testigo (extracto de cacao) y el hidrolato de clavo con el grupo de los

otros tres tratamientos (hidrolatos de canela y pimienta y polisulfuro de calcio)

que inhibieron en mayor grado la formación de conidias, datos que corroboran

las pruebas efectuadas en los tres métodos desarrollados en medio sólido

(difusión en agar, disco de papel y disco de papel Kirby-Bauer), al inhibir la

formación de estas estructuras reproductivas.

90

HORAS

0

20

40

60

80

100

120

140

12 24 48 72 96

Clavo semillaHidrolato

Pimienta semillaHidrolato

Canela cortezaHidrolato

Ziram

Polisulfuro decalcio

Testigo absoluto

c

o

n

i

d

i

as

X106

Figura 14. Efecto de los tratamientos sobre la formación de conidias de M. roreri.

El análisis de varianza efectuado registró diferencias altamente significativas

entre los tratamientos (Anexo 25) y la prueba de Rango múltiple de Tukey

realizada para los tratamientos sobre la cantidad de conidias muestra

diferencias entre todos los tratamientos en las diferentes horas evaluadas,

siendo el hidrolato elaborado a partir de la corteza de la canela el que registró

los menores valores y que presentó diferencia con los demás tratamientos,

mostrándose su efecto sobre la reducción en la formación de conidias de M.

roreri (Anexo 26).

91

HORAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

12 24 48 72 96

Clavo semilla Hidrolato

Pimienta semilla Hidrolato

Canela corteza Hidrolato

Testigo químico

Polisulfuro de calcio

Testigo absoluto

Conidias

Germinadas

X106

Figura 15. Efecto de los tratamientos sobre la germinación de


El efecto de los tratamientos sobre la germinación de conidias se puede ver en

la Figura 15. Se aprecia como el testigo absoluto presentó las mayores

cantidades de conidias germinadas en el transcurso de las horas de

evaluación, con valores entre 46,52 y 26,52 X 106 conidias/mL., mientras que

desde las 12 horas de evaluación los hidrolatos de canela y pimienta y el

polisulfuro de calcio presentaron los valores más bajos de conidias germinadas

de M. roreri, disminuyendo los valores en el transcurso de las horas de

evaluación; el polisulfuro de calcio fue el tratamiento que registró en el

trascurso de las horas de evaluación los valores más bajos de conidias

germinadas (0,41 a 3,19 X 106 conidias/mL), seguido por el testigo químico

(Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn) y el hidrolato de la corteza de canela; a las

96 horas de evaluación el tratamiento que inhibió el mayor porcentaje de

conidias germinadas fue el químico con el 96,87%, seguido por el polisulfuro de

calcio con el 93,21%, la corteza de canela con el 92,53%,el clavo con el

89,02% y el que inhibió en menor grado la germinación fue el hidrolato de

pimienta con 59,84%.

92

El análisis de varianza efectuado registró diferencias altamente significativas

entre los tratamientos (Anexo 27) y la prueba de Rango múltiple de Tukey

realizada para los tratamientos sobre la cantidad de conidias germinadas

muestra diferencias entre todos los tratamientos en las diferentes horas

evaluadas, siendo el polisulfuro de calcio y los hidrolatos elaborados a partir de

clavo y de pimienta los tratamientos que a las 12 horas de evaluación

mostraron los menores valores y que presentaron diferencias estadísticas con

el testigo absoluto y con los demás tratamientos; sin embargo a las 96 horas de

evaluación los tratamientos de corteza de canela, clavo, el polisulfuro de calcio

y el testigo químico (Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn) registraron los valores

más bajos de germinación de conidias los cuales entre si no presentaron

diferencias estadísticas, pero si con los demás tratamientos incluido el testigo

absoluto que fue el que registró el valor más alto de conidias germinadas de M.

roreri (Anexo 28).

Estos resultados muestran que los hidrolatos de canela, clavo y pimienta

presentan compuestos que ejercen una acción directa sobre la germinación de

conidias de M. roreri, lo cual evidencia un alto potencial de estos extractos en el

manejo de éste patógeno a nivel de campo, ya que este efecto sobre la

germinación de las conidias es de vital importancia en la reducción de la

infección del hongo en los frutos, ya que como señalan Phillips Mora y

Wilkinson (2007), las esporas son los únicos propágulos infecciosos de M.

roreri, y el hongo requiere germinar sobre la superficie del fruto para poder

realizar la infección e iniciar con ello su proceso invasivo, de manera que, al

inhibir la germinación de las conidias, los eventos de infección serán reducidos

y las probabilidades de infección y desarrollo de la enfermedad serán menores.

4.2. Fase 2. Trabajo en condiciones de campo

4.2.1. Determinación del ciclo de la enfermedad

4.2.1.1. Síntomas y signos de la moniliasis en frutos inoculados con M. roreri.

93

En el Cuadro 5 se muestra el promedio de días en que fueron visibles los

síntomas y signos ocasionados por la inoculación con M. roreri sobre frutos de

cacao de uno a cinco meses de edad. Se aprecia que los primeros estados de

desarrollo del fruto son más susceptibles a la infección y al desarrollo de

síntomas y signos del patógeno, mientras que a edades de cuatro y cinco

meses es menor.

Las gibas (que son deformaciones o protuberancias) fue el primer síntoma

visible en frutos entre uno y dos meses de edad, deformaciones que fueron

visibles de los 40±18 a los 46±12 días después de la inoculación. En frutos de

edad mayor, no se presentó este síntoma.

La decoloración del fruto fue el siguiente síntoma visible, el cual se manifestó

en frutos de dos meses de edad hasta los cinco meses. El período de aparición

de este síntoma es en promedio de 62±6 días en frutos de dos meses, que se

reduce conforme aumenta la edad, terminando en 30 días en frutos de cinco

meses de edad.

Cuadro 5. Tiempo de aparición de síntomas y signos en frutos de cacao

inoculados con M. roreri

Edad de

frutos

(Mes)

Días a aparición de síntomas y signos

Gibas Mosaico Decoloración Mancha

aceitosa

Inicio de

esporulación

Esporas

maduras

1 40±18 - - 63±8 80±20 91±27

2 46±12 - 62±6 73±13 82±17 86±16

3 - - 60±3 75±10 83±9 87±6

4 - - 42±11 - - -

5 - - 30 - - -

La aparición de mancha aceitosa, se observó únicamente en frutos que son

infectados de uno a tres meses de edad; esta mancha aparece en promedio a

los 63±8 días después de la inoculación en frutos de un mes de edad, y el

período se alarga a 73±13 para frutos de dos meses y a 75±10 para los de tres

meses. En frutos a edad mayor a tres meses este síntoma no se presentó.

94

En esta investigación el síntoma de mosaico no se manifestó a ninguna edad

de los frutos. Es probable que este síntoma haya sido enmascarado por el color

natural que presentan los frutos del clon utilizado, los cuales son de un rojo

intenso.

Los frutos que se inocularon a la edad de tres meses, no presentaron la

formación de deformaciones o gibas, en éstos el primer síntoma visible fue la

decoloración de los frutos que ocurrió 60±3 días, posterior a este síntoma se

observó a los 75±10 días en promedio la aparición de manchas aceitosas.

La formación de estroma esporulante solo fue observado en frutos infectados a

la edad de uno a tres meses, en los cuales el inicio de la esporulación del

hongo fue cuantificado de los 80±20 a los 83±9 días después de la infección,

concluyendo con la maduración de las esporas a los 91±27, 86±16 y 87±6 días.

Se observa que frutos con edad mayor a los tres meses infectados por el

hongo, no alcanzan a desarrollar tejido esporulante.

El ciclo completo de la enfermedad se pudo observar en frutos inoculados de

uno a tres meses de edad; aunque en frutos de tres meses no se presentaron

deformaciones; pero al término del ensayo todos desarrollaron tejido

esporulante.

En frutos de cuatro a cinco meses edad, el único síntoma visible fue la

decoloración del tejido, manifestándose a los 42±11 días en frutos de cuatro

meses y 30 días en frutos de cinco meses. Estos frutos no alcanzaron a formar

tejido esporulante. En la Figura 16 se presentan los síntomas y signos

presentes en frutos de cacao infectados con M. roreri.

4.2.1.2. Porcentaje de la ocurrencia de síntomas y signos desarrollados

por la inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao.

Como se puede apreciar en el Cuadro 6, el porcentaje de presencia de cada

síntoma varía según la edad del fruto. La aparición de deformaciones o gibas,

95

alcanza el 77,8% de frutos de un mes de edad mientras que para los frutos de

dos meses el porcentaje se reduce al 40%.

Cuadro 6. Porcentaje de ocurrencia de síntomas y signos desarrollados por la

inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao.

Edad de los frutos (Mes)

Porcentaje de síntomas y signos

% de daño interno Gibas

1 Decoloración

2 Mancha

3

Inicio de esporulación

4

Esporas maduras

5

1 77.8 0 100 100 100 100

2 40 80 100 80 80 100

3 0 83.3 100 100 83.3 100

4 0 70 0 0 0 50

5 0 20 0 0 0 0

La decoloración de los frutos alcanza valores de 80 y 83% en frutos de dos y

tres meses de edad, y se reduce conforme la edad del fruto se incrementa,

hasta llegar al 20% en frutos de cinco meses. Mientras que la aparición de

manchas, se presenta en el 100% de frutos infectados de uno a tres meses de

edad; y en la formación de tejido esporulante, el valor fluctúa entre el 80 y el

100 % de los frutos de uno a tres meses de edad.

Figura 16. Síntomas y signos presentes en frutos de cacao infectados con Moniliophthora roreri.

96

4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

El daño interno ocasionado por las inoculaciones de M. roreri es expresado en

Índice de Severidad Interna (ISI), en el Cuadro 7, se puede apreciar que los

frutos de uno, dos y tres meses de edad al ser infectados con el hongo M.

roreri, presentan la mayor afectación con un ISI 5, el cual indica una necrosis

del 80 al 100% del fruto, por lo que las semillas no pueden ser aprovechadas.

El nivel de daño interno en el fruto se reduce a medida que éste se acerca a su

madurez ya que se observó que en frutos de cuatro meses de edad, el 10% de

los frutos presentaron ISI de 3 y el 40% con ISI de 5; en frutos de cinco meses

de edad, a pesar de que se observa un 20% de frutos con decoloración, hacia

el interior del fruto no causa ningún daño, permitiendo aprovechar el 100% de

los granos.

Cuadro 7. Índice de severidad interna en frutos inoculados con M. roreri.

Edad de los frutos (Meses)

Índice de severidad interna (%)

0 (Fruto sano)

1 (1-20%)

2 (21-40%)

3 (41-60%)

4 (61-80%)

5 (81-100%)

1 0 0 0 0 0 100

2 0 0 0 0 0 100

3 0 0 0 0 0 100

4 50 0 0 10 0 40

5 100 0 0 0 0 0

Los resultados obtenidos en esta investigación muestran que M. roreri presentó

la habilidad de desarrollar infección en todas los estados de desarrollo de los

frutos infectados, alcanzando una alta incidencia de la enfermedad, lo que

denota una alta capacidad de infección de este patógeno, esto explica la

gravedad del daño que M. roreri ocasiona en las regiones donde está presente

y el efecto devastador que puede tener en las cosechas de cacao (Aranzazu;

Enríquez et al., 1982; Krauss y Soberanis, 2001). Es probable que este

comportamiento corresponda a la alta especialización que M. roreri ha

alcanzado como producto de su largo proceso de coevolución con sus

hospederos.

97

La forma y secuencia como se presentan los síntomas de la moniliasis,

observados en esta investigación, son concordantes con la descripción

realizada por diversos investigadores (FHIA, 2003; Krauss et al., 2006;

Aranzazu, Martínez y Martínez, 2009) en los que se reporta que los frutos

jóvenes hasta de tres meses de edad, son los más susceptibles; y en estos el

patógeno logra desarrollar completamente su ciclo hasta la formación de

estroma esporulante.

En cuanto al período que dura cada síntoma en manifestarse, se observa que

en condiciones de Tapachula y en el clon estudiado, el número de días en que

estos síntomas son visibles en frutos infectados con M. roreri es mayor a los

reportados por los citados autores; ellos reportan que la formación de

protuberancias y algunos puntos aislados, observables ocurre entre 30±10

días, la presencia de la mancha ocurre a los 60±10 días y la formación del

micelio o estroma con formación de esporas ocurre entre los 60±70 días

después de la infección. En frutos mayores de tres meses, los citados autores

describen que el síntoma inicial corresponde a puntos acuosos, inicialmente

aislados y luego concéntricos que se observan entre los 30±10 días; la mancha

aparece a los 60±10 días y la esporulación entre los 60 a 70 días. Esta

variación en el tiempo de expresión de los síntomas y signos podría estar

evidenciando la influencia del componente genético del clon estudiado así

como el efecto ambiental.

En Honduras, según reporta la FHIA (2003) el hongo M. roreri manifiesta un

largo período de incubación, es decir desde que infecta al fruto hasta que se

observa algún síntoma externo. Este tiempo puede ser de tres a ocho

semanas, el cual varía según la edad del fruto, la severidad del ataque, la

susceptibilidad del árbol y las condiciones ambientales. En frutos tiernos, en

días lluviosos y calurosos, el período de incubación se acorta a tres semanas.

En los frutos adultos (mayores de tres meses) el síntoma más común de la

moniliasis es una mancha de color café, que puede extenderse hasta cubrir

todo el fruto.

98

El conocimiento de la forma y período en que ocurren los síntomas y signos

que provoca la moniliasis en frutos infectados, obtenidos en esta investigación

permiten comprender la importancia que tiene la edad del fruto al momento de

la infección y que indican que el período más importante para la

implementación de estrategias de protección de los frutos, ya sea por la

aplicación del control químico convencional, el biocontrol o aspersiones de

biofungicidas. Estos tratamientos deben de intensificarse durante los primeros

cuatro meses de edad de los frutos de cacao. Es en esta etapa en la que hay

que poner mayor énfasis en el manejo de las plantaciones y en la protección de

los frutos, ya que esto permitirá alcanzar una mayor cantidad de frutos sanos.

En la Figura 17 se presenta el ciclo de la enfermedad en condiciones de

Tapachula, Chiapas- México.

Figura 17. Ciclo de M. roreri sobre clon UNACH 130, en condiciones de Tapachula, Chiapas - México.

99

4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación.

4.2.2.1. Incidencia de M. roreri.

En la Figura 18 se muestran los resultados de los tratamientos en relación al

porcentaje de incidencia de la enfermedad sobre los frutos de cacao, en la cual

se aprecia como con la aplicación de los extractos antes de la inoculación con

M. roreri el mejor efecto se presentó con el hidrolato de pimienta ya que tan

solo mostró el 25% de incidencia de la enfermedad en los frutos, seguido del

hidrolato de canela con el 28% y el valor más alto lo registró el hidrolato de

clavo con el 44,4%, valor que coincide con su aplicación después de la

inoculación, mientras que los valores tanto para el hidrolato de canela como el

de pimienta aplicados después de la inoculación con M. roreri aumentaron

registrando valores del 50 y 75% respectivamente, mostrando un efecto más

antiesporulante que fungicida; el polisulfuro de calcio mostró el mejor efecto ya

que tanto con su aplicación antes y después de la inoculación no permitió la

infección del patógeno mostrando un efecto fungistático y fungicida.

Según el análisis de varianza practicado existen diferencia entre los

tratamientos (Anexos 29 y 30) y la prueba de Tukey indica que el testigo

inoculado muestra diferencias con los demás tratamientos, los extractos de

clavo aplicado antes y después, así como los extractos de canela y pimienta

aplicados antes de la inoculación registraron diferencias con los demás

tratamientos, mientras que el polisulfuro de calcio aplicado tanto antes como

después fue el único producto que no registro diferencias con el testigo sin

inocular ya que no permitieron la infección ni avance de la enfermedad.

100

0

20

40

60

80

100

120

A ClavSH20%

A CanAH30%

A PimSH30%

APolisul

Ca

D ClavSH20%

D CanAH30%

D PimSH30%

DPolisul

Ca

Test sinIn

Test In

%

INCIDENCIA

TRATAMIENTOS

Figura 18. Efecto de extractos vegetales sobre la Incidencia de M. roreri en cacao por inoculación artificial. 4.2.2.2. Severidad externa ocasionada por la inoculación de M. roreri.

El efecto de la aplicación de los extractos vegetales y el polisulfuro de calcio

sobre la severidad externa se aprecia en la Figura 20, en la cual se muestra

como mientras en el testigo inoculado el 100% de los frutos presentó gibas y un

12,5% presentó además mancha aceitosa, los tratamientos con la aplicación de

los extractos antes de la inoculación registraron entre un 86 y 72% de frutos sin

síntomas externos, y entre un 44,5 y un 100% de frutos sin síntomas en la

cuando se aplicaron éstos después de la inoculación, siendo el hidrolato de

pimienta el único que no registró sintomatología externa. La presencia de

manchas se apreció en los extractos de clavo y canela aplicados antes de la

inoculación y de gibas con el extracto de pimienta, mientras que con el

hidrolato de canela aplicado después de la inoculación se presentaron gibas,

mosaico y mancha aceitosa y con el extracto de clavo gibas y se registró el

único caso con fruto esporulado. El único tratamiento que no mostró síntomas

tanto con su aplicación antes como después fue el polisulfuro de calcio.

101

0

20

40

60

80

100

120

A ClavSH20%

A CanAH30%

A PimSH30%

APolisul

Ca

D ClavSH20%

D CanAH30%

D PimSH30%

DPolisul

Ca

Test sinIn

Test In

Esporul

Inicio espor

Mancha

Mosaico

Jibas

Sano

TRATAMIENTOS

%

FRUTOS

INDICE

Figura 20. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral

sobre la severidad externa producida por M. roreri en frutos de cacao

por inoculación artificial.

Estos tratamientos mostraron diferencias estadísticas entre ellos según el

análisis de varianza practicado (Anexo 31) y la prueba de Rango múltiple de

Tukey (Cuadro 8) indica que el testigo inoculado tiene diferencias con los

demás tratamientos al presentar éste el mayor valor (0,7), los tratamientos de

clavo y canela aplicados antes y después de la inoculación y el de pimienta

aplicado antes formaron otro grupo, los cuales registraron valores de ISE de

0,6 a 0,2; teniendo diferencias estadísticas con los demás tratamientos los

cuales no mostraron síntomas de la enfermedad por lo que presentaron ISE

con valor de 0.

102


del Índice de Severidad Externa del efecto de los hidrolatos de clavo,

canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

4.2.2.3. Severidad interna ocasionada por la inoculación de M. roreri.

La severidad interna mostrada por los tratamientos evaluados se aprecia en la

Figura 21 y Cuadro 10, siendo los extractos aplicados antes de la inoculación

los que registraron los valores más bajos de daños internos, con el 57, 71 y

75% de frutos sin daño interno para los hidrolatos de clavo, canela y pimienta

respectivamente, mientras que para la aplicación después de la inoculación los

valores bajan a 55, 50 y 25%, sin embargo es de aclarar que para el caso del

Índice 1, éste se registró por apreciarse daño, pero permaneció solo en la

cáscara sin afectar los granos. El único tratamiento que no registró daños ni

antes ni después de inoculado el hongo fue el polisulfuro de calcio, mientras

que en el testigo inoculado se pudieron apreciar los niveles de daño del 1 al 4,

y tan solo en el clavo y pimienta aplicados después de la inoculación se

presentó el nivel más alto de daño.

Estos datos indican que los extractos presentan dos tipos de acciones: la

principal es de tipo preventivo ya que al aplicarse antes de la inoculación de las

esporas de M. roreri en el fruto, las probabilidades de desarrollar infección

fueron de un 42% con el hidrolato de clavo, 28,6% para el hidrolato de canela,

15% para el hidrolato de pimienta y de 0% para el polisulfuro de calcio, frente al

100% del testigo inoculado. Sin embargo también tienen cierta acción curativa

es decir, aún con la inoculación del patógeno en los frutos de cacao los

Tratamiento N ISE Tukey*

Testigo inoculado 10 0,7 A

Clavo hidrolato Antes 10 0,6 AB

Canela hidrolato Después 10 0,3 AB

Clavo hidrolato Después 10 0,3 AB

Canela hidrolato Antes 10 0,3 AB

Pimienta hidrolato Antes 10 0,2 AB

Pimienta hidrolato Después 10 0 B

Polisulfuro de calcio Antes 10 0 B

Polisulfuro de calcio Antes 10 0 B

Testigo sin inocular 10 0 B

103

extractos permitieron el desarrollo de frutos sin infección, con valores de frutos

sanos de 25% para el hidrolato de pimienta, 55,55% para el hidrolato de clavo,

66,7% en el hidrolato de canela, y del 100% para el polisulfuro de calcio, frente

a cero frutos sanos en el testigo inoculado.

0

20

40

60

80

100

120

A ClavSH20%

A CanAH30%

A PimSH30%

A PolisulCa

D ClavSH20%

D CanAH30%

D PimSH30%

D PolisulCa

Test sinIn

Test In

5

4

3

2

1

0

TRATAMIENTOS

%

FRUTOS

INDICE


sobre la severidad interna producida por M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial.

El ANOVA realizado para el Índice de Severidad Interno (Anexo 32), indica la

existencia de diferencias estadísticas entre los tratamientos, y la prueba de

Rango múltiple de Tukey (Cuadro 9) indica que el Testigo inoculado tiene

diferencias con los demás tratamientos, con un ISI de 1,8 que según la escala

reportada por Phillips-Mora, 2005 es un material catalogado como

Moderadamente resistente, mientras los valores de ISI más bajos los

registraron los hidrolatos aplicados antes de la inoculación de M. roreri siendo

el hidrolato de pimienta el valor más bajo con 0,1, registrando diferencias con el

104

de canela con ISI de 0,45 y el de clavo con 0,5, y éstos registraron diferencias

con los aplicados después de la inoculación del patógeno, por lo que se

evidencia que el momento de la aplicación de los hidrolatos es determinante en

la maximización del buen efecto que puede ejercer en el control de M. roreri.

Sin embargo se aprecia que con la aplicación de los hidrolatos sea antes o

después de la inoculación y considerando los ISI registrados por éstos, este

material se comportaría como resistente ya que Phillips-Mora, 2005, cataloga a

los materiales como resistentes si su ISI está entre 0 y 1,25; de 1,26 a 2,5

como moderadamente resistentes.

Es de resaltar que el Polisulfuro de calcio fue el único tratamiento que aplicado

tanto antes como después de la inoculación con M. roreri, registró un ISI de 0,

por lo que éste no registró diferencias estadísticas el testigo sin inocular, pero

sí con los demás tratamientos, estos resultados son concordantes con las

pruebas realizadas en condiciones in vitro en las cuales éste tratamiento

registro los valores más bajos de inhibición en la germinación de conidias, así

como en su formación, seguido por los tratamientos de los hidrolatos de canela

y clavo.

Cuadro 9. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del Índice de Severidad Interna del efecto de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

Tratamiento N ISI Tukey*

Testigo inoculado 10 1,8 A

Pimienta hidrolato Después 10 1,15 AB

Canela hidrolato Después 10 0,95 ABC

Clavo hidrolato Después 10 0,8 ABCD

Clavo hidrolato Antes 10 0,5 BCD

Canela hidrolato Antes 10 0,45 BCD

Pimienta hidrolato Antes 10 0,1 CD

Polisulfuro de calcio Antes 10 0 D

Polisulfuro de calcio Después 10 0 D

Testigo sin inocular 10 0 D

105

4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles

de cacao

4.2.3.1. Incidencia de la enfermedad.

En la Figura 22 se aprecia el comportamiento de incidencia de M. roreri sobre

frutos de cacao en estado chilillos en una plantación comercial en el trascurso

de 58 semanas, en la cual se aprecia como en el testigo absoluto es decir

aquel que muestra la afección natural del patógeno en la plantación se

registraron los valores más altos, registrando hacia la semana 40 un máximo

de 70% de chilillos enfermos, mientras que todos los tratamientos donde se

aplicaron los extractos vegetales y el polisulfuro de calcio mostraron valores

mucho más bajos, mostrando afectación en las primeras ocho semanas, con

valores que no superaron el 7% de chilillos enfermos.

Las semanas posteriores mostraron la eficiencia de los tratamientos ya que la

incidencia fue de cero, con excepción de la semana 9, en la que el hidrolato de

la semilla de clavo registró el 6,6% de chilillos afectados por M. roreri y durante

las semanas 23, 27 y 29 donde el hidrolato de la semilla de pimienta registró

valores inferiores al 1% de incidencia de la enfermedad en frutos en estado de

chilillo, situación positiva y de gran repercusión en el manejo de la enfermedad

ya que los chilillos que es el estado en donde mayores pérdidas puede

ocasionar el patógeno, ya que daña completamente los frutos y con ello la

producción se ha visto protegida por los tratamientos empleados, pudiendo

asegurar un buen control de la enfermedad y con ello una mayor producción.

El comportamiento de los tratamientos sobre la incidencia de la moniliasis del

cacao sobre mazorcas se puede apreciar en la Figura 23, siendo el testigo

absoluto el que registró los valores más altos en el transcurso de las

evaluaciones, con un máximo del 87% de incidencia sobre mazorcas hacia el

final de las evaluaciones.

106

% CHILILLOS ENFERMOS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56

Clavo sem H 20%

Canela Ast H 30%

Pimien Sem H 30%

Sulfocalcico

Testigo relativo

Testigo Absoluto

SEMANAS

%

Figura 22. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta y de

polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en

chilillos de cacao.

% INCIDENCIA EN MAZORCAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56

Clavo sem H 20%

Canela Ast H 30%

Pimien Sem H 30%

Sulfocalcico

Testigo relativo

Testigo Absoluto

SEMANAS


sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre mazorcas de

cacao.

El efecto positivo de los tratamientos fue evidente ya que los valores de

incidencia de M. roreri sobre las mazorcas de cacao fue casi nulo, en el

107

transcurso de las 29 semanas de evaluación, registrándose para el hidrolato de

canela corteza en las semanas 19, 26 y 29, el 6,6; 2,2 y 9,9% de incidencia

respectivamente, mientras que para el hidrolato de clavo en las semanas 14 y

58 se registraron valores del 2 y 11% respectivamente; con respecto al

hidrolato de pimienta en las semanas 12 y 58 la incidencia sobre las mazorcas

fue del 6,6% y 4,4%, respectivamente y el polisulfuro de calcio en las semanas

con 22 con 2,5% y en el 52 con 6,6% de incidencia, siendo estos valores muy

bajos con respecto al testigo.

% INCIDENCIA EN FRUTOS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56

Clavo sem H 20%

Canela Ast H 30%

Pimien Sem H 30%

Sulfocalcico

Testigo relativo

Testigo Absoluto

SEMANAS


sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre frutos de cacao.

En la Figura 24, se muestra la incidencia total de M. roreri (suma de chilillos

con mazorcas), apreciándose una menor incidencia de la enfermedad en los

hidrolatos de canela, clavo y pimienta y el polisulfuro de calcio con respecto al

testigo, ya que mientras los extractos registraron valores máximos del 7% de

incidencia, en la semana 38, el testigo absoluto registró valores hasta del 81%

de frutos afectados por el hongo, apreciándose una significativa reducción de la

incidencia de monilia en frutos de cacao con la aplicación de los extractos

vegetales y con el polisulfuro de calcio, siendo éste último el que registró los

108

valores más bajos en el transcurso de las evaluaciones realizadas, seguido por

los hidrolatos de pimienta, canela y clavo.

En la Figura 25, se aprecia el efecto de los tratamientos sobre el promedio de

la incidencia en frutos en estado chilillo y mazorca y el total de la incidencia,

con respecto al hidrolato de canela se presentó 0% de incidencia en chilillos y

1,08% en mazorcas, para el caso del hidrolato de clavo los valores fueron de

0,08% y de 1,1%, mientras que para el hidrolato de pimienta fueron de 0,26% y

de 0,89% para la incidencia en chillos y mazorcas, respectivamente; en tanto

que el polisulfuro presentó 0,07% para chilillos y 0,46% para mazorcas.

Con respecto al promedio de la incidencia total (suma de incidencia en chilillos

y mazorcas), al practicar el Análisis de varianza se evidencia la presencia de

diferencias estadísticas entre los tratamientos (Anexo 34) y la Prueba de Tukey

(Cuadro 10) muestra que el tratamiento que presentó el mayor porcentaje de

incidencia total de la enfermedad fue el testigo absoluto con un 69,64% el cual

registró diferencias con los demás tratamientos, seguido del tratamiento con

manejo cultural (21,02%), el cual también registró diferencias con los demás, y

los tratamientos con la aplicación de los extractos de clavo, pimienta y canela

con porcentajes de 1,18; 1,15 y 1,08% respectivamente, no registraron

diferencias estadísticas entre ellos, pero si con los demás tratamientos, incluido

con el polisulfuro de calcio, que fue el que tuvo el menor valor de incidencia de

la enfermedad con 0,53% resultados que corroboran los obtenidos en el

ensayo anterior con la inoculación de frutos de cacao con M. roreri,

evidenciando así, el alto grado de efectividad de estos productos al reducir la

infección del hongo en los frutos de cacao.

109

0

10

20

30

40

50

60

70

CanelaHidrolato

ClavoHidrolato

PimientaHidrolato

Polisulfurode calcio

Testigocultural

TestigoAbsoluto

%INCIDENCIACHILILLOS

%INCIDENCIAMAZORCAS

%INCIDENCIATOTAL

%

INCIDENCIA

Figura 25. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta y de

polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en

una plantación de cacao.

Cuadro 10. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao.

Tratamiento % Incidencia

total Tukey*

% Incidencia en Chilillos

Tukey* % Incidencia en Mazorcas

Tukey*

Polisulfuro de calcio 0,5375 A 0,0763 A 0,4612 A

Canela Hidrolato 1,0841 B 0 A 1,0841 B

Pimienta Hidrolato 1,1593 B 0,2637 B 0,8956 B

Clavo Hidrolato 1,1852 B 0,0806 A 1,1046 B

Testigo cultural 21,023 C 5,2295 C 15,7939 C

Testigo Absoluto 69,641 D 19,1607 D 50,4805 D


Los valores de reducción en la afectación de M. roreri fue del 98% para los

hidrolatos y del 99% para el polisulfuro de calcio, datos que muestran mayor

efectividad que los reportados por otros autores. En Venezuela Sánchez, et al.,

110

2003 reporta que con prácticas culturales la incidencia de M. roreri fue menor al

6% y mostró la mayor producción, aunque fue igual a tratamientos con

aspersiones de oxicloruro de cobre y Mancozeb cada 15 días en concentración

de 860 y 347 g i.a/ha, respectivamente solos o combinados con prácticas

culturales quincenalmente; sin embargo menciona que la incidencia de la

enfermedad fue baja para este período evaluado. Bateman, et al., 2005, indican

que el hidróxido de cobre 1500 g i.a ha (-1), ha mostrado ser consistentemente

el más eficaz en el control de M. roreri de una serie de ensayos realizados en

Costa Rica, con un promedio de incremento del 72-100% (es decir, a veces el

doble) en número de frutos sanos y que el fungicida sistémico flutolanil en una

dosis de 300 g de i.a ha-1, parece proteger los frutos sustancialmente al

principio de su etapa de desarrollo, pero con un control proporcionalmente

menor de M. roreri que el cobre en las etapas de desarrollo tardío de los frutos.

Reportes que indican que si bien el cobre actúa sobre M. roreri, no reportan

datos de incidencia tan bajos como los obtenidos en esta investigación con los

hidrolatos de canela, clavo y pimienta y con el polisulfuro de calcio, respuestas

que se dan aún con incidencias naturales de la enfermedad elevadas (69,6%),

es decir que aún en alta presencia del inóculo natural se pueden reducir la

incidencia de la enfermedad con la aplicación de los hidrolatos y del polisulfuro

de calcio, es importante remarcar que en los reportes citados no se menciona

el tipo de material (clones, híbridos) utilizado en la realización de esos ensayos,

ya que como reporta Phillips-Mora, et al., 2005 existe un componente genético

de tolerancia del cacao al patógeno y según los datos para el clon en el que se

realizó el presente estudio es moderadamente resistente, factor que sumado al

buen manejo agronómico de la plantación y a la aspersión de los hidrolato y del

polisulfuro de calcio, permitió bajar substancialmente la incidencia de la

enfermedad.

4.2.3.2. Producción de cacao.

Con respecto a la producción se aprecia en la Figura 26, en la cual el

tratamiento con las aspersiones de polisulfuro de calcio registró el mejor

111

comportamiento con 1485,36 kg de cacao seco por hectárea, seguido del

hidrolato de canela con 1468,64 kg, el de clavo con 1249,44 kg y 1216,56 kg

para el hidrolato pimienta, valores significativamente mayores a los mostrados

por los testigos ya que el testigo cultural registró 449,46 kg mientras que en el

testigo absoluto fue de 142,48 kg de cacao seco/ha.

Estadísticamente el análisis de varianza registró diferencias altamente

significativas entre los tratamientos (Anexo 35). La Prueba Rango múltiple de

Tukey (Cuadro 11) sobre del efecto en la producción de cacao seco de la

aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de M.

roreri, en una plantación comercial muestra que entre los tratamientos de los

hidrolatos de canela, clavo y pimienta y el polisulfuro de calcio no existió

diferencias estadísticas, pero si de éstos con respecto a los testigos de manejo

cultural y el absoluto.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

CanelaHidrolato

ClavoHidrolato

PimientaHidrolato

Polisulfurode calcio

Testigocultural

Testigoabsoluto

g/planta


sobre la producción de cacao.

Si bien el polisulfuro de calcio esta reportado como insecticida (Giménez,

2009), en el caso del cacao pareció que no afectó negativamente a sus

mosquitas polinizadoras Forcipomyia (Díptera: Ceratopogonidae) dados estos

112

datos de producción, situación que puede ser similar a los hidrolatos de clavo,

canela y pimienta, ya que existen reportes de que el hidrolato de la hoja canela

al 50% tiene efecto insecticida sobre Selenothrips rubrocinctus (Aguilar, 2008),

y Zebadua, 2008 reporta efecto de repelencia del hidrolato de la semilla de

pimienta sobre Toxoptera aurantii. Es importante señalar que tampoco se

presentó marchitez o pérdida de los frutos por quemazón debida a una posible

fitotoxicidad de los productos.

Según los reportes dados por el SIAP, 2012 de la SAGARPA, los rendimientos

los rendimientos promedio de los años 2005 al 2011 han estado entre los 540 a

340 kg/ha, valor similar al registrado en el manejo de tipo cultural, pero

inferiores a los obtenidos con el uso de los hidrolatos, ya que para el caso de la

pimienta fue de 760 kg/ha, clavo con 780,9 kg/ha, canela 917,19 kg/ha y del

polisulfuro de calcio con 928,35 kg/ha.


del efecto en la producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri, en una plantación comercial.

Tratamiento kg/ha Tukey*

Testigo absoluto 89,05 A

Testigo cultural 280,91 A

Pimienta Hidrolato 760,35 B

Clavo Hidrolato 780,90 B

Canela Hidrolato 917,90 B

Polisulfuro de calcio 928,35 B


4.3. Análisis económico

Una parte importante de las tecnologías que se generan es su viabilidad desde

el punto de vista económico, es por ello que se analizaron los costos de

producción, dentro del cual están los costos fijos representados por el costo

por la realización de labores culturales en la plantación de cacao del clon

UNACH 130, tales como: el deshierbe, riego y podas, dando un total de 300

113

dólares por hectárea. Además se contemplaron los costos variables para el

caso del testigo cultural, se cuantificó el valor por concepto de mano de obra

para la eliminación semanal de frutos enfermos con un valor de 325 dólares/ha,

que sumado al costo por labores culturales da un valor total para el tratamiento

del testigo cultural de USD 625 por hectárea (Cuadro 12).

Cuadro 12. Costo de labores culturales desarrolladas en una hectárea de

cacao del Clon UNACH 130.

ACTIVIDAD Jornales/año Precio jornal

USD Precio total

USD

Deshierbe 24 6,25 150

Riego 12 6,25 75

Poda 12 6,25 75

TOTAL 300

Eliminación frutos enfermos (testigo cultural)

52 6,25 325

TOTAL Testigo

cultural 625

En el Cuadro 13 se aprecia el valor calculado por concepto del costo por

aplicación de los tratamientos en una hectárea de cacao del clon UNACH 130,

en el cual se desglosa el valor por el costo del producto requerido a la

concentración evaluada (hidrolatos de canela, clavo y pimienta y del polisulfuro

de calcio), para una hectárea de cacao durante 16 aplicaciones realizadas

durante la época de producción, con aspersiones quincenales equivalente a

ocho meses de aplicación de los productos.

Se incluyó el costo por mano de obra local requerida para la aspersión de los

productos, así como de la recolección y poscosecha de la producción obtenida

en cada uno de los tratamientos evaluados, de esta manera se sumaron a los

costos de mano de obra obtenidos anteriormente dando el total del costo para

cada tratamientos, siendo el más económico el testigo absoluto con USD

573,45, seguido por el testigo cultural con USD 868,65, el polisulfuro de calcio

con USD 1337,5, el hidrolato de clavo con USD 1537,5 y los de mayor costo

114

fueron los tratamientos con aplicación de los hidrolatos de canela y pimienta

con un valor de USD 1887,5.

Por concepto de ingresos por venta de las semillas de cacao secas obtenidas

en una hectárea (Cuadro 14), se tomó el valor promedio de venta en la zona el

cual fue de USD 4,6875, siendo el testigo absoluto el de menor ingreso con

USD 417,42, seguido por el testigo con manejo cultural USD 1316,48; los

tratamientos con los hidrolatos y el polisulfuro a pesar que fueron los de

mayores costos de producción son los generaron mayores ingresos, con

valores de USD de 3564,14, 3660,47 y de 4302,66, para los hidrolatos de

pimienta, clavo y canela respectivamente y el de mayor ingreso fue el

polisulfuro de calcio con USD 4351,64.

115

Cuadro 13. Costo de aplicación por hectárea de los tratamientos sobre el clon de cacao UNACH 130

TRATAMIENTO Concentración

%

Precio litro USD

Número aplicaciones/año

Costo total del producto/año

USD

Mano de obra

Aplicaciones USD

Costo total aplicación

USD

Costo Labores

culturales USD

Costos cosecha y

poscosecha USD

Costo total USD

Hidrolato canela 30 1,09 16 1050 50 1100 300 487,5 1887,5

Hidrolato clavo 20 1,09 16 700 50 750 300 487,5 1537,5

Hidrolato pimienta

30 1,09 16 1050 50 1100 300 487,5 1887,5

Testigo polisulfuro de calcio

10 1,56 16 500 50 550 300 487,5 1337,5

Testigo cultural 0 0 0 0 0 0 625 243,75 868,75

Testigo absoluto 0 0 0 0 0 0 300 243,75 543,75

Cuadro 14. Ingresos por hectárea por venta de semillas de cacao seco producido en cada uno de los tratamientos aplicados sobre el Clon UNACH 130

TRATAMIENTO Producción cacao seco kg/ha/año

Precio venta cacao

USD/kg

Ingresos por venta USD

Hidrolato canela 917,90 4,6875 4302,66

Hidrolato clavo 780,90 4,6875 3660,47

Hidrolato pimienta 760,35 4,6875 3564,14

Testigo polisulfuro de calcio 928,35 4,6875 4351,64

Testigo cultural 280,85 4,6875 1316,48

Testigo absoluto 89,05 4,6875 417,42

116

El análisis económico practicado para los tratamientos evaluados (Cuadro 15)

indica que la menor relación Beneficio: Costo (B/C) fue en el testigo absoluto con

0,8; es decir que por cada peso que se invierta no se recupera, ya que su valor es

menor de 1, por el contrario existen pérdidas de USD 126,33; con una rentabilidad

negativa de un 23,2%, situación que presentan en la actualidad los productores

quienes al tener baja producción no logran obtener ingresos ni siquiera para

reinvertir en sus plantaciones.

El Tratamiento del manejo cultural sigue siendo una alternativa para los

productores ya que su B/C fue de 1,5; es decir que por cada peso invertido

recuperan el peso más 0,5 y su rentabilidad fue de 51,5%; sin embargo esta

rentabilidad es inferior a la obtenida por los demás tratamientos, ya que con el

hidrolato de pimienta su B/C fue de 1,9, mientras su rentabilidad fue de 88,8%;

seguido por el hidrolato de canela con B/C de 2,3 y 127,95% de rentabilidad, las

mejores relaciones de B/C fueron de 2,4 y 3,3 y rentabilidades de 138,1% y

225,4% para el hidrolato de clavo y el polisulfuro de calcio respectivamente. Es

decir que la aplicación de cualquiera de los hidrolatos de pimienta, canela o clavo

o del polisulfuro de calcio permite reducir la incidencia de M. roreri y mejorar los

ingresos de los productores de cacao, siendo técnica y económicamente viable

este tipo de alternativas para el manejo de la moniliasis del cacao.

Este tipo de alternativas con productos de origen natural permiten a los

productores ingresar a mercados de producción orgánica, los cuales pagan un

sobre precio de entre un 10 a un 30%, lo cual mejoraría aún mas los ingresos de

los productores.

En el Anexo 35 se presenta un análisis de sensibilidad de los tratamientos a

diferentes niveles de producción de cacao, el cual permite calcular con base en

rendimientos potenciales de los clones o de las plantaciones (en forma

generalizada en México existe diversidad de material en una misma plantación) las

posibles relaciones B/C y sus rentabilidades al aplicar la tecnología generada.

117

Según reportes de la SAGARPA el rendimiento promedio en México es de 350

kg/ha, sin embargo la Agencia para la Gestión de la Innovación (AGI, 2010), con

acciones en la Zona del soconusco, (región donde se realizó el presente ensayo)

reporta que los rendimientos actuales son de 167 kg/ha y que antes de la llegada

de la moniliasis eran de 350 kg/ha, datos que permiten apreciar que el problema

de la moniliasis solo agudizó la crisis presentada en el sector ya que los

rendimientos por hectárea son bajos al comparar los obtenidos por países como

Granada, Malasia, Indonesia (cercanos a 1 ton/ha) y Latino Americanos como El

Salvador, Bolivia, Guatemala, Perú y Colombia, con 1; 0,49; 0,48; 0,64 y 0,48

Ton/ha, respectivamente (ICCO, 2012).

Cuadro 15. Análisis económico de cada uno de los tratamientos aplicados sobre el

Clon UNACH 130.

Tratamiento Total costos

USD Total Ingresos

USD

B/C

Beneficio Neto

RENTABILIDAD %

Hidrolato canela 1887,5 4302,66 2,3 2415,16 127,95

Hidrolato clavo 1537,5 3660,47 2,4 2122,97 138,1

Hidrolato pimienta 1887,5 3564,14 1,9 1676,64 88,8


1337,5 4351,64 3,3 3014,14 225,4

Testigo cultural 868,75 1316,48 1,5 447,73 51,5

Testigo absoluto 543,75 417,42 0,8 -126,32 -23,2

B/C = Relación Beneficio: costo.

4.4. Análisis de los compuestos de los extractos En cuanto al contenido de los compuestos de los dos extractos analizados,

detectados por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-

MS), se observa en el Cuadro 16 los tiempos de retención y el porcentaje de

abundancia para los hidrolatos de canela y clavo, que fueron los que presentaron

el mejor comportamiento en las pruebas realizadas en condiciones de campo.

118

Cuadro 16. Comparación de los Tiempos de Retención (TR) y porcentaje de

abundancia obtenidos en GC-MS de los extractos de canela y clavo

PICOS

Extracto de clavo CL Extracto de canela éter

TR (min)

% TOTAL

TR (min)

% TOTAL

1 14.241 0.6158463 6.071 0.73256843

2 15.148 0.3947116 7.125 0.18992602

3 20.376 2.27352 7.666 0.13332543

4 22.758 9.1671069 8.149 0.15316138

5 27.262 0.572439 8.527 0.26914739

6 96.911 86.976376 10.877 74.0895138

7 12.156 1.1524062

8 14.292 6.80477317

9 15.643 0.47974818

10 17.056 2.0162307

11 17.427 5.19400854

12 18.274 0.40196693

13 20.081 3.41242019

14 20.421 0.37842409

15 22.565 0.35878054

16 23.237 0.97234053

17 28.686 3.26125845

Cuadro 17. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada

por el equipo de GC-MS del hidrolato de canela PICOS TR

(min) % TOTAL Compuesto propuesto

por MS Cas# Formula Estructura

1 6.071 0.73256843

1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl

Linalol

78-70-6 C10H18O

2 7.125 0.18992602 Benzenepropanal

Dihydrocinnamaldehyde

104-53-0 C9H10O

3 7.666 0.13332543 Benzofuran, 2-methyl

Methylbenzofuran

4265-25-2 C9H8O

119

4 8.149 0.15316138

3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1(1-methylethyl)

Carvomenthenol

Terpinenol

562-74-3 C10H18O

5 8.527 0.26914739

3-Cyclohexene-1-methanol, α,α, 4-trimethyl-,

(S)

α-terpieol

10482-56-1 C10H18O

6 10.877 74.0895138

2-Propanal, 3-phenyl

Cinnamaldehyde

Aldehído cinámico

104-55-2 C9H8O

7 12.156 1.1524062

2-propen-1-ol, 3-phenyl

Cinnamyl alcohol

Alcohol cinámico

104-54-1 C9H10O

8 14.292 6.80477317 Eugenol

Ácido carofilico

97-53-0 C10H12O2

9 15.643 0.47974818 Copaene 3856-25-5 C15H24

10 17.056 2.0162307 Caryophyllene 87-44-5 C15H24

11 17.427 5.19400854

2-propen-1-ol, 3-phenyl-,acetate

Cinnamyl acetate

103-54-8 C11H12O2

12 18.274 0.40196693 α –caryophyllene

humulene

6753-98-6 C15H24

13 20.081 3.41242019

2-propenal, 3-(2-methoxyphenyl)

Cinnamaldehyde, o-

methoxy

1504-74-1 C10H10O2

14 20.421 0.37842409 Butylated hydroxytoluene

Ionol

128-37-0 C15H24O

120

15 22.565 0.35878054 Caryophyllene oxide 1139-30-6 C15H24O

16 23.237 0.97234053

Phenol, 2,6-dimethoxy-4-(2-propenyl)

Methoxyeugenol

6627-88-9 C11H14O3

17 28.686 3.26125845 Benzyl Benzoate

Ascabiol

120-51-4 C14H12O2

Cuadro 18. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada

por el equipo de GC-MS del Hidrolato de clavo PICOS TR

(min) % TOTAL Compuesto

propuesto por el MS

Cas# Formula Estructura

1 14.241 0.615 Eugenol 97-53-0 C10H12O2

2 15.148 0.39 Vanillin vanilla

121-33-5 C8H8O3

3 20.376 2.271

Phenol, 2-methoxy-4-(2-propenyl)-, acetate

Eugenol acetato

93-28-7 C12H14O3

4 22.758 9.16 Diethyl phthalate

Anozol

84-66-2 C12H14O4

5 27.262 0.57 2- propenal, 3-(4-

hydroxy-3-methoxyphenyl)

458-36-6 C10H10O3

6 96.911 86.97

1,2-benzenedicarboxylic

acid, mono (2-ethylhexyl) ester

Mehp

4376-20-9 C16H22O4

121

Los cromatogramas de cada extracto se presentan en la Figuras 27 y 28.

Considerando la abundancia de picos en el caso del extracto de canela se realizó

el análisis con éter de petróleo y para clavo con cloroformo. Destacando las

siguientes observaciones: todos los picos no corresponden a compuestos

naturales, ya que para el caso del hidrolato de clavo el Diethyl phthalate es un

compuesto que esta presente en los plásticos y el 1,2- benzenedicarboxylic acido,

mono (2-ethylhxyl) ester, se encuentra en el PVC, por lo que se consideran

impurezas, éste último compuesto, se excluyó del porcentaje del total de los

compuestos del extracto, y mostrado así por el análisis del equipo en el cual se

analizó, el cual arrojo una suma de correlación del área de 999197900, y una

correlación del porcentaje del 100%. Mientras que para los otros cinco picos

incluido el Diethyl phthalate la suma de las áreas fue de 126110678, dando los

porcentajes mostrados en el Cuadro 18.

122

Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes solventes

123

Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes solventes En cuanto a la naturaleza química de los compuestos y su concentración en cada

extracto es necesario mencionar que esta última fue evaluada por cromatografía

de gases, por lo que estos valores se tomaran como reales. Sin embargo, la

identificación de cada componente se ha realizado con el apoyo de la biblioteca

que contiene el equipo GC-MS, por lo que dicha identificación para este trabajo

será considerada por estas sugerencias, siendo que el grado de confiabilidad es

grande pero no es definitiva.

124

En cuanto al extracto de canela se lograron identificar 17 compuestos los cuales

se presentan en el Cuadro 17; los compuestos mayoritarios son el aldehído

cinámico con el 74,08%, eugenol con 6,8% y acetato de cinamilo con el 5,18% (en

la Figura 29, se presenta el espectro de masas y en el Cuadro 17 sus estructuras),

porcentajes que coinciden con lo reportado por diversos autores quienes

menciona que el aceite esencial de canela esta constituido fundamentalmente por

aldehído cinámico (65-75%) y de eugenol (5-10%) (Albo, 2001; Padrón, 2010;

Kumar, 2012; Matan y Matan, 2007).

El aldehído cinámico, es un aldehído aromático que tiene reportes de su actividad

antifúngica en varios organismos tanto para bacterias patógenas (Suresh et al.,

1992) como para hongos (Barrera y García, 2008; Giordani, 2006, Velluti, 2003).

Se tienen reportes que la actividad de la canela es debido a la presencia de

cinamaldehído, el cual inhibe la actividad la descarboxilasa aminoácida

(Wendakoon y Sakaguchi,1995) este aldehído es altamente electro-negativo, el

cual interfiere en los procesos biológicos que implican electrones, el cual transfiere

y reacciona con componentes que contienen nitrógeno, por ejemplo proteínas y

ácidos nucleicos, y por lo tanto inhibe el crecimiento de los microrganismos, tal

como lo reporta Barrera y García, (2008) donde el aldehído cinámico inhibió

totalmente el crecimiento micelial de Fusarium sp.

El segundo compuesto mayoritario es el Eugenol (6,8%), el cual también es

reportado como constituyente de aceite de la canela (Ranasinghe et al., 2002,

reportó contenidos del 4,7%), este compuesto también es reconocido por su fuerte

actividad contra bacterias y hongos con efecto fungicida y fungistático,

dependiendo de la concentración utilizada (Pelczar et al., 1988).

Di Pascua, et al., (2006), reporta que Escherichia coli presentó cambio

substanciales en la composición de ácidos grasos de la membrana celular en

presencia de aldehído cinámico mientras que para Salmonella typhimurium se

presentó el mismo efecto en presencia de eugenol.

125

El hidrolato de canela también contiene acetato de cinamilo (5,19%), que según lo

reportado por Gupta, et al., 2008, potencializa la actividad de los demás

compuestos, además menciona que los mecanismos involucrados de estos tres

compuestos en la actividad fungistática o fungicida son a nivel del citoplasma, la

ruptura de la membrana citoplasmática y la inactivación y/o inhibición de enzimas

intra y extracelular. Estos eventos biológicos podrían tener lugar por separado o

simultáneamente, que culmina con la inhibición de germinación y el desarrollo del

micelio, también, pueden actuar sobre la pared celular fúngica, causando la

ruptura de b-1, 3 glucano, b-1, 6 glucano y polímeros de quitina (Cowan, 1999;

Brull y Coote, 1999 citados por Gupta, 2008).

Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de canela: Aldehído cinámico.

En cuanto al hidrolato de clavo el análisis registro 6 picos de los cuales el pico 4 y

6 no son productos naturales, considerandosen impurezas. Por lo que el

126

compuesto mayoritario es el Acetato de Eugenol, su estructura química se

presenta en el Cuadro 18, y su Espectro de masas se muestra en la Figura 30, el

porcentaje de este compuesto incluyendo las impurezas seria del 2,27%, y

quitándolas sería del 58,95%, el siguiente compuesto bajo estas mismas

circunstancias correspondería al Eugenol con el 15,96% (en la Figura 31 se

presenta su espectro de masas), el 2- propenal, 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl),

con el 14,84% y finalmente el pico 2 correspondiente a la vainilla con el 10,23%,

las estructuras químicas de estos compuestos se presentan en el Cuadro 18.

Estos compuestos han sido reportados por varios autores como componentes del

aceite esencial del clavo, aunque en porcentajes diferentes ya que reportan al

eugenol como compuesto mayoritario con el 70 al 85%, y otros compuestos como

α y β cariofilenos, isoeugeno, acetato de eugenol y pequeñas cantidades de

ésteres, cetonas y alcoholes y se tienen reportes que el aceite esencial de clavo

de olor contiene 85 - 95% de eugenol y acetileugenol (Mazzafera, P. 2003,

Omidbeygi, 2007; Padrón, 2010; Matan y Matan, 2007; Kumar, et al., 2012).

Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de clavo: Acetato de eugenol.

127

El efecto del hidrolato de clavo sobre M. roreri puede ser debido al Eugenol, que

es un compuesto fenólico de acción antiséptica con reconocido efecto inhibitorio

sobre diversos organismos, Lining Cai y Christine D. Wu (1996) comprobaron el

potencial como antimicrobiano de los extractos no polares del clavo contra

patógenos orales Gram negativos, bacterias como E. coli y Cepas de Salmonella

(Di Pascua et al., 2006) Dorman y Deans (2000) demostraron su efecto sobre 25

bacterias patógenas gram positivas y gam negativas a cultivos y al hombre,

también se tiene reporte de su efecto sobre microorganismos como nematodos,

insectos así como efecto antiviral (Mazzafera, 2003), Padrón, (2010) encontró que

los hongos fueron los microorganismos más susceptibles frente a la fracción con

actividad antimicrobiana del extracto hexánico del clavo, cuyo constituyente

principal fue el Eugenol. También se observó que los hongos más susceptibles

fueron los filamentosos, principalmente Trichophyton tonsurans y Sporotrix

schenckii; estas cualidades antifúngicas del clavo sobre cepas filamentosas

también han sido descritas por autores como Amiri A. et al., (2008) quienes

mencionan al eugenol como posible agente activo en formulaciones para evitar el

desarrollo de enfermedades posteriores a la cosecha de frutos como la manzana;

así mismo Costa (2011) reporta el efecto del clavo sobre F. oxysporum, y R.

solani, además cita a Amaral y Bara (2005) los que reportan efecto en la

reducción del crecimiento micelial del aceite esencial de clavo sobre Rhizopus

stolonifer. Ranasinghe et al., (2002), demuestra la acción inhibitoria del clavo

sobre Lasiodiplodia theobromae, C. musae y proliferatum, Fusarium y

Colletotrichum en banano.

La actividad antifúngica del aceite esencial de clavo, está relacionada con su

hidrofobicidad, lo que les permite interactuar con la pared lipídica, la membrana

celular y la permeabilidad de las mitocondrias, alterándolos y causando

perturbaciones en estas estructuras. Los componentes de aceite pueden unirse a

iones y moléculas (hormonas) de otras células. También se ha informado por

Dorman y Deans (2000) que los antifúngicos naturales causan daño a la

membrana celular de las células expuestas a ellos, dejándolos extremadamente

128

soluble y fracturas que en última instancia exponer el contenido celular, incluyendo

el núcleo. Sin embargo Padrón (2010) reporta que en general, los aceites

esenciales poseen fuertes propiedades antibacterianas debido a que contienen un

alto porcentaje de compuestos fenólicos como el eugenol. Lo anterior sugiere que

su mecanismo de acción, sea similar al de otros compuestos fenólicos, por

alteración de la membrana citoplasmática, interrumpiendo la fuerza motriz de

protones (PMF), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación del

contenido celular. Se ha encontrado que a concentraciones subletales de eugenol

se inhibe la producción de amilasa y proteasas de B. cereus, deteriorando la pared

celular, lo que origina la lisis celular. Se cree que el grupo hidroxilo del eugenol al

que se unen ciertas proteínas, previene la acción enzimática en E. aerogenes

(Denyer y Hugo, 1991b; Sikkema et al., 1995.; Davidson, 1997; Wendakoon y

Sakaguchi, 1995 citados por Padrón).

Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del hidrolato de clavo.

129

CONCLUSIONES Los hidrolatos de clavo al 20% y de canela al 30% son eficientes en el manejo de

la moniliasis del cacao Moniliophthora roreri, los cuales son técnica y

económicamente viables de incorporarlos en un sistema de producción orgánica

de cacao (Theobroma cacao L) en México.

La mejor forma de obtención de los extractos es el hidrolato ya que en las seis

plantas evaluadas éste resultó ser el método que presentó el mejor efecto

regulador sobre M. roreri, seguido por el presurizado y la fermentación aeróbica.

De los tres métodos evaluados (difusión en agar, discos de papel modificado y el

de Kirby-Bauer), para determinar la efectividad de los extractos in vitro sobre M.

roreri, el Kirby-Bauer puede ser utilizado como una prueba rápida de screening y

el de difusión en agar es útil para la determinación de la Concentración Mínima

Inhibitoria.

La menor concentración mínima inhibitoria de los extractos sobre M. roreri, se

determinó al 20% (V/V), con los hidrolatos de flor de clavo, hoja de canela y hoja

de pimienta, así como para el presurizado de flor de clavo; seguidos por la del

30% (V/V) de los hidrolatos de pimienta semilla, canela corteza y jengibre y para el

fermentado aeróbico de flor de clavo.

El medio líquido preparado con extracto de cacao resultó ser el más eficiente para

promover la mayor al multiplicación y germinación de las conidias de M. roreri en

condiciones de laboratorio.

La efectividad de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta se debe posiblemente

al efecto preventivo al inhibir la germinación y multiplicación de las conidias, así

como al efecto funguicida al destruir las conidias de M. roreri que en conjunto

130

provocan la reducción de la incidencia y severidad externa e interna de la

enfermedad.

Aún con alta incidencia natural de M. roreri (69,6%) en una plantación monoclonal

de cacao los valores de reducción en la afectación de la enfermedad al aplicar en

campo los hidrolatos de clavo, canela y pimienta fueron del 98% y del 99% para el

polisulfuro de calcio, y el aumento en la producción de cacao entre un 800 y

1000% con respecto al testigo absoluto, lo que indica una alta viabilidad técnica de

estas alternativas dentro de un plan de manejo de la moniliasis del cacao.

En plantaciones comerciales de cacao manejadas con los hidrolatos de canela y

clavo, se obtuvo una mejora en los rendimientos y reducción de la enfermedad con

una relación Beneficio/Costo mayor a 2 y una rentabilidad del 127,95% y 138%

respectivamente, por lo que es factible económicamente el uso de estos extractos

dentro de un sistema de producción de cacao ya sea tradicional o con manejo

orgánico.

Para el hidrolato de canela se identificaron 17 compuestos siendo los mayoritarios

el aldehído cinámico con el 74,08%, eugenol con 6,8% y acetato de cinamilo con

el 5,18%; mientras que para el hidrolato de clavo los compuestos mayoritarios son

el acetato de eugenol (58,95%), y el eugenol (15,96%), los cuales tienen reportes

de actividad sobre diversos organismos pudiendo ser éstos compuestos los que

ejerzan acción inhibitoria sobre M. roreri.

131

RECOMENDACIONES Realizar pruebas con los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en otras

plantaciones de cacao bajo otros ambientes y con otros materiales de cacao ya

que el componente genético es un aspecto importante a considerar en este tipo de

trabajos en condiciones de campo.

Efectuar evaluaciones in vitro de estos hidrolatos para las otras cepas de M. roreri,

las cuales aún no están presentes en México, pero que pueden igualmente

ingresar.

Determinar mediante ensayos de laboratorio y de campo la efectividad de la

mezcla en diferentes proporciones de los extractos de pimienta, clavo y canela

que se encontraron como los ejercen la mayor acción inhibitoria sobre M. roreri y

establecer si su mezcla permite la potencialización de su efecto o bien la

reducción de la concentración mínima inhibitoria.

Realizar el escalamiento a nivel de planta piloto y posteriormente a nivel industrial

de este tipo de alternativas que permitan poner a disposición de los productores

de cacao este tipo de alternativa para el manejo de la moniliasis del cacao y que

se integre a un plan de manejo de la plantación, que incluya la renovación de las

plantaciones viejas e improductivas, bajar el porte de los árboles de cacao a

máximo cuatro metros de tal manera que permita la observación y remoción de

frutos enfermos, optimizar la aplicación de los extractos y de fertilizantes líquidos,

y con ello maximizar los recursos para que sea económicamente atractivo para los

productores de cacao.

132

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142

ANEXOS

143

Anexo 1.Produccion Mundial de cacao

Producción mundial de cacao en miles de toneladas

2008/2009 % de participación

2009/2010 % de participación

Estimado 2010/2011

% de participación

África 2516 70 2483 68.4 3180 74.8

Camerún 224 205 230

Costa de Marfil 1223 1242 1511

Ghana 662 632 1025

Nigeria 250 235 240

Otros 157 168 175

América 478 13.3 517 14.2 540 12.7

Brasil 157 161 200

Ecuador 135 150 145

Otros 186 206 195

Asia y Oceanía 598 16.6 632 17.4 530 12.5

Indonesia 490 550 440

Papua Nueva Guinea

59 39 45

Otros 48 44 45

Total mundial 3593 100 3631 100 4250 100

Fuente: ICCO, 2011

Anexo 2. Producción de cacao en México

AÑO Sup. Sembrada Sup. Cosechada Producción Rendimiento PMR

Valor Producción

(ha) (ha) (t) (t/ha) ($/t) (Miles de Pesos)

2000 81,400.90 81,022.90 28,046.49 0.35 8,792.62 246,602.23

2001 83,135.90 83,036.90 46,737.65 0.56 8,339.39 389,763.37

2002 83,174.45 83,130.45 46,194.39 0.56 14,146.98 653,511.18

2003 81,987.11 80,903.05 49,964.76 0.62 16,920.18 845,412.97

2004 81,964.11 80,878.96 43,974.52 0.54 17,972.24 790,320.76

2005 62,687.66 61,476.51 36,366.16 0.59 17,871.26 649,909.18

2006 61,220.77 60,866.27 38,150.87 0.63 15,406.36 587,766.02

2007 61,024.27 60,933.77 29,909.74 0.49 16,992.77 508,249.25

2008 61,092.35 61,035.85 27,548.93 0.45 25,700.69 708,026.43

2009 61,403.35 61,317.35 22,660.79 0.37 31,689.04 718,098.73

2010 61,344.25 61,187.25 27,173.61 0.44 37,473.85 1,018,299.71

2011 21,568.00

Fuente: Servicio de información Agroalimentaria y pesquera (SIAP) de la SAGARPA, 2012

Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre

el crecimiento de M. roreri. FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 37 69548,86842 1879,69915 23041,5 0,0001 Error 152 12,40000 0,08158 Total 189 69561,26842

Coeficiente de Variación 1,521386

144

Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre el crecimiento de M. roreri.

TRATAMIENTOS Crecimiento

mm Tukey* Canela hoja hidrolato 0 O Canela hoja presurizado 0 O Canela hoja aeróbico 0 O Canela corteza hidrolato 0 O Pimienta hoja hidrolato 0 O Pimienta hoja presurizado 0 O Pimienta semilla hidrolato 0 O Pimienta semilla presurizado 0 O Clavo hoja hidrolato 0 O Clavo flor hidrolato 0 O Clavo flor presurizado 0 O Clavo flor aeróbico 0 O Clavo flor anaeróbico 0 O Orégano hidrolato 0 O Maguey hidrolato 0 O Jengibre hidrolato 0 O Testigo Químico 0 O Canela hoja anaeróbica 11,40 N Canela corteza presurizado 11,80 N Clavo hoja presurizado 21,00 M Pimienta hoja anaeróbica 22,20 L Orégano aeróbica 22,80 KL Canela corteza anaeróbica 23,20 K Pimienta hoja aeróbica 26,20 J Pimienta semilla anaeróbica 29,80 I Jengibre presurizado 29,80 I Pimienta semilla aeróbica 32,20 H Orégano presurizado 33,00 G Jengibre aeróbica 35,20 F Clavo hoja anaeróbica 39,80 E Maguey presurizado 43,60 D Jengibre anaeróbica 44,60 C Clavo hoja aeróbica 45,00 C Orégano anaeróbica 45,00 C Canela corteza aeróbica 46,80 B Maguey aeróbica 50,00 A Maguey anaeróbica 50,00 A Testigo absoluto 50,00 A


145

Anexo 5. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre la formación de conidias de M. roreri.

FV GL SC CM F P>F Tratamiento 37 3,5876493 9,6963495 46066,5 0,0001

Error 152 3,199389 2,1048612 Total 189 3,5879692

Coeficiente de Variación 1,833237

Anexo 6. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey

(P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre la formación de conidias de M. roreri.

TRATAMIENTO Conidias/Ml X 107 Tukey*

Canela hoja hidrolato 0 R

Canela hoja presurizado 0 R

Canela hoja F. aeróbico 0 R

Canela corteza hidrolato 0 R

Pimienta hoja hidrolato 0 R

Pimienta hoja presurizado 0 R

Pimienta semilla hidrolato 0 R

Pimienta semilla presurizado 0 R

Clavo hoja hidrolato 0 R

Clavo flor hidrolato 0 R

Clavo flor presurizado 0 R

Clavo flor F. aeróbico 0 R

Clavo flor F. anaeróbico 0 R

Orégano hidrolato 0 R

Maguey hidrolato 0 R

Jengibre hidrolato 0 R

Testigo Químico 0 R

Canela hoja F. anaeróbica 0,455 Q

Canela corteza presurizado 0,742 PQ

Canela corteza F. anaeróbico 0,760 PQ

Pimienta semilla F. aeróbico 0,948 OP

Clavo hoja presurizado 1,243 NO

Pimienta semilla F. anaeróbico 1,319 N

Orégano presurizado 1,819 M

Pimienta hoja F. anaeróbico 3,271 L

Jengibre presurizado 4,910 K

Maguey presurizado 5,595 J

Pimienta hoja F. aeróbica 6,189 I

Jengibre aeróbica 8,984 H

Orégano F. anaeróbica 9,181 H

Orégano F. aeróbica 9,983 G

Canela corteza F. aeróbica 13,635 F

Testigo absoluto 34,463 E

Clavo hoja F. anaeróbica 36,920 D

Jengibre F. anaeróbica 37,567 D

Maguey F. anaeróbica 39,864 C

Clavo hoja F. aeróbica 40,454 B

Maguey F. aeróbica 42,817 A

*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes.

146

Anexo 7. Análisis de varianza para extractos a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 33 76595.200 2321.067 554.187 0,0001 Error 136 6.40000 0.04706 Total 169 76601.60000

Coeficiente de Variación 0.881831

Anexo 8. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple deTukey (P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentración sobre el crecimiento de M. roreri.

TRATAMIENTOS Crecimiento mm Tukey* Canela hoja hidrolato 40% 0 N Canela hoja hidrolato 30% 0 N Canela hoja hidrolato 20% 0 N Canela hoja presurizado 40% 0 N Canela corteza hidrolato 40% 0 N Canela corteza hidrolato 30% 0 N Pimienta hoja hidrolato 40% 0 N Pimienta hoja hidrolato 30% 0 N Pimienta hoja hidrolato 20% 0 N Pimienta semilla hidrolato 40% 0 N Pimienta semilla hidrolato 30% 0 N Pimienta semilla presurizado 40% 0 N Testigo Químico 0 N Canela corteza hidrolato 20% 13,80 M Canela hoja presurizado 40% 24,20 L Pimienta hoja presurizado 40% 26,20 K Canela hoja hidrolato 10% 27,00 J Pimienta semilla hidrolato 20% 27,80 I Canela corteza hidrolato 10% 30,80 H Canela hoja F. aeróbico 40% 31,40 G Pimienta semilla presurizado 30% 34,20 F Pimienta hoja hidrolato 10% 39,80 E Pimienta hoja presurizado 30% 42,20 D Canela hoja F. aeróbico 30% 44,00 C Canela hoja presurizado 20% 45,00 B Canela hoja presurizado 10% 50,00 A Canela hoja F. aeróbico 20% 50,00 A Canela hoja F. aeróbico 10% 50,00 A Pimienta hoja presurizado 20% 50,00 A Pimienta hoja presurizado 10% 50,00 A Pimienta semilla hidrolato 10% 50,00 A Pimienta semilla presurizado 20% 50,00 A Pimienta semilla presurizado 10% 50,00 A Testigo absoluto 50,00 A


147

Anexo 9. Análisis de varianza para extractos de clavo, jengibre, orégano y maguey, a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 33 76023.112 2303.731 242.573 0,0001

Error 136 1291.600 9.497

Total 169 77314.712

Coeficiente de variación 1,026308


(P<0.05) para extractos de clavo, jengibre, orégano y maguey, evaluados a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.

TRATAMIENTOS Crecimiento m Tukey* Clavo botón floral hidrolato 40% 0 A Clavo botón floral hidrolato 30% 0 A Clavo botón floral hidrolato 20% 0 A Clavo botón floral presurizado 40% 0 A Clavo botón floral presurizado 30% 0 A Clavo botón floral presurizado 20% 0 A Clavo botón floral F. aeróbico 40% 0 A Clavo botón floral F. aeróbico 30% 0 A Clavo botón floral F. anaeróbico 40% 0 A Jengibre hidrolato 40% 0 A Jengibre hidrolato 30% 0 A Testigo Químico 0 A Maguey hidrolato 40% 9,00 AB Orégano hidrolato 30% 12,20 AB Orégano hidrolato 40% 12,40 AB Clavo hoja hidrolato 40% 17,00 CD Clavo hoja hidrolato 30% 24,40 DE Clavo botón floral F. anaeróbica 30% 25,60 E Clavo botón floral hidrolato 10% 25,80 E Oregano hidrolato 20% 26,80 E Clavo botón floral F. Aeróbico 20% 39,40 F Clavo botón floral F. Anaeróbico 20% 42,40 F Maguey hidrolato 30% 44,60 FG Clavo hoja hidrolato 20% 45,00 FG Clavo botón floral presurizado 10% 45,00 FG Jengibre hidrolato 20% 45,00 FG Clavo hoja hidrolato 10% 50,00 G Clavo botón floral F. aeróbico 10% 50,00 G Clavo botón floral F. anaeróbico 10% 50,00 G Orégano hidrolato 10% 50,00 G Maguey hidrolato 20% 50,00 G Maguey hidrolato 10% 50,00 G Jengibre hidrolato 10% 50,00 G Testigo absoluto 50,00 G


148

Anexo 11. Análisis de varianza para extractos de canela y pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la formación de conidias de M. roreri.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 33 2168724451892406000 65718922784618300 113.091 0,0001

Error 136 79031604559875000 581114739410845

Total 169 2247756056452281000



(P<0.05) para extractos de canela y pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la producción de conidias de M. roreri.

TRATAMIENTO

Conidias/mL X 10

7 Tukey*

Canela hoja hidrolato 40% 0 V



Canela hoja presurizado 40% 0 V

Canela corteza hidrolato 40% 0 V

Canela corteza hidrolato 30% 0 V

Pimienta hoja hidrolato 40% 0 V



Pimienta semilla hidrolato 40% 0 V

Pimienta semilla hidrolato 30% 0 V

Pimienta semilla presurizado 40% 0 V

Testigo Químico 0 V

Pimienta semilla hidrolato 20% 2,99 U

Pimienta hoja presurizado 40% 4,09 T

Canela hoja presurizado 30% 5,09 S

Canela hoja hidrolato 10% 5,73 R

Pimienta hoja presurizado 30% 6,45 Q

Pimienta hoja hidrolato 10% 7,33 P

Canela corteza hidrolato 20% 8,98 O

Canela hoja F. aeróbica 40% 9,66 N

Pimienta semilla presurizado 30% 9,71 M

Canela hoja F. aeróbica 20% 13,70 L

Canela hoja F. aeróbica 30% 14,82 K

Canela hoja presurizado 20% 15,18 J

Canela corteza hidrolato 10% 15,75 I

Pimienta semilla hidrolato 10% 19,57 H

Pimienta semilla presurizado 20% 20,50 G

Pimienta hoja presurizado 20% 24,98 F

Pimienta hoja presurizado 10% 25,95 E

Pimienta semilla presurizado 10% 29,49 D

Canela hoja presurizado 10% 29,60 C

Canela hoja F. aeróbica 10% 30,68 B

Testigo absoluto 40,32 A


149

Anexo 13. Análisis de varianza para extractos a cuatro concentraciones sobre la formación de conidias de M. roreri.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento

33 2352164728993844000 71277719060419500 87.079 0,0001

Error

136 111321778279483300 818542487349142

Total

169 2463486507273327000


.

150

Anexo 14. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentraciones sobre la producción de conidias de M. roreri.


TRATAMIENTO Conidias/mL Tukey* Clavo flor hidrolato 40% 0 A Clavo flor hidrolato 30% 0 A Clavo flor hidrolato 20% 0 A Clavo flor presurizado 40% 0 A Clavo flor presurizado 30% 0 A Clavo flor presurizado 20% 0 A Clavo flor F. aeróbico 40% 0 A Clavo flor F. anaeróbico 30% 0 A Clavo flor F. anaeróbico 40% 0 A Jengibre hidrolato 40% 0 A Jengibre hidrolato 30% 0 A Testigo Químico 0 A Orégano hidrolato 30% 2,34 AB Orégano hidrolato 40% 2,81 AB Maguey hidrolato 40% 2,86 AB Clavo flor hidrolato 10% 3,31 AB Orégano hidrolato 20% 3,56 AB Clavo flor F. anaeróbico 30% 3,92 ABC Clavo flor F. aeróbico 20% 4,76 ABC Clavo hoja hidrolato 40% 7,23 ABC Maguey hidrolato 30% 8,20 BCD Jengibre hidrolato 20% 8,63 BCD Clavo hoja hidrolato 30% 8,68 BCD Clavo flor F. anaeróbico 20% 9,28 BCD Clavo flor presurizado 10% 10,93 CD Clavo hoja hidrolato 20% 14,63 DE Clavo flor F. Aeróbico 10% 19,96 EF Maguey hidrolato 20% 23,31 FG Orégano hidrolato 10% 25,87 FGH Jengibre hidrolato 10% 27,61 GHI Maguey hidrolato 10% 30,20 GHI Clavo flor F. Anaeróbico 10% 31,00 HI Clavo hoja hidrolato 10% 33,57 IJ Testigo absoluto 40,32 J

151

Anexo 15. Análisis de varianza de productos de síntesis química sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de disco de papel.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 11 145,729 13,248 635,909 0,0001

Error 36 0,750 0,021

Total 47 146,479


Anexo 16. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P<0,05) para productos de síntesis química evaluados sobre la producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de papel.

PRODUCTOS DE SINTESIS QUIMICA

Diámetro de inhibición

(mm) Tukey*

Barrida 20 µL 0,00 A

Barrida 50 µL 0,00 A

Ranman 20 µL 0,00 A


Eco 720 20 µL 0,00 A

Eco 720 50 µL 0,00 A

Tamis 20 µL 0,00 A

Tamis 50 µL 0,00 A

Ridomil 20 µL 0,00 A

Ridomil 50 µL 0,00 A

Ziram 20 µL 4,00 B

Ziram 50 µL 5,25 C


Anexo 17. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales sobre el

crecimiento de M. roreri mediante el método de Disco de papel.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 36 9099,892 252,775 876,813 0,0001

Error 111 32,000 0,288

Total 147 9131,892

152

Anexo 18. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P<0,05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de papel.

EXTRACTOS DIAMETRO DE

INHIBICION (mm) TUKEY*

Orégano hidrolato 0,00 A

Orégano presurizado 0,00 A

Orégano F. Aeróbico 0,00 A

Orégano F. Anaeróbico 0,00 A

Maguey hidrolato 0,00 A

Maguey presurizado 0,00 A

Maguey F. Aeróbico 0,00 A

Maguey F. Anaeróbico 0,00 A

Jengibre hidrolato 0,00 A

Jengibre presurizado 0,00 A

Jengibre F. Aeróbico 0,00 A

Jengibre F. Anaeróbico 0,00 A

Clavo hoja hidrolato 0,00 A

Clavo hoja presurizado 0,00 A

Clavo hoja F. Aeróbico 0,00 A

Clavo hoja F. Anaeróbico 0,00 A

Canela corteza F. aeróbico 0,00 A

Canela corteza F. anaeróbico 0,00 A

Pimienta hoja hidrolato 0,00 A

Pimienta hoja presurizado 0,00 A

Pimienta hoja F. aeróbico 0,00 A

Pimienta hoja F. anaeróbico 0,00 A

Pimienta semilla presurizado 0,00 A

Pimienta semilla F. aeróbico 0,00 A

Pimienta semilla F. anaeróbico 0,00 A

Canela corteza presurizado 7,00 B

Canela hoja presurizado 9,50 C

Clavo flor F. aeróbico 11,00 CD

Canela hoja F. anaeróbico 11,50 D

Clavo flor presurizado 13,50 E

Clavo flor F. anaeróbico 14,50 EF

Pimienta semilla hidrolato 14,50 EF

Canela corteza hidrolato 16,00 F

Canela hoja F. aeróbico 21,50 G

Testigo quimico Ziram 22,00 G

Clavo flor hidrolato 22,50 G

Canela hoja hidrolato 22,50 G


Anexo 19. Análisis de varianza de productos de síntesis química sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de Disco de papel Kirby-Bauer.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 11 667,063 60,642 55,621 0,0001

Error 36 39,250 1,090

Total 47 706,313


153

Anexo 20. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P<0.05) para productos de síntesis química evaluados sobre la producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de papel Kirby-Bauer.

PRODUCTOS DE SINTESIS QUIMICA Diámetro de

inhibición (mm)

Tukey*



Eco 720 20 µL 3,00 B

Eco 720 50 µL 4,50 BC

Barrida 20 µL 5,00 BCD

Tamis 20 µL 5,25 BCD

Tamis 50 µL 6,00 CD

Ridomil 20 µL 6,00 CD

Barrida 50 µL 7,25 D

Ridomil 50 µL 7,25 D

Ziram 20 µL 10,00 E

Ziram 50 µL 14,00 F


Anexo 21. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales sobre el

crecimiento de M. roreri mediante el método de Disco de papel Kirby-Bauer.

FV GL SC CM F P>F

Tratamiento 36 2310,703 64,186 1017,810 0,0001

Error 111 7,000 0,063

Total 147 2317,703


154

Anexo 22. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P<0.05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de papel Kirby-Bauer modificado.

EXTRACTO DIAMETRO DE

INHIBICION (mm) TUKEY*

Orégano hidrolato 0,00 A

Orégano presurizado 0,00 A

Orégano F. Aeróbico 0,00 A

Orégano F. Anaeróbico 0,00 A

Maguey hidrolato 0,00 A

Maguey presurizado 0,00 A

Maguey F. Aeróbico 0,00 A

Maguey F. Anaeróbico 0,00 A

Jengibre hidrolato 0,00 A

Jengibre presurizado 0,00 A

Jengibre F. Aeróbico 0,00 A

Jengibre F. Anaeróbico 0,00 A

Clavo hoja hidrolato 0,00 A

Clavo hoja presurizado 0,00 A

Clavo hoja F. Aeróbico 0,00 A

Clavo hoja F. Anaeróbico 0,00 A

Canela corteza presurizado 0,00 A

Canela corteza F. aeróbico 0,00 A

Canela corteza F. anaeróbico 0,00 A

Pimienta hoja hidrolato 0,00 A

Pimienta hoja presurizado 0,00 A

Pimienta hoja F. aeróbico 0,00 A

Pimienta hoja F. anaeróbico 0,00 A

Pimienta semilla presurizado 0,00 A

Pimienta semilla F. aeróbico 0,00 A

Pimienta semilla F. anaeróbico 0,00 A

Canela hoja hidrolato 0,00 A

Canela hoja presurizado 0,00 A

Canela hoja F. aeróbico 0,00 A

Canela hoja F. anaeróbico 0,00 A

Clavo botón floral presurizado 0,00 A

Clavo botón floral F. anaeróbico 0,00 A

Clavo botón floral F. aeróbico 0,00 A

Pimienta semilla hidrolato 8,00 B

Clavo semilla hidrolato 9,00 C

Canela corteza hidrolato 15,50 D

Testigo químico ziram 16,00 D


155

Anexo 23. Análisis de varianza (Anova), del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número de conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 72 horas.

Conidias Totales Horas

FV GL SC CM F P>F

12 horas Tratamientos 2 1,2888721911316,660 6,444360955658330 Infin 0,344

Error 9 0 0 0,063

Total 11 1.2888722

Coeficiente de variación 0

24 horas Tratamientos 2 1,33380546875000000 6,6690273437500000 Infin 0,0001

Error 9 0 0

Total 11

1.3338055



Error 9 0 0

Total 11 2.0492753



Error 9 0 0

Total 11 1.2365064


156

Anexo 24. Análisis de varianza (Anova), del efecto medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número de conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 72 horas.

Conidias

Germinadas Horas

FV GL SC CM F P>F

12 horas Tratamientos 2 398988635417 199494317708 1,065 0,0001

Error 9 16862,500061 1873,6111179

Total 11 398988652279



Error 9 19149,999954 2127,7777727

Total 11 456744810817



Error 9 1500,0000975 166,6666775

Total 11 355104168167



Error 9 2550,0002502 283,33336114

Total 11 395182294217


157

Anexo 25. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 96 horas.

Conidias Totales Horas

FV GL SC CM F P>F

12 horas Tratamientos 5 1,4372767 287455347222 11826,7 0,001

Error 12 291666666,67 24305555,556

Total 17 1,4375684

C. V. 0.601126


Error 12 3295833333,3 274652777,78

Total 17 1,5845

C. V. 2.232007


Error 12 185189259,33 15432438,278

Total 17 1,8834508

C. V. 0.614838


Error 12 241666666,67 20138888,889

Total 17 1,8320319

C. V. 0.771145


Error 12 653587962962962 54465663580246,9

Total 17 1,676658360

C. V. 0.976612

158

Anexo 26. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de conidias de M. roreri.

Tratamiento 12 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey* 24 horas

Conidias/mL x106

Tukey* 48 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey*

72 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey*

96 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey*

Clavo semilla

Hidrolato 112,08 B 106,66 B 110,27 A 79,16 B 78,19 B

Pimienta semilla

Hidrolato 52,90 E 56,27 D 41,89 D 36,59 D 34,84 E

Canela corteza

Hidrolato 50,16 F 40,94 E 24,27 F 25,32 F 11,89 F

Testigo químico

114,44 A 84,58 C 70,13 C 64,16 C 75,69

C


59,44 D 42,50 E 36,94 E 29,16 E 39,86 D

Testigo absoluto

104,16 C 115,69 A 100,0 B 115,13 A 98,88 A


Anexo 27. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,

clavo y pimienta en el número de conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 96 horas.

Conidias

germinadas Horas

FV GL SC CM F P>F

12 horas Tratamientos 5 390483333333 78096666667 8996,74 0,001 Error 12 104166666,67 8680555,5556 Total 17 390587500000

C. V. 1,537189

24 horas Tratamientos 5 940062500000 188012500000 22561,5 0,001 Error 12 100000000 8333333,3333 Total 17 940162500000

C. V. 1,337491


C. V. 1,912436


C. V. 4,537204


C. V. 4,34516

159

Anexo 28. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de conidias germinadas de M. roreri.

Tratamiento

12 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey* 24 horas Conidias/mL x10

6

Tukey* 48 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey*

72 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey*

96 horas

Conidias/mL x10

6

Tukey*

Clavo semilla Hidrolato

9,02 D 7,36 D 8,05 D 5,97 C 2,91 C

Pimienta semilla

Hidrolato 9,13 D 15,25 C 12,23 C 10,25 B 10,65 B

Canela corteza Hidrolato

28,96 B 31,28 B 17,45 B 5,91 C 1,98 C

Testigo químico

19,44 C 5,83 E 3,33 E 1,66 E 0,83 C


3,19 E 0,41 F 1,38 F 1,94 D 1,80 C

Testigo absoluto

46,52 A 68,19 A 50,83 A 24,30 A 26,52 A


Anexo 29. Análisis de varianza (Anova), del Porcentaje de incidencia de M. roreri

del efecto de la aspersión de hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao inoculados.

FV

GL

SC

CM

F

P>F

Tratamiento

9 23,810 2,646 7,366 0,0001

Error

90 32,323 0,359

Total

99 56,133

Anexo 30. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del

Porcentaje de Incidencia de M. roreri en frutos de cacao asperjados con hidrolatos de clavo, canela y pimienta.

Tratamiento

N % Incidencia Tukey*

Testigo inoculado 10 100 A

Pimienta semilla Hidrolato Después 10 75 AB

Canela Hidrolato Después 10 50 ABC

Clavo flor Hidrolato Después 10 44,44 BC

Clavo flor Hidrolato Antes 10 42,86 BC

Canela Hidrolato Antes 10 28,57 BC

Pimienta semilla Hidrolato Antes 10 25 BC

Polisulfuro de calcio Antes 10 0 C

Polisulfuro de calcio Después 10 0 C

Testigo sin inocular 10 0 C

160

Anexo 31. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad Externa (ISE) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

FV

GL

SC

CM

F

P>F

Tratamiento 9 1.902 0.211 3.204 0,0001

Error 90 5.937 0.066

Total 99 7.840

C.V. 31.22715

Anexo 32. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad Interna (ISI) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.

FV

GL SC

CM

F

P>F

Tratamiento 9 5.549 0.617 7.822 0,0001

Error 90 7.094 0.079

Total 99 12.643

C.V. 31.48399

Anexo 33. Porcentaje de mazorcas afectadas con M. roreri por tratamiento y sus índices de severidad interna (ISI) y externa (ISE) después de 60 días de la inoculación artificial con 9 x 104 conidias*mL-1. Tapachula, Chiapas – México.

TRATAMIENTO INDICE

PORCENTAJE DE MAZORCAS Grados de la escala

0 1 2 3 4 5

Clavo hidrolato Aplicado Antes de la inoculación

ISI 57,14 28,57 0 0 14,28 0

ISE 71,73 0 0 28,57 0 0

Canela hidrolato Aplicado Antes de la inoculación

ISI 71,42 0 28,57 0 0 0

ISE 85,72 0 0 14,28 0 0

Pimienta hidrolato Aplicado Antes de la inoculación

ISI 75 25 0 0 0 0

ISE 75 25 0 0 0 0

Polisulfuro de calcio Aplicado Antes de la inoculación

ISI 100 0 0 0 0 0

ISE 100 0 0 0 0 0

Clavo hidrolato Aplicado Después la inoculación

ISI 55,55 22,22 0 11,11 0 11,11

ISE 77,77 11,11 0 0 0 11,11

Canela hidrolato Aplicado Después la inoculación

ISI 66,7 0 0 16,66 16,66 0

ISE 83,4 0 0 16,66 0 0

Pimienta hidrolato Aplicado Después la inoculación

ISI 25 50 0 0 0 25

ISE 100 0 0 0 0 0

Polisulfuro de calcio Aplicado Después la inoculación

ISI 100 0 0 0 0 0

ISE 100 0 0 0 0 0

Testigo sin inocular ISI 100 0 0 0 0 0

ISE 100 0 0 0 0 0

Testigo inoculado ISI 0 37,5 12,5 25 25 0

ISE 0 87,5 12,5 0 0 0

161

Anexo 34. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao.

VARIABLE FV GL SC CM F P>F

Incidencia Total Tratamiento 5 3.33237200 0.66647440 13308.1 0,0001 Error 24 0.00120193 0.00005008 Total 29 3.33357392

C. V. 0.561083

Incidencia Chilillos Tratamiento 5 0.82589020 0.16517804 614.36 0,0001

Error 24 0.00645271 0.00026886 Total 29 0.83234291

C. V. 1.135432

Incidencia Mazorcas Tratamiento 5 2.07973912 0.41594782 10673.2 0,0001 Error 24 0.00093531 0.00003897 Total 29 2.08067443

C.V. 0.476864

Anexo 35. Análisis de varianza (Anova), del efecto en la producción de cacao seco

de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri, en una plantación comercial.

FV

GL SC

CM

F

P>F

Tratamiento 5 8013637,039 1602727,408 8090,18 0,0001 Error 24 4754,588 198,108 Total 29 8018391,627

C. V. 1,404712

162

Anexo 36. Análisis de sensibilidad de los tratamientos para diferentes niveles de

rendimiento de cacao.

Tratamiento Producción Nivel

kg/ha/año Total

costos USD

Total Ingresos

USD

B/C

VPN

RENTABILIDAD %

Hidrolato canela

Muy baja 400 1643,75 1875,00 1,14 231,25 14,07

Baja 500 1643,75 2343,75 1,43 700,00 42,59

Media 700 1887,50 3281,25 1,74 1393,75 73,84

Media alta 1000 1887,50 4687,50 2,48 2800,00 148,34

Alta 1500 1887,50 7031,25 3,73 5143,75 272,52

Muy Alta 3750 2862,50 17578,13 6,14 14715,63 514,08

Hidrolato clavo

Muy baja 400 1293,75 1875,00 1,45 581,25 44,93

Baja 500 1293,75 2343,75 1,81 1050,00 81,16

Media 700 1537,50 3281,25 2,13 1743,75 113,41

Media alta 1000 1537,50 4687,50 3,05 3150,00 204,88

Alta 1500 1537,50 7031,25 4,57 5493,75 357,32

Muy Alta 3750 2512,50 17578,13 7,00 15065,63 599,63

Hidrolato pimienta

Muy baja 400 1643,75 1875,00 1,14 231,25 14,07

Baja 500 1643,75 2343,75 1,43 700,00 42,59

Media 700 1887,50 3281,25 1,74 1393,75 73,84

Media alta 1000 1887,50 4687,50 2,48 2800,00 148,34

Alta 1500 1887,50 7031,25 3,73 5143,75 272,52

Muy Alta 3750 2862,50 17578,13 6,14 14715,63 514,08


Muy baja 400 1093,75 1875,00 1,71 781,25 71,43

Baja 500 1093,75 2343,75 2,14 1250,00 114,29

Media 700 1337,50 3281,25 2,45 1943,75 145,33

Media alta 1000 1337,50 4687,50 3,50 3350,00 250,47

Alta 1500 1337,50 7031,25 5,26 5693,75 425,70

Muy Alta 3750 2312,50 17578,13 7,60 15265,63 660,14

Testigo cultural

Muy baja 400 868,75 1875,00 2,16 1006,25 115,83

Baja 500 868,75 2343,75 2,70 1475,00 169,78

Media 700 1112,50 3281,25 2,95 2168,75 194,94

Media alta 1000 1112,50 4687,50 4,21 3575,00 321,35

Alta 1500 1112,50 7031,25 6,32 5918,75 532,02

Muy Alta 3750 2087,50 17578,13 8,42 15490,63 742,07

Testigo absoluto

Muy baja 400 543,75 1875,00 3,45 1331,25 244,83

Baja 500 543,75 2343,75 4,31 1800,00 331,03

Media 700 787,50 3281,25 4,17 2493,75 316,67

Media alta 1000 787,50 4687,50 5,95 3900,00 495,24

Alta 1500 787,50 7031,25 8,93 6243,75 792,86

Muy Alta 3750 1762,50 17578,13 9,97 15815,63 897,34