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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA CARRERA DE ODONTOLOGÍA "ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE ODONTÓLOGA AUTOR: MISHELLE CAROLINA CUASÉS TETAMUEZ TUTOR: Dra. MARINA ANTONIA DONA VIDALE QUITO, Mayo 2018

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

CARRERA DE ODONTOLOGÍA

"ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA PLANTA

HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE CÁNDIDA

ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO

PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE

ODONTÓLOGA

AUTOR: MISHELLE CAROLINA CUASÉS TETAMUEZ

TUTOR: Dra. MARINA ANTONIA DONA VIDALE

QUITO, Mayo 2018

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© DERECHOS DE AUTOR

Yo, Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez, en calidad de autora de la tesis realizada

sobre “ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA

PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE

CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO, autorizo a la

Universidad Central del Ecuador a hacer uso del contenido total o parcial que me

pertenecen, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente

autorización serán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

También autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización y

publicación de éste trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad

a lo dispuesto en el artículo 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

----------------------------

Mishelle Cuasés

0401829486

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APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Yo, Dra. Marina Antonia Dona Vidale, en mi calidad de tutora del trabajo de

titulación, modalidad trabajo de investigación, elaborado por Mishelle Carolina

Cuasés Tetamuez; cuyo título es "ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL

EXTRACTO ACUOSO DE LA PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM

NIGRUM) SOBRE CEPAS DE CÁNDIDA ALBICANS

ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO previo a la obtención del Grado de

Odontóloga; considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el

campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte

del tribunal examinador que se designe, por lo que APRUEBO, a fin de que el

trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la

Universidad Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 3 días del mes de Abril de 2018.

……………………………………

Dra. Marina Antonia Dona Vidale

DOCENTE-TUTORA

CI. 170888442-2

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APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL

El tribunal constituido por: El Dr. Juan Pablo Jaramillo y la Dra. Silvana Terán.

Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención

del título (o grado académico) de Odontóloga presentado por la Srta. Mishelle

Carolina Cuasés Tetamuez.

Con el título:

"ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA

PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE

CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO

Emite el siguiente veredicto: APROBADO

Fecha: 06 de mayo de 2018.

Para constancia de lo actuado firman:

Nombre y Apellido Calificación Firma

Presidente: Dr. Juan Pablo Jaramillo. ---------------- ---------------------

Vocal 1: Dra. Silvana Terán. ---------------- ---------------------

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v

DEDICATORIA

A Dios por darme la oportunidad de vivir guiar mi vida e iluminar mi camino.

A mi Padre Abraham Cuasés por toda lucha constante, su amor infinito y apoyo incondicional

quien con su carácter me ayudo a ser fuerte y la dulzura como siempre es conmigo.

A mi madre Carmita Tetamuez por todo su amor, dedicación, su entrega desde que nací y sus

consejos hasta sus últimos suspiros de vida.

A mis hermanos Esteban, Alicia, Tania, José Luis, Carlos Alberto por quererme y ayudarme

cada momento y estar presentes siempre.

A mis Ti@s Alicia, Clara, Arnaldo, Maorí, Mariela, Ximena, Silvia y Consuelo por su apoyo

moral sentimental y económico.

A mí querido Alexis por acompañarme en todo momento.

Mishelle C.

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vi

AGRADECIMIENTO

A Dios ya que con su suplo de vida pude culminar mis objetivos.

A mis amados padres por su entrega total para yo poder terminar mis estudios, amor

incondicional, paciencia, apoyo económico y por saber reprenderme cuando lo necesitaba

por ello logre ser ahora todo lo que soy las agradezco con mi corazón y a usted mamita linda

gracias por dar más de lo normal por cada uno de sus hijos y aunque la vida está muy difícil

sin usted, le prometo que seguiré adelante.

A mis queridos herman@s porque todos han estado pendientes de mí.

A mis queridas tías Alicia y Clara que se han convertido como unas madres para mí y mis

hermanos.

A mi familia por su granito de arena para yo poder culminar mis estudios.

A la Universidad Central del Ecuador por permitirme ser parte de la gloriosa Universidad.

A la Facultad de Odontología y sus docentes que impartieron sus conocimientos y anécdotas

que ayudaron a mi formación profesional.

A mi querida Tutora Marina Dona por su paciencia, comprensión y predisposición para

ayudarme a realizar mi trabajo.

Mishelle C.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

LISTA DE TABLAS. ................................................................................................. xi

LISTA DE FIGURAS. ............................................................................................... xii

LISTA DE ANEXOS. ............................................................................................... xiii

RESUMEN ............................................................................................................... xiv

ABSTRACT ............................................................................................................... xv

CAPITULO I ............................................................................................................... 1

1.1.- INTRODUCCION. .......................................................................................... 1

1.2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................ 3

1.3 OBJETIVOS: ..................................................................................... 5

1.3.1.- OBJETIVO GENERAL ........................................................................... 5

1.3.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS. .................................................................. 5

1.4.- JUSTIFICACIÓN ........................................................................................... 6

1.5.- HIPÓTESIS ..................................................................................................... 8

1.5.1.- Hipótesis de investigación ........................................................................ 8

1.5.2.-Hipótesis nula ............................................................................................ 8

CAPITULO II .............................................................................................................. 9

2.1.- MARCO TEORICO ....................................................................................... 9

2.1.1.- MEDICINA NATURAL. ............................................................................. 9

2.1.1.1.- Extractos acuosos. ............................................................................. 9

2.1.1.2.- Métodos de obtención de los extractos. ........................................... 10

2.1.1.2.1.- EFS, fluidos supercríticos. ........................................................ 10

2.1.1.2.2.- Extracción por centrifugación. ................................................. 10

2.1.1.2.3.- Extracción en fase sólida. ......................................................... 10

2.1.1.2.4- Extracción por infusión.- ........................................................... 11

2.2.- HIERBA MORA ........................................................................................... 11

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viii

2.2.1.- Familia. ................................................................................................... 11

2.2.2.- Descripción y origen de la planta. .......................................................... 11

2.2.3.- Principios activos y composición química. ............................................ 12

2.2.4.- Propiedades. ............................................................................................ 14

2.2.5.- Indicaciones. ........................................................................................... 15

2.2.6.- Efectos adversos. .................................................................................... 15

2.2.7.- Extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora. .............................. 16

2.2.7.1.- Método de obtención. ...................................................................... 16

2.3.- Micosis Oportunistas. .................................................................................... 16

2.3.2- Factores de Oportunismo. ........................................................................ 18

2.3.2.1- Condiciones de los hongos ............................................................... 18

2.3.2.2.- Factores que dependen del huésped. ............................................... 18

2.3.2.3.- Factores específicos que afectan la distribución de Cándida en la

cavidad bucal. ................................................................................................ 18

2.3.2.4.- Factores sistémicos. ........................................................................ 19

2.3.3.- Patogenia ................................................................................................ 19

2.3.4.- Manifestaciones Clínicas. ...................................................................... 20

2.3.5.- Tratamiento farmacológico. ................................................................... 21

2.4.- Cándida Álbicans. .......................................................................................... 22

2.4.1.- Descripción de la Cepa. .......................................................................... 22

2.4.2.- Taxonomía. ............................................................................................. 23

2.4.3.- Reproducción. ......................................................................................... 23

2.4.4.- Sensibilidad a la Nistatina. ..................................................................... 24

CAPITULO III ......................................................................................................... 25

3.- METODOLOGÍA ............................................................................................... 25

3.1- DISEÑO DE INVESTIGACIÓN. .................................................................. 25

3.2.- SUJETO Y TAMAÑO DE MUESTRA ........................................................ 25

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ix

3.3.- CRITERIOS DE INCLUSIÓN. ..................................................................... 26

3.4.- CRITERIOS DE EXCLUSIÓN. ................................................................... 26

3.5.- SELECCIÓN DE LA MUESTRA. ............................................................... 26

3.7.- ORGANIZACIÓN Y PLANIFICACION DE LA INVESTIGACION. ....... 29

3.7.1.- Infraestructura. ........................................................................................ 29

3.7.2.- Recursos humanos. ................................................................................. 29

3.7.3.- Recursos Utilitarios. ............................................................................... 29

3.7.4.- Diseño de la Investigación. ..................................................................... 31

3.7.4.1.- Preparación de las hojas de la Hierba Mora (Solanum Nigrum). .... 31

3.7.4.2.- Proceso de obtención del extracto de la Hierba Mora (Solanum

Nigrum) .......................................................................................................... 32

3.7.4.3.- Dilución del extracto. ...................................................................... 34

3.7.5.- Medio de Cultivo. ................................................................................... 35

3.7.6.- Activación de la cepa Cándida Álbicans ATCC® 10231™ .................. 36

3.7.7.- Inoculación bacteriana para le experimentación. ................................... 38

3.7.7.1- Aplicación de los extractos sobre los discos y en los cultivos. ........ 39

3.7.7.2.- Incubación de los medios de cultivo. ............................................ 40

3.7.7.3.- Medición de los halos de inhibición. ............................................ 40

3.7.3.4.- Manejo de Bioseguridad y Control. ................................................. 41

3.7.3.5.- Eliminación de Desechos. ............................................................... 42

3.8.- ASPECTOS BIOETICOS. ............................................................................ 43

3.9.1.- Riesgos potenciales del estudio. ............................................................. 44

3.9.2.- Beneficios potenciales del estudio. ......................................................... 44

3.9.3.- Idoneidad ética y experticia técnica del investigador principal. ............. 45

3.9.4.- Idoneidad ética y experticia técnica del tutor. ........................................ 45

3.9.5.- Declaración de conflicto de intereses del investigador principal. .......... 45

3.9.6.- Declaración de conflicto de intereses del turor. ..................................... 45

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x

3.10.- RESULTADOS ESPERADOS. .................................................................. 45

CAPITULO IV ......................................................................................................... 47

4. 1.- ANÁLISIS DE RESULTADOS. .................................................................. 47

4.2.- RESULTADOS. ............................................................................................ 48

CAPITULO V .......................................................................................................... 57

5.1 DISCUSIÓN. ................................................................................................... 57

6.-CONCLUSIONES. .............................................................................................. 60

7.-RECOMENDACIONES. .................................................................................... 61

8.- BIBLIOGRAFIA. ............................................................................................... 62

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xi

LISTA DE TABLAS.

Tabla 1.- Resultados de Inhibición por grupo. .......................................................... 48

Tabla 2.- Estadísticos descriptivos de la distribución de halos de inhibición por

grupo. ......................................................................................................................... 49

Tabla 3.- Prueba de Normalidad mediante estadístico de Kolmogorov Smirnov. .... 51

Tabla 4.- Media y desviación estándar del halo de inhibición por grupo. ................ 51

Tabla 5.- Resultados de la prueba de Kruskal Wallis. .............................................. 53

Tabla 6.- Resultados de la prueba de U Mann Whitney. .......................................... 54

Tabla 7.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans. ..................... 55

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LISTA DE FIGURAS.

Figura 1.- Hierba Mora en su estado Natural. .......................................................... 12

Figura 2.- Recolección y desinfección de la Hierba Mora. ...................................... 31

Figura 3.- Trituración de las hojas de Hierba Mora. ................................................. 32

Figura 4.- Hojas colocadas en el papel filtro y luego en el equipo de Soxhlet ......... 33

Figura 5.- Almacenamiento en envase de vidrio. ..................................................... 33

Figura 6.- Extractos al 50%, 75% y 100% ................................................................ 35

Figura 7.- Colocación del medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck

sobre discos Petri. ...................................................................................................... 36

Figura 8.- Activación de la cepa Cándida albicans ATCC® 10231™ ..................... 37

Figura 9.- Caldo con inóculos de fúngicos en relación con escala estándar

McFarland. ................................................................................................................. 38

Figura 10.- Siembra en el medio de cultivo. ............................................................. 39

Figura 11.- Discos blancos embebidos con el extracto y colocados en las cajas Petri.

................................................................................................................................... 39

Figura 12.- Colocación en la incubadora por un periodo de 24horas. ...................... 40

Figura 13.- Contador de colonias tipo Quebec® y medicion de halos. .................... 41

Figura 14. Cámara de flujo laminar tipo II. .............................................................. 42

Figura 15.- Autoclave derecha esteriliza material contaminado antes de su proceso

final de eliminación. Autoclave izquierda esteriliza material previo a su uso. ......... 43

Figura 16.- Diagrama de caja y bigotes para la distribución de halos de inhibición

por grupo. ................................................................................................................... 50

Figura 17.- Media del halo de inhibición por grupo. ................................................ 52

Figura 18.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans. .................. 56

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xiii

LISTA DE ANEXOS.

Anexo 1.- Certificado de Aprobación por el SEISH-UCE. ....................................... 65

Anexo 2.- Aprobación para el uso y asesoramientos de los Laboratorios de la F.C.Q.

................................................................................................................................... 66

Anexo 3.- Factura de compra de Cándida Álbicans ATCC®10231™. .................... 67

Anexo 4.- Certificado de calidad de la cepa Cándida Álbicans ATCC®10231™. .. 68

Anexo 5.- Instrucciones de uso y activación de la cepa Cándida Albicans® 10231™.

................................................................................................................................... 69

Anexo 6.- Certificado de esterilización de los materiales. ........................................ 70

Anexo 7.- Protocolo de Manejo de Desechos. ........................................................... 71

Anexo 8.- Autorización para el uso de las instalaciones del Depósito de Desechos

Infecciosos. ................................................................................................................ 72

Anexo 9.- Certificado de haber realizado el experimento. ........................................ 73

Anexo 10.- Certificado de idoneidad del autor. ......................................................... 74

Anexo 11.- Certificado de idoneidad del tutor. ......................................................... 75

Anexo 12.- Declaración de conflicto de interés del autor. ........................................ 76

Anexo 13.- Declaración de conflicto de interés del tutor. ......................................... 77

Anexo 14.- Certificado de análisis de resultados. ..................................................... 78

Anexo 15.- Renuncia al trabajo estadístico. .............................................................. 79

Anexo 16.- Certificado de Urkund Analysis Result .................................................. 80

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TEMA.- "ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO ACUOSO DE LA

PLANTA HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) SOBRE CEPAS DE

CÁNDIDA ALBICANS ATCC®10231™”ESTUDIO IN VITRO.

Autor: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.

Tutor: Dra. Marina Dona

RESUMEN

Científicamente se conoce que la Cándida Àlbicans es el hongo que encontramos

con mayor frecuencia en cavidad oral; se caracteriza por ser un patógeno oportunista

de importancia, por tal motivo en este estudio se demostrará una alternativa para el

tratamiento de las patologías causadas por este fúngico, que son de fácil acceso y

bajo costo, nos referimos a las plantas medicinales. Así nos planteamos identificar la

actividad antifúngica de extracto acuoso de las hojas secas de la Hierba Mora en una

concentración de 50%, 75% y 100 % sobre cepas de Cándida Álbicans

ATCC®10231™. Una vez obtenido el extracto de las hojas secas de la Hierba Mora,

mediante la disecación y trituración de la hojas, donde se añadió alcohol potable al

70% se prepararon 15 unidades experimentales en cajas Petri con el fúngico donde

colocamos discos embebidos con el extracto de la planta a concentraciones de 50%,

75% y 100%, se midieron los halos inhibitorios formados alrededor de los discos de

papel, como control negativo agua destilada y como control positivo nistatina, luego

se colocaron en la incubadora por un tiempo de 24 horas a 35 grados. Como

resultado se determinó que la concentración al 100% demostró un pequeño halo de

inhibición mientras que las contracciones de 50% y 75% no demostraron actividad

antifúngica a diferencia de la nistatina.

PALABRAS CLAVES: CÁNDIDA ALBICANS, HIERBA MORA, EXTRACTO

ACUOSO

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THEME. - "ANTIFUNGAL ACTIVITY OF THE AQUEOUS ABSTRACT OF

THE GRASS MORA PLANT (SOLANUM NIGRUM) ON CEDIDA CEPAS

ALBICANS ATCC®10231 ™" IN VITRO STUDY

Author: Cuasés Tetamuez Mishelle Carolina

Tutor: Dra. Dona Vidale Marina Antonia

ABSTRACT

It is scientifically known that Candida Àlbicans is the fungus that we find most

frequently in the oral cavity; It is characterized as an opportunistic pathogen of

importance, for this reason in this study will be demonstrated an alternative for the

treatment of the pathologies caused by this fungal, which are easily accessible and

low cost, we refer to medicinal plants. Thus we set out to identify the antifungal

activity of aqueous extract of the dried leaves of the Black Herb at a concentration of

50%, 75% and 100% on strains of Candida Álbicans ATCC®10231 ™. Once

obtained the extract of the dried leaves of the Black Herb, by means of the dissection

and crushing of the leaves, where 70% drinking alcohol was added, 15 experimental

units were prepared in Petri dishes with the fungal one where we placed disks

embedded with the extract of the plant at concentrations of 50%, 75% and 100%, the

inhibitory haloes formed around the paper discs were measured, as negative control

distilled water and as positive control nystatin, then placed in the incubator for a time

of 24 hours at 35 degrees. As a result, it was determined that the 100% concentration

showed a small halo of inhibition, while the 50% and 75% contractions showed no

antifungal activity, unlike nystatin.

KEYWORDS: CANDIDA ALBICANS, MORA GRASS, AQUEOUS EXTRACT.

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1

CAPITULO I

1.1.- INTRODUCCIÓN.

.

Abdul (1) mencionó que no de los principales fúngicos oportunistas de mayor

importancia en humanos es la Cándida Álbicans, existen diversos tipos de Cándidas

pero más agresivo desde el punto de vista médico y odontológico es el tipo

Álbicans, el cual por sus factores de progresión para causar una enfermedad genera

la Candidiasis. Aguirre (2) aseguró que es un hongo habitual en cavidad oral pero

llega a producir enfermedad cuando existe desequilibrio de sistema inmunitario entre

otros factores predisponentes. (2)

Existen varias terapias farmacológicas para el tratamiento de esta enfermedad para

lograr controlar este fúngico, pero que muchos de estos fármacos además de su costo

elevado causan efectos secundarios no deseados, por eso se ha buscado alternativas

para el control de este fúngico por medio de la medicina natural aprovechando la

biodiversidad que existe en nuestro país. (3)

La Hierba Mora es una planta muy común que existe en casi todos los países del

mundo, perteneciente al familia de las Solanaceae, muy conocidas por poseer

sustancias químicas tipo venenoso, que son glucoalcaliodes como la solanina en

mayor cantidad y alfa-chaconina, solasonina en menor proporción, en este estudio se

pretende obtener mediante un proceso de laboratorio, el extracto acuoso de las hojas

secas de la hierba mora. (4)

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2

Martínez (5) mencionó que la solanina tenía una actividad inhibitoria frente a

Cándida Álbicans ATCC ® 10231™, ya que la ser un veneno invade y envenena al

hongo impidiendo su proliferación debido que impide el potencial de membrana

evitando la colonización en el huésped.

El objetivo de la investigación es determinar la actividad antifúngica mediante un

estudio in vitro del extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora (Solanum

Nigrum), aplicado sobre cepas de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™. A partir de

lo cual se determinará la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima

Antifúngica por que se aplica a diferentes de 50%, 75% y 100%.

El tipo de investigación es experimental in vitro trasversal, operamos con cepas de

Cándida Álbicans ATCC® 10231™ identificadas anteriormente por laboratorios

Microbiológicos e importadas por Medibac – Inc S.A Trabajaremos con 200 gramos

de hojas de Solanum Nigrum, para obtener el extracto acuoso.

TIPO DE MUESTRA. Muestreo por conveniencia que sea dirigido por personal de

la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador. El análisis

de la actividad antifúngica se dará utilizando 3 concentraciones de extracto acuoso de

las hojas secas de Hierba Mora al 50%, 75% y 100%, tres repeticiones de cada una,

utilizando el método de difusión en disco, como control cero se hará con agua

destilada y el control positivo con nistatina.

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3

1.2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Lindhe (6) mencionó que en el gran conjunto de las enfermedades gingivales

de origen micótico la de mayor importancia, fueron originada por Cándida

donde el género Álbicans siendo el más común. Sapp (7) agregó que la

Cándida Álbicans, es un hongo común de la cavidad bucal, que suele

desarrollarse por deterioro de la inmunidad del huésped, causando así

alteraciones que no se manifiestan solo en cavidad bucal sino se extienden e

involucran a la faringe, laringe y el esófago.

De tal manera también Carranza (8) afirmó que las alteraciones de la mucosa

bucal originadas por hongos serían escasas en pacientes inmunocompetentes,

pero muy frecuentes en inmunodeprimidos, o en personas que hayan sido

sometidas a un tiempo prolongado de antibioticoterapia.

Sapp (7) sugirió que existen factores predisponente para la proliferación de

este hongo los cuales menciona la edad, estado inmunológico del huésped etc.

ya que esos factores van a favorecer a la colonización de este

microorganismo, que posteriormente este hongo invadirá tejidos blandos de la

cavidad bucal, provocando Candidiasis oral. (2)

En estudios previos Martínez et al (5) mencionaron la eficacia del extracto

acuoso de las hojas de Hierba Mora sobre Cándida Álbicans, pero no hay

evidencia científica que lo demuestre que el extracto puede perder o no

características químicas fungicidas contra C. Álbicans.

Fuentes (9) aseguró que en la cocción de las hojas se potencializa su efecto

contra Cándida Álbicans, pero solo se han obtenido pruebas en laboratorio

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cultivando Cándida Álbicans y sometiendo al extracto acuoso de las hojas de

hierba mora, obteniendo resultados favorables. Así también Sánchez (4)

argumentó que hace falta realizar más estudios con plantas medicinales para

tratar patologías bucales.

Por lo mencionado anteriormente, esta investigación se realizará con el fin de

determinar la efectividad antifúngica del extracto acuoso de las hojas de

Hierba Mora a diferentes concentraciones de 50%, 75% y 100% de

concentración sobre Cándida Álbicans; ya que se han destacado estudios

donde muestran que inhibe su crecimiento, pero no existe evidencia

científica, de acuerdo al volumen o cantidad exacta de extracto para ser usado

con este fin. Así como también no existe evidencia científica de cómo

utilizarlo, en productos para uso odontológico, para la eliminación de

Cándida Álbicans.

Es así que para definir el problema de esta investigación formulamos la

siguiente pregunta: ¿El extracto acuoso de las hojas de la Hierba Mora tiene

actividad antifúngica sobre Cándida Álbicans inoculada en cultivos?

Por este motivo surge la necesidad de obtener y emplear productos naturales a

base de plantas, que han sido utilizado por personas de muchos países ya que

esta planta crece en casi todos los países; para la prevención y tratamiento de

patologías bucales, de esta manera tendríamos un alternativa de tratamiento

que es natural, fácil de hacer, no es costosa y que si es efectiva, tratando de

evitar los fármacos que comúnmente se utiliza para tratar esta patología.

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1.3 OBJETIVOS:

1.3.1.- OBJETIVO GENERAL

Determinar si existe una actividad antifúngica del extracto acuoso de las

hojas de Hierba Mora (Solanum Nigrum) frente a cepas de Cándida

Álbicans ATCC®10231™ mediante un diseño experimental in vitro.

1.3.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

Obtener el extracto acuoso al de las hojas secas de la Hierba Mora

Identificar la actividad antifúngica del extracto acuoso de las hojas de Hierba

Mora a concentraciones de 50%, 75% y al 100% mediante el método de

difusión del disco sobre cepas de Cándida Álbicans ATCC®10231™

inoculados en cultivos estériles.

Comparar el grado de inhibición de los discos impregnados con el extracto de

Hierba mora en sus concentraciones de 50%, 75% y 100% en los cultivos

inoculados con Cándida Álbicans ATCC®10231™

Diferenciar los halos inhibitorios de los discos con extracto acuoso de hierba

mora con los discos de nistatina sobre cepas de Cándida Álbicans

ATCC®10231™.

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1.4.- JUSTIFICACIÓN

Calixto (10) destacó la importancia del uso de plantas dentro de la medicina

tradicional, dicho conocimiento de ciertas especies ha sido escasamente desarrollado,

creando la necesidad de fomentar la investigación acerca de los beneficios de los

recursos naturales, en beneficio de la salud. Así Ansaloni et al. (3) indicaron lo

importante que resultó el uso de plantas medicinales, dentro del campo de la

medicina, para favorecer la ꞌsaludꞌ y el ꞌbienestarꞌ

Martínez (5) sugirió la importancia de desarrollar investigaciones con extractos de

ciertas plantas; dentro de su estudio destacó que el extracto acuoso de las hojas secas

de hierba mora, posee sustancias químicas que ayudan a detener el crecimiento y

desarrollo de microorganismos como hongos y bacterias. Indicó Sánchez (4) que el

compuesto más importante que actúa como antibacterianos y antifúngicos contra

microorganismos como el hongo Cándida Álbicans es la solanina que resultó ser

como un potente veneno para el fúngico.

Por lo que Martínez (5) mencionó la importancia del estudio de dichas sustancias

naturales en el beneficio de la salud bucal, logrando un uso adecuado de las mismas,

bajo un sustento científico.

Se desarrollará la conceptualización de medicina natural, por ende hablaremos de

plantas medicinales y la fitoterapia, para concentrarnos específicamente de la planta

Hierba Mora, especies, descripción botánica, propiedades y usos terapéuticos. Se

profundizará el conocimiento de la planta Hierba Mora, ya que existen datos

antropológicos y etnobotánica por parte de la medicina ancestral, pero propician de

un sustento científico. Así mismo se encontró estudios de su composición y

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características químicas, que nos llamó la atención y nos dedicamos investigarla

para lograr comprobar su efectividad. (11)

Consiguiente describiremos la composición química, propiedades, mecanismo de

acción y actividad biológica con el objetivo de determinar efectividad antimicótica

del extracto acuoso de las hojas secas de la planta hierba mora en una concentración

de 50%, 75% y 100% sobre cepas de Cándida Álbicans de cultivos estériles, donde

se observará los halos inhibitorios de este microorganismo, para sugerir que dicha

planta sea utilizada, como control de patologías que afectan a la mucosa oral, que el

mencionado hongo sea el causante.

Con esta investigación esperamos resultados positivos para inhibir C. Álbicans, y

así podemos contribuir a un posible tratamiento natural, de bajo costo, accesible a

personas de bajos recursos económicos que no tienen acceso a la salud oral integral,

mejorando su calidad de vida. Esto servirá entonces como un precedente para

siguientes estudios y la posibilidad de emplear en productos antimicóticos contra

alteraciones buco dentales, que afectan a la población.

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1.5.- HIPÓTESIS

1.5.1.- Hipótesis de investigación

H1. El extracto acuoso de las hojas de la planta Hierba Mora tiene acción

antifúngica sobre las cepas de Cándida Álbicans ATCC®10231™.

1.5.2.-Hipótesis nula

H0. El extracto acuoso de las hojas de la planta Hierba Mora no tiene

acción antifúngica sobre las cepas de Cándida Álbicans

ATCC®10231™.

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CAPITULO II

2.1.- MARCO TEÓRICO

2.1.1.- MEDICINA NATURAL.

Jiménez (12) mencionó que el uso de medicina natural, está relacionado

con la evolución del hombre y su raciocinio, por estar en íntimo contacto

con la naturaleza y mediante la observación de costumbres de otros

animales, ha logrado tener conocimientos empíricos así como también

experiencia con respecto al uso de plantas medicinales, dando origen a la

medicina natural.

Es así que Castro et al. (13) aclararon que los productos a base de

plantas medicinales podrían ser seguros y efectivos, aunque no están

sustentados con suficientes bases científicas. Sánchez (4) confirmó que la

fitoterapia es una alternativa para tratamientos de varias enfermedades

así es que Torres (14)sugirió que se debe hacer constantemente

múltiples investigaciones con plantas para obtener bases científicas y

poder difundir esta clase de medicina.

2.1.1.1.- Extractos acuosos.

Bruneton (15) explicó que las plantas luego de ser sometidas a varios

procesos se puede obtener los extractos, que consisten en la fracción

no volátil de los principios activos, es decir, que al no ser

volatilizables o ser inestables con la temperatura, no se pueden

obtener mediante destilación.

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2.1.1.2.- Métodos de obtención de los extractos.

2.1.1.2.1.- EFS, fluidos supercríticos.

Bruneton (15) determinó que un fluido supercrítico es una

sustancia, que mediante operaciones mecánicas, cumpliendo

condiciones operativas de presión y temperatura, se sitúa por

encima de su punto crítico, pero por debajo de la presión que hace

falta para condensarlo en un sólido.

Saiz (16) también argumentó que se utiliza gases como el CO2 a

elevada presión, en estado líquido o supercrítico, en lugar de

disolventes clorados, que producen residuos tóxicos, la extracción

suele durar unas 24 horas que se lo puede acelerar manualmente.

2.1.1.2.2.- Extracción por centrifugación.

Bruneton (15)explicó que los extractos obtenidos por este proceso

poseen características aromáticas superiores a las conseguidas por

extracción por arrastre de vapor, no es un proceso térmico, por

ello sus propiedades son más estables, por los antioxidantes

naturales presentes. A pesar de ello, la fricción interna de la

materia prima produce una elevación de temperatura no

controlable que puede implicar una degradación térmica y un

oscurecimiento del extracto. (15)

2.1.1.2.3.- Extracción en fase sólida.

Bruneton (15) menciona que se emplean columnas o cartuchos

capaces de retener el analito, que se extrae posteriormente con un

pequeño volumen de disolvente.

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2.1.1.2.4- Extracción por infusión.-

Saiz (16) aconsejó que se debe disecar el vegetal del cual se

requiere el extracto para lego ser molidos o triturados y ser

vaciados en agua a punto de ebullición y dejar reposar para

posteriormente ser guardados en frascos rotulados.

2.2.- HIERBA MORA

2.2.1.- Familia.

Ugaz (17) sugirió que la Hierba Mora proviene de:

Nombre vulgar: “Hierba Mora

REYNO: PLANTAE

DIVISION: MAGNOLIOPHYTA

CLASE: MAGNLIOPSIDA

SUB CLASE: ASTERIDAE

ORDEN: SOLANALES

FAMILIA: SOLANACEAE

GENERO: Solanum.

ESPECIE: Solanum Nigrum

2.2.2.- Descripción y origen de la planta.

Suags (18) la describe como una planta morfológicamente muy variable,

tallos cortamente pubescentes o glabros, peciolos de 12 a 50 mm de largo, sus

hojas a menudo en pares, aovadas, enteras o sinuado-dentadas, de 5 a 10 cm

de largo y 1 a 5 cm de ancho, fruto carnoso, globoso y negro al madurar,

llegan a mediar hasta 60cm.

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Figura 1.- Hierba Mora en su estado Natural.

Elaboración.- Cantón Espejo, provincia del Carchi. Fecha.- 10/01/2018

Fuente.- Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez

Ansaloni (3) argumenta que es una planta silvestre y anual, que se propaga

por semillas y no requiere de cuidados especiales para su desarrollo, se

originan en regiones templadas y tropicales de todo el mundo, para esta la

investigación la hierba mora la tomaremos de la región sierra (Provincia del

Carchi).

2.2.3.- Principios activos y composición química.

Gao (19) mencionó que esta planta está compuesta de esta manera.

Glucoalcaloides: Solanina, alfa-solanina, solasonina, solanigrina, alfa-

chaconina.

Gao (19) afirmó que los glucoalcaloides del género Solanum son

alquilaminas esteroidales con el esqueleto C27 del colestano que se

encuentran en la planta en forma de glicósidos, son derivados de esteroides,

biogenéticamente muy relacionados a los triterpeniodes tetracíclicos, del

ciclopentanoperhidrofenantreno.

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Ugaz (17) agregó que se los conoce como metabolitos de estrés ya que son

importantes en el control de algunas enfermedades por hongos y por

nematodos e insectos.

Solanina.- Produce disminución de la actividad motora, aceleración de la

velocidad respiratoria, efectos inotrópicos positivos similares al glicósido

cardiotónico K-estrofantósido y efecto hemolítico (20). Así también Gao

(19)incluye también que el mecanismo tóxico de la solanina se da por la

interacción química con las membranas mitocondriales.

La exposición a la solanina abre los canales de potasio de la mitocondria, así

se disminuye el potencial de la membrana, haciendo que el ión Ca2+ pase de

la mitocondria al citoplasma, creando un incremento de la concentración del

mismo lo que provocaría los daños celulares y apoptosis. (19)

solamargina y solasonina.- alteran el potencial de membrana y canales

iónicos (20).

Alfa-chaconina y alfa-solanina alteran el potencial de membrana y el

transporte activo de sodio estas moléculas al igual que la alfa-tomatina,

favorecen la pérdida de componentes celulares (iones, Ca2+ y proteínas), por

desestabilización de la membrana celular y actividad cardiotónica. (22)

Taninos: Son compuestos polifenólicas soluble en agua, alcohol, y acetona

no nitrogenadas de origen vegetal, se encuentra en las raíces, la corteza, y

escasamente en las hojas son de sabor astringente y son muy utilizados por

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sus propiedades antibacteriana, antioxidantes, antisépticas, vasoconstrictoras,

astringentes, cicatrizantes, antidiarreicas. (39)

Saponina: Son un grupo de glucósidos naturales solubles en agua y poseen

propiedades diuréticas, digestivas, antiinflamatorias, expectorantes,

antimicrobianas, anticancerígenas y antiespasmódicas. (9)

Flavonoides: Quercitina

Quercitina.- Muñoz (23)afirmó que proporciona el color a flores, frutas,

hortalizas con propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antihistamínicas,

ofrece una variedad de posibles usos terapéuticos, principalmente en la

prevención y tratamiento de las siguientes condiciones:

Tratamiento para alergias.

Asma.

la urticaria.

inhibe la liberación de histamina de los basófilos y los mastocitos

Aftas.

Diabetes mellitus, cataratas, trastornos de la retina, enfermedades

nerviosas, y otras complicaciones de la diabetes.

2.2.4.- Propiedades.

Se le atribuye ciertas propiedades que aún no están científicamente

comprobadas pero que han dado un gran resultado, Vernal (19)mencionó que

la planta actúa como cicatrizante, calmante, narcótica, anti herpética,

antihemorroidal, analgésica, antifúngica, antiséptica, pediculicida. Lizarazo

(25) aseguró que es de buena utilidad en la agricultura por ser un planta

venenosa en altas cantidades s la prepara para ser empleada como insecticida.

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2.2.5.- Indicaciones.

Vernal (20)mencionó que esta planta era muy utilizada por nuestros ancestros

muy efectiva para lavados vaginales, en el tratamiento de las afecciones de la

piel y los ojos. Suags (18) recomendó para tratamientos de aftas bucales.

Torres (14) agregó que se puede utilizar en curación de heridas superficiales

para resfriados tratamientos gastrointestinales urticarias. Martínez (5) afirmó

que fue una gran alternativa para el tratamiento de las afecciones

oportunistas de la Cándida Álbicans dando un buen resultado para su

eliminación.

2.2.6.- Efectos adversos.

Sánchez. (21) relacionó los efectos adversos de acuerdo a la cantidad de

ingesta de la planta; si se excede más de 30mg resulta ser tóxico, actúa como

un veneno, en casos más graves afecto el sistema nervioso. Sacha (26) replicó

que la toxicidad por solanina que se da por el consumo de frutos y hojas,

puede llevar a la muerte.

Gao (19) destacó que el envenenamiento por solanina se manifiesta con

problemas gastrointestinales y neurológicos, con síntomas como nausea,

diarrea, vómito, calambres estomacales, ardor en la garganta, arritmia

cardiaca, dolor de cabeza y mareo.

Kuklinki (21) aseveró que los casos más severos incluyen alucinaciones,

entumecimiento, parálisis, ictericia, fiebre, dilatación de las pupilas e

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hipotermia, en altas dosis, el envenenamiento por solanina puede causar la

muerte. Luego de estudios realizados Gao (19)confirmó que dosis de 2 a 5

miligramos por kilo de peso corporal pueden causar síntomas tóxicos, y dosis

de 3 a 6 miligramos por kilo pueden llegar a ser fatales

2.2.7.- Extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora.

Calixto (10)afirmó, que el extracto se lo puedo obtener de todas las especies

de Solanum ya que presentan el mismo principio activo y con similares usos

terapéuticos. Lizarazo (25) resaltó que es utilizado en muchos países por sus

efectos insecticidas utilizados en la agricultura. Martínez (5) destacó que el

extracto tiene actividad antifúngica. La solanina es el componente primordial

del extracto acuoso de la Hierba Mora.

2.2.7.1.- Método de obtención.

Se empleará el método extracción por infusión de la planta

previamente disecada y triturada añadiendo alcohol potable al

70%.

2.3.- Micosis Oportunistas.

Aguirre (2) explicó que las infecciones provocadas por hongos han

incrementado su frecuencia y su importancia clínica, en épocas anteriores las

micosis bucales estaban asociadas con condiciones tales que tienen relación

con un sistema inmunológico deteriorado. Ceccoti (26) enunció que en las

personas con cánceres destructivos, quemaduras, diabetes, mal nutrición,

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tratamientos prolongados con corticoides, entre otros; favorece la colonización

de esta levadura.

Por otra parte el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene (27) mencionó que;

la ‘candidiasis oral’ en la población normal estuvo presente entre un ‘40%’ y

‘60%’considerándose más frecuente en el paciente geriátrico debido a factores

generales y locales.

Rodríguez (29) definió como una enfermedad micótica causada por cualquiera

de las especies del género Cándida, determinándose como una enfermedad

oportunista, muy frecuente en nuestros días, en la que siempre debemos

investigar la presencia de factores favorecedores del crecimiento y

transformación patógena del germen.

Rodríguez el at.(29) aclararon que Candidiasis Oral es una enfermedad

cosmopolita muy frecuente siendo una de las micosis más importantes, con

mayor frecuencia en la cavidad bucal; afecta a ambos sexos, a cualquier edad,

aunque son más frecuentes en los extremos de la vida.

Granados (30) agregó que estos hongos son habitantes habituales en boca,

sistema gastrointestinal, piel y vagina, por lo que se consideran agentes

infecciosos endógenos específicos, que logran proliferar cuando el huésped no

se encuentra inmunocompetente.

Cecoti (27) sugirió que son poco virulentos, no son transmisibles y solo

producen infección de la mucosa en presencia de una predisposición local o

general manifiesta o ambas.

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2.3.2- Factores de Oportunismo.

2.3.2.1- Condiciones de los hongos

.Aguirre (2) mencionó que estas son los factores de oportunismo:

Soportar temperaturas de 37°C. (2)

Producir un cambio bioquímico, debido a que le huésped es ricos en enzimas

y el hongo las aprovecha. (2)

Cambian de forma, el hongo reduce su tamaño. (2)

Poseer los factores de virulencia. (2)

Relación con el huésped. (2)

2.3.2.2.- Factores que dependen del huésped.

Por utilizar esteroides inhalados

Dieta altas en carbohidratos

Xerostomía

Por uso de prótesis

Granados (30)

2.3.2.3.- Factores específicos que afectan la distribución de Cándida

en la cavidad bucal.

Granados (30)manifestó que la C. Álbicans absorbe mucinas salivales, lo que

le facilita la adhesión a las superficies inorgánicas como las prótesis

La C. Álbicans prolifera en un medio bucal con pH ácido. (30)

Existe cambio en la capa externa de la pared celular de la C. Álbicans debido

a la variación de proteínas que las hace hidrofóbicas que se unen sin

dificultad a los tejidos y la parte hidrofílicas se cree q se une por medio de

fuerzas denominada London-Van der Walls, que son fuerzas electrostáticas.

(2).

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2.3.2.4.- Factores sistémicos.

Inmunosupresión. (8)

De acuerdo con la edad muy joven o de avanzada edad. (8)

Deficiencias nutricionales. (8)

Uso de antibióticos de amplio espectro por largo tiempo. (8)

Trastornos endocrinos como diabetes. (8)

Enfermedades como hepatitis, tuberculosis. (8)

2.3.3.- Patogenia

Liébana (31)aclaró que los Hongos tipo Cándida tienen numerosas

moléculas en su superficie directamente responsable de la adherencia a los

tejidos del huésped, entre las que se encuentran:

a. Un receptor homólogo de la integrina humana CR 3, que se une con los

grupos argininaglicina-ácido aspártico (RGD) de C3bi, fibrinógeno,

fibronectina y laminina. (31)

b. Una lectina que se une con los azúcares de las células epiteliales. (31)

c. Proteínas con manosa que se unen con las moléculas similares a lectina de

las células epiteliales. (31)

Rodríguez (29) mencionó otros factores de virulencia, como la

aspartilproteinasa, que ayuda en la invasión tisular destruyendo las proteínas

de la matriz extracelular y una adenosina secretada que bloquea la

producción de radicales de O2 en los neutrófilos y su degranulación.

Finalmente, la transición de formas levaduriformes a hifas es importante

para la virulencia del hongo, ya que parece que las hifas brotan fuera de las

células, que las absorben.

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2.3.4.- Manifestaciones Clínicas.

Depende del sitio afectado lo recalcó Palacios (32)

a.- A nivel Cutáneo.- Palacios (32) destacó que es más frecuente en

diabéticos por el alto contenido de glucógeno en piel y acidez elevada, se

manifiesta como erosiones que no sangran y en el fondo se observa rojo

brillante, sensación de ardor o quemazón que se presenta en axilar,

interglúteo, inguinal, submamario, suprapúbico y en uñas degenerando el

tejido.

b.- A nivel Muco-cutánea. Ryan (33)observó lesiones eritematosas con

material blanquecino o lechoso, por la formación de una película o

pseudomembrana, que cubre la lengua, carrillos y paladar, muy frecuente en

recién nacidos inmunodeprimidos y desnutridos, también se presenta en

pacientes diabéticos por medicación constante, otra manifestación es la

queilitis angular.

- Palacios(32) afirmó que se manifiesta en mucosa vaginal por consumo de

ATB, embarazadas o anticonceptivos orales, se presenta con secreciones

grumosas blanquecinas con un aspecto de leche cortada, prurito intenso, en

hombres se presenta zonas eritematosas o pseudomembranosas en la parte del

glande o en el surco balano-prepucial.

- Candidiasis mucocutánea crónica.- Palacios(32)mencionó que es un

síndrome infeccioso raro y heterogéneo que afecta a niños con defectos

genéticos (inmunodeficiencias), se desarrolla en los primeros años de vida a

manera de un eritema en piel que evoluciona a lesión hiperqueratósica y en la

mucosa bucal por lo tanto se observa glositis, queilitis, onixis, perionixis,

infección del grande y pequeños pliegues producidos por Cándida.

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- Palacios (32) agregó que puedo involucrar mucosa digestiva; esófago,

estómago e intestino. La afección esofágica puede ser parte del afta que se

inicia en la boca, odinofagia, disfagia, dolor retroesternal, hemorragia,

náuseas, vómitos, aunque el cuadro puede ser asintomático.

c.- Candidiasis Profunda o Invasiva. Palacios (32)mencionó que las

principales rutas de invasión de las levaduras son vía catéteres endovenosos

(a nivel hospitalario) y por penetración a través de la mucosa intestinal

(involucra a las especies que colonizan previamente el tracto gastrointestinal).

d.- Enfermedad alérgica: Ciancio (34) argumentó que algunos pacientes

presentan cuadros alérgicos por sensibilización a los antígenos de Cándida,

por lo que se observa; eczemas, gastritis, enteritis u otras manifestaciones

clínicas. Pueden verse lesiones vesiculosas en piel que se localizan en

espacios interdigitales de manos y pies u otras localizaciones que por lo

general son estériles.

2.3.5.- Tratamiento farmacológico.

El Instituto Nacional e Higiene (28) sugirió que para el tratamiento de

candidiasis mucosas y cutáneas, se emplean antifúngicos del grupo

azoles, los cuales encontramos en lociones, pomadas, cremas tópicas y

supositorios. Solo en infecciones profundas recurriremos a tratamientos

sistémicos, utilizando fármacos como fluconazol y la nistatina.

Rodríguez (29) aconsejó que lo mejor es evitar la interferencia con el

equilibrio de la flora microbiana y las defensas del huésped ya que se

puede alterar y favorecer la colonización del fúngico; como medidas de

precaución, se debe suprimir los irritantes, tales como los alimentos

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demasiado calientes, ácidos y picantes, el tabaco y alcohol.

Se dispone en general de las siguientes alternativas terapéuticas: (29)

a.-Control de factores predisponentes. (29)

b.-Colutorios. (29)

c.-Antimicóticos específicos tópicos y/o sistémicos en uso tópico (29)

- Derivados poliénicos: Nistatina, Anfotericina B.

- Derivados imidazólicos: Miconazol, Ketoconazol, Clotrimazol,

Econazol.

- Derivados triazólicos: Fluconazol, Itraconazol.

d.-Tratamiento sistémico: se utilizan los derivados imidazólicos y

triazólicos, así como en casos muy excepcionales la Anfotericina

B.7(29)

2.4.- Cándida Álbicans.

Negroni (35)enunció que los hongos del género Cándida son levaduras, es decir que

son unicelulares.

2.4.1.- Descripción de la Cepa.

Sapp et al. (7) mencionaron que estos microorganismos se muestran como

levaduras en gemación o también como seudohifas; se las observó en

cadenas de células alargadas enlazadas entre ellas. Sin embargo Liébana

(31) explicó que la Cándida se puede presentar como una célula redonda u

ovalada.

INH (28) afirmó que son de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en

pequeños grupos, mientras que, en forma de hongo filamentoso, las células

se alargan y se diversifican tomando la apariencia de filamentos, pseudo-

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hifas o pseudo-micelio. Liébana (31) mencionó que presentaron un

metabolismo aerobio siendo así gram positivas.

2.4.2.- Taxonomía.

Hooper (36) determinó de esta manera:

Reino: Fungi

Clase: Saccharomycetes

Orden: Saccharomycetales

Familia: Saccharomycetaceae

Género: Cándida

Especie: C. Álbicans

2.4.3.- Reproducción.

Ryan(33) manifestó que la Cándida Álbicans se reproduce por medio de

gemación mediante la formación de blastoconidias, puede formar hifas,

estimulada por temperatura, pH y nutrientes, las hifas en las etapas

iniciales, tienen el aspecto de retoños, denominados tubos germinales,

las seudohifas, son formas elongadas con restricciones a intervalos,

carecen de paredes paralelas y de la tabicación que se observa en las

hifas verdaderas. (37)

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2.4.4.- Sensibilidad a la Nistatina.

Este medicamento es empleado en infecciones por hongos de tipo oral,

vaginal, intestinal, cutáneo y esofágico.

Barata (38) señaló que la nistatina es un medicamento de tipo poliénico,

con poca absorción intestinal a dosis bajas, que se aísla en cultivos de

streptomyces noursei, es un medicamento capaz de impedir el

crecimiento fúngico.

Barata (38) concluye que la nistatina a más de erradicar el origen de las

molestias como medicamento antifúngico tópico cada ocho horas

ayuda a desaparecer la presencia del hongo en la cavidad bucal.

Se elimina por vía renal, se emplea en infecciones fúngicas de piel y

mucosas, tales como la candidiasis o la estomatitis.

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CAPITULO III

3.- METODOLOGÍA

Con la aprobación del Subcomité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la

Universidad Central del Ecuador SEISH-UCE podemos realizar la investigación.

(VER ANEXO 1)

3.1- DISEÑO DE INVESTIGACIÓN.

Experimental.- Porque identificó actividad antifúngica del extracto

acuoso de las hojas secas de hierba mora sobre cepas de Cándida

Álbicans ACCT®10231TM .Se llevó a cabo con la aprobación de la Dra.

Isabel Fierro Decana en la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Central del Ecuador. (VER ANEXO 2)

In Vitro.- El experimento se realizó en un ambiente cerrado fuera del

organismo.

Comparativo.- Se determinó que a la máxima concentración de extracto

se logró un halo de inhibición pequeño y se observó la mayor actividad

de la nistatina.

3.2.- SUJETO Y TAMAÑO DE MUESTRA

-Trabajamos con cepas de Cándida Álbicans ATCC® 10231™ importadas

anteriormente por Medibac – Inc S.A.

-Se requirió 2 kilogramos de hojas secas de hierba mora traídas de la Provincia

del Carchi, con lo que se preparó el extracto acuoso.

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-Para el método de difusión en disco, utilizamos 15 cajas Petri con medios de

cultivo Sabouraud-Dextrosa con agar inoculados con Cándida Álbicans ATCC

®10231™, con concentraciones obtenida del extracto acuoso de la hierba

mora al 50%, 75% y 100%, nistatina, la cual fue control positivo y para el

control negativo con agua destilada.

3.3.- CRITERIOS DE INCLUSIÓN.

Multiplicación de cepas de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™

Cepas de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™ que no hayan tenido contacto

con ningún tipo de reactivo.

Extracto acuoso de la Hierba Mora que sea del tipo (Solanum Nigrum)

3.4.- CRITERIOS DE EXCLUSIÓN.

Cultivos de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™ que se hayan contaminado

con otros microorganismos.

Hongos tipo Cándida Álbicans ATCC que no han sido cultivadas bajo las

condiciones adecuadas para su crecimiento.

3.5.- SELECCIÓN DE LA MUESTRA.

Cepa liofilizada de Cándida Álbicans ATCC ® 10231™ importadas por

Laboratorios Medibac – Inc S.A, en condiciones y temperatura apropiada.

(VER ANEXO 3)

Hojas secas de la planta Hierba Mora un aproximado de 150mg traída de la

Provincia del Carchi

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3.6.- DEFINICIÓN OPERACIONAL DE LAS VARIABLES

VARIABLE DEFINICIÓN OPERACIONAL TIPO CLASIFICACION INDICADOR CATEGÓRICO ESTANDARIZACIÓ

N

Actividad

antifúngica

Característica química del extracto acuoso

de las hojas secas de la hierba mora;

capacidad de alcanzar el efecto deseado,

tras un procedimiento alcanza la acción.

Dependiente Cualitativa

Nominal

Halo de inhibición Dirigido por la Dra.

Rachide Acosta

responsable del área

de Laboratorio

Químico y

Bacteriológico de la

Facultad de Ciencias

Químicas. Extracto acuoso al 50%,

75 y 100% de las hojas

secas de hierba mora

Sustancia química proveniente de la

desecación de las hojas de la hierba mora

para luego someterse a infusión.

Independiente Cuantitativa

Intervalo

Halo de actividad anti

fúngica

Elaborado por el

Biólogo Darwin

Roldan.

Cándida Álbicans ATCC

® 10231™ CEPA Es un hongo diploide asexual (forma de

levadura) y saprófito, de la familia de los

Sacaromicetos.

Dependiente Cuantitativo Grado de crecimiento Dirigido por la Dra.

Rachide Acosta

responsable del área

de Laboratorio

Químico y

Bacteriológico de la

Facultad de Ciencias

Químicas.

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Nistatina

Antifúngico potente muy utilizado en cantidad

de 100.000 U

Independiente Cuantitativa

Mínima concentración

antifúngica

Dirigido por la Dra.

Rachide Acosta

responsable del área

de Laboratorio

Químico y

Bacteriológico de la

Facultad de Ciencias

Químicas.

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3.7.- ORGANIZACIÓN Y PLANIFICACION DE LA INVESTIGACION.

3.7.1.- Infraestructura.

- Instalaciones de los Laboratorios de Análisis Clínico y Bacetariológico del

departamento de Ofertas Servicios y Productos de la Facultad de Ciencias

Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

- Uso del Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Ciencias

Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

- Unidad de Titulación de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del

Ecuador.

3.7.2.- Recursos humanos.

Con los permisos requeridos se obtuvo la colaboración de la Dra. Rachide

Acosta quien se fue la encargada de la supervisión del proceso experimental,

al Bioquímico Darwin Roldan que colaboró en la elaboración del extracto,

realizando las respectivas diluciones, al Ing. Juan Carlos Túquerres, quien

ayudó con la recepción de los datos para elaborar los respectivos cuadros y

tablas estadísticas para comparar resultados y el personal designado de la

Facultad de Odontología encargados de evaluar los avances y trabajos finales

del presente estudio para que los resultados puedan ser confiables.

3.7.3.- Recursos Utilitarios.

MATERIALES.

Guantes.

Hisopos.

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Discos de papel filtro de 6mm de diámetro.

Mascarilla.

Mandil.

Gafas.

EQUIPOS.

Autoclave.

Incubadora.

Cabina de flujo laminar II.

Refrigeradora.

Equipo tipo Quebec.

Estufa.

INSTRUMENTOS.

Cajas Petri.

Tubos de ensayo.

Pipetas.

Puntas para pipetas.

Asas bacteriológicas.

Gradilla.

MATERIAL BIOLÓGICO.

Extracto de las hojas secas de Hierba Mora

Nistatina 30mg/ml

Agua destilada.

Agar Sabouraud dextrosa.

Solución MacFarland 0.5

Cepas liofilizada de Cándida Álbicans ATCC®10231™

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3.7.4.- Diseño de la Investigación.

3.7.4.1.- Preparación de las hojas de la Hierba Mora (Solanum Nigrum).

Recolección.

Se recolectaron las hojas de la Hierba Mora (Solanum nigrum) en la provincia del

Carchi cantón Espejo. Los cuales fueron desinfectados con Lysol, desechando las

partes marchitas. Luego se disecaron a temperatura ambiente durante tres días en un

ambiente donde no hay luz natural ni artificial colocados en recipientes limpios y

secos, posteriormente se empaquetó 2 kilogramos de lo recolectado en un recipiente

hermético y seco, se transportó las hojas hasta la ciudad de Quito, a los Laboratorios

de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

Figura 2.- Recolección y desinfección de la Hierba Mora.

Elaboración.- Cantón Espejo, provincia del Carchi. Fecha.- 9/03/2018

Fuente.- Cuasés Tetamuez Mishelle Carolina.

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Siguiente a esto la muestra fue triturada en un mortero y se depositaron en un

recipiente limpio y seco forrada con papel Kraft listas para su utilización.

Figura 3.- Trituración de las hojas de Hierba Mora.

Elaboración.- Laboratorio de la F.C.Q. Fecha.- 12/03/2018

Fuente.- Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez

3.7.4.2.- Proceso de obtención del extracto de la Hierba Mora (Solanum

Nigrum)

El procedimiento para obtener las sustancias se basó en la extracción

sólido-líquido, donde se procedió a pesar las hojas de dicha planta, se

obtuvo 100g y se colocó en un cartucho de material poroso que se lo puso

en el equipo Soxhlet, añadiendo con el alcohol potable al 70% que actuó

como solvente para obtener el extracto de las hojas y filtrando de esta

forma el extracto en un recipiente estéril.

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Figura 4.-Hojas colocadas en el papel filtro y luego en el equipo de Soxhlet

Elaboración.- Laboratorios de la F.C.Q. Fecha.- 19/03/2018

Fuente.- B.F. Darwin Roldan.

El extracto obtenido se almacenó en un recipiente de vidrio que no permita

el paso de la luz solar, cerrados herméticamente y colocados a refrigeración

y con la debida rotulación.

Figura 5.-Almacenamiento en envase de vidrio.

Elaboración.-Laboratorios de la F.C.Q. Fecha.- 20/03/2018

Fuente.- Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.

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3.7.4.3.- Dilución del extracto.

Luego de esperar la evaporación del alcohol durante una semana se precedió a

realizar las diluciones del extracto que de acuerdo a nuestro experimento se

realizaron 2 diluciones al 50% 75% con agua destilada, la concentración del 100%

no requiere dilución es el extracto puro, para realizar las diluciones se aplicó la

siguiente fórmula.

VICI= V2C2

Dónde:

V1 = Volumen de extracto concentrado.

C1= Concentración del extracto.

V2 = Volumen de extracto diluido a preparar.

C2 = Concentración del extracto diluido.

De esta manera se preparó 30 ml de solución del extracto de Hierba Mora al 50% a

partir de la solución al 100%.

V1 = C2V2 = (50%) (30ml)

C1 (100%)

V1 = 15ml del extracto de hierba mora.

VH2O = 15ml de agua destilada.

V1 + VH2O = 15ml + 15ml

VT = 30ml de extracto de hierba mora al 50%

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De esta manera se preparó 30 ml de solución del extracto de Hierba Mora al 75% a

partir de la solución al 100%.

V1 = C2V2 = (75%) (30ml)

C1 (100%)

V1 = 22.5ml del extracto de hierba mora.

VH2O = 7.5 ml de agua destilada.

V1 + VH2O = 22.5ml + 7.5ml

VT = 30ml de extracto de hierba mora al 75%

.Figura 6.- Extractos al 50%, 75% y 100%

Elaboración.-Laboratorios de la F.C.Q. Fecha.- 21/03/2018

Fuente.- Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.

3.7.5.- Medio de Cultivo.

Se utilizó el medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck, ya que es el

adecuado para el crecimiento de levaduras y hongos, en éste caso de Cándida

Álbicans. Es el medio selectivo recomendado por el Laboratorio de Análisis

Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química de la Universidad Central del

Ecuador.

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Figura 7.- Colocación del medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck sobre

discos Petri.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 19/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez

3.7.6.- Activación de la cepa Cándida Álbicans ATCC® 10231™

La cepa de Cándida Álbicans ATCC® 10231™ fue importada en rigurosas

condiciones de temperatura, en estado de liofilización en su envase KWIK-

STIK™. (VER ANEXO 4)

Para activación la cepa se la retiró de refrigeración y dejó a que se equilibre a

temperatura ambiente por 20 minutos, luego se siguió las recomendaciones de

apertura y uso con aproximadamente 10 pasos propuestas por el fabricante. (VER

ANEXO 5)

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Fueron incubadas a temperatura 35°c por 24 horas en el Laboratorio de Análisis

Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química de la Universidad Central del

Ecuador.

Figura 8.- Activación de la cepa Cándida albicans ATCC® 10231™

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 20/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.

Como referencia de turbidez se utilizó la estandarización de turbidez de 0,5

McFarland y se comparó visualmente con el caldo del inóculo previamente

elaborado con la cepa Cándida Álbicans ATCC® 10231™ para determinar que la

cantidad de bacterias por mililitro esté dentro de los índices preestablecidos. Se

obtuvo una escala de 1.5 x 109 u.f.c/ml de Cándida Álbicans ATCC® 1023™

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Figura 9.- Caldo con inóculos de fúngicos en relación con escala estándar McFarland.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 26/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.

3.7.7.- Inoculación bacteriana para le experimentación.

Se sembró el fúngico sobre el medio de cultivo Sabouraud Dextrosa 4% Merck

localizado en las cajas Petri, previamente realizado la estandarización McFarland,

mediante un hisopo estéril el cuál fue presionado sobre las paredes del mismo para

reducir excesos. La siembra se realizó en diferentes direcciones con la finalidad de

esparcir sobre toda la superficie de la placa la levadura.

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Figura 10.- Siembra en el medio de cultivo.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 26/03/2017 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.

3.7.7.1- Aplicación de los extractos sobre los discos y en los cultivos.

Se colocaron 20 micro litros de la diluciones (50%,75% y 100%) sobre cada disco

de papel con la ayuda de una pipeta. En cada caja Petri se colocó un disco de

control positivo Nistatina 30 mg/ml y un disco para control negativo con agua

destilada.

Figura 11.-Discos blancos embebidos con el extracto y colocados en las cajas Petri.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 26/03/2018Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez

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3.7.7.2.- Incubación de los medios de cultivo.

Se incubó por 24 horas a temperatura de 35 grados.

Figura 12.- Colocación en la incubadora por un periodo de 24horas.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 26/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.

3.7.7.3.- Medición de los halos de inhibición.

Se midieron los halos de inhibición a las 24 horas luego de su incubación,

utilizando una regla milimetrada Merck Sharp & Dohme y un contador de

colonias tipo Quebec. Se detallan los resultados en el capítulo IV.

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Figura 13.- Contador de colonias tipo Quebec® y medicion de halos.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de

Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 27/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez.

3.7.3.4.- Manejo de Bioseguridad y Control.

Este proceso experimental se ejecutó dentro de la cámara de flujo laminar, que es un

equipo cuya función es filtrar el aire contaminado y emitir aire limpio en cada

momento mientras dura el proceso de experimentación. Se trabajó dentro de ésta

cabina para evitar contaminarnos

al respirar partículas de bacterias que afecten la salud, el medio ambiente y evitar a

toda escala que las muestras elaboradas se contaminen.

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Figura 14. Cámara de flujo laminar tipo II.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad

de Química de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 26/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuases Tetamuez.

3.7.3.5.- Eliminación de Desechos.

Los materiales e instrumentos como caja Petri, tubos de ensayo e hisopos que

fueron utilizados durante el proceso de experimentación fueron llevados a un

autoclave específico obviamente clasificados por alrededor de 30 minutos a

134°C, 1,1 atmósferas de presión, el paso final después del enfriamiento por

alrededor de 30min se coloca en fundas rojas rotuladas, pesar, fechar y enviar al

Depósito final de Desechos de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad

Central. (VER ANEXO 6)

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La empresa que retira los desechos infecciosos de la Universidad es la empresa

“EMGIRS-EP”. Toda información adicional en base al manejo de material

infeccioso fue proporcionada por el laboratorio de análisis clínico y bacteriológico

(VER ANEXO 7)

Figura 15.- Autoclave derecha esteriliza material contaminado antes de su proceso final de

eliminación. Autoclave izquierda esteriliza material previo a su uso.

Elaboración: Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química

de la Universidad Central del Ecuador.

Fecha: 28/03/2018 Fuente: Mishelle Carolina Cuasés Tetamuez

3.8.- ASPECTOS BIOÉTICOS.

Este estudio fue experimental, in vitro, se realizó con la aprobación de la Dra.

Isabel Fierro, Decana de la Facultad de Ciencias Químicas quien concedió el

uso de las instalaciones de los Laboratorios de Química del departamento de

Ofertas, servicios y Productos de la Facultad de Ciencias Químicas de la

Universidad Central del Ecuador y del Laboratorio de Análisis Clínico y

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Bacteriológico a cargo de la Dra. Rachide Acosta, quien certifica que se ha

realizado la investigación en sus instalaciones. (VER ANEXO 9)

Por completo esta investigación se llevó a cabo en condiciones controladas, sin

experimentos en seres vivos, solamente con cepas liofilizadas fúngicas que

crecen en aereobiosis, por ello no se requiere un consentimiento informado ni

una declaración de confidencialidad. El análisis de los fundamentos bioéticos,

jurídicos y metodológicos de esta investigación fueron avalados por el Comité

de Ética de la Universidad Central.

3.9.1.- Riesgos potenciales del estudio.

Se cumplió todas las normativas establecidas por los Laboratorios de Facultad

de Ciencias Químicas, se siguió las normas de bioseguridad propuestas por el

laboratorio de análisis clínico y bacteriológico de la Facultad de Química de la

Universidad Central. Por ser un estudio in vitro no se estuvo expuesto a

fluidos.

3.9.2.- Beneficios potenciales del estudio.

Con este trabajo de investigación, se espera que el beneficio sea de la

Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Odontología ya que puede

promover a los estudiantes con futuras investigaciones relacionadas a este

tema.

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Con los resultados obtenidos, el beneficio será para las personas que llegue a

leer sobre este estudio, ya que con el avance científico en un futuro se

pretende motivar a seguir investigando y se opte por el consumo de productos

naturales para tratar patologías producidas por el fúngico en mención, Es una

alternativa de tratamiento que a mas ser eficaz es de fácil acceso elaboración y

bajo costo.

3.9.3.- Idoneidad ética y experticia técnica del investigador principal.

(VER ANEXO 9)

3.9.4.- Idoneidad ética y experticia técnica del tutor.

(VER ANEXO 10)

3.9.5.- Declaración de conflicto de intereses del investigador principal.

(VER ANEXO 11)

3.9.6.- Declaración de conflicto de intereses del turor.

(VER ANEXOS 12)

3.10.- RESULTADOS ESPERADOS.

Se espera obtener un muestreo lo suficientemente amplio para poder determinar

datos en este tipo de estudio; donde se pueda establecer la acción inhibitoria del

extracto acuoso de las hojas secas de Hierba Mora frente a la cepa C. Álbicans.

Datos que servirán para visualizar el beneficio que se tiene hoy en día, al utilizar

tratamientos a base de medicina natural como tratamientos antifúngicos.

Con esto se espera obtener información valiosa que ayude a que en un futuro se

puedan utilizar colutorios a base de extractos naturales en el tratamiento de

micosis oportunistas que afectan a las mucosas bucales, e ir creando nuevas

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alternativas que sean de fácil acceso para aquellos sectores de bajos recursos

económicos, con lo cual se espera que tengan también acceso a un sistema de

salud bucal a base de medicina natural el cual lo puedan obtener sin ningún

costo.

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CAPITULO IV

4. 1.- ANÁLISIS DE RESULTADOS.

El objetivo de la investigación fue analizar la actividad antifúngica que podría

producir el extracto acuoso de la planta Hierba Mora sobre cepas de Cándida

Álbicans, para ello se llevó a cabo un proceso experimental en el que se midió

en milímetros los halos de inhibición capaces de ser creados por el extracto en

mención sobre el fúngico, la técnica utilizada fue de difusión en agar, y los

resultados fueron avalados por profesionales especialistas.(VER ANEXO 13)

Análisis de la información.

A partir del informe suministrado por el Laboratorio de Ciencias Químicas de

la Universidad Central, se procedió a estimar el valor promedio del halo de

inhibición de cada cepa, mediante el uso de una hoja de cálculo en Microsoft

Excel 2010. Con dicho valor medio se diseñó una base de datos en el programa

SPSS 23 a fin de realizar el procesamiento estadísticos descriptivos e

inferencial.

Se aplicó la prueba de normalidad según Kolmogoron Smirnov, determinándose

que las distribuciones no podrían considerarse como normales por lo cual para la

comparación de la eficacia de las soluciones inhibidoras de Cándica albicans se

debieron emplear las pruebas no paramétricas; en este caso Kruskal Wallis (para

los grupos), U Mann Whitney (para pares) y Chi cuadrado (para nivel de

sensibilidad de las soluciones).

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4.2.- RESULTADOS.

Tabla 1.- Resultados de Inhibición por grupo.

HIERBA MORA (SOLANUM NIGRUM) NISTATINA

AGUA DESTILADA

50% 75% 100%

REPETICIÓN HALOS DE INHIBICIÓN (mm) HALOS DE INHIBICIÓN (mm)

1 6 6 9 20 6

2 6 6 8 23 6

3 6 7 9 25 6

4 6 7 9 24 6

5 6 6 8 23 6

6 6 6 9 25 6

7 6 7 9 24 6

8 6 7 9 25 6

9 6 7 8 23 6

10 6 6 9 25 6

11 6 7 9 24 6

12 6 7 8 24 6

13 6 7 8 25 6

14 6 6 9 23 6

15 6 7 9 24 6

Se observó que en la solución acuosa con Hierba mora al 50%, no se formó halo

de inhibición, al igual que con el control negativo, por ello el valor reportado es

de 6mm que equivale al diámetro del disco de difusión empleado en la

experiencia. Además es evidente que al aumentar la concentración de Hierba

mora, aumentó el diámetro del halo de inhibición, aun cuando estos valores

estuvieron muy por debajo del hallado para el control positivo.

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A partir de estos resultados se procedió a estimar los estadísticos descriptivos

como se indican en las siguientes tablas y gráficas.

Tabla 2.- Estadísticos descriptivos de la distribución de halos de inhibición por grupo.

Se realizó el análisis estadístico descriptivo de cada uno de los grupos en estudio

(cepas), caracterizado por el agente INHIBITORIO. En base a los resultados se

observa que dentro de cada grupo existió homogeneidad del diámetro, y a medida que

se aumentó la concentración de hierba mora, también aumentó el halo formado.

El grupo con solución acuosa al 50% de Hierba mora, al igual que el control negativo

presentaron un valor constante (diámetro del disco 6mm), lo que indicó ausencia de

formación de halo, por ello no se han estimado sus estadísticos descriptivos.

Estadístico Hierba mora

75% Hierba mora

100%

Control positivo (Nistatina)

Media 6,60 8,67 23,80

95% de intervalo de confianza para la media

Límite inferior 6,32 8,40 23,07

Límite superior 6,88 8,94 24,53

Mediana 7,00 9,00 24,00

Varianza 0,26 0,24 1,74

Desviación estándar 0,51 0,49 1,32

Error estándar 0,13 0,13 0,34

Mínimo 6,00 8,00 20,00

Máximo 7,00 9,00 25,00

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Figura 16.- Diagrama de caja y bigotes para la distribución de halos de inhibición por

grupo.

En la gráfica se observa la tendencia de los cinco grupos; el grupo 1 (50%) y el

grupo 5 (control negativo), se muestran constantes a valor de 6mm, y el valor de la

mediana para los grupos experimentales aumentó con la concentración, siendo de

7mm para la solución al 75% y de 9 mm para la concentración al 100%, valores

que se encuentran muy por debajo del control positivo que presentó una mediana

de 24mm.

Dado que se muestrearon 15 discos por grupo y en atención a los resultados

descriptivos, se procedió a desarrollar la prueba de Kolmogorov-Smirnov, con

corrección de Lilliefors y la de Shapiro Wilks para contrastar la hipótesis de

distribución normal.

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Tabla 3.- Prueba de Normalidad mediante estadístico de Kolmogorov Smirnov.

GRUPO

Kolmogorov-Smirnovb Shapiro-Wilk

Estadístico gl Sig. Estadístico Gl Sig.

HALO Hierba

mora 75% ,38 15,00 ,00 ,63 15,00 ,00

Hierba

mora

100%

,42 15,00 ,00 ,60 15,00 ,00

Control

positivo

(Nistatina)

,23 15,00 ,04 ,79 15,00 ,00

Las dos pruebas determinaron que los tres grupos con datos (no constantes)

referidos al halo de inhibición, no cumplieron con el criterio de normalidad

(p<0,05), por lo que para el procesamiento inferencial, fue necesario considerar la

pruebas no paramétricas.

Tabla 4.- Media y desviación estándar del halo de inhibición por grupo.

GRUPO MEDIA (DS)

Hierba mora

50% 6,0 (0,00)

Hierba mora

75% 6,6 (0,51)

Hierba mora

100% 8,7 (0,49)

Control positivo

(Nistatina) 23,8 (1,32)

Control negativo

(Agua destilada)

6,0 (0,00)

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A juzgar por los valores de la media, la hierba mora al 75% apenas sobrepasa el valor de 6

mm y al 100% se presentó un valor de 8,7mm, en tanto que para las Nistatina el valor

medio fue sumamente alto en este caso 23,8 mm.

Al realizar la prueba de Kruskal Wallis (H- test), la significancia fue p <0,01, con lo que se

pudo inferir que existían diferencias significativas en el valor medio del halo, y por lo tanto

en la efectividad.

Figura 17.- Media del halo de inhibición por grupo.

Se realizó la prueba de Kruskal Wallis para los tres grupos (con distribución no

uniforme), con el fin de establecer si existía diferencia significativa en la capacidad

inhibitoria determinada por el diámetro del halo de inhibición.

6,0 6,6

8,7

23,8

6,0

Hierba mora50%

Hierba mora75%

Hierba mora100%

Control positivo(Nistatina)

Controlnegativo (Agua

destilada)

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Tabla 5.- Resultados de la prueba de Kruskal Wallis.

GRUPO N

Rango

promedio

Chi-

cuadrado

Signifinacia

asintótica

(p)

HALO Hierba

mora 50% 15 8,00 40,162 ,000

Hierba

mora

100%

15 23,00

Control

positivo

(Nistatina)

15 38,00

Total 45

Al realizar el análisis de los valores medios de cada grupo, se determinó una

significancia inferior a la crítica (p<0,001), determinando que si existió diferencia en la

capacidad inhibitoria entre los grupos, por lo que se realizó además la prueba U Mann

Whitney para determinar si las diferencias encontradas en los valores medios del halo de

inhibición de pares correspondientes eran significativas, encontrándose lo siguiente:

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Tabla 6.- Resultados de la prueba de U Mann Whitney.

(I) GRUPO

Diferencia de medias

(I-J) Significancia (p)

Hierba mora 50% Hierba mora 75% -,60 ,113

Hierba mora 100% -2,67 ,000

Control positivo

(Nistatina) -17,8 ,000

Control negativo

(Agua destilada) 0,00 1,000

Hierba mora 75% Hierba mora 100% -2,07 ,000

Control positivo

(Nistatina) -17,2 ,000

Control negativo

(Agua destilada)

,60

,113

Hierba mora 100% Control positivo

(Nistatina) -15,13 ,000

Control negativo

(Agua destilada) 2,67 ,000

Control positivo

(Nistatina)

Control negativo

(Agua destilada) 17,8 ,000

.

Se observa que prácticamente no hay diferencia en las soluciones de 50% y 75% respecto al

control negativo, es decir que a estas concentraciones serían ineficientes en el control de

Cándida Álbicans.

En tanto que al 100% ya presenta diferencia significativa respecto a las concentraciones

anteriores, pero a su vez es mucha más baja que el control positivo.

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Adicionalmente se evaluó el nivel de sensibilidad de las soluciones frente a Cándida

Álbicans, empleando la siguiente escala: halo: <8mm : resistente; 8≤Halo≤14: sensibilidad

intermedia ( o al límite); Halo > 14mm: sumamente sensible.

Tabla 7.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans.

GRUPO

SENSIBILIDAD

Total Resistente

Sensibilidad al

límite

Sumamente

sensible

Hierba mora

50% 15 (100) 0 0 15

Hierba mora

75% 15 (100) 0 0 15

Hierba mora

100% 0 15 (100) 0 15

Control positivo

(Nistatina) 0 0 15 (100) 15

Control negativo

(Agua destilada) 15 (100) 0 0 15

Total 45 15 15 75

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Figura 18.- Nivel de sensibilidad del grupo frente a Cándida Álbicans.

Se observó una total dependencia del nivel de sensibilidad en función al grupo, de acuerdo

a la prueba de chi cuadrado (p=0). El control positivo en un 100% se mostró como

sumamente sensibles, en el caso de Hierba Mora al 100% se llegó al nivel de

sensibilidad intermedia, para el resto de grupos se determinó un nivel de 100%

resistente.

100 100 100100 100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hierba mora50%

Hierba mora75%

Hierba mora100%

Controlpositivo

(Nistatina)

Controlnegativo (Agua

destilada)

Resistente Sensibilidad al límite Sumamente sensible

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CAPITULO V

5.1 DISCUSIÓN.

Esta planta se ha investigada científicamente por dos ocasiones, aplicado al campo

de la salud, para la cual tomaremos referencia de estos artículos sobre la planta

Hierba Mora para posibles comparaciones de datos.

En esta investigación se buscó una alternativa como una posibilidad de que esta una

planta existente en el Ecuador, y de la que no se tiene evidencias científicas de su

utilización, puede demostrar actividad sobre un patógeno existente en cavidad oral

como es la Cándida Álbicans, para ello se vio la necesidad de hacer un estudio

experimental, con la técnica de difusión en disco, y el análisis de resultados indicó

que va a depender del grado de concentración aplicado tendrá una actividad

antifúngica.

La eficacia del extracto acuoso de la planta Hierba Mora sobre Cándida Álbicans,

fue comprobada por un estudio realizad por la revista Cubana de Plantas

medicinales Scielo, los cuales utilizaron métodos distintos para llegar a un mismo

fin, como la utilización de Dimetilsulfóxido (3) (DMSO) que es un disolvente

orgánico sobre la planta a comparación de que en otro estudio solo se empleó el

método de infusión de las hojas secas de la Hierba Mora al 20% de concentración

(5). En nuestra investigación se realizó con alcohol potable al 70% obteniendo como

resultado un efecto de inhibición leve.

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Martinez (5)determinó en su estudio que al utilizar el extracto de la planta hierba

mora al 20% de concentración puede formar halos de inhibición sobre Cándida

Álbicans en la realización de su prueba experimental in vitro. Los resultados tienen

algo de concordancia a nuestra investigación, ya que el extracto si detuvo

levemente el crecimiento fúngico, dependiendo la concentración a la que fue

expuesta.

Martínez (5)mencionó que el extracto acuoso de la planta Hierba Mora inhibe

Cándida Álbicans manifestando halos mayores a los 15 mm, al igual que el otro

estudio según Ansaloni (3) describió que, se formó un halo de inhibición de 18mm

lo que discrepa de la investigación presente, ya que la concentración de 100% tuvo

la mayor zona de inhibición en 9 mm existiendo una diferencia de aproximadamente

6 mm- 9 mm, respectivamente.

En este experimento se realizaron tres concentraciones 50%,75% y 100% del

extracto acuoso obteniendo valores inhibitorios con promedio de 6mm, 7mm y

9mm respectivamente, mientras que en el estudio de Martínez (5) se realizó con una

única concentración de 20% obteniendo valores mayores o iguales a 15mm de

inhibición frente a Cándida Álbicans, en el estudio de Ansaloni (3) recalcó que

utilizando como solvente el Dimetilsulfóxido se obtuvo valores de 18mm de halos

de inhibición. En nuestro estudio únicamente se utilizó alcohol potable al 70% por

lo tanto, cabe mencionar la diferencia en el estudio.

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Ansaloni (3)indicó que, las concentraciones de nistatina al 0,2mg/ml obtuvieron

inhibición de 37mm frente a Cándida siempre y cuando estén disueltas en

Dimetilsulfóxido. Así también Martínez (5)demostró en su investigación que con

una concentración al 20% de extracto acuoso de Hierba Mora se podía inhibir el

crecimiento de Cándida Álbicans, en nuestro estudio no se utilizó disolvente

orgánico Dimetilsulfóxido y realizamos varias concentraciones, en cuanto a la

nistatina únicamente utilizamos nistatina en concentración de 30mg/ml y el valor

promedio de inhibición fue de 24mm frente a Cándida Álbicans. Razón por la cual

el estudio varía.

En el estudio de Ansaloni (3) empleó Dimetilsulfóxido con una concentración de

extracto al 100% y en el estudio de Martínez (5)se empleó concentraciones de

extracto acuoso al 20% y en nuestro estudio concentraciones de 50%, 75% y 100%

teniendo actividad antifúngica leve solo a la concentración de 100%, entonces

determinamos que la variación de resultados se debe a las diferentes sustancias

empleadas y a los métodos de obtención del extracto de la planta Hierba Mora, por

lo que se sugiere ampliar el estudio de esta planta creando aceites, extractos o

esencias con diferentes métodos de obtención ya que es de fácil recolección

existente en el Ecuador.

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6.-CONCLUSIONES.

- El extracto acuoso de las hojas de Hierba Mora a concentraciones del 100%

presentó actividad antifúngica en el estudio in vitro sobre Cándida Álbicans

con un promedio de halos de inhibición de 9mm.

- El extracto acuoso de las hojas de Hierba Mora a concentraciones a

concentraciones del 75% presentó actividad antimicrobiana in vitro sobre

Cándida Álbicans con un promedio de halos de inhibición de 7 mm.

- El extracto acuoso de las hojas de Hierba Mora a concentraciones a

concentraciones del 50% no presentó actividad antimicrobiana in vitro

sobre Cándida Álbicans.

- La nistatina presentó halos de inhibición in vitro por un promedio de 24 mm

frente a Cándida Álbicans.

- Cándida Álbicans demostró ser sensible al extracto acuoso de las hojas de

Hierba Mora a concentraciones del 75% y 100%, no obstante, presentó

mayor sensibilidad frente a la nistatina 30mg/ml.

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7.-RECOMENDACIONES.

- Se recomienda realizar estudios dónde se utilice Dimetilsulfóxido como

disolvente a las mismas concentraciones de 50%, 75% y 100% para poder

determinar cuáles son las semejanzas o las diferencias al utilizarlo.

- Se sugiere realizar el extracto por otros métodos de obtención ya que

dependiendo de eso se puede llegar a tener mejores valores de actividad

antifúngica frente a Cándida Álbicans.

- Debido a su actividad inhibitoria, se sugiere investigaciones junto a

medicamentos naturales ya existentes en el mercado para poder potenciar su

acción antifúngica y se lo pueda emplear en el campo de la medicina.

- Se recomienda realizar una experimentación del extracto acuoso de la planta

fresca versus la planta seca, para saber si varía los resultados.

- Motivar a los estudiantes que realicen estudios posteriores a fin de descubrir

si la planta puede actuar con diferentes microorganismos que se localizan en

boca, a fin de encontrar soluciones a patologías orales.

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ANEXOS

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Anexo 1.- Certificado de Aprobación por el SEISH-UCE.

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Anexo 2.- Aprobación para el uso y asesoramientos de los Laboratorios de la F.C.Q.

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Anexo 3.- Factura de compra de Cándida Álbicans ATCC®10231™.

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Anexo 4.- Certificado de calidad de la cepa Cándida Álbicans ATCC®10231™.

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Anexo 5.- Instrucciones de uso y activación de la cepa Cándida Albicans® 10231™.

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Anexo 6.- Certificado de esterilización de los materiales.

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Anexo 7.- Protocolo de Manejo de Desechos.

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Anexo 8.- Autorización para el uso de las instalaciones del Depósito de Desechos

Infecciosos.

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Anexo 9.- Certificado de haber realizado el experimento.

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Anexo 10.- Certificado de idoneidad del autor.

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Anexo 11.- Certificado de idoneidad del tutor.

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Anexo 12.- Declaración de conflicto de interés del autor.

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Anexo 13.- Declaración de conflicto de interés del tutor.

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Anexo 14.- Certificado de análisis de resultados.

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Anexo 15.- Renuncia al trabajo estadístico.

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Anexo 16.- Certificado de Urkund Analysis Result

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