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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
“EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA E RECOMBINANTE DEL VIRUS DENGUE4 Y PRODUCCION DE ANTICUERPOS POLICLONALES DIFIGIDOS
CONTRA ELLA”
CEBALLOS OLVERA IVONNE
Vo. Bo. Dr. José Luis Gomes OlivaresJefe de Área de Biología Celular
Vo.Bo. Dra. Rosa Ma. del AngelProfesora Titular
Patología Experimental
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL I.P.N.
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA EXPERIMENTALLABORATORIO 8
INICIO EL 30 DE JUNIO AL 30 DE DICIEMBRE DEL 2003.
1
Expresión de la proteína E recombinante del virus Dengue 4 y
producción de anticuerpos policlonales dirigidos contra ella
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
El dengue es una enfermedad viral que en humano presenta fiebre
aguda como síntoma y signo clínica principal. El humano adquiere la
enfermedad a través de la picadura de un mosquito que está infectado por virus
del género Flavivirus, en el caso del denge es Aedes aegypti.
Durante el ciclo infectivo viral, el primer paso es la interacción entre el
virus y una molécula en la superficie celular que permita la entrada del virus al
humano.
El análisis de las moléculas que utiliza el virus para lograr introducirse a
las células hospederas, permitirá obtener información que podrían emplearse
como un tratamiento, tratando de evitar el proceso de unión, y por ende, la
infección.
1. INTRODUCCIÓN
Existen determinadas patologías que por su naturaleza endémica o
epidémica se tornan en verdaderos problemas de Salud Pública. El dengue, es
una enfermedad viral producida por un virus del género Flavivirus de la familia
Sloviviridae del genero aedes, y transmitida por la picadura de la hembra del
mosquito (orden Diptera) de la especie aegypti, de la familia Culicidae.
En su forma común, el dengue es una enfermedad febril, cuyo período
de incubación en el ser humano oscila de cinco a ocho días, generalmente
produce una baja letalidad. Sin embargo, en una forma grave de la enfermedad
2
puede llegar a ser mortal, a esta variante se ha denominado dengue
hemorrágico, que se caracteriza por insuficiencia circulatoria, hipotensión,
síndrome de schock y episodios hemorrágicos (Acha y Szyfres, 1992).
El dengue se distribuye en zonas rurales, urbanas y suburbanas. Los
vectores de la enfermedad son los mosquitos, que tienen un ciclo de vida
relativamente corto, se consideran 40 días en promedio. No obstante, las
condiciones ambientales del hábitat de Aedes aegypti influyen en la duración
del ciclo de vida.
El mosquito tiene hábitos de vuelo corto y vive de manera
peridomiciliaria. A diferencia de otros parientes, los mosquitos que son
portadores prefieren las aguas limpias donde se reproducen con gran facilidad,
hecho que no ocurre en las aguas negras y contaminadas.
Al final del proceso de la reproducción, la hembra deposita entre 250-
500 huevecillos, en apenas pocos días o hasta en seis meses, los huevos se
convierten larvas cuando las condiciones de humedad del ambiente son
óptimas. La aparición de las larvas se intensifica con la llegada de las lluvias,
aunque, el mosquito está presente en todo el año.
Su ámbito de acción es básicamente doméstico, permanecen en un
espacio que pocas veces excede los 100 metros de distancia, con lo cual
garantizan la reproducción de las hembras. Una vez que una hembra adulta
ingiere sangre, ella deposita los huevecillos después de 3-7 días, cuya eclosión
ocurre luego de 48-72 horas que están en contacto con el agua.
Los mosquitos se distribuyen en diversas altitudes, prefiriendo regiones
por debajo de los 1,200 metros. No obstante, son capaces de reproducirse en
una amplia gama de ecosistemas. Los moscos se alimentan básicamente de
3
néctar de algunas flores. Aunque, la hembra adulta requiere
indispensablemente de la ingesta de sangre para el desarrollo de los
huevecillos.
La transmisión del virus del dengue de mosquito a mosquito se realiza
de una generación a otra, una hembra infectada que se reproducirá
potencialmente contaminará a su descendencia.
1.1. Características generales del virus del dengue
El genoma de los viriones del dengue están constituidos por ácido ácido
(ARN) de cadena sencilla con polaridad positiva de una longitud de 11 Kb. El
genoma está rodeado por una nucleocápside de simetría icosaédrica de 30 nm
de diámetro. La nucleocápside contiene a la proteína-C, que presenta una
masa molecular aparente de 11 kDa y una envoltura lipídica de 10 nm de
grosor.
El virión tiene forma esférica y un diámetro aproximado de 50 nm, su
densidad es de 1.23 cm3, y tiene un coeficiente de sedimentación de 210 S. La
bicapa lipídica tiene 2 proteínas asociadas, una de membrana (definida con la
letra M) y otra de envoltura (definida por la letra E). En arreglo homodimérico y
conformación icosaédrica, representa la molécula más expuesta en la
superficie del virión.
No existe un modo de lograr diferenciar entre las partículas virales
liberadas al medio extracelular de las que se encuentran en las vesículas
intracelulares. A pesar que estas últimas, son las partículas inmaduras y
contienen exclusivamente la proteína precursora asociada a membrana (prM)
sin procesar, y son menos infecciosas que aquellas que son liberadas. (Rice,
4
1996). Además, de las proteínas estructurales antes mencionadas, el RNA viral
codifica para 7 proteínas no estructurales denominadas: NS1, NS2a, NS2b,
NS3, NS4a, NS4b y NS5, que son importantes en la replicación viral. La
proteína E y la proteína NS1 inducen anticuerpos neutralizantes que son
protectores (Chen, 1997).
Se han descrito cuatro serotipos en el virus del dengue: DEN-1, DEN-2,
DEN-3, DEN-4. Los análisis de homología de secuencia han mostrado que hay
un 70% aproximadamente entre ellos. Aunque, la homología es mayor para
DEN-1, DEN-3 y DEN-4, pero no así para DEN-2, razón que ha hecho suponer
un origen evolutivo distinto (Monath, 1997).
Estos virus comparten determinantes antigénicos entre sí y tienen
reacción de anticuerpos cruzada con los otros miembros de la familia, lo que
puede ocasionar dificultades para su diagnóstico. Sin embargo, la presencia de
anticuerpos no brinda protección cruzada entre estas enfermedades.
2. ANTECEDENTES
2.1. Características generales de las proteínas virales
2.1.1. Proteínas estructurales
El virión maduro contiene tres proteínas estructurales: 1) proteína C de
la nucleocápside o núcleo; 2) proteína M asociada a la membrana; y c) proteína
E de la envoltura.
1) La proteína C es el primer polipéptido viral que es sintetizado durante
la generación de nuevos viriones. Tiene un carácter altamente básico, que al
parecer influye en su interacción con el ARN, su peso molecular es de 11kDa
(Heinz, 1994).
5
2) La nucleocápside posee una simetría icosaédrica y está rodeada por
una bicapa de lípidos que proveniente de la membrana plasmática del
huésped. El precursor glicosilado prM tiene un peso molecular de 26 kDa una
vez que ha madurado da lugar a la proteína M de 8 kDa. Este evento parece
ser crucial para la morfogénesis del virión (Heinz, 1990). Su función principal
ocurre durante la maduración viral, y necesaria para evitar cambios
conformacionales en la proteína E. Se ha sugerido, que anticuerpos dirigidos
contra la prM pueden mediar la inmunidad protectora (Osatomi, K., 1990).
3) La glicoprotreína E constituye la proteína más grande del virión, tiene
un peso molecular de aproximadamente 51 a 59 kDa, se encuentra anclada a
la membrana por su extremo carboxilo terminal.
Un modelo estructural para la proteína E de los flavivirus propone que
consiste de tres dominios antigénicos designados I, II y III (Heinz, y col., 1995,
Allison, 1995 y Anderson, 1992).
Dado que la proteína E es la más expuesta en el virión, la mayor parte
de los determinantes antigénicos (epitopes) reconocidos por los anticuerpos
durante la infección viral se encuentran hacia dicha proteína. Se ha demostrado
que la susceptibilidad celular a la infección se correlaciona con la unión a la
proteína E (Anderson, 1992).
En estudios de unión (binding) se ha observado que la proteína E es la
responsable del reconocimiento y unión del virus con su receptor (Roehring,
1990). Posterior a la unión en la superficie, es la hemaglutinina viral y ciertas
regiones de la proteína E se han correlacionado con la virulencia de la cepa del
virus en el desarrollo de apoptosis en las células blanco (Rey, 1995).
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También, se ha establecido que la proteína E media la fusión entre la
membrana viral y la membrana de la vesícula endocítica, proceso dependiente
del pH ácido (Allison, 1995; Heinz, 1995,).
2.1.2. Proteínas no estructurales
La glicoproteína NS1 presenta un mosaico de determinantes antigénicos
específicos de serotipo y también algunos de reactividad cruzada de complejo y
de grupo.
Se cree que la glicopoteína NS1 interviene en el ensamblaje del virión,
ya que se encuentra asociada a la célula. En células infectadas con el virus, se
ha observado que puede darse una protección al ocurrir lisis mediada por
anticuerpos ya que las células expresan la proteína NS1 en la superficie celular
(Schelesinger, 1990).
La proteína NS2 está constituida por 2 proteínas; NS2a y NS2b, esta
última interviene como cofactor en el procesamiento proteolítico. Se sugiere
que las interacciones E-prM en las partículas virales están mediadas por los
dominios en el anclaje del carboxi-terminal de la proteína E.
Mientras, que la actividad de unión a la célula es prevenida por un
ectodominio de la NS1 (Young, 1990.) y la NS2 es capaz de mediar la ruptura
proteolítica del precursor E-prM-C (Yamshchikov, 1994).
La proteína NS3 tiene actividad de proteasa que actúa en el
procesamiento postraduccional de la poliproteína y de un componente de la
polimerasa viral de ARN (Heinz, 1990, Krishna, 1999). Se trata de una serín-
proteasa, que procesa el precursor de poliproteína en proteínas maduras, junto
con la peptidasa señal del hospedero, y requiere de NS2b como cofactor.
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Recientemente, se ha descrito su estructura cristalina, la cual combinada
con los sustratos peptídicos de su sitio activo, ha sugerido que existen residuos
de aminoácidos muy específicos que están involucrados en el reconocimiento
del sustrato. Así como, la base estructural para explicar los efectos de
mutaciones sobre la actividad enzimática, lo cual es útil para el desarrollo de
inhibidores específicos como vía terapéutica contra el dengue y otras proteasas
de los flavivirus (Krishna, H. M., 1999). Asimismo, la proteína cuenta con
secuencias comienzo de la helicasa, cuya función que se presume pero no se
ha demostrado.
La proteína NS4 se deriva de dos proteínas: NS4a y NS4b. Se piensa
que estas unidades tienen la función de cofactores del complejo enzimático de
duplicación del ARN.
La proteína NS5 es la polimerasa viral de ARN dependiente de ARN
(Osatomi, 1990). Es la proteína viral más conservada entre miembros de la
familia, posee una región consenso para las replicasas virales.
2.1.3. El sistema inmune y su capacidad de reconocer lo propio y lo
extraño
2.1.3.1. Las células y órganos del sistema inmune
Los seres vivos tienen un sistema eliminación de microorganismos
patógenos y sustancias tóxicas que definen el sistema inmune. Para esto, el
organismo cuenta dos líneas de defensa.
La primera conocida como respuesta inmune innata que esta
compuestas; a) epitelios cuyas células pueden secretar sustancias
microbicidas, b) proteínas plasmáticas como las del complemento que pueden
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activarse y eliminar al patógeno y c) células fafocíticas como son los
macrófagos y células asesinas naturales. Esta respuesta innata tiene la
característica que no es específica, ni mantiene memoria inmunológica.
Cuando un agente extraño al organismo atraviesa esta primera barrera
de protección, se topa con una segunda línea de defensa que está compuesta
por células especializadas como son las células profesionales presentadoras
de antígenos (macrófagos, células dentríticas), linfocitos T y B.
Los linfocitos son las células encargadas de eliminar de manera efectiva
a los agentes extraños que rompen la homeostasia del organismo. Estas
células están distribuidas en los cuerpos en los denominados tejidos primarios,
que representa el sitio de maduración del cual salen como células con potencial
para responder al patógeno. En estos sitios, las células son educadas y
adiestradas para reconocer solo aquellas células o compuestos que son
extraños, y evitan el reconocimiento de lo propio. En el caso de los linfocitos T,
el timo representa el tejido en que se originan. Mientras, que en el caso de los
linfocitos B es la médula ósea.
Una vez maduros los linfocitos T y B migran a los órganos linfoides
secundarios que representan sitios de respuesta rápida al ingreso de los
elementos extraños. Estos sitios están representados por el bazo, nódulos
linfáticos, amigadalas, placas de peyer entre otras. La composición celular de
estos lugares de respuesta inmunológica es variable, en el caso del bazo
coexisten linfocitos T (cooperadores TCD4+ y citotóxicos TCD8+), linfocitos B
y células presentadoras de antígenos. Una composición similar existe en los
otros órganos secundarios.
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Esta integración celular permitirá al organismo responder contra
cualquier microorganismo o compuesto tóxico. Dependiendo vía de la entrada,
grado de complejidad estructural, cantidad de compuesto, el sistema inmune
puede generar dos tipos de respuesta.
La respuesta inmune celular por la cual responderá hacia células
tumorales, células infectadas por virus que dependen de la diferenciación de
los linfocitos TCD4+ cooperadores hacia el fenotipo Th1, que implica la
secreción de las citocinas interferón gamma (IFN- ) e interleucina (IL-)12.
La segunda es la respuesta inmune humoral o mediada por anticuerpos,
que depende de la diferenciación de los linfocitos TCD4+ cooperadores con
capacidad de producir IL-4, IL-5, IL-6.
Por ambas respuestas se pueden producir anticuerpos, en el caso de la
respuesta celular los anticuerpos tenderán a ser opsonizantes, mientras que en
la respuesta humoral producirá anticuerpos neutralizantes.
1.3.1.2. Los anticuerpos como herramienta para estudios
epidemiológicos.
Los anticuerpos son proteínas globulares presentes en el plasma y se
generan en respuesta a un reto antigénico natural o experimental. Poseen la
característica de ser específicos y con alta afinidad para reconocer y unirse al
antígeno que indujo su generación. Esto hace de ellos una herramienta útil
para la buscar la existencia del mismo antígeno en sujetos en los cuales se
sospecha que han estado expuestos intencionalmente a ciertos agentes
patógenos o sustancias tóxicas.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general:
• Producción anticuerpos policlonales en ratón contra la proteína de la
envoltura del virus del dengue 4.
3.2. Objetivos específicos:
• Expresión de la proteína E del virus del dengue en bacterias
recombinantes.
• Purificación de la proteína E recombinante mediante cromatografía de
afinidad al Niquel.
• Inmunización de ratones con diferentes concentraciones de proteínas
recombinante .
4. METODOLOGÍA
4.1. Inducción de la proteína recombinante.
A partir de una placa de LB ampicilina (100µg/ml) estriada con bacterias
transformadas con el plásmido pJR-E, se inocularon 125 ml de medio líquido
de cultivo LB ampicilina con una colonia y se crecieron durante toda la noche
con agitación constante a 37° C.
Cuando el cultivo alcanzo la fase estacionaria, que duró 16 h
aproximadamente de crecimiento, luego se subcultivo en dos volúmenes de
medio LB ampicilina fresco con una concentración final de 0.6 mM de
isopropiltiogalactósido (IPTG, como inductor). La inducción se llevó a cabo con
agitación enérgica por 5 h a 30° C. Al término de la inducción las bacterias
fueron colectaron mediante centrifugación a 10,000 x g por 20 minutos a 4° C.
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Las pastillas celulares se guardaron congeladas a –20°C hasta el momento de
su usarse.
4.2. Obtención de sobrenadantes clarificados de bacterias inducidas.
Las pastillas bacterianas se descongelaron en hielo por 15 min y se les
agregaron 4 ml de buffer de lisis (50 mM NaH2PO4, 750mM NaCl, 20 mM
imidazol, pH 8.0) por cada gramo de peso de la pastilla y se resuspendieron
cuidadosamente. Posteriormente, las bacterias se lisaron mediante digestión
con lisozima 1mg/ml en Tris 10 mM pH 8.0 en hielo por 30 minutos, y se
sonicaron a 12 volts por 5 ocasiones a 30 segundos alternando 30 segundos
de reposo en hielo. Los sobrenadantes se clarificaron mediante la
centrifugación a 12000 x g por 30 minutos a 4°C.
4.3. Cromatografía de afinidad a Níquel para aislar la proteína E
recombinante.
El sobrenadante clarificado se interaccionó con 500µl de resina NiNTA-
agarosa (Niquel-nitrilotriacetato) por una hora a 4° C con agitación constante.
Posteriormente, se obtuvo la fracción no unida a la resina mediante
centrifugación a 1000 x g por 1 minuto.
La resina se lavo extensamente con 20 volúmenes de buffer de lavado
(50 mM NaH2PO4, 1.2M NaCl, 20 mM imidazol, 1% Triton X100, 20% etanol,
pH 8.0) por 10 minutos con agitación constante por cinco veces y la resina se
obtuvo por la centrifugación como en el paso anterior. Una vez lavada la resina,
se empaco en una columna y la proteína recombinante se eluyó por
competencia con imidazol, pasando a través de la columna 250µl de buffer
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eluyente (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol pH 8.0), se
colectaron cinco fracciones de elusión.
Las que se sometieron al análisis electroforético en gel de poliacrilamida
al 10%. Una vez corroborada la presencia de la proteína recombinante, las
fracciones de elución se concentraron y se desalaron en una columna Microcon
(Millipore) de corte 30,000 –faltan ubnidades- de acuerdo a las instrucciones
del fabricante.
4.4. Inoculación de ratones con la proteína recombinante.
Previo a la inmunización con la proteína E recombinante se colectó una
muestra sanguínea de la cola para la obtención del suero preinmune. Se
realizo la inoculación por vía intraperitoneal con 3 µg de la proteína
recombinante en PBS cbp 75 µl con otro volumen de adyuvante completo de
Freund para la primera inoculación, a cinco ratones machos de 5 semanas de
vida de la cepa Balb/c.
Las inoculaciones subsiguientes se realizaron con adyuvante incompleto
de Freund a una periodicidad de una semana los primeros 4 inóculos y cada 15
días los subsiguientes.
Los ratones se sangraron de la cola para obtener el suero inmune a los
cuatro días de la cuarta inoculación y a la semana de la sexta inoculación con
la finalidad de probar su reactividad al inmunógeno por inmunoreactividad en
papel después de la transferencia de gel a papel (Western-blot).
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4.5. Inmunotransferencia de gel a papel (Western-blot)
Para probar la inmunoreactividad de los sueros preinmunes frente a los
inmunes se realizo un Western blot usando los anticuerpos a una dilución inicial
1:200 en PBS 0.5% Tween 20. Se procedió de la siguiente manera: 30 µg de
proteína por carril de extractos proteicos totales de células C6/36 no infectados
o infectados (para demostrar la presencia de la proteína E) fueron sometidos a
SDS-PAGE al 10% y posteriormente el gel fue transferido a nitrocelulosa con
un sistema semiseco por 30 min a 16 volts.
Posteriormente, las membranas se bloquearon con leche descremada
por toda la noche a 4° C, después de lavar las membranas con PBS tween 20,
el suero se incubo por 2 horas a temperatura ambiente con agitación gentil,
constante. Las membranas se incubaron con un segundo anticuerpo anti-IgG
de ratón acoplado a peroxidasa diluido en PBS tween 20 1:30000 por una hora
a 37° C, luego se lavo la membrana intensamente en PBS Tween 20 y se
revelo por quimioluminiscencia de acuerdo a las instrucciones del fabricante
(Pierce).
5. ACTIVIDADES REALIZADAS
• Se expresó la proteína E recombinante del virus del Dengue 4 a partir de
bacterias transformadas con el plásmido pJR-E que fueron inducidas
con isopropiltiogalactósido (ITPG)
• Se purificó la proteína E recombinante del virus del Dengue 4 a partir de
sobrenadantes de cultivo de bacterias inducidas y no inducidas, usando
la cromatografía de afinidad con la resina de níquel-nitrilotriacetato
(NiNTA-agarosa).
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• Se acondicionó la proteína E recombinante en adyuvante completo e
incompleto de Freund para intensificar la respuesta inmune.
• Se realizó un protocolo de inmunización de ratones balb-c (una
inmunización con adyuvante completo y cuatro con adyuvante
incompleto).
• Se lograron colectar fracciones de suero policlonal de las distintas
etapas de inmunización.
• Se determinó la reactividad del suero inmune contra la proteína E
recombinante del Dengue 4 mediante el procedimiento de transferencia
de gel a papel e inmunoreactividad en el papel.
• Revisión bibliográfica especializada en el tema del Dengue
• Análisis de los resultados obtenidos en cada una de las etapas del
desarrollo experimental.
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6. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS
• Expresión y purificación de la proteína E recombinante.
• Acondicionamiento de la proteína E recombinante como Inmunógeno
• Inmunización de ratones.
• Obtención de suero hiperinmune policlonal.
• Inmunoreactividad de los sueros inmunes contra la proteína E del virus
del Dengue 4.
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7. RESULTADOS Y CONCLUSIONES
7.1. Expresión de la proteína E recombinante.
Para la producción de anticuerpos policlonales de ratón primeramente
era necesario seleccionar un antígeno adecuado para la inoculación. Para esto
se empleo la tecnología de ADN recombinante, que se basa en la construcción
de un vector clonación que se contiene la información que se desea expresar.
Un vector ideal para esto son los plásmidos, que tienen la ventaja adicional de
que contienen genes por los que las bacterias responden hacia la presencia de
antibióticos que permiten sólo seleccionar células que los tienen introducidos.
En el laboratorio contamos con un vector de expresión que contiene
codificado en marco de lectura la región completa del gen de la proteína E del
virus Dengue tipo 4, dicho vector es denominado pJR-E. En la figura 1 se
muestran las regiones del plásmido pJR-E:
• Contiene codificado el gen de resistencia a ampicilina. De esta
manera podemos seleccionar el crecimiento de las bacterias
transformadas con el plásmido mediante la adición de ampicilina en el
medio de cultivo.
• Contiene codificado el gen lac. La transcripción del inserto se
encuentra bajo el control del operón lactosa. De esta manera la expresión
del gen la logramos inducir mediante la adición al medio de isopropil- -
tiogalactosido (IPTG), un análogo.
Contiene en marco de lectura hacia el extremo 5’, la región que codifica
para seis histidinas secuenciales. De esta manera la proteína recombinante
inducida contiene seis histidinas en su extremo amino-terminal, lo cual favorece
que la proteína pueda ser purificada mediante cromatografía de afinidad.
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Figura 1. Diagrama esquemático del vector de expresión pJR-E. Tienecodificado en marco de lectura la región que codifica para la proteína E en elsitio de multiclonación (MCS), también se encuentran representados, el genque codifica para el represor de lactosa (lacq), el origen independiente dereplicación (ori), el gen de resistencia a ampicilina (amp) y el promotor de latranscripción.
pJR-Er6100 bp
lacIq
MCS
PTrc
f1 intergenicregion
Ori
Apr
EcoRI XhoIPTrc
6xHist-tag
E cDNA
18
El gen de la proteína que esta insertada en el plásmido de clonación se
deseo que solo fuera expresado en las células bacterianas que los contenían,
esto se logro mediante el cultivo celular en presencia de la ampicilina.
Para obtener grandes cantidades de la proteína E recombinante que nos
permitiera lograr la secuencia de inmunización fue necesario modificar el
protocolo inicial de inducción de forma en que primero se obtuvo un cultivo por
crecimiento por toda la noche a 37° C de 200 ml, y posteriormente se diluyó el
mismo con dos volúmenes de medio fresco con una cantidad de IPTG
(inductor) suficiente para 0.6 mM. La inducción se mantuvo por 5 horas a 30°C.
La expresión de la secuencia de seis histidinas unido al gen de la
proteína E permitió que dicha proteína quimérica fuera secretada al medio de
cultivo por parte de las bacterias que proliferaban y contenían el plásmido de
expresión.
Varias alícuotas de medios de cultivos no inducidos e inducidos con
IPTG fueron separadas por electroforesis en condiciones condiciones
desnaturalizantes con dodecil sulfato de sodio. Como se muestra en la figura 2
en todos los sobrenadantes de cultivo se observó claramente la presencia de
una banda a la altura de 65 kDa, que correspondió a la proteína E.
7.2. Purificación de la proteína E recombinante.
La cromtografía de afinidad se basa en la conjugación de un elemento
de unión, sea ligando, receptor, inhibidor o cofactor con una resina inerte. El
fundamento es que de la mezcla de proteínas en un fluido complejo de
proteínas solo quedaran unidas a elemento de unión adsorbido a la matriz.
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Figura 2. Análisis por electroforésis en acrialmida al 10% de la cinética deinducción de la proteína E recombinante. Carril M, marcadores de pesomolecular, los cuales se muestran a la izquierda; carriles 0, 1, 2 y 3 representanlas horas de inducción posteriormente a la adición de IPTG. Se señala con unaflecha en el margen derecho la posición de la proteína E recombinante.
97
68
43
29
97
68
43
kDa M s/I 0 1 2 3
pEr
20
Los extractos clarificados bacterianos conteniendo la proteína quimérica
con las histidinas fueron pasados a través de una columna de níquel-agarosa
(NiNTA), lavados intensivamente para eliminar proteínas bacterianas
contaminantes y posteriormente eluidos de la columna mediante la
competencia con imidazol 250 mM.
Para corroborar la presencia de la proteína E recombinante en las
fracciones de elución, éstas fueron sometidas a electroforesis en poliacrilamida
al 10%, en donde aparte de la banda correspondiente a la proteína E
recombinante, se observa otra banda a la altura de 30 kDa, que puede
corresponder a procesamiento proteolítico de la misma proteína. (Figura 3). Las
fracciones de elución fueron colectadas de acuerdo a su concentración
aparente en geles de poliacrilamida y dializadas contra PBS.
7.3. Inducción de suero inmune en ratón.
La generación de anticuerpos para reconocer proteínas de interés esta
basado en la capacidad del sistema inmune de los mamíferos para reconocer
microorganismos extraños y sustancias tóxicas a los que estamos expuestos
en el ambiente.
Una vez que se tuvo la proteína E purificada, se realizó la inmunización de
los ratones con adyuvante completo de Freund, esto tuvo como propósito la
liberación pulsátil del antígeno y el reclutamiento al sitio de inoculación de
células presentadoras de antígeno (en nuestro caso de la proteína E).
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Figura 3. Análisis por electroforesis de poliacrilamida al 10% en lasfracciones obtenidas de la cromatografía de afinidad a Níquel. NU, fracciónno unida a la columna. Carriles L, diferentes fracciones de lavado. Carriles E,tres fracciones de elusión por competencia a imidazol. Se muestra la presenciade la proteína E por la flecha a la derecha.
200
97
68
43
kDa NU L 1 L 2 E 1 E 2 E 3L 3
200
97
68
43
kDa NU L 1 L 2 E 1 E 2 E 3L 3
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En la respuesta hacia la proteína E recombinante, las células con capacidad
fagocítica digieren y presentan a células linfocitos T y/o B. Durante este
proceso se genera una respuesta inmune primaria por la que se generaron
anticuerpos contra la proteína E recombinante con bajo título de
reconocimiento y los anticuerpos son del tipo de IgM.
Las inmunizaciones posteriores, tuvieron como fin que ocurriera una
respuesta inmune en mayor intensidad, en la que se generaran anticuerpos con
un alto título, y que estuvieran representados por las inmunoglobulinas del tipo
IgG.
Posterior a la cuarta inoculación el suero fue probado para verificar su
reactividad hacía la proteína E en extractos proteicos de células infectadas.
(Figura 4).
9. Conclusiones.
El sistema bacteriano transformado con el plásmido no inducido y
inducido por IPTG fue útil para expresar la proteína E del virus del Dengue 4. El
nivel de expresión de la proteína E del virus del Dengue 4 facilitó su purificación
mediante cromatografía de afinidad usando la resina NiNTA-agarosa (Niquel-
nitrilotriacetato). A partir de algunas fracciones enriquecidas en la proteína E
recombinante se desarrollo un protocolo de inmunización que permitió producir
anticuerpos policlonales que reconocieron a la proteína E recombinante.
Finalmente, los anticuerpos se consideran un valioso reactivo específico que
permitirá el seguimiento del virus Dengue en ensayos de unión a receptor.
23
Figura 4. Reactividad del suero policlonal de ratón contra la proteína Erecombinante. Los extractos de células C6/36 no infectadas (NI) e infectadas(I) fueron sometidos a electroforesis de poliacrilamida y posteriormentetransferidos a nitrocelulosa. La membrana fue incubada con una mezcla desuero de la última inmunización obtenidos de los ratones inoculados con laproteína E recombinante. Se muestra la reactividad de los anticuerpos contra laproteína E en el extracto de células infectadas.
200
97
68
43
200
97
68
43
kDa NI I
24
8. BIBLIOGRAFÍA
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monoclonal antibodies. Southeast J TropMed Hyg; 21: 646-650.
26
INDICE
Paginas
1. Introducción---------------------------------------------------------------------
1
1.1. Características generales del virus del dengue-------------------------
3
2. Antecedentes---------------------------------------------------------------------
4
2.1. Características generales de las proteínas virales---------------------
4
2.1.1. Proteínas estructurales----------------------------------------------------
4
2.1.2. Proteínas no estructurales------------------------------------------------
6
2.1.3. El sistema inmune y su capacidad de reconocer lo propio y lo extraño-------------------------------------------
7
2.1.3.1. Las células y órganos del sistema inmune--------------------------
7
1.3.1.2. Los anticuerpos como herramienta
para estudios epidemiológicos--------------------------------------------------
9
3. Objetivos-------------------------------------------------------------------------
10
3.1. Objetivo general-------------------------------------------------------------
10
3.2. Objetivos específicos---------------------------------------------------------
10
4. Metodología----------------------------------------------------------------------
10
4.1. Inducción de la proteína recombinante----------------------------------
10
4.2. Obtención de sobrenadantes clarificados de bacterias inducidas-----------------------------------------------------------
11
27
4.3. Cromatografía de afinidad a Níquel para aislar la proteína E recombinante---------------------------------------------
11
4.4. Inoculación de ratones con la proteína recombinante----------------
12
4.5. Inmunotransferencia de gel a papel (Western-blot)------------------
13
5. Actividades realizadas---------------------------------------------------------
13
6. Objetivos y metas alcanzados------------------------------------------------
14
7. Resultados y conclusiones-----------------------------------------------------
16
7.1. Expresión de la proteína E recombinante-------------------------------
16
7.2. Purificación de la proteína E recombinante----------------------------
18
7.3. Inducción de suero inmune en ratón-------------------------------------
20
8. Conclusiones---------------------------------------------------------------------
22
8.1 Criterios de evaluación-------------------------------------------------------
23
Figuras-------------------------------------------------------------------------------
16, 18, 20 y 22
9. Bibliografía----------------------------------------------------------------------
24