uji antiproliferasi partisi etil asetat daun asoka (ixora

UJI ANTIPROLIFERASI PARTISI ETIL ASETAT DAUN ASOKA (Ixora

coccinea L.) TERHADAP SEL 4T1 MELALUI PENGHAMBATAN MMP-9

IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Thomas David Gonzaga

NIM : 178114060

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2021

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i



IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :


NIM : 178114060

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2021


ii

Persetujuan Pembimbing



IN VITRO

Skripsi yang telah diajukan oleh :


NIM : 178114060

telah disetujui oleh :

Pembimbing Utama

(apt. Maywan Hariono, Ph.D.) (12 Januari 2021)


Pengesahan Skripsi Berjudul



IN VITRO

Oleh :


NIM : 178114060

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal : 17 Februari 2021

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan,

Dr. apt. Yustina Sri Hartini

Panitia Penguji Tanda tangan

1. apt. Maywan Hariono, Ph.D. ……………

2. Dr. apt. Erna Tri Wulandari ……………

3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. ……………

iii


iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam

kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana layaknya

karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam

naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan

perundang-undangan

yang berlaku.

Yogyakarta, 10 Januari 2021

Penulis,



v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma

Nama : Thomas David Gonzaga

Nomor Mahasiswa : 178114060

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :



IN VITRO

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Demikian juga saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma untuk menyimpan, mengalihkan

dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengolahan data,

mendistribusikannya secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya

maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Atas kemajuan teknologi informasi, saya tidak berkeberatan jika nama, tanda

tangan, gambar atau image yang ada di dalam karya ilmiah saya terindeks oleh

mesin pencari (search engine), misalnya google.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya,

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal 19 Februari 2021

Yang menyatakan,

(Thomas David Gonzaga)


vi

ABSTRAK

Kanker diperkirakan telah mengakibatkan 9,6 juta orang meninggal dunia

dan merupakan penyebab kematian kedua terbesar setelah penyakit

kardiovaskular. Pada sel kanker, aktivitas Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9)

berperan penting dalam proses perkembangan, invasi, dan metastasis sel, melalui

degradasi Extracelullar Matrix (ECM). Masalah paling utama pada pengembangan

agen antikanker payudara adalah ketidakselektivannya terhadap target, yang dapat

menimbulkan beberapa efek samping yang merugikan. Oleh karena itu, penemuan

kandidat obat anti kanker baru berbasis alam sangat diperlukan, dengan harapan

dapat memberikan efek terapi yang lebih efektif dan selektif terhadap target. Pada

penelitian ini partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka (Ixora Coccinea L.)

diuji aktivitas penghambatannya dengan menggunakan metode FRET-based

terhadap enzim MMP-9, menunjukan persen penghambatan sebesar 94%.

Pengujian sampel kemudian dilanjutkan ke tingkat seluler, yaitu diuji aktivitas

antiproliferasinya dengan menggunakan metode MTT secara in vitro terhadap sel

4T1 dan sel Vero, diperoleh nilai EC50 57,5 µg/mL dan CC50 429,5 µg/mL,

dengan Indeks keamanan sebesar 7,47. Hasil KG-SM menunjukan adanya 10

puncak yang terkandung dalam sampel, tiga komponen dengan persen area

terbesar, yaitu 75,91; 12,91; dan 7,06 % diprediksi sebagai 1,2-

benzendicarboxylic acid, dan squalene.

Kata kunci : Kanker payudara, MMP-9, Ixora Coccinea L., In vitro


vii

ABSTRACT

Cancer is estimated to kill 9.6 million people and becoming the leading

cause of death after cardiovascular disease. In cancer cells, the activity of Matrix

Metalloproteinase-9 (MMP-9) plays an important role in the process of cell

development, invasion, and metastatic, through degradation of the Extracellular

Matrix (ECM). The most problem in the development of anti-breast cancer agents

is the non-selectivity to the target, which results in several adverse effects.

Therefore, the discovery of a natural-based anticancer drug is urgently needed, in

hopes of providing a more effective and selective drug. In this study, the ethyl

acetate partition of methanolic extract of asoka (Ixora Coccinea L.) leaves was

tested using FRET-based method against the MMP-9 enzyme, showing a

percentage of inhibition by 94%. Then the testing was continued at the cellular

level through the antiproliferation assay using MTT method against 4T1 and Vero

cell, obtaining EC50 values being 57,5 µg/mL, and CC50 429,5 µg/mL, with safety

index 7,47. The partition showed ten compounds based on the result of GC-MS,

and there are three compounds that possessed the largest percentage area which

are 75,91 %, 12,91 % and, 7,06 % predicted as 1,2-benzendicarboxylic acid and

squalene.

Keyword : Breast cancer, MMP-9, Ixora Coccinea L., In vitro


viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN ................................................ v

ABSTRAK ....................................................................................................... vi

ABSTRACT ....................................................................................................... vii

DAFTAR ISI .................................................................................................... viii

DAFTAR TABEL ............................................................................................ ix

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xi

PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ................................................................................ 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 10

KESIMPULAN ................................................................................................ 26

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 27

LAMPIRAN ..................................................................................................... 32

BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 51


ix

DAFTAR TABEL

Tabel I. Desain well-plate untuk uji aktivitas in vitro MMP-9 ........................ 6

Tabel II. Desain well-plate untuk uji MTT ...................................................... 8

Tabel III. Hasil fluoresensi terhadap aktivitas enzim MMP-9 ......................... 12

Tabel IV. Hasil fluoresensi kontrol positif terhadap aktivitas enzim MMP-9 . 13

Tabel V. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel 4T1 pada perlakuan

sampel partisi etil asetat ................................................................. 18

Tabel VI. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel Vero pada perlakuan

sampel partisi etil asetat ................................................................... 19

Tabel VII. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel 4T1 pada perlakuan

kontrol positif .................................................................................. 20

Tabel VIII. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel Vero pada perlakuan

kontrol positif .................................................................................. 21

Tabel IX. Hasil EC50, CC50, dan IK dari sampel dan kontrol positif ............... 22

Tabel X. Prediksi senyawa yang terkandung dalam partisi etil asetat daun ....

asoka pada puncak 4, 5, dan 6 ......................................................... 25


x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Mekanisme pemotongan substrat oleh enzim MMP-9 ................... 11

Gambar 2. Visualisasi sel a) 4T1 dan b) Vero dalam keadaan konfluen 80%

sebelum diberi perlakuan ............................................................. 15

Gambar 3. Visualisasi sel 4T1 hidup ditandai dengan tanda lingkaran,

sedangkan sel yang mati ditandai dengan tanda persegi .............. 15

Gambar 4. Visualisasi sel a) 4T1 tanpa perlakuan, b) 4T1 dengan perlakuan

sampel 1000 µg/mL, c) Vero tanpa perlakuan, dan d) Vero

dengan perlakuan sampel 1000 µg/mL ......................................... 17

Gambar 5. Perbandingan kristal formazan yang terbentuk dari sel 4T1 a)

tanpa perlakuan dan b) perlakuan sampel 1000 µg/mL ................ 18

Gambar 6. Grafik persentase viabilitas sel 4T1 vs a) log kosentrasi sampel

dan b) log kosentrasi doxorubicin dengan persamaan regresi

non-linear ...................................................................................... 19

Gambar 7. Grafik persentase viabilitas sel Vero vs a) log konsentrasi sampel

dan b) log konsentrasi doxorubicin dengan persamaan regresi

non-linear .................................................................................... 20

Gambar 8. Kromatogram hasil KG partisi etil asetat daun asoka .................... 23

Gambar 9. Spektrum MS senyawa pada puncak 4 ........................................... 23

Gambar 10. Spektrum MS senyawa pada puncak 5 ......................................... 24

Gambar 11. Spektrum MS senyawa pada puncak 6 ......................................... 24


xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman asoka .............................. 32

Lampiran 2. Perhitungan sel 4T1 ..................................................................... 33

Lampiran 3. Perhitungan sel Vero ................................................................... 34

Lampiran 4. Morfologi sel 4T1 di bawah pengamatan mikroskop inverted .... 35

Lampiran 5. Morfologi sel Vero di bawah pengamatan mikroskop inverted .. 37

Lampiran 6. Hasil Uji-T antara kontrol positif dan perlakuan sampel

terhadap sel Vero ........................................................................ 39

Lampiran 7. Hasil Uji-T antara kontrol positif dan perlakuan sampel

terhadap sel 4T1 .......................................................................... 40

Lampiran 8. Homologi protein MMP-9 pada Balb/c (Mus musculus) dengan

manusia (Homo sapiens) menggunakan fitur BLAST pada

NCBI ......................................................................................... 41

Lampiran 9. Hasil homologi protein MMP-9 pada monyet hijau afrika

(Chlorocebus sabaeus) dengan manusia (Homo sapiens)

menggunakan fitur BLAST pada NCBI ................................. 42

Lampiran 10. Skema proses pembuatan partisi etil asetat daun asoka ............ 43

Lampiran 11. Spektrum MS partisi etil asetat daun asoka .............................. 44

Lampiran 12. Daftar singkatan ......................................................................... 50


1

PENDAHULUAN

Kanker merupakan sekumpulan penyakit yang dicirikan dengan sel-sel

yang tumbuh secara cepat dan tidak terkendali sehingga membentuk tumor yang

dapat menyerang ke jaringan di sekitarnya dan organ lain melalui darah atau

sistem limfa yang disebut metastasis (American Cancer Society, 2020). Menurut

WHO (2017), kanker diperkirakan telah mengakibatkan 9,6 juta orang meninggal

dunia dan merupakan penyebab kematian kedua terbesar setelah penyakit

kardiovaskular. Pada tahun 2021, diperhitungkan 1.898.160 kasus baru dan

608.570 kematian akibat kanker telah terjadi di Amerika Serikat yang setara

dengan hampir 1.600 kematian per hari. Jumlah kematian terbesar berasal dari

kanker paru-paru, prostat, dan kolorektum pada pria, sedangkan pada wanita

meliputi kanker paru-paru, payudara, dan kolorektum (Siegel et al. 2021). Di

Indonesia, angka kejadian kanker payudara yang menyerang perempuan, yaitu

sebesar 42,1 per 100.000 penduduk dengan rata-rata kematian 17 per 100.000

(Kemenkes RI, 2019). Kanker payudara merupakan tipe sel kanker yang

pertumbuhan selnya dimulai dari payudara dan merupakan penyebab kematian

kedua akibat kanker pada wanita (American Cancer Society, 2017). Pertumbuhan

pada sel kanker payudara dimediasi oleh beberapa hormon dan reseptor

pertumbuhan seperti esterogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), dan

human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) (Dai et al. 2016).

Hariono et al. (2020) telah melakukan penelitian mengenai MMP

inhibitor secara in vitro, menunjukan persen penghambatan yang bervariasi dari 0-

92% dengan konsentrasi 1 mg/mL pada sepuluh ekstrak tanaman lokal. Salah satu

tanaman yang diekstraksi dengan pelarut metanol dan menunjukkan aktivitas

penghambatan yang tinggi adalah daun asoka (Ixora coccinea L.) dengan

hambatan sebesar 86% dan IC50 81,56 μg/mL. Penelitian kemudian dilanjutkan

dengan melakukan uji sitotoksik ekstrak metanol daun asoka terhadap sel kanker

payudara 4T1 dan sel Vero, diperoleh nilai EC50 sebesar 270 g/mL, nilai CC50

sebesar 653 g/mL, dan nilai indeks keamanan sebesar 2,42. Djohan (2020) telah

melakukan pengujian fraksi etil asetat daun asoka terhadap penghambatan


2

aktivitas enzim MMP-9, menunjukkan persen penghambatan oleh fraksi 1 n-

heksana-etil asetat daun asoka dengan IC50 sebesar 116 μg/mL sehingga fraksi

tersebut memiliki potensi sebagai kandidat obat kanker payudara subtipe triple

negative. Senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 berdasarkan analisis spektra

KG-SM diprediksi sebagai ixorapeptida dengan variasi residu asam amino.

Tanaman asoka digolongkan sebagai tanaman hias dan secara tradisional

dipercaya dapat digunakan untuk berbagai pengobatan seperti nyeri, peradangan,

ketombe, radang kulit, pertumbuhan rambut dan kudis (Vutukuri, 2015). Okhale

et al. (2018) menyatakan bahwa tanaman asoka memiliki sifat antioksidan,

aktivitas antelmintik, hepatoprotektif, penyembuhan luka, sitotoksik dan

antitumor, kardioprotektif, dan pelindung saraf. Uji sitotoksik ekstrak kloroform

asoka telah dilakukan oleh Vutukuri (2015) terhadap sel kanker payudara MCF-7

menunjukan EC50 sebesar 429.9 ± 27.7 μg/mL.

Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) merupakan enzim yang berperan

penting dalam perkembangan sel kanker karena dapat mendegradasi extracellular

matrix (ECM) (Hariono et al. 2018) sehingga sel kanker dapat berkembang,

menginvasi, dan bermigrasi ke organ lain (Yousef et al. 2014). Berdasarkan

subtipe molekulnya, kanker payudara dikategorikan menjadi beberapa jenis yaitu

luminal tipe A, luminal tipe B, HER2, dan triple-negative (Ebili et al. 2014). Kim

et al. (2018) telah meneliti senyawa ipatasertib yang dikombinasi dengan

paclitaxel sebagai terapi lini pertama untuk kanker payudara triple-negative

metastatik pada fase klinik dua menunjukan hasil peningkatan kelangsungan

hidup pasien. MMP-9 diidentifikasi paling banyak diekspresikan pada subtipe

triple-negative, yang erat kaitannya dengan proses metastasis sel (Mehner et al.

2014).

Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan Djohan (2020), dilakukan

pengujian fraksi n-heksana etil asetat daun asoka terhadap aktivitas penghambatan

MMP-9. Hingga saat ini, uji antiproliferasi partisi etil asetat daun asoka terhadap

sel kanker payudara metastatik 4T1 belum dilakukan. Sehingga pada penelitian ini

akan dilakukan uji antiproliferasi partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka


3

terhadap sel kanker payudara metastatik 4T1 yang diawali dengan uji

penghambatan MMP-9 secara in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat

menghasilkan kandidat produk herbal yang secara selektif dapat menghambat

enzim MMP-9 sehingga tidak menimbulkan efek toksik bagi sel yang normal.

Selektitivitas partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka pada sel kanker

payudara metastatik 4T1 akan dibuktikan dengan membandingkan efek sitotoksik

pada sel kanker dengan sel Vero menggunakan metode MTT assay, melalui

parameter nilai IK (indeks keamanan). Senyawa yang terkandung di dalam partisi

tersebut akan diidentifikasi menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa

(KG-SM).

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka diperoleh dari penelitian

Djohan (2020) yang dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Kit

MMP-9 dibeli dari Biovision terdiri atas enzim MMP-9, substrat FRET-based

peptide, buffer, N-isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil) glisil hidroksamat (NNGH),

gliserol, dan dimetilsulfoksida (DMSO), Media kultur DMEM, Medium 199

(M199), fetal bovine serum (FBS), fungizone, streptomycin dan penicillin, tripsin-

EDTA, Trypan blue solution, phosphate buffer saline (PBS), sodium dodecyl

sulphate (SDS), reagen MTT diperoleh dari Laboratorium Kultur Sel, Fakultas

Kedokteran, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

Alat Penelitian

BSC kelas II (Esco), autoklaf (Hirayama), kulkas freezer, vortex, tanki

nitrogen, timbangan analitik (Ohaus), inkubator, alat dan gelas pada umumnya,

tips pipet, vortex, dan Synergy™ HTX multi-mode microplate reader (BioTek),

magnetic stirrer, pH meter, filter 0,2 mikron, botol duran 1000 mL, micropipette

(Socorex), 96-well plate (Iwaki), cryotube, conical tube, culture dish,

sentrifugator, mikroskop inverted (Magnus), hemasitometer counter, inkubator


4

CO2 (Thermo Science), dan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM

QP2010S SHIMADZU).

Tata Cara Penelitian

Pembuatan partisi etil asetat daun asoka

Partisi etil asetat daun asoka diperoleh dari penelitian Djohan (2020)

yang dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Determinasi

tanaman dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, dengan tujuan

memastikan spesimen yang dimaksud merupakan tanaman asoka (Ixora coccinea

L.). Daun asoka varietas bunga kuning diperoleh dari daerah Paingan,

Yogyakarta. Daun asoka yang dipilih merupakan daun dengan permukaan halus,

berwarna hijau, tidak layu, tidak berlubang, tidak kotor dan berukuran sedang

sampai besar. Daun asoka terpilih kemudian di pisahkan dari bahan pengganggu

dan dicuci dengan air mengalir. Setelah itu daun asoka dipotong membujur

dengan ukuran sedang hingga besar dan dikeringkan dengan dijemur diatas

nampan yang tertutup dengan kain hitam. Daun asoka yang telah kering

dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu yang tersisa, kemudian dibuat serbuk

dengan menggunakan grinder dan disimpan. Simplisia daun asoka yang telah

dibuat ditetapkan kadar airnya dengan menggunakan metode destilasi toluena,

dengan tujuan untuk meminimalisir bertumbuhnya mikroba, jamur, dan

mikroorganisme lainnya dalam serbuk simplisia.

Pembuatan ekstrak metanol dilakukan dengan maserasi. Sebanyak 180

gram serbuk simplisia ditimbang dan dilarutkan kedalam 540 mL metanol (1:3),

ditutup, dan dibiarkan selama 24 jam dengan kondisi terlindung dari cahaya dan

diaduk dengan shaker. Hasil maserat disaring dengan corong butchner yang

dilapisi kertas saring Whatman No.1 sambil di vakum. Serbuk hasil penyarian

dimaserasi kembali dengan pelarut, jumlah volume, dan waktu yang sama

sebanyak 3 kali. Hasil maserat pertama, kedua, dan ketiga kemudian diuapkan

dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 °C dan diuapkan kembali

dengan waterbath pada suhu yang sama untuk menghilangkan pelarut metanol

yang masih terdapat dalam ekstrak. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang


5

sebanyak 40 gram dan dipartisi dengan 800 mL pelarut mulai dari n-heksana, etil

asetat, butanol, dan akuades menggunakan corong pisah. Ekstrak terlebih dahulu

dilarutkan dalam akuades dan dimasukan ke dalam corong pisah, kemudian

ditambahkan juga n-heksana dengan volume yang sama dengan akuades. Partisi

dilakukan sebanyak 3 kali hingga diperoleh fase air dan n-heksana. Fase air yang

diperoleh disiapkan untuk partisi selanjutnya dengan menggunakan etil asetat dan

n-butanol. Empat fase yang diperoleh yaitu : fase n-heksana, etil asetat, n-butanol,

dan air, kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dengan

suhu 40°C. Partisi etil asetat daun asoka yang diperoleh kemudian akan di uji

aktivitas penghambatannya terhadap enzim MMP-9.

Uji aktivitas penghambatan enzim MMP-9

Blanko kontrol (100 µL buffer uji MMP-9) dipipetkan ke dalam well-

plate pada baris A 1-3. Kontrol negatif disiapkan dengan memipet 45 µL buffer

uji MMP-9 dan 5 µL enzim MMP-9 pada baris A 4-6. Sampel partisi asoka etil

asetat dipipet sebanyak 1 µL kemudian ditambah 44 µL buffer uji MMP-9 dan 5

µL enzim MMP-9 tiap well pada baris B 4-6. Kontrol pelarut disiapkan dengan

memipet 44 µL buffer uji MMP-9, 1 µL pelarut yang digunakan (DMSO) dan 5

µL enzim MMP-9 tiap well pada baris A 10-12. Kontrol positif disiapkan dengan

memipet 43 µL buffer uji MMP-9, 2 µL NNGH, dan 5 µL enzim MMP-9 pada

baris A 7-9.

Setelah semua perlakuan selesai, well- plate diinkubasi pada suhu 37°C

selama 30 menit. Setelah itu, 1 µL substrat FRET-based MMP-9 dan 49 µL buffer

ditambahkan pada sampel, kontrol pelarut, kontrol positif, dan kontrol negatif,

kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai,

fluorosensi dari masing-masing well dibaca menggunakan multimode microplate

reader (Synergy HTX-3) pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang

gelombang emisi 393 nm. Desain well-plate untuk uji aktivitas in vitro MMP-9

disajikan pada Tabel I.


6

Tabel I. Desain well-plate untuk uji aktivitas in vitro MMP-9

Keterangan :

B : Blangko (larutan buffer 100 µl)

KP : Kontrol positif (larutan buffer 45 µl + enzim 5 µl + substrat 50 µl)

KN : Kontrol negatif (larutan buffer 43 µl + NNGH 2 µl + enzim 5 µl + substrat 50 µl)

P : Kontrol pelarut (larutan buffer 40 µl + DMSO 5 µl + enzim 5 µl + substrat 50 µl)

S : Sampel (larutan buffer 44 µl + sampel partisi etil asetat daun asoka 1 µl + enzim 5 µl +

substrat 50 µl)

Uji proliferasi sel 4T1 dan sel Vero

a. Sterilisasi alat dan bahan. Alat – alat yang akan digunakan terlebih

dahulu dicuci dengan deterjen dan dikeringkan. Setelah kering, alat disterilkan

dengan autoklaf pada tekanan 2 atm dan suhu 121oC selama kurang lebih 20

menit. Sterilisasi BSC dilakukan terlebih dahulu, dengan cara menyalakan UV

selama 30 menit. Kemudian lampu UV dimatikan, dan ditunggu 3 menit. Penutup

BSC dibuka dan dinyalakan lampu biasa, permukaan meja disemprot dengan

alkohol 70% dan dikeringkan dengan tisu. Alat dan bahan yang akan digunakan,

dimasukkan ke dalam BSC.

b. Pembuatan media. Di dalam BSC, media padat DMEM untuk sel

4T1 dan M199 untuk sel Vero dilarutkan dengan 950 mL akuabides steril dalam

gelas beker 1000 mL. Kemudian, ditambahkan 2,2 g NaHCO3 dan akuabides steril

hingga volume 1000 mL. Campuran diaduk dengan magnetic stirrer hingga

larutan homogen. pH disesuaikan 0,2-0,3 di bawah pH yang diinginkan dengan

penambahan NaOH 1 N atau HCl 1 N. Filtrasi media dilakukan dengan filter 0,2

mikron, ditampung dalam duran 1000 mL dan disimpan pada suhu 4°C.

c. Pembuatan media kultur lengkap. Botol duran volume 100 mL

disiapkan, kemudian ditambahkan 10 mL FBS dan 1,5 mL penisilin-streptomisin

ke dalam botol duran, dan ditambah media cair hingga 100 mL.

d. Thawing sel. Media kultur yang sesuai untuk sel disiapkan

sebanyak 3 mL dalam conical tube. Cyro tube yang berisi sel diambil dari tangki

nitrogen dan dicairkan pada suhu ruang. Suspensi sel diambil dengan mikropipet


7

1000 µL kemudian dimasukan tetes demi tetes ke dalam conical tube yang berisi

MK. Conical tube kemudian disentrifugasi dengan sentrifus pada 1000 rpm

selama 1-3 menit. Supernatan dibuang ke limbah pembuangan, sementara media

baru sebanyak 4 mL ditambahkan, dan diresuspensi kembali hingga homogen.

Jumlah sel dalam larutan yang hidup dihitung menggunakan hemositometer dan

trypan blue. Sejumlah sel dimasukan dalam TCD 10 cm dan ditambahkan media

kultur hingga total media 7 mL. Kondisi sel diamati dengan mikroskop kemudian

disimpan ke dalam inkubator CO2 dengan konsentrasi 5 %.

e. Panen sel. Sel diambil dari inkubator CO2 dan diamati kondisinya

dengan mikroskop inverted. Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen. Media

tumbuh sel dibuang dengan menggunakan mikropipet, sel kemudian dicuci

menggunakan PBS sebanyak 1-2 kali dengan volume 3 mL. Tripsin-EDTA

(tripsin 0,25%) ditambahkan ke semua bagian sel, kemudian tripsin-EDTA

dibuang untuk menghindari kerusakan pada kultur sel dengan menggunakan

mikropipet. Sel diinkubasi selama 2 menit pada inkubator sambil diketuk bagian

bawah dish-nya untuk membantu melepas sel kemudian ditambahkan media 3 mL

ke dalam dish untuk menonaktifkan tripsin. Media dan sel dipindahkan ke dalam

conical tube untuk disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama empat

menit. Media yang berada di bagian atas dibuang tanpa mengganggu pellet sel

yang telah terbentuk. Resuspensi dilakukan pada media tumbuh yang baru (2 mL).

f. Perhitungan sel dengan hemositometer. Stok dari hasil panen sel

diambil dari dalam conical tube kemudian dipastikan telah tersuspensi dengan

baik. Dari sel tersebut diambil 10 µL sebanyak dua kali dan masing - masing

ditambahkan trypan blue 10 µL, dihomogenkan dan dipipetkan ke hemasitometer.

Sel yang hidup diindikasikan dengan warna terang kemudian dihitung di bawah

mikroskop dengan bantuan hand counter. Perhitungan sel dilakukan pada empat

kamar hitung. Sel yang berwarna gelap dan berada di batas luar atas dan kanan

tidak dihitung, sedangkan yang berada pada batas kiri dan bawah dihitung. Jumlah

sel dan volume pemanenan dihitung, kemudan diambil sejumlah sel yang

dibutuhkan untuk ditambahkan dengan media.

g. Uji proliferasi terhadap sel kanker payudara 4T1. Sel 4T1 yang


8

telah dikultur diisikan kedalam 96 well-plate sebanyak 100 µL ke dalam setiap

well, kemudian diinkubasi selama 12-24 jam. Sampel dipreparasi dengan cara

ditimbang masing - masing partisi sebanyak 10 mg dengan seksama dalam

mikrotube sampel kemudian dilarutkan dengan 100 µL DMSO sehingga

didapatkan larutan stok sampel dengan konsentrasi 10 mg/mL. Satu seri

konsentrasi (dibuat sebagai berikut :1000 ; 500 ; 250 ; 125 ; 62,5 ; 31.25

µg/mL). Sel yang telah diinkubasi kemudian diamati kondisinya dengan

menggunakan mikroskop inverted. Media lama kemudian dibuang dan sel dicuci

dengan menggunakan PBS secukupnya. PBS dibuang, kemudian dimasukan seri

konsentrasi tiap sampel dan diinkubasi selama 24 jam. Reagen MTT sebanyak 0,5

mg/mL disiapkan dengan cara mengambil 0,8 mL stok MTT dalam PBS (5

mg/mL) lalu ditambahkan dengan MK hingga 8 mL (1:9). Kultur sel kemudian

dicuci dengan PBS sebanyak 1-2 kali. Setiap well kemudian ditambahkan dengan

100 µL MTT dan diinkubasi selama 4 jam. Kultur sel diperiksa kondisinya

menggunakan mikroskop inverted, jika sudah terbentuk kristal formazan dengan

jelas maka dapat ditambahkan 100 µL stopper SDS 10% dalam 0,01 N HCl. Plate

dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi di tempat gelap selama 12

jam. Setelah waktu inkubasi selesai, plate kemudian diuji dengan ELISA reader

dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm (550-600). Tabel II

menyajikan desain well-plate untuk uji MTT.

Tabel II. Desain well-plate untuk uji MTT

Keterangan :

KP : Kontrol positif (sel kultur + doxorubicin dengan konsentrasi (KP1: 2.5 ; KP2: 5, KP3:

10 ; KP4: 20 ; KP5: 40) µg/mL)

KB : Kontrol blangko (media kultur)

KS : Kontrol sel (sel kultur)

AEA : Sel kultur + sampel asoka etil asetat dibuat dalam enam seri konsentrasi (baris A : 31,25

; baris B : 62,5 ; baris C : 125 ; baris D : 250 ; baris E : 500 ; baris F : 1000) µg/mL

h. Uji keamanan terhadap sel Vero. Prosedur yang dilakukan sama


9

dengan pengujian aktivitas terhadap sel kanker payudara 4T1.

Pemeriksaan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

Analisis KG-SM dilakukan di Laboratorium Penelitian Terpadu Fakultas

Farmasi-Universitas Ahmad Dahlan (UAD). Alat yang digunakan adalah GCMS-

QP2010 SE (Shimadzu, Jepang) dengan spesifikasi kolom kapiler Rtx 5 MS (5%

diphenyl / 95% dimethyl polysiloxane) dan gas pembawa berupa helium. Partisi

sebanyak 5 mg dilarutkan dalam pelarut yang telah diorientasi kemudian diambil

sebanyak 1 μL untuk diinjekkan ke dalam KG-SM. KG-SM dikondisikan dengan

kondisi operasional, yaitu gas pembawa dialirkan dengan laju alir konstan 3,22

mL/ menit, Suhu awal oven dijaga pada 60° C selama 3,4 menit kemudian

ditingkatkan 12° C/menit hingga 240 ° C. Suhu secara bertahap ditingkatkan dari

60 ° C menjadi 290° C dan ditahan secara isothermal selama 2 menit. Senyawa

diidentifikasi dengan membandingkan spektrum massa yang diperoleh dengan

spektrum massa pada perpustakaan NIST08s Library.

Analisis hasil

1. Analisis hasil uji In Vitro enzim MMP-9

Senyawa hasil fraksinasi diprediksi aktivitasnya dengan menghitung nilai

persentase penghambatan, dihitung menggunakan rumus :

1 − Bacaan fluoresensi sampel −blanko

Bacaan fluoresensi −blanko x 100 % (1)

2. Jumlah sel yang dibutuhkan dan volume panenan sel yang ditransfer

Jumlah sel terhitung/ 2 mL = sel pada keempat kamar

4 x 10

4 x 2 (2)

Volume panenan sel yang ditransfer = Jumlah sel yang diperlukan

Jumlah sel terhitung /mL (3)

3. Menentukan persen viabilitas sel

Persen viabilitas sel ditentukan dengan rumus :

Viabilitas sel (%) = absorbansi perlakuan −absorbansi kontrol media

absorbansi kontrol sel−absorbansi kontrol medi 𝑎 x 100% (4)


10

4. Indeks keamanan

IK = CC 50 sel Vero

EC 50 sel 4T1 (5)

5. Analisis profil KG-SM

Output yang dihasilkan berupa spektrum massa, yaitu grafik jumlah ion

yang terdeksi sebagai fungsi dari rasio m/z.

6. Analisis Statistik

Analisis statistik berupa perhitungan nilai SD dan uji T tidak

berpasangan dengan menggunakan aplikasi GraphPad Prism 9.0.0.

7. Perhitungan EC50 dan CC50

Grafik log konsentrasi vs persentase viabilitas sel dengan persamaan regrersi non-

linear dibuat dengan aplikasi GraphPad Prism 9.0.0 menggunakan model

log(inhibitor) vs normalized response – variable slope. Perhitungan dilakukan

secara otomatis dengan menggunakan aplikasi, hingga diperoleh nilai r untuk

masing-masing grafik, nilai EC50 terhadap sel 4T1 dan CC50 terhadap sel Vero.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim MMP-9

Partisi etil asetat daun asoka diuji aktivitas penghambatannya terhadap

enzim MMP-9 secara in vitro berdasarkan prinsip FRET (Fluorescence

Resonance Energy Transfer). MMP-9 merupakan suatu enzim yang memiliki

aktivitas proteolitik dan berperan penting dalam proses degradasi extracellular

matrix (ECM). Substrat yang digunakan berupa suatu peptida yang berikatan

dengan gugus fluorofor. MMP-9 akan memotong ikatan tersebut yang kemudian

akan melepas gugus fluofor dan akan terbaca fluroresensinya pada panjang

gelombang eksitasi 325 nm dan emisi 393 nm. Aktivitas enzim MMP-9 akan

berbanding lurus dengan nilai fluororesensi yang dihasilkan, semakin tinggi nilai

fluororesensi yang terdeteksi menunjukan semakin tinggi pula aktivitas enzim

dalam memotong ikatan peptida dengan substrat. Mekanisme pemotongan

substrat oleh enzim MMP-9 disajikan pada Gambar 1.


11

Gambar 1. Mekanisme pemotongan substrat oleh enzim MMP-9 (Cheng et

al. 2008; Nicolotti et al. 2012)

Sampel partisi yang digunakan diuji secara organoleptis dengan melakukan

pemeriksaan terhadap warna dan bentuk fisiknya, menunjukan tidak adanya

perubahan bila dibandingkan dengan penelitian sebelumnya, yaitu padatan kristal

berwarna hitam tanpa adanya pertumbuhan jamur maupun mikroba. Preparasi

sampel dilakukan dengan menguji kelarutannya terlebih dahulu. DMSO dipilih

sebagai pelarut karena mampu melarutkan sampel dengan sempurna. Kesalahan

dalam pemilihan pelarut dapat menyebabkan penurunan konsentrasi sampel

terlarut dalam pelarut, sehingga hasil yang diperoleh menjadi tidak akurat. Popa-

Burke dan Russell (2014) menyatakan bahwa konsentrasi DMSO yang dapat

ditoleransi dalam pengujian berbasis enzim yaitu sebesar 1%, sehingga sampel

dipreparasi hingga diperoleh konsentrasi akhir DMSO untuk masing-masing well

yaitu 1%. NNGH digunakan sebagai kontrol positif dikarenakan terdapat suatu

gugus hidroksamat pada struktur NNGH. Gugus tersebut akan membentuk kelat

dengan ion zinc dan berinteraksi dengan asam amino GLU402 untuk menarik air

sehingga lebih dekat dengan ikatan scissile amide pada inhibitor sehingga

mencegah proteolisis substrat peptida oleh enzim (Hariono et al., 2020).

Kontrol blanko dalam pengujian ini berupa buffer tanpa adanya aktivitas

dari enzim, digunakan sebagai baseline bacaan fluororesensi. Kontrol negatif

+


12

berupa buffer, enzim, dan substrat, digunakan untuk melihat fluororesensi

aktivitas enzim tanpa adanya penghambatan. Kontrol positif berupa buffer, N-

isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil) glisil hidroksamat (NNGH), enzim, dan

substrat, digunakan sebagai pembanding penghambatan dengan sampel terhadap

aktivitas MMP-9, sekaligus memastikan bahwa prosedur yang telah dilaksankan

sudah valid. Kontrol pelarut berupa buffer, pelarut (DMSO), enzim, dan substrat,

digunakan untuk memastikan pelarut yang digunakan dalam pengujian ini tidak

berfluororesensi, sehingga tidak akan mengganggu hasil pembacaan. Kelompok

perlakuan berupa buffer, enzim, substrat, dan sampel partisi etil asetat daun asoka.

Pada penelitian ini kontrol positif yang digunakan mengacu pada

penelitian Hariono et al (2020), dengan menggunakan metode yang sama dan

sudah tervalidasi. Nilai penghambatan pada kontrol positif menunjukan nilai

sebesar 100%, hal tersebut mengindikasikan bahwa prosedur yang telah dilakukan

sudah sesuai. Kontrol pelarut menunjukan nilai penghambatan sebesar 5%, nilai

tersebut digunakan sebagai koreksi terhadap nilai penghambatan sampel tanpa

adanya faktor penghambatan dari pelarut. Pada penelitian ini konsentrasi sampel

1000 µg/mL dipilih berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Cha et al.

(2003) menunjukan konsentrasi optimal suatu sampel herbal dalam menghambat

enzim MMP-9 adalah 1000 µg/mL . Aderogba et al. (2013) menyatakan bahwa

penghambatan aktivitas enzim oleh sampel dapat dikategorikan menjadi 4 tingkat

: dikatakan tidak aktif (penghambatan <20%); lemah (20-40%); Sedang (40-70%);

Tinggi (penghambatan >70%). Hasil pengujian in vitro menunjukan partisi etil

asetat daun asoka memiliki persen penghambatan terhadap enzim sebesar 94%

dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Berdasarkan hasil yang diperoleh maka dapat

dikatakan sampel partisi etil asetat daun asoka memiliki penghambatan aktivitas

yang tinggi terhadap enzim MMP-9. Hasil fluororesensi terhadap aktivitas enzim

MMP-9 disajikan pada Tabel III.


13

Tabel III. Hasil fluoresensi sampel uji terhadap aktivitas enzim MMP-9

Bacaan fluororesensi Rata-

rata Baseline

Aktivitas

enzim (%)

Inhibisi

enzim (%)

Inhibisi enzim -

kontrol pelarut

(%)±SD R1 R2 R3

Blanko 99 99 96 98 - - - -

Kontrol

pelarut 212 206 201 206 108 95 5 5±5,5

Kontrol

negatif 224 190 222 212 114 100 - -

Sampel 105 90 104 100 2 1 99 94±8,38

Tabel IV. Hasil fluoresensi kontrol positif terhadap aktivitas enzim MMP-9

(Hariono et al. 2020)

Blanko 72 81 83 79 - - - -

Kontrol

positif 81 68 68 72 -6 -5 80 75±4

Uji Proliferasi Sel 4T1 dan Sel Vero

Pengujian sampel partisi etil asetat daun asoka kemudian dilanjutkan ke

tingkat seluler terhadap sel kanker payudara 4T1 dan sel normal Vero. Selain dari

karakteristiknya, Sel 4T1 dan Sel Vero dipilih sebagai subjek uji berdasarkan

tingkat kemiripan sekuens protein MMP-9 dengan manusia (Homo sapiens). Kode

protein yang diperoleh dari NCBI kemudian dibandingkan dengan menggunakan

program BLAST, diperoleh tingkat kemiripan masing-masing yaitu 71,96% dan

93,92%. Penentuan tingkat kemiripan tersebut sangat penting dilakukan untuk

memastikan bahwa subjek yang akan digunakan dalam penelitian dapat

merepresentasikan protein pada sel manusia. Sel yang digunakan dalam penelitian

ini merupakan hasil kultur dari sel induk, sel 4T1 merupakan sel generasi ke-5,

sedangkan sel Vero merupakan generasi ke-8.

Ketepatan dalam pemilihan media yang akan digunakan selama

pengujian akan mempengaruhi pertumbuhan, tingkat stres, hingga kematian sel.

Pada penelitian ini, media dipilih berdasarkan kesesuaiannya dengan sel yang

pada sel 4T1 digunakan media DMEM sedangkan pada sel Vero digunakan media

M199. Uji proliferasi ke sel 4T1 dan sel Vero dilakukan dengan menggunakan

metode MTT. MTT merupakan metode yang paling umum digunakan untuk

mengevaluasi penelitian terkait proliferasi dan sitotoksisitas sel dengan

mekanisme redoks (Molaae et al. 2017; Sylvester, 2011). MTT mendeteksi


14

proliferasi sel berdasarkan laju pertumbuhan sel, dapat dideteksi dari aktivitas sel

dan nilai absorbansi yang terbaca oleh alat (Duzgunes, 2012). Prinsip metode

tersebut adalah pemotongan garam tetrazolium berwarna kuning menjadi kristal

formazan berwarna ungu oleh enzim mitokondria suksinat dehidrogenase (SDH)

(Sylvester, 2011).

Kontrol blanko dalam penelitian ini berisi media dan reagen MTT tanpa

adanya sel, digunakan sebagai dasar pengurangan nilai bacaan absorbansi oleh

media maupun reagen MTT. Kontrol sel hanya berisi sel 4T1 atau sel Vero,

digunakan untuk melihat viabilitas sel tanpa adanya perlakuan sampel maupun

obat. Nilai absorbansi yang diperoleh dari kontrol negatif akan digunakan sebagai

faktor pembagi terhadap absorbansi sel yang diberikan perlakuan. Doxorubicin

digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian, dikarenakan doxorubicin

merupakan pengobatan lini pertama pada berbagai jenis kanker (Pados et al. 2012;

Utami et al. 2020). Selain itu, di berbagai penelitian terkait sel kanker dengan

menggunakan metode MTT, doxorubicin hingga saat ini masih digunakan sebagai

kontrol positif. Doxorubicin diketahui memiliki mekanisme penghambatan

terhadap sel kanker melalui interkalasi DNA, mengganggu perbaikan DNA yang

dimedias olehi topoisomerasi-II, dan pembentukan radikal bebas yang akan

merusak membran, DNA, dan protein sel kanker (Thorn et al. 2012).

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian harus disterilkan

terlebih dahulu, dan pengujian dilakukan di BSC kelas 2 untuk menghindari

adanya kontaminasi dari luar. Media yang digunakan sebagai media tumbuh sel

ditambahkan penisilin dan streptomisin untuk menghindari adanya infeksi bakteri

pada sel. Dalam pertumbuhannya, konsentrasi sel yang tinggi menyebabkan

produksi asam laktat dan berkurangnya nutrisi untuk pertumbuhan sel, sehingga

perlu dilakukan penggantian media tumbuh yang baru guna mencapai kondisi sel

yang pertumbuhannya optimum. Pemanenan sel 4T1 dan sel Vero dilakukan

ketika sel sudah konfluen 80%, ditambahkan tripsin-EDTA (tripsin 0,25%) untuk

melepas ikatan antar sel dan ikatan sel dengan matriks tanpa merusak sel itu

sendiri. Sel 4T1 dan sel Vero yang telah konfluen 80% disajikan pada Gambar 2.


15

Gambar 2. Visualisasi sel a) 4T1 dan b) Vero dalam keadaan konfluen 80%

sebelum diberi perlakuan (Perbesaran 4x/0,1 wd 18 mm)

Sel yang telah dipanen dipipet ke hemositometer, kemudian dihitung

dengan bantuan trypan blue di bawah mikroskop inverted. Sel yang hidup masih

memiliki sel membran yang utuh sehingga trypan blue tidak dapat menembus

masuk. Sebaliknya pada sel yang mati, trypan blue dapat masuk ke sitoplasma

melalui sel membran yang rusak (Duzgunes, 2012). Pada hemositometer, sel yang

masih hidup akan terlihat berwarna putih terang, sedangkan pada sel yang mati

akan berwarna gelap akibat trypan blue yang menembus membran sel. Sel

dihitung pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap dan sel yang berada di batas

luar menjauhi pusat tidak ikut dihitung. Jumlah sel 4T1 yang terhitung pada

hemositometer, yaitu sebanyak 95 x 104

sel/ mL, sedangkan sel Vero sebanyak

71,5 x 104

sel/ 2 mL. Visualisasi sel 4T1 setelah ditambahkan trypan blue, yang

diamati di bawah mikroskop inverted yang disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Visualisasi sel 4T1 hidup ditandai dengan tanda lingkaran,

sedangkan sel yang mati ditandai dengan tanda persegi (Perbesaran 4x/0,1

wd 18 mm)

Sel hidup

Sel mati

a) b)


16

Jumlah sel yang akan ditanam ke dalam 96 well-plate kemudian dihitung

hingga diperoleh jumlah sel tiap well sebanyak 104

sel. Stok sampel dibuat dengan

melarutkan 10 mg sampel dalam DMSO dan WFI dengan perbandingan 1:9.

Selain dapat melarutkan sampel, DMSO dipilih karena merupakan pelarut terbaik

yang dapat melarutkan kristal formazan (Twentyman and Luscombe, 1987).

Kelarutan formazan dalam pelarut yang sesuai sangat penting diperhatikan dalam

pengujian MTT untuk memperoleh data yang valid dan reliable (Septisetyani et

al. 2014). Sampel partisi etil asetat daun asoka dipreparasi dalam 6 seri

konsentrasi yaitu 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/mL, pengenceran

dilakukan dengan menggunakan media yang sesuai untuk sel. Begitu pula dengan

doxorubicin sebagai kontrol positif, dipreparasi dalam 6 seri konsentrasi yaitu

400; 200; 100; 50; 25; 12,5 µg/mL.

Sel yang telah diinkubasi kemudian diberi perlakuan sampel dan

doxorubicin, lalu diinkubasi kembali selama 24-48 jam. Visualisasi kontrol sel

dan sel perlakuan sampel yang diamati di bawah mikroskop inverted, disajikan

pada Gambar 4. Berdasarkan gambar, dapat dilihat perbandingan morfologi antara

sel yang diberi perlakuan dengan sel yang tidak diberi perlakuan. Sel yang diberi

perlakuan cenderung mengalami perubahan bentuk menjadi tidak beraturan dan

secara kualitatif jumlah sel yang terbentuk jauh lebih sedikit. Secara umum, sel

kanker akan terus berproliferasi hingga mencapai kepadatan yang tinggi di dalam

media (Cooper, 2000), sebaliknya, penurunan jumlah sel kanker dalam media

menjadi salah satu indikator adanya penghambatan proliferasi sel oleh sampel.


17

Gambar 4. Visualisasi sel a) 4T1 tanpa perlakuan, b) 4T1 dengan perlakuan

sampel 1000 µg/mL, c) Vero tanpa perlakuan, dan d) Vero dengan perlakuan

sampel 1000 µg/mL (Perbesaran 4x/0,1 wd 18 mm)

Reagen MTT ditambahkan ke dalam tiap well kontrol dan perlakuan,

untuk mempertegas pembacaan secara kuantitatif berdasarkan nilai absorbansi

yang terbaca. Semakin tinggi jumlah sel yang hidup maka jumlah kristal

formazan yang terbentuk juga akan semakin banyak. Setelah diinkubasi selama 2-

4 jam, kristal formazan secara jelas telah terbentuk, maka ditambahkan SDS 10%

dalam HCl untuk menghentikan reaksi. Selain digunakan sebagai stopper, SDS

juga mampu melarutkan kristal formazan sebesar 10% dan membantu pembacaan

absorbansi formazan (Septisetyani et al. 2014). Pada kontrol negatif, jumlah

kristal formazan yang terbentuk jauh lebih banyak dibandingkan dengan

perlakuan, hal ini menunjukan bahwa sel memiliki aktivitas yang lebih tinggi

dengan tidak adanya perlakuan sampel. Visualisasi terbentuknya kristal formazan

oleh sel 4T1 disajikan pada Gambar 5.

Bentuk sel beraturan

dan membrane sel utuh

Bentuk sel beraturan

dan membrane sel utuh

Bentuk sel tidak beraturan

dan membrane sel rusak

Bentuk sel tidak beraturan

dan membrane sel rusak

a) b)

c) d)


18

Gambar 5. Perbandingan kristal formazan yang terbentuk dari sel 4T1 a)

tanpa perlakuan dan b) perlakuan sampel 1000 µg/mL (Perbesaran 4x/0,1

wd 18 mm)

Tabel V. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel 4T1 pada perlakuan

sampel partisi etil asetat

Konse-

ntrasi

(µg

/mL)

Log

Konse

-ntrasi

Absorbansi Viabilitas sel (%)

R1 R2 R3 Rerata V1 V2 V3 Rerata ± SD

1000 3,00 0,113 0,1169 0,1179 0,116 17,23 18,13 18,37 17,91 ± 0,60

500 2,70 0,0968 0,0953 0,1003 0,097 13,23 12,87 14,09 13,40 ± 0,62

250 2,40 0,0817 0,088 0,0901 0,087 9,56 11,04 11,60 10,73 ± 1,06

125 2,10 0,1201 0,1141 0,1103 0,115 18,91 17,45 16,52 17,63 ± 1,20

62,5 1,80 0,1906 0,1731 0,1967 0,187 36,08 31,82 37,57 35,15 ± 2,98

31,25 1,49 0,4324 0,489 0,488 0,470 94,97 108,7

6 108,4

2 104,05 ±

7,86

Kontrol sel 0,468 0,4423 0,4488 0,453

Kontrol media 0,0426 0,0427 0,0421 0,042

Well plate kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 595

nm, hasil absorbansi sel 4T1 pada perlakuan sampel disajikan pada Tabel V.

Perlakuan sampel pada konsentrasi 1000 µg/mL menunjukan persen viabilitas sel

rata-rata sebesar 17,91%, sedangkan pada konsentrasi 31,25 µg/mL sebesar

104,05%. Berdasarkan hasil pembacaan, diperoleh nilai EC50 sampel terhadap sel

4T1 sebesar 57,50 ± 1,366 µg/mL. Menurut Wibowo et al. (2011), suatu senyawa

dikatakan sangat aktif apabila nilai EC50 <5 µg/mL; aktif EC50 5-10 µg/mL;

sedang EC50 10-20 µg/mL; lemah EC50 20-100 µg/mL; tidak aktif EC50 >100

µg/mL. Berdasarkan spektrum aktivitas senyawa di atas, maka dapat dinyatakan

partisi etil asetat daun asoka memiliki aktivitas yang lemah karena memiliki nilai

EC50 pada rentang 20-100 µg/mL. Aktivitas lemah yang diperoleh dapat

b) a)

Kristal formazan banyak

terbentuk

Kristal formazan sedikit atau

tidak terbentuk


19

disebabkan karena keberagaman senyawa yang terkandung dalam partisi masih

tinggi. Hasil pengujian ini menunjukan bahwa partisi etil asetat daun asoka

memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai kandidat antikanker payudara

subtipe triple negative. Bagaimanapun, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan

untuk memaksimalkan potensi yang terdapat dalam sampel, dengan mengisolasi

senyawa target, ataupun melakukan uji kombinasi sampel dengan tanaman lain

atau dengan obat antikanker. Haryanti et al. (2019) telah melakukan pengujian

kombinasi ekstrak etanolik kayu secang dan rimpang lempuyang, menunjukan

efek antikanker yang lebih sinergis bila dibandingkan dengan ekstrak tunggal.

Gambar 6 menyajikan grafik log konsentrasi vs persentase viabilitas sel 4T1 yang

dibuat dengan persamaan regrersi non-linear, diperoleh nilai R2

pada perlakuan

sampel = 0,8469 dan kontrol positif = 0,5193.

Gambar 6. Grafik persentase viabilitas sel 4T1 vs a) log kosentrasi sampel

dan b) log kosentrasi doxorubicin dengan persamaan regresi non-linear

Tabel VI. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel Vero pada

perlakuan sampel partisi etil asetat Konse-

ntrasi

(µg

/mL)

Log

Konse

-ntrasi



1000 3,00 0,080 0,0806 0,0816 0,081 6,66 6,79 6,98 6,81 ± 0,159

500 2,70 0,3008 0,28 0,2806 0,287 47,77 43,90 44,01 45,23 ± 2,20

250 2,40 0,4245 0,416 0,4962 0,446 70,79 69,29 84,14 74,74 ± 8,17

125 2,10 0,6503 0,5228 0,5498 0,559 104,4

4 89,09 94,11 95,88 ± 7,83

62,5 1,80 0,5596 0,5659 0,6274 0,584 95,94 97,11 108,5

5 100,53 ±

6,97

31,25 1,49 0,5392 0,5761 0,604 0,573 92,14 99,01 104,1

6 98,44 ± 6,03

Kontrol sel 0,585 0,5363 0,623 0,581

Kontrol media 0,043 0,0442 0,0451 0,044

a) b)


20

Masalah paling utama pada pengembangan agen antikanker payudara

adalah ketidakselektivannya terhadap target, yang dapat menimbulkan beberapa

efek samping yang merugikan. Pengujian sampel terhadap sel normal Vero sangat

penting dilakukan, untuk memastikan bahwa sampel memiliki tingkat keamanan

yang tinggi. Hasil absorbansi sel Vero pada perlakuan sampel disajikan pada

Tabel VI. Perlakuan sampel pada konsentrasi 1000 µg/mL menunjukan persen

viabilitas sel rata-rata sebesar 6,81%, sedangkan pada konsentrasi 31,25 µg/mL

sebesar 98,44%. Berdasarkan hasil pembacaan diperoleh nilai CC50 sampel

terhadap sel Vero sebesar 429,5 ± 29,81 µg/mL, sehingga dapat dinyatakan

sampel partisi etil asetat daun asoka tidak aktif terhadap sel normal Vero. Gambar

10 menyajikan grafik log konsentrasi vs persentase viabilitas sel Vero yang dibuat

dengan persamaan regrersi non-linear, diperoleh nilai R2 pada perlakuan sampel =

0,9713 dan kontrol positif = 0,849.

Gambar 7. Grafik persentase viabilitas sel Vero vs a) log konsentrasi sampel

dan b) log konsentrasi doxorubicin dengan persamaan regresi non-linear

Tabel VII. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel 4T1 pada

perlakuan kontrol positif Konse-

ntrasi

(µg

/mL)

Log

Konse

-ntrasi



400 2,60 0,281 0,2828 0,2762 0,280 58,15 58,54 56,93 57,87 ± 0,84

200 2,30 0,2812 0,2844 0,3122 0,293 58,15 58,93 65,70 60,92 ± 4,15

100 2,00 0,3033 0,342 0,3753 0,340 63,53 72,98 81,07 72,53 ± 8,78

50 1,70 0,3615 0,3875 0,4166 0,389 77,71 84,04 91,13 84,29 ± 6,71

25 1,40 0,4301 0,4447 0,5344 0,470 94,91 97,97 119,8

2

104,07 ±

13,76

12,5 1,10 0,5415 0,5652 0,717 0,608 121,5

5

127,3

2

164,3

4

137,74 ±

23,22

Kontrol sel 0,468 0,4423 0,4488 0,453

Kontrol media 0,0426 0,0427 0,0421 0,042

a) b)


21

Tabel VIII. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel Vero pada

perlakuan kontrol positif Konse-

ntrasi

(µg

/mL)

Log

Konse

-ntrasi



400 2,60 0,076 0,078 0,078 0,077 7,29 7,67 7,67 7,54 ± 0,22

200 2,30 0,198 0,186 0,191 0,192 30,63 28,33 29,29 29,41 ± 1,15

100 2,00 0,307 0,314 0,305 0,309 51,48 52,82 51,09 51,79 ± 0,90

50 1,70 0,387 0,387 0,372 0,382 66,78 66,78 63,91 65,82 ± 1,66

25 1,40 0,389 0,378 0,399 0,389 67,16 65,06 69.07 67,10 ± 2,01

12,5 1,10 0,391 0,393 0,397 0,394 67,54 67,93 68,89 68,05 ± 0,58

Kontrol sel 0,546 0,567 0,569 0,561

Kontrol media 0,0379 0,0387 0,0371 0,038

Dalam penelitian ini doxorubicin dipilih sebagai kontrol positif,

digunakan untuk membandingkan tingkat aktivitas dan keamanan dari sampel

terhadap sel kanker dan sel normal. Hasil absorbansi kontrol positif dan pada

perlakuan sampel disajikan pada Tabel VII dan VIII. Berdasarkan penelitian yang

telah dilakukan, kontrol positif doxorubicin menunjukan nilai EC50 sebesar 388,4

µg/mL dan CC50 sebesar 69,58 µg/mL. Data yang telah diperoleh kemudian

digunakan untuk menghitung Indeks Keamanannya (IK). IK merupakan indikator

yang digunakan untuk mengetahui keamanan dari suatu senyawa yang didasarkan

pada tingkat selektivitasnya terhadap sel kanker dan sel normal. Sutejo et al.

(2016), menyatakan suatu senyawa mempunyai selektivitas yang tinggi apabila

nilai IK ≥ 3, dan dikatakan kurang selektif apabila nilai IK < 3. Berdasarkan hasil

yang disajikan pada Tabel VI, ditunjukan bahwa sampel memiliki aktivitas yang

lebih tinggi terhadap sel kanker dan lebih selektif terhadap sel normal

dibandingkan dengan kontrol positif. Nilai EC50 kontrol postif yang terlalu tinggi

dapat dikaitkan dengan ketidakselektivan obat terhadap target dan beberapa efek

samping yang merugikan. Selain itu, efek samping yang ditimbulkan doxorubicin

juga dapat merusak sel normal (Yusuf et al. 2018) Tabel absorbansi dan

viabililitas kontrol positif dapat dilihat pada Lampiran 6.


22

Tabel IX. Hasil EC50, CC50, dan IK dari sampel dan kontrol positif

EC50 (µg/mL) CC50 (µg/mL) IK

Sampel 57,5 429,5 7,469

Kontrol positif 388,4 69,58 0,179

Uji T tidak berpasangan dilakukan untuk mengetahui adanya perbedaan

signifikan pada perlakuan dan kontrol positif. Uji T dilakukan dengan taraf

kepercayan 95%, dikatakan berbeda bermakna apabila p-value < 0,05 (Putra and

Syarif, 2014). Berdasarkan hasil uji T pada sel 4T1 dengan membandingkan EC50

sampel dengan kontrol positif, diperoleh p-value < 0,0001. Di sisi lain, uji T juga

dilakukan pada sel Vero dengan perbandingan yang sama, diperoleh p-value <

0,0001 sehingga dapat dikatakan terdapat perbedaan yang bermakna antara

sampel dan kontrol positif terhadap sel 4T1 dan sel Vero.

Pemeriksaan Profil KG-SM

Setelah dilakukan pengujian secara in vitro, sampel kemudian diuji

dengan menggunakan KG-SM untuk memprediksi senyawa yang terkandung

dalam sampel berdasarkan kelimpahan massa dan fragmentasi molekul yang

terbentuk. Kolom yang digunakan yaitu RTX-5 MS (difenildimetilsiloksan) yang

bersifat nonpolar sedangkan fase gerak yang digunakan adalah gas helium.

Senyawa dengan afinitas yang rendah terhadap fase diam akan terlebih dahulu

keluar dari kolom, sehingga waktu retensi yang dibutuhkan akan semakin singkat.

Senyawa-senyawa tersebut kemudian dideteksi massanya pada spektrometri

massa dan dianalisis berdasarkan bobot molekulnya. Hasil kromatogram (Gambar

8) menunjukan adanya 10 puncak, dengan tiga persen area terbesar yaitu pada

puncak 4 (12,91%), 5 (75,91%), dan puncak 6 (7,06%).


23

Gambar 8. Kromatogram hasil KG partisi etil asetat daun asoka

Puncak 4 memiliki waktu retensi 19,841 menit dengan m/z sebesar 995

diikuti oleh puncak-puncak fragmentasi yang lain yang terbaca pada spektrum

massa. Spektrum pada m/z 149 merupakan base peak dan diprediksi sebagai ethyl

benzoate (C9H10O2), diikuti oleh pecahan fragmentasi lain yaitu 2-methylpropane

((CH3)3CH) dengan m/z 57, kemudian penambahan methyl pada 2-methylpropane

membentuk fragment dengan rumus struktur ((CH3)4CH) pada m/z 71. Spektrum

massa pada puncak 4 disajikan pada Gambar 9.

Gambar 9. Spektrum MS senyawa pada puncak 4


yang terbaca oleh spektrum massa. Berdasarkan pola fragment yang dihasilkan

maka dapat dikatakan senyawa pada puncak 5 memiliki tingkat kemiripan yang

tinggi dengan senyawa pada puncak 4, dengan base peak pada m/z 149 sebagai

4

5

6

m/z = 995


24

ethyl benzoate, diikuti beberapa pecahan fragment lain. Spektrum massa pada

puncak 5 disajikan pada Gambar 10.



yang terbaca oleh spektrum massa. Spektrum pada m/z 69 merupakan base peak

dan diprediksi sebagai 2-methyl-2-butene (C5H9), diikuti oleh penambahan methyl

sehingga terbaca fragmentasi m/z 81, kemudian m/z 95 merupakan senyawa base

peak (C5H9) dengan penambahan etana. Spektrum massa pada puncak 6 disajikan

pada Gambar 11.


Ketiga profil spektra tersebut kemudian dibandingkan dengan library

NIST08s.LIB yang dimiliki oleh Laboratorium Terpadu Fakultas Farmasi-UAD

berdasarkan nilai Similarity Index (SI). Berdasarkan hasil KG-SM terdapat tiga

puncak yang diprediksi sebagai senyawa di dalam sampel yang diketahui

memiliki persen kelimpahan tertinggi. Pada puncak 4 dan 5, diprediksi senyawa

dengan SI tertinggi berdasarkan library sebagai 1,2-benzenedicarboxylic acid,

diisooctyl ester. Pada puncak 6 diprediksi senyawa sebagai squalene. Pada

penelitian Zellagui et al. (2012) diketahui bahwa tanaman dengan kandungan

dioctyl phthalate yang tinggi menunjukan adanya aktivitas antibakteri. Di sisi lain,

m/z = 988

m/z = 992


25

squalen telah dilaporkan memiliki efek penghambatan terhadap kejadian kanker

dan secara umum digunakan sebagai terapi suportif pada berbagai kanker karena

memiliki aktivitas anti-tumor yang tinggi (Gunes, 2013). Sejauh penelusuran

pustaka oleh peneliti belum ditemukan publikasi senyawa dengan m/z 981-995,

sehingga perlu dilakukan investigasi lebih lanjut untuk mengetahui profil senyawa

yang terkandung dalam sampel berdasarkan spektrum massa yang terbaca.

Tabel X. Prediksi senyawa yang terkandung dalam partisi etil asetat daun

asoka pada puncak 4, 5, dan 6

Puncak

Waktu

retensi

(menit)

Persen

area Mr Fragmen Prediksi senyawa SI

4 19,841 12,91 995

390 1,2-Benzenedicarboxylic acid,

diisooctyl ester; diisooctyl phthalate 92

390 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dioctyl ester; 91

390 1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2-

ethylhexyl) ester 91

5 20,585 75,91 988

390 1,2-Benzenedicarboxylic acid,

diisooctyl ester; diisooctyl phthalate 92

390 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dioctyl ester; 91

390 1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2-

ethylhexyl) ester 91

6 24,09 7,06 992

410 Squalene; 2,6,10,14,18,22-

Tetracosahexaene, 2,6,10,15,19,23-hexamethyl 97

410 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene,

2,6,10,15,19,23-hexamethyl-, 96

410

Squalene; 2,6,10,14,18,22-

Tetracosahexaene, 2,6,10,15,19,23-

hexamethyl-

96


26

KESIMPULAN

Sampel partisi etil asetat daun asoka menunjukan aktivitas antiproliferasi

yang lemah terhadap sel kanker 4T1 dan tidak aktif terhadap sel normal Vero,

namun memiliki persen penghambatan yang tinggi terhadap enzim MMP-9.

Berdasarkan hasil KG-SM diprediksi dua senyawa yang berpotensi sebagai agen

antiproliferasi sel kanker 4T1 melalui penghambatan aktivitas enzim MMP-9, di

antaranya 1,2-Benzendicarboxylic acid, dan squalene. Meskipun sampel dapat

dikatakan selektif terhadap target, namun partisi etil asetat daun asoka memiliki

aktivitas yang rendah terhadap sel kanker subtipe triple negative. Optimasi dan uji

kombinasi terhadap sampel perlu dilakukan, dengan harapan dapat meningkatkan

aktivitas dan efektivitasnya dalam menghambat sel kanker.


27

DAFTAR PUSTAKA

Aderogba, M. A., Ndhlala, A. R., Rengasamy K. R. R., Staden, J. V., 2013.

Antimicrobial and Selected In Vitro Enzyme Inhibitory Effects of Leaf

Extracts, Flavonols and Indole Alkaloids Isolated from Croton menyharthii.

Molecules.

Adhipandito, C.F., Ludji, D.P., Aprilianto, E., Jenie, R.I., Al-Najjar, B., Hariono,

M., 2019. Matrix metalloproteinase9 as the protein target in anti-breast

cancer drug discovery: an approach by targeting hemopexindomain. Future

Journal of Pharmaceutical Sciences

American Cancer Society, 2020. Cancer Facts & Figures 2020. American Cancer

Society,.

American Cancer Society, 2017. About Breast Cancer. Breast Cancer Facts and

Figures, 1–19.

American Cancer Society, 2019. About Breast Cancer. Breast Cancer Facts and

Figures, 1–6

Ammerman, N.C., Beier-sexton, M., 2017. Growth and Maintenance of Vero Cell

Lines. Current Protocols in Microbiology,.

Bahuguna, A., Khan, I., Bajpai, V.K., Kang, S.C., 2017. MTT assay to evaluate

the cytotoxic potential of a drug. Bangladesh Journal of Pharmacology,

12(2), 115–118.

Baliga, M.S., Kurian, P.J., 2012. Ixora coccinea Linn.: Traditional uses,

phytochemistry and pharmacology. Chinese Journal of Integrative

Medicine, 18(1), 72–79.

Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9

as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor

progression. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer, 1825(1),

29–36.

Chavez, K.J., Garimella, S. V., and Lipkowitz, S., 2010. Triple Negative Breast

Cancer Cell Lines: One Tool in the Search for Better Treatment of Triple

Negative Breast Cancer. National Institutes of Health. 1-17

Cheng, X.C., Fang, H., Xu, W.F., 2008. Advances in assays of matrix

metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors. Journal of Enzyme

Inhibition and Medicinal Chemistry, 23(2), 154–167.

Cooper, G.M., 2000. The Cell 2nd Edition, A Molecular Approach, Sinauer

Associates

Dai, X., Xiang, L., Li, T., Bai, Z., 2016. Journal of Cancer Cancer Hallmarks,


28

Biomarkers and Breast Cancer Molecular Subtypes. Journal of Cancer, 7.

Dai, X., Cheng, H., Bai, Z., Li, J., 2017. Breast Cancer Cell Line Classification

and Its Relevance with Breast Tumor Subtyping. Journal of Cancer. 2–3.

Djohan, M. A., 2020. Uji Aktivitas Fraksi n-Heksana-Etil Asetat Daun Asoka

(Ixora coccinea L.) Terhadap Penghambatan Matrix Metalloproteinase-9

(MMP-9)

Duzgunes, N., 2012. Nanomediciene: Cancer, Diabetes, and Cardiovascular,

Central Nervous System, Pulmonary and Inflamatory Diseases, Elsevier

Ebili, H.O., Olayiwola, A.O., Olopade, O.I., 2014. Molecular subtypes of breast

cancer. Personalized Management of Breast Cancer, (August 2016), 21–33.

Ediriweera, M.K., Tennekoon, K.H., Samarakoon, S.R., 2019. In vitro assays and

techniques utilized in anticancer drug discovery. Journal of Applied

Toxicology, 39(1), 38–71.

Fitmawati, Siti Fathonah, Y.R.I., 2016. Tanaman Obat Perkarangan Berbasiskan

Pengetahuan Tumbuhan Obat Masyarakat Asli Riau (ETNOMEDICINE).

UNI Press, Riau.

Gunes, F.E., 2013. Medical use of squalene as a natural antioxidant. Journal of

Marmara University Institute of Health Sciences, (January), 1.

Hasibuan, P. A. Z., Rosidah., Haro, G., Satria, D., 2019. Cytotoxicity Activity of

Ethanol Extract of Andaliman Fruits (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

towards 4T1 Breast Cancer Cells. Indonesian Journal of Pharmaceutical

and Clinical Research. 2(2). 31-34

Hariono, M., Rollando, R., Karamoy, J.R., Hariyono, P., Atmono, M.T., Djohan,

M.A., Wiwy, W., Anggoro, A.B., Kurniawan, C., Nuwarda, R., Salin, N.,

Wahab, H., 2020. Identifying Local Plants with Anti-Breast Cancer Matrix

Metalloproteinase 9 Activities: In Silico and In Vitro Study. 1–17

Hariono, M., Yuliani, S.H., Istyastono, E.P., Riswanto, F.D.O., Adhipandito, C.F.,

2018. Matrix metalloproteinase 9 (MMP9) in wound healing of diabetic foot

ulcer: Molecular target and structure-based drug design, Wound Medicine.

Elsevier B.V.

Hussain, S.Z., Maqbool, K., 2014. GC-MS: Principle, Technique and its

application in Food Science. Int J Curr Sci, 13, 116–126.

Institute, N.N.C., 2020. Cancer Facts & Figures 2020. American Cancer Society,.

Kemenkes RI, 2019. Hari Kanker Sedunia 2019. Kementerian Kesehatan

Republik Indonesia,.

Kevin Range, and D.M.Y.A.M., 2012. Prevention of Metastasis in a 4T1 Murine


29

Breast Cancer Model by Doxorubicin Carried by Folate Conjugated pH

Sensitive Polymeric Micelles. J Control Release, 23(1), 1–7.

Kim, Dent, Im, 2018. Ipatasertib plus paclitaxel versus placebo plus paclitaxel as

first- line therapy for metastatic triple-negative breast cancer (LOTUS): a

multicentre, randomised, double-blind, placebo- controlled,. HHS Public

Access, 18(10), 1360–1372.

Linlin M, Fan Y, J.Z., 2015. Application of fluorescence resonance energy

transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure, 25(8), 713–724.

Mehner, C., Hockla, A., Miller, E., Ran, S., Radisky, D.C., Radisky, E.S., 2014.

Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant

progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer.

Oncotarget, 5(9), 2736–2749.

Mendon, R., 2015. Morphological Characterization of Vero Cell Death Induced

By Nutrient Depletion. Acta Microscopica,.

Molaae, N., Mosayebi, G., Pishdadian, A., Ejtehadifar, M., Ganji, A., 2017.

Evaluating the Proliferation of Human PeripheralBlood Mononuclear Cells

Using MTT Assay. International Journal of Basic Science in Medicine,

2(1), 25–28.

Muti'ah. 2014. Pengembangan Fitofarmaka Antikanker : Panduan Teknik

Pengembangan Obat Herbal Indonesia Menjadi Fitofarmaka. UIN Maliki

Press

Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A.,

Pisani, L., Cellamare, S., Tortorella, P., Loiodice, F., Carotti, A., 2012.

Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5-substituted-

pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases MMP-2 and

MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 368–376.

Okhale, S.E., Ugbabe, G.E., Oladosu, P., Ibrahim, J., Egharevba, H.O., Kunle,

O.F., Elisha, E.P., Chibuike, Aj., Ettah, Uo., 2018. Chemical constituents

and antimicrobial activity of the leaf essential oil of Ixora coccinea L (

Rubiaceae ) collected from North Central. International Journal of

Bioassays, 5, 5630–5637.

Popa-Burke, I., Russell, J., 2014. Compound precipitation in high-concentration

DMSO solutions. Journal of Biomolecular Screening, 19(9), 1302–1308.

Prados, J., Melguizo, C., Ortiz, R., Velez, C., Alvarez, P.J., Arias, J.L., Ruiz,

M.A., Gallardo, V., Aranega, A., 2012. Doxorubicin-Loaded Nanoparticles:

New Advances in Breast Cancer Therapy. Anti Cancer Agent in Medical

Chemistry.

Putra, A., Syarif, H., 2014. Comparison of an Emotional Intelligent between


30

Conventional and KBK Students in School of Nursing Program , Faculty of

Medicine , Syiah Kuala University (1), 1–7.

Sekton, B., 2010. Matrix metalloproteinases – an overview. Research and

Reports in Biology, 1.

Septisetyani, E.P., Ningrum, R.A., Romadhani, Y., Wisnuwardhani, P.H.,

Santoso, A., 2014. Optimization of Sodium Dodecyl Sulphate As a

Formazan Solvent and Comparison of 3-(4,-5-Dimethylthiazo-2-Yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium Bromide (Mtt) Assay With Wst-1 Assay in Mcf-7

Cells. Indonesian Journal of Pharmacy, 25(4), 245.

Siegel, R.L., Miller, K.D., Fuchs, H.E., Jemal, A., 2021. Cancer statistics, 2021.

CA: A Cancer Journal for Clinicians, 71(1), 1–6.

Steenbrugge, J., Vander Elst, N., Demeyere, K., De Wever, O., Sanders, N.N.,

Van Den Broeck, W., Dirix, L., Van Laere, S., Meyer, E., 2019.

Comparative Profiling of Metastatic 4T1- vs. Non-metastatic Py230-Based

Mammary Tumors in an Intraductal Model for Triple-Negative Breast

Cancer. Frontiers in Immunology, 10, 1–19.

Sultan, A.O., 2012. In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles,

Advantages, and Disadvantages. Intech, 13.

Sutejo, I.R., Putri, H., Meiyanto, E., 2016. Selektivitas Ekstrak Etanolik Buah

Makassar (Brucea javanica) pada Kanker Payudara Metastasis secara In

Vitro The Selectivity of Ethanolic Extract of Buah Makassar (Brucea

javanica) on In Vitro Study of Metastatic Breast Cancer. Journal of

Agromedicine and Medical Sciences, 2(1), 1–5.

Sylvester, P.W., 2011. Optimization of Tetrazolium Dye (MTT) Colorimetric

Assay for Cellular Growth and Viability. Methods Mol Biol,

Sztalmachova, M., Gumulec, J., Raudenska, M., Polanska, H., Holubova, M.,

Balvan, J., Hudcova, K., Knopfova, L., Kizek, R., Adam, V., Babula, P.,

Masarik, M., 2015. Molecular response of 4T1-induced mouse mammary

tumours and healthy tissues to zinc treatment. International Journal of

Oncology, 46(4), 1810–1818.

Thorn, C. F., Oshiro, O., Marsh, S., Boussard, T. H., McLeod, H., Klein, T. E.,

Altman, R. B., 2012. Doxorubicin Pathways : Pharmacodynamics and

Adverse Effect. National Institute of Health. 21 (17).

Twentyman PR, Luscombe M, 1987. A study of some variables in a tetrazolium

dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. British

Journal of Cancer, 56(3), 279–85.

United States Department of Agriculture, 2020. Ixora coccinea L.

https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=IXCO, diakses pada April


31

2020Veronesi, U., Boyle, P., 2016. Breast Cancer. International

Encyclopedia of Public Health, 272–280.

Utami, D. T., Fitrianingsih., and Maharini, I., 2020. Development of Ethanolic

Extract of Pinang Masak Jambi (Areca Catechu L.) as A Modulator of

Doxorubicin Cytotoxic Effect in Breast Cancer Therapy. Pharmaceutical

Sciences and Research. 45-47.

Veronesi, U., Boyle, P., 2016. Breast Cancer. International Encyclopedia of

Public Health, 272–280.

Vutukuri, S., 2015. Evaluation of phytochemical content and In vitro cytotoxic

activity of various ornamental plant flower extracts against MCF-7 Cell

lines Evaluation of phytochemical content and In vitro cytotoxic activity of

various ornamental plant flower extracts agains. International Journal of

Current Research in Life Sciences,.

WHO, 2017. Global Burden of Disease Study 2017, The Lancet.

Wibowo, A., Ahmat, N., Hamzah, A.S., Sufian, A.S., Ismail, N.H., Ahmad, R.,

Jaafar, F.M., Takayama, H., 2011. Malaysianol A, a new trimer resveratrol

oligomer from the stem bark of Dryobalanops aromatica. Fitoterapia, 82(4),

676–681.

Winer, A., Adams, S., Mignatti, P., 2019. Past Failures into Future Successes. Mol

Cancer Ther, 17, 1147–1155.

Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., Gaboury, L.A., 2014. MMP-9

expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC

Cancer, 14(1), 1–12.

Yusuf, S. S., Nurani, L. H., Widyarini, S., 2018. The effect of co-chemotherapy of

ethyl acetate fraction of Long jack roots (Eurycoma longifolia jack) on

interleukin-6 expression of 7,12- dimethylbenz(α)anthrasen breast

carcinoma model. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.

Zellagui, A., Gherraf, N., Ladjel, S., Hameurlaine, S., 2012. Chemical

composition and antibacterial activity of the essential oils from Launaea

resedifolia L, Organic and Medicinal Chemistry Letters, 2(2),


32

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman asoka


33

Lampiran 2. Perhitungan sel 4T1

Jumlah sel pada keempat kamar : 380

i. Jumlah sel panenan :

Jumlah sel terhitung2 mL =

sel pada keempat kamar

4× 104

2

Jumlah sel terhitung = 380

4 x 10

4 = 950.000 sel

j. Jumlah sel yang diperlukan :

Sel diperlukan = 42 well x 10.000

= 420.000 sel

= 450.000 sel

k. Volume panenan sel yang ditransfer :

= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑙𝑢𝑘𝑎𝑛

𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑟ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 /𝑚𝐿

= 450.000

950.000

= 0,47 mL


34

Lampiran 3. Perhitungan sel Vero

Jumlah sel pada keempat kamar : 143

a. Jumlah sel panenan :

Jumlah sel terhitung2 mL =

sel pada keempat kamar

4× 104

2

Jumlah sel terhitung/ 2 mL = 143

4 x 10

4 x 2 = 715.000 sel

b. Jumlah sel yang diperlukan :

Sel diperlukan = 42 well x 10.000

= 420.000 sel

= 450.000 sel

c. Volume panenan sel yang ditransfer :

= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑙𝑢𝑘𝑎𝑛

𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑟ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 /𝑚𝐿

= 450.000

715.000/2𝑚𝐿

= 1,26 mL


35

Lampiran 4. Morfologi sel 4T1 dibawah pengamatan mikroskop inverted

Kontrol negatif sel 4T1

Perlakuan partisi etil asetat daun

asoka dengan konsentrasi 31,25

µg/mL terhadap sel 4T1


asoka dengan konsentrasi 62,5



asoka dengan konsentrasi 125






36









µg/mL terhadap sel 4T1 setelah MTT


37

Lampiran 5. Morfologi sel Vero dibawah pengamatan mikroskop inverted

Kontrol negatif sel Vero

Perlakuan partisi etil asetat daun asoka dengan konsentrasi 31,25

µg/mL terhadap sel Vero

Perlakuan partisi etil asetat daun asoka dengan konsentrasi 62,5


Perlakuan partisi etil asetat daun asoka dengan konsentrasi 125






38


asoka dengan konsentrasi 500 µg/mL terhadap sel Vero






µg/mL terhadap sel 4T1 setelah

Vero


39

Lampiran 6. Hasil Uji-T antara kontrol positif dan perlakuan sampel terhadap sel

Vero


40

Lampiran 7. Hasil Uji-T antara kontrol positif dan perlakuan sampel terhadap sel

4T1


41

Lampiran 8. Homologi protein MMP-9 pada Balb/c (Mus musculus) dengan

manusia (Homo sapiens) menggunakan fitur BLAST pada NCBI


42

Lampiran 9. Hasil homologi protein MMP-9 pada monyet hijau afrika

(Chlorocebus sabaeus) dengan manusia (Homo sapiens) menggunakan fitur

BLAST pada NCBI


43

Lampiran 10. Skema proses pembuatan partisi etil asetat daun asoka


44

Lampiran 11. Spektrum MS partisi etil asetat daun asoka


45


46


47


48


49


50

Lampiran 12. Daftar singkatan

DAFTAR SINGKATAN

CC50 = Cytotoxic Concentration 50

DMSO = Dimetil Sulfoksida

ECM = Extracellular Matrix

EC50 = Effective Concentration 50

ER = Estrogen Receptor

FBS = Fetal Bovine Serum

FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer

HER2 = Human Epidermal Growth Factor Receptor 2

IC50 = Inhibitory Concentration 50

IK = Indeks Keamanan

KG-SM = Kromatografi Gas- Spektrometri Massa

MK = Media Kultur

MMP-9 = Matrix Metalloproteinase-9

MTT = Metil Tetrazolium Tes

NADPH = Nikotinamid adenin dinukleotid fosfat

NNGH = N-isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil) glisil hidroksamat

PBS = Phospate Buffer Saline

PR = Progesteron Receptor

SDH = Suksinat Dehidrogenase

SDS = Sodium Dodecyl Sulphate

SI = Safety Index

WFI = Water For Injection


51

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Uji Antiprolfiferasi Partisi

Etil Asetat Daun Asoka (Ixora Coccinea L.) Terhadap

Sel 4t1 Melalui Penghambatan MMP-9 In Vitro”

memiliki nama lengkap Thomas David Gonzaga. Penulis

merupakan anak bungsu dari Titus Yohanes Munandar

dan Debora Titi Rohani. Penulis lahir di Temanggung

pada 11 Juni 1999. Riwayat pendidikan formal yang telah

penulis tempuh diawali di TK Ade Irma Suryani

Temanggung (2004-2005), SD Santa Maria (2005-2011),

SMP Shekinah Temanggung (2011-2014), SMA Shekinah Temanggung (2014-

2017). Kemudian pada tahun 2017, penulis melanjutkan pendidikan Sarjana 1 di

Fakultas Farmasi Univeristas Sanata Dharma Yogyakarta. Semasa menempuh

perkuliahan, penulis terlibat dalam berbagai kegiatan kampus diantaranya sebagai

bendahara UKF Drug Discovery Stundent Club (2020-2021), anggota divisi

tabdek kegiatan Pharmacy Performance (2017 dan 2018), koordinator divisi P3K

(Pertolongan Pertama Pada Kecelakaan) kegiatan Titrasi (2018), dan menjadi

salah satu oral presenter pada 1st AASP Young Scientist Conference 2020. Penulis

harap penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi pembaca.


uji antiproliferasi partisi etil asetat daun asoka (ixora

Documents