uji antiproliferasi partisi etil asetat daun asoka (ixora

Click here to load reader

Post on 04-Oct-2021

2 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

IN VITRO
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
i
IN VITRO
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
ii
IN VITRO
Thomas David Gonzaga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
IN VITRO
Fakultas Farmasi
Mengetahui
Panitia Penguji Tanda tangan
2. Dr. apt. Erna Tri Wulandari ……………
3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. ……………
iii
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak
memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana layaknya
karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam
naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan
perundang-undangan
v
Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma
Nama : Thomas David Gonzaga
IN VITRO
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Demikian juga saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma untuk menyimpan, mengalihkan
dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengolahan data,
mendistribusikannya secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya
sebagai penulis.
Atas kemajuan teknologi informasi, saya tidak berkeberatan jika nama, tanda
tangan, gambar atau image yang ada di dalam karya ilmiah saya terindeks oleh
mesin pencari (search engine), misalnya google.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya,
Dibuat di Yogyakarta
Yang menyatakan,
vi
ABSTRAK
dan merupakan penyebab kematian kedua terbesar setelah penyakit
kardiovaskular. Pada sel kanker, aktivitas Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9)
berperan penting dalam proses perkembangan, invasi, dan metastasis sel, melalui
degradasi Extracelullar Matrix (ECM). Masalah paling utama pada pengembangan
agen antikanker payudara adalah ketidakselektivannya terhadap target, yang dapat
menimbulkan beberapa efek samping yang merugikan. Oleh karena itu, penemuan
kandidat obat anti kanker baru berbasis alam sangat diperlukan, dengan harapan
dapat memberikan efek terapi yang lebih efektif dan selektif terhadap target. Pada
penelitian ini partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka (Ixora Coccinea L.)
diuji aktivitas penghambatannya dengan menggunakan metode FRET-based
terhadap enzim MMP-9, menunjukan persen penghambatan sebesar 94%.
Pengujian sampel kemudian dilanjutkan ke tingkat seluler, yaitu diuji aktivitas
antiproliferasinya dengan menggunakan metode MTT secara in vitro terhadap sel
4T1 dan sel Vero, diperoleh nilai EC50 57,5 µg/mL dan CC50 429,5 µg/mL,
dengan Indeks keamanan sebesar 7,47. Hasil KG-SM menunjukan adanya 10
puncak yang terkandung dalam sampel, tiga komponen dengan persen area
terbesar, yaitu 75,91; 12,91; dan 7,06 % diprediksi sebagai 1,2-
benzendicarboxylic acid, dan squalene.
Kata kunci : Kanker payudara, MMP-9, Ixora Coccinea L., In vitro
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
ABSTRACT
Cancer is estimated to kill 9.6 million people and becoming the leading
cause of death after cardiovascular disease. In cancer cells, the activity of Matrix
Metalloproteinase-9 (MMP-9) plays an important role in the process of cell
development, invasion, and metastatic, through degradation of the Extracellular
Matrix (ECM). The most problem in the development of anti-breast cancer agents
is the non-selectivity to the target, which results in several adverse effects.
Therefore, the discovery of a natural-based anticancer drug is urgently needed, in
hopes of providing a more effective and selective drug. In this study, the ethyl
acetate partition of methanolic extract of asoka (Ixora Coccinea L.) leaves was
tested using FRET-based method against the MMP-9 enzyme, showing a
percentage of inhibition by 94%. Then the testing was continued at the cellular
level through the antiproliferation assay using MTT method against 4T1 and Vero
cell, obtaining EC50 values being 57,5 µg/mL, and CC50 429,5 µg/mL, with safety
index 7,47. The partition showed ten compounds based on the result of GC-MS,
and there are three compounds that possessed the largest percentage area which
are 75,91 %, 12,91 % and, 7,06 % predicted as 1,2-benzendicarboxylic acid and
squalene.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
ix
DAFTAR TABEL
Tabel I. Desain well-plate untuk uji aktivitas in vitro MMP-9 ........................ 6
Tabel II. Desain well-plate untuk uji MTT ...................................................... 8
Tabel III. Hasil fluoresensi terhadap aktivitas enzim MMP-9 ......................... 12
Tabel IV. Hasil fluoresensi kontrol positif terhadap aktivitas enzim MMP-9 . 13
Tabel V. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel 4T1 pada perlakuan
sampel partisi etil asetat ................................................................. 18
Tabel VI. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel Vero pada perlakuan
sampel partisi etil asetat ................................................................... 19
Tabel VII. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel 4T1 pada perlakuan
kontrol positif .................................................................................. 20
Tabel VIII. Hasil pembacaan absorbansi dan viabilitas sel Vero pada perlakuan
kontrol positif .................................................................................. 21
Tabel IX. Hasil EC50, CC50, dan IK dari sampel dan kontrol positif ............... 22
Tabel X. Prediksi senyawa yang terkandung dalam partisi etil asetat daun ....
asoka pada puncak 4, 5, dan 6 ......................................................... 25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
Gambar 1. Mekanisme pemotongan substrat oleh enzim MMP-9 ................... 11
Gambar 2. Visualisasi sel a) 4T1 dan b) Vero dalam keadaan konfluen 80%
sebelum diberi perlakuan ............................................................. 15
Gambar 3. Visualisasi sel 4T1 hidup ditandai dengan tanda lingkaran,
sedangkan sel yang mati ditandai dengan tanda persegi .............. 15
Gambar 4. Visualisasi sel a) 4T1 tanpa perlakuan, b) 4T1 dengan perlakuan
sampel 1000 µg/mL, c) Vero tanpa perlakuan, dan d) Vero
dengan perlakuan sampel 1000 µg/mL ......................................... 17
Gambar 5. Perbandingan kristal formazan yang terbentuk dari sel 4T1 a)
tanpa perlakuan dan b) perlakuan sampel 1000 µg/mL ................ 18
Gambar 6. Grafik persentase viabilitas sel 4T1 vs a) log kosentrasi sampel
dan b) log kosentrasi doxorubicin dengan persamaan regresi
non-linear ...................................................................................... 19
Gambar 7. Grafik persentase viabilitas sel Vero vs a) log konsentrasi sampel
dan b) log konsentrasi doxorubicin dengan persamaan regresi
non-linear .................................................................................... 20
Gambar 8. Kromatogram hasil KG partisi etil asetat daun asoka .................... 23
Gambar 9. Spektrum MS senyawa pada puncak 4 ........................................... 23
Gambar 10. Spektrum MS senyawa pada puncak 5 ......................................... 24
Gambar 11. Spektrum MS senyawa pada puncak 6 ......................................... 24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
Lampiran 2. Perhitungan sel 4T1 ..................................................................... 33
Lampiran 3. Perhitungan sel Vero ................................................................... 34
Lampiran 4. Morfologi sel 4T1 di bawah pengamatan mikroskop inverted .... 35
Lampiran 5. Morfologi sel Vero di bawah pengamatan mikroskop inverted .. 37
Lampiran 6. Hasil Uji-T antara kontrol positif dan perlakuan sampel
terhadap sel Vero ........................................................................ 39
Lampiran 7. Hasil Uji-T antara kontrol positif dan perlakuan sampel
terhadap sel 4T1 .......................................................................... 40
Lampiran 8. Homologi protein MMP-9 pada Balb/c (Mus musculus) dengan
manusia (Homo sapiens) menggunakan fitur BLAST pada
NCBI ......................................................................................... 41
Lampiran 9. Hasil homologi protein MMP-9 pada monyet hijau afrika
(Chlorocebus sabaeus) dengan manusia (Homo sapiens)
menggunakan fitur BLAST pada NCBI ................................. 42
Lampiran 10. Skema proses pembuatan partisi etil asetat daun asoka ............ 43
Lampiran 11. Spektrum MS partisi etil asetat daun asoka .............................. 44
Lampiran 12. Daftar singkatan ......................................................................... 50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Kanker merupakan sekumpulan penyakit yang dicirikan dengan sel-sel
yang tumbuh secara cepat dan tidak terkendali sehingga membentuk tumor yang
dapat menyerang ke jaringan di sekitarnya dan organ lain melalui darah atau
sistem limfa yang disebut metastasis (American Cancer Society, 2020). Menurut
WHO (2017), kanker diperkirakan telah mengakibatkan 9,6 juta orang meninggal
dunia dan merupakan penyebab kematian kedua terbesar setelah penyakit
kardiovaskular. Pada tahun 2021, diperhitungkan 1.898.160 kasus baru dan
608.570 kematian akibat kanker telah terjadi di Amerika Serikat yang setara
dengan hampir 1.600 kematian per hari. Jumlah kematian terbesar berasal dari
kanker paru-paru, prostat, dan kolorektum pada pria, sedangkan pada wanita
meliputi kanker paru-paru, payudara, dan kolorektum (Siegel et al. 2021). Di
Indonesia, angka kejadian kanker payudara yang menyerang perempuan, yaitu
sebesar 42,1 per 100.000 penduduk dengan rata-rata kematian 17 per 100.000
(Kemenkes RI, 2019). Kanker payudara merupakan tipe sel kanker yang
pertumbuhan selnya dimulai dari payudara dan merupakan penyebab kematian
kedua akibat kanker pada wanita (American Cancer Society, 2017). Pertumbuhan
pada sel kanker payudara dimediasi oleh beberapa hormon dan reseptor
pertumbuhan seperti esterogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), dan
human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) (Dai et al. 2016).
Hariono et al. (2020) telah melakukan penelitian mengenai MMP
inhibitor secara in vitro, menunjukan persen penghambatan yang bervariasi dari 0-
92% dengan konsentrasi 1 mg/mL pada sepuluh ekstrak tanaman lokal. Salah satu
tanaman yang diekstraksi dengan pelarut metanol dan menunjukkan aktivitas
penghambatan yang tinggi adalah daun asoka (Ixora coccinea L.) dengan
hambatan sebesar 86% dan IC50 81,56 μg/mL. Penelitian kemudian dilanjutkan
dengan melakukan uji sitotoksik ekstrak metanol daun asoka terhadap sel kanker
payudara 4T1 dan sel Vero, diperoleh nilai EC50 sebesar 270 g/mL, nilai CC50
sebesar 653 g/mL, dan nilai indeks keamanan sebesar 2,42. Djohan (2020) telah
melakukan pengujian fraksi etil asetat daun asoka terhadap penghambatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
aktivitas enzim MMP-9, menunjukkan persen penghambatan oleh fraksi 1 n-
heksana-etil asetat daun asoka dengan IC50 sebesar 116 μg/mL sehingga fraksi
tersebut memiliki potensi sebagai kandidat obat kanker payudara subtipe triple
negative. Senyawa yang terkandung dalam fraksi 1 berdasarkan analisis spektra
KG-SM diprediksi sebagai ixorapeptida dengan variasi residu asam amino.
Tanaman asoka digolongkan sebagai tanaman hias dan secara tradisional
dipercaya dapat digunakan untuk berbagai pengobatan seperti nyeri, peradangan,
ketombe, radang kulit, pertumbuhan rambut dan kudis (Vutukuri, 2015). Okhale
et al. (2018) menyatakan bahwa tanaman asoka memiliki sifat antioksidan,
aktivitas antelmintik, hepatoprotektif, penyembuhan luka, sitotoksik dan
antitumor, kardioprotektif, dan pelindung saraf. Uji sitotoksik ekstrak kloroform
asoka telah dilakukan oleh Vutukuri (2015) terhadap sel kanker payudara MCF-7
menunjukan EC50 sebesar 429.9 ± 27.7 μg/mL.
Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) merupakan enzim yang berperan
penting dalam perkembangan sel kanker karena dapat mendegradasi extracellular
matrix (ECM) (Hariono et al. 2018) sehingga sel kanker dapat berkembang,
menginvasi, dan bermigrasi ke organ lain (Yousef et al. 2014). Berdasarkan
subtipe molekulnya, kanker payudara dikategorikan menjadi beberapa jenis yaitu
luminal tipe A, luminal tipe B, HER2, dan triple-negative (Ebili et al. 2014). Kim
et al. (2018) telah meneliti senyawa ipatasertib yang dikombinasi dengan
paclitaxel sebagai terapi lini pertama untuk kanker payudara triple-negative
metastatik pada fase klinik dua menunjukan hasil peningkatan kelangsungan
hidup pasien. MMP-9 diidentifikasi paling banyak diekspresikan pada subtipe
triple-negative, yang erat kaitannya dengan proses metastasis sel (Mehner et al.
2014).
pengujian fraksi n-heksana etil asetat daun asoka terhadap aktivitas penghambatan
MMP-9. Hingga saat ini, uji antiproliferasi partisi etil asetat daun asoka terhadap
sel kanker payudara metastatik 4T1 belum dilakukan. Sehingga pada penelitian ini
akan dilakukan uji antiproliferasi partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
terhadap sel kanker payudara metastatik 4T1 yang diawali dengan uji
penghambatan MMP-9 secara in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat
menghasilkan kandidat produk herbal yang secara selektif dapat menghambat
enzim MMP-9 sehingga tidak menimbulkan efek toksik bagi sel yang normal.
Selektitivitas partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka pada sel kanker
payudara metastatik 4T1 akan dibuktikan dengan membandingkan efek sitotoksik
pada sel kanker dengan sel Vero menggunakan metode MTT assay, melalui
parameter nilai IK (indeks keamanan). Senyawa yang terkandung di dalam partisi
tersebut akan diidentifikasi menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa
(KG-SM).
Partisi etil asetat ekstrak metanol daun asoka diperoleh dari penelitian
Djohan (2020) yang dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Kit
MMP-9 dibeli dari Biovision terdiri atas enzim MMP-9, substrat FRET-based
peptide, buffer, N-isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil) glisil hidroksamat (NNGH),
gliserol, dan dimetilsulfoksida (DMSO), Media kultur DMEM, Medium 199
(M199), fetal bovine serum (FBS), fungizone, streptomycin dan penicillin, tripsin-
EDTA, Trypan blue solution, phosphate buffer saline (PBS), sodium dodecyl
sulphate (SDS), reagen MTT diperoleh dari Laboratorium Kultur Sel, Fakultas
Kedokteran, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.
BSC kelas II (Esco), autoklaf (Hirayama), kulkas freezer, vortex, tanki
nitrogen, timbangan analitik (Ohaus), inkubator, alat dan gelas pada umumnya,
tips pipet, vortex, dan Synergy™ HTX multi-mode microplate reader (BioTek),
magnetic stirrer, pH meter, filter 0,2 mikron, botol duran 1000 mL, micropipette
(Socorex), 96-well plate (Iwaki), cryotube, conical tube, culture dish,
sentrifugator, mikroskop inverted (Magnus), hemasitometer counter, inkubator
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
QP2010S SHIMADZU).
Partisi etil asetat daun asoka diperoleh dari penelitian Djohan (2020)
yang dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Determinasi
tanaman dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, dengan tujuan
memastikan spesimen yang dimaksud merupakan tanaman asoka (Ixora coccinea
L.). Daun asoka varietas bunga kuning diperoleh dari daerah Paingan,
Yogyakarta. Daun asoka yang dipilih merupakan daun dengan permukaan halus,
berwarna hijau, tidak layu, tidak berlubang, tidak kotor dan berukuran sedang
sampai besar. Daun asoka terpilih kemudian di pisahkan dari bahan pengganggu
dan dicuci dengan air mengalir. Setelah itu daun asoka dipotong membujur
dengan ukuran sedang hingga besar dan dikeringkan dengan dijemur diatas
nampan yang tertutup dengan kain hitam. Daun asoka yang telah kering
dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu yang tersisa, kemudian dibuat serbuk
dengan menggunakan grinder dan disimpan. Simplisia daun asoka yang telah
dibuat ditetapkan kadar airnya dengan menggunakan metode destilasi toluena,
dengan tujuan untuk meminimalisir bertumbuhnya mikroba, jamur, dan
mikroorganisme lainnya dalam serbuk simplisia.
Pembuatan ekstrak metanol dilakukan dengan maserasi. Sebanyak 180
gram serbuk simplisia ditimbang dan dilarutkan kedalam 540 mL metanol (1:3),
ditutup, dan dibiarkan selama 24 jam dengan kondisi terlindung dari cahaya dan
diaduk dengan shaker. Hasil maserat disaring dengan corong butchner yang
dilapisi kertas saring Whatman No.1 sambil di vakum. Serbuk hasil penyarian
dimaserasi kembali dengan pelarut, jumlah volume, dan waktu yang sama
sebanyak 3 kali. Hasil maserat pertama, kedua, dan ketiga kemudian diuapkan
dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 °C dan diuapkan kembali
dengan waterbath pada suhu yang sama untuk menghilangkan pelarut metanol
yang masih terdapat dalam ekstrak. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
sebanyak 40 gram dan dipartisi dengan 800 mL pelarut mulai dari n-heksana, etil
asetat, butanol, dan akuades menggunakan corong pisah. Ekstrak terlebih dahulu
dilarutkan dalam akuades dan dimasukan ke dalam corong pisah, kemudian
ditambahkan juga n-heksana dengan volume yang sama dengan akuades. Partisi
dilakukan sebanyak 3 kali hingga diperoleh fase air dan n-heksana. Fase air yang
diperoleh disiapkan untuk partisi selanjutnya dengan menggunakan etil asetat dan
n-butanol. Empat fase yang diperoleh yaitu : fase n-heksana, etil asetat, n-butanol,
dan air, kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dengan
suhu 40°C. Partisi etil asetat daun asoka yang diperoleh kemudian akan di uji
aktivitas penghambatannya terhadap enzim MMP-9.
Uji aktivitas penghambatan enzim MMP-9
Blanko kontrol (100 µL buffer uji MMP-9) dipipetkan ke dalam well-
plate pada baris A 1-3. Kontrol negatif disiapkan dengan memipet 45 µL buffer
uji MMP-9 dan 5 µL enzim MMP-9 pada baris A 4-6. Sampel partisi asoka etil
asetat dipipet sebanyak 1 µL kemudian ditambah 44 µL buffer uji MMP-9 dan 5
µL enzim MMP-9 tiap well pada baris B 4-6. Kontrol pelarut disiapkan dengan
memipet 44 µL buffer uji MMP-9, 1 µL pelarut yang digunakan (DMSO) dan 5
µL enzim MMP-9 tiap well pada baris A 10-12. Kontrol positif disiapkan dengan
memipet 43 µL buffer uji MMP-9, 2 µL NNGH, dan 5 µL enzim MMP-9 pada
baris A 7-9.
Setelah semua perlakuan selesai, well- plate diinkubasi pada suhu 37°C
selama 30 menit. Setelah itu, 1 µL substrat FRET-based MMP-9 dan 49 µL buffer
ditambahkan pada sampel, kontrol pelarut, kontrol positif, dan kontrol negatif,
kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai,
fluorosensi dari masing-masing well dibaca menggunakan multimode microplate
reader (Synergy HTX-3) pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang
gelombang emisi 393 nm. Desain well-plate untuk uji aktivitas in vitro MMP-9
disajikan pada Tabel I.
6
Tabel I. Desain well-plate untuk uji aktivitas in vitro MMP-9
Keterangan :
B : Blangko (larutan buffer 100 µl)
KP : Kontrol positif (larutan buffer 45 µl + enzim 5 µl + substrat 50 µl)
KN : Kontrol negatif (larutan buffer 43 µl + NNGH 2 µl + enzim 5 µl + substrat 50 µl)
P : Kontrol pelarut (larutan buffer 40 µl + DMSO 5 µl + enzim 5 µl + substrat 50 µl)
S : Sampel (larutan buffer 44 µl + sampel partisi etil asetat daun asoka 1 µl + enzim 5 µl +
substrat 50 µl)
Uji proliferasi sel 4T1 dan sel Vero
a. Sterilisasi alat dan bahan. Alat – alat yang akan digunakan terlebih
dahulu dicuci dengan deterjen dan dikeringkan. Setelah kering, alat disterilkan
dengan autoklaf pada tekanan 2 atm dan suhu 121 o C selama kurang lebih 20
menit. Sterilisasi BSC dilakukan terlebih dahulu, dengan cara menyalakan UV
selama 30 menit. Kemudian lampu UV dimatikan, dan ditunggu 3 menit. Penutup
BSC dibuka dan dinyalakan lampu biasa, permukaan meja disemprot dengan
alkohol 70% dan dikeringkan dengan tisu. Alat dan bahan yang akan digunakan,
dimasukkan ke dalam BSC.
b. Pembuatan media. Di dalam BSC, media padat DMEM untuk sel
4T1 dan M199 untuk sel Vero dilarutkan dengan 950 mL akuabides steril dalam
gelas beker 1000 mL. Kemudian, ditambahkan 2,2 g NaHCO3 dan akuabides steril
hingga volume 1000 mL. Campuran diaduk dengan magnetic stirrer hingga
larutan homogen. pH disesuaikan 0,2-0,3 di bawah pH yang diinginkan dengan
penambahan NaOH 1 N atau HCl 1 N. Filtrasi media dilakukan dengan filter 0,2
mikron, ditampung dalam duran 1000 mL dan disimpan pada suhu 4°C.
c. Pembuatan media kultur lengkap. Botol duran volume 100 mL
disiapkan, kemudian ditambahkan 10 mL FBS dan 1,5 mL penisilin-streptomisin
ke dalam botol duran, dan ditambah media cair hingga 100 mL.
d. Thawing sel. Media kultur yang sesuai untuk sel disiapkan
sebanyak 3 mL dalam conical tube. Cyro tube yang berisi sel diambil dari tangki
nitrogen dan dicairkan pada suhu ruang. Suspensi sel diambil dengan mikropipet
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
1000 µL kemudian dimasukan tetes demi tetes ke dalam conical tube yang berisi
MK. Conical tube kemudian disentrifugasi dengan sentrifus pada 1000 rpm
selama 1-3 menit. Supernatan dibuang ke limbah pembuangan, sementara media
baru sebanyak 4 mL ditambahkan, dan diresuspensi kembali hingga homogen.
Jumlah sel dalam larutan yang hidup dihitung menggunakan hemositometer dan
trypan blue. Sejumlah sel dimasukan dalam TCD 10 cm dan ditambahkan media
kultur hingga total media 7 mL. Kondisi sel diamati dengan mikroskop kemudian
disimpan ke dalam inkubator CO2 dengan konsentrasi 5 %.
e. Panen sel. Sel diambil dari inkubator CO2 dan diamati kondisinya
dengan mikroskop inverted. Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen. Media
tumbuh sel dibuang dengan menggunakan mikropipet, sel kemudian dicuci
menggunakan PBS sebanyak 1-2 kali dengan volume 3 mL. Tripsin-EDTA
(tripsin 0,25%) ditambahkan ke semua bagian sel, kemudian tripsin-EDTA
dibuang untuk menghindari kerusakan pada kultur sel dengan menggunakan
mikropipet. Sel diinkubasi selama 2 menit pada inkubator sambil diketuk bagian
bawah dish-nya untuk membantu melepas sel kemudian ditambahkan media 3 mL
ke dalam dish untuk menonaktifkan tripsin. Media dan sel dipindahkan ke dalam
conical tube untuk disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama empat
menit. Media yang berada di bagian atas dibuang tanpa mengganggu pellet sel
yang telah terbentuk. Resuspensi dilakukan pada media tumbuh yang baru (2 mL).
f. Perhitungan sel dengan hemositometer. Stok dari hasil panen sel
diambil dari dalam conical tube kemudian dipastikan telah tersuspensi dengan
baik. Dari sel tersebut diambil 10 µL sebanyak dua kali dan masing - masing
ditambahkan trypan blue 10 µL, dihomogenkan dan dipipetkan ke hemasitometer.
Sel yang hidup diindikasikan dengan warna terang kemudian dihitung di bawah
mikroskop dengan bantuan hand counter. Perhitungan sel dilakukan pada empat
kamar hitung. Sel yang berwarna gelap dan berada di batas luar atas dan kanan
tidak dihitung, sedangkan yang berada pada batas kiri dan bawah dihitung. Jumlah
sel dan volume pemanenan dihitung, kemudan diambil sejumlah sel yang
dibutuhkan untuk ditambahkan dengan media.
g. Uji proliferasi terhadap sel kanker payudara 4T1. Sel 4T1 yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
telah dikultur diisikan kedalam 96 well-plate sebanyak 100 µL ke dalam setiap
well, kemudian diinkubasi selama 12-24 jam. Sampel dipreparasi dengan cara
ditimbang masing - masing partisi sebanyak 10 mg dengan seksama dalam
mikrotube sampel kemudian dilarutkan dengan 100 µL DMSO sehingga
didapatkan larutan stok sampel dengan konsentrasi 10 mg/mL. Satu seri
konsentrasi (dibuat sebagai berikut :1000 ; 500 ; 250 ; 125 ; 62,5 ; 31.25
µg/mL). Sel yang telah diinkubasi kemudian diamati kondisinya dengan
menggunakan mikroskop inverted. Media lama kemudian dibuang dan sel dicuci
dengan menggunakan PBS secukupnya. PBS dibuang, kemudian dimasukan…