446 H. K r a u t, Zeitschr. f. Untersuchung der LebensmitteL

Die biologischen Prafungen sind bei Untersuchung der Milch ein wertvolles. Mittel far ihre Bewertung und verdienen eine weitgehende Anwendung in den gesund- heitsamtlichen und hygienischen Laboratorien.

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{Jber den Nachweis der Hefe durch die Hefegummireaktion in Gegenwart yon Hydrolysaten yon tierischem Eiweil und

yon tierischen 0rganen. Von

H. Kraut in Manchen.

[Eingegangen am JO. Junl 1927.]

Die Zusammensetzung des Eatans, eines therapeutischen Pri~parates, ist am Ende des letzten Jahres Gegenstand zweier Ver0ffentlichungen gewesen, deren erste yon L e b b i n ~) dem Eatan einen Hefeextraktgehalt yon uugef'ahr 10 % zuschrieb, wi~hrend die zweite yon L. G r a f ~) die L e b b in 'schen Ergebnisse als Analysenfehler bezeichnet und die v011ige Abwesenheit yon Hefeextrakt und yon Bestandteilen pflanzlicher Her- kunft tiberhaupt im Eatan betont. Ich habe nun das Eatan - - aus einer Mtinchener Apotheke im Dezember 1926 bezogen - - auf seinen Hefegehalt geprfift, ohne eine Spur dieses Stoffes darin aufzufinden. Diese Untersuchung gab geranlassung, die abliche Methode des Hefenachweises durch Erzeugung eines Niederschlages yon Hefe- gummi mit alkalischer Kupferl0sung auf ihre Zuverlhssigkeit zu priifen.

1) Therapie d. Gegenw. 1926, 67, 523. ~) Daselbst 1926, 67, 568.

st. Band. ] Hefegummireaktion. 447 Nov./Dez, 1927.l

Das Verfahren, welches in das bekannte Lehrbuch yon J. K 0 n i g ~) Aufnahme fand, ist yon K. M i c k o '~) far die Bestimmung yon Hefe in Fleischextrakten ausge- arbeitet worden. Man versetzt danach die zu untersuchende Fltissigkeit mit Ammoniak in mN]igem Uberschul~, filtriert u entstandenen Niederschlag und vermengt das Filtrat mit einem Uberschul~ yon frisch bereiteter natronhaltiger, ammoniakalischer Kupferl6sung (100 ccm 13%-ige Kupfersulfatl6sung, 150 ccm Ammoniak, 300 ecru t4%-ige Natronlauge). Der abfiltrierte Niedersehlag wird in verdtinnter Salzsaure gelOst und die LOsung mit dem dreifaehen (naeh meiner Erfahrung besser mit dem ftinffachen) Volumen Alkohol gefallt. M i e k o gibt an, dag die aus hefeextrakthaltigen Fleischextrakten ausgeschiedene Substanz alle yon S a l k o w sk i s) beschriebenen Reak- tionen des Hefegummis zeigte.

Nach seinen Angaben hat L e b b i n den Hefegummi im Eatan ebenfalls n~ch dem Verfahren yon M i e k o nachgewiesen und zw~r unter ,Ausschaltung yon Ti~n- sehungsmSglichkeiten". Eine im Jahre 1915 ersehienene Arbeit L e b b i n ' s 4) gibt aber zur Bestimmung yon Here in Fleischextrakten ein wesentlich verktirztes u fahren an; die FNlung der salzs~uren Lbsung des Kupferniederschlags mit Alkohol ist weggelassen worden, und aus dem ~(olumen, das cler Kupferniederschla.g einnimmt, wird direkt ein Riickschluit auf die vorhandene Hefeextraktmenge gezogen. Diese Vereinfachung ist unzulassig. Selbst der aus Hefe mit KupferlOsung erhaltene Nieder- sehlag besteht nut zum Teil aus Hefegummi, und auch zahlreiche tierisehe Substanzen geben mit alkaliseher Kupferl0sung eine Fallung. Naeh einer Untersuehung yon lI. K r a u t und F. E i e h h o r n 5) begleiten fremde Substanzen den Hefegummi zum Tell sogar noch in die Alkoholfallung. Doeh geht aus den Arbeiten yon K. M i c k o hervor, dab bei Abwesenheit yon Hefegummi in den Fleisehextrakten aus der salz- sauren LOsnng des Kupferniederschlages mit Alkohol keine Abseheidung erhalten wird.

Wenn man das mit Ammoniak versetzte und filtrierte Eatan mit aberschassiger Mieko-L(~sung fallt, so entsteht ein dunkelgrtiner, sehmieriger Niedersehlag, der am besten mit der Zentrifuge isoliert wird. Er 16st sieh vollstandig nut in starker Salz- shure. Beim Versetzen der salzsauren LOsung mit dem fanffaehen Volumen Alkohol entsteht ein brauner, flockiger Niedersehlag, der nach erneutem L0sen in Saure und Fallen mit Alkohol durch Auswaschen mit J~ther leieht troeken gewonnen werden kann.

200 ecru kaufliehes Eatan, enthaltend 104 g Trockenrtiekstand, gaben auf diese Weise 0,176 g eines gelblich grauen Pulvers - - 0,17% der Troekensubstanz. Ware alas Ausgangsmaterial der Untersuehung Fleischextrakt gewesen, so k6nnte man nach M i e k o diese Fallung unbedenklich als Hefegummi ansprechen und daraus auf einen Znsatz yon Hefeextrakt zu dem nntersuchten Pri~parat schliessen. Das Eatan besteht abet naeh den Angaben des Etiketts arts Hydrolysaten yon tierischem Eiweil~ und tierisehen 0rganen (mit einem Zusatz yon Fleisehextrakt). Der im Lehrbueh yon J. K O n i g enthaltene Hinweis: ,,Man kann den Alkoholnieder- sehlag naeh S a 1 k o w sk i auf seine Eigensehaften untersuehen" ist bei der Anwendung des Mieko ' sehen Verfahrens anf anderes Untersuchungsmaterial selbstverst~ndlieh

~) J. KSnig , Chemie d. Nahrungs- u. Genul~mittel. 4. Aufl. Berlin 1914, 8, II, 151. 2) Diese Zeitschrift 1904, 8, 225. 3) Ber. Deutsch. Chem. Gesellsch. 1894, 27, 497. 4) L e b b in, Neue Untersuchungen fiber Fleischextrakt. Berlin 1915, S. 18. 5) Ber. Deutsch. Chem. Gesellsch. 1927, 6t), 1639.

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dahin zu erweitern, dal~ eine Prafung des Alkoholniederschlages unbedingt notwen- dig ist.

Diese Prafung lgfit bei Eatan aber die Abwesenheit yon Hefegummi keinen Zweifel. Beim Glahen des Alkoholniederscblages verbleiben nicht weniger als 70% im Raekstand, wahrend nut eine geringe u eintritt; er besteht also zum grSl~ten Tell aus anorganischen Stoffen. In Wasser ist tier Aikoholniederschlag im Gegensatz zum ttefegummi nut zu 2/s l~slich, dagegen vollstgndig in verdfinnter Salz- saure. W~hrend der Hefegummi eine spezifische Drehung yon A_ 88,8o besitzt, be- wirkt diese L0sung keine Drehung des polarisierten Liehtes. Aus der wgsserigen L6sung des Alkoholniederschlages krystallisierten (nach Entfernung yon etwa 1]t zu Vorproben) weitere 0,060 g anorganischer Substanz, die beim Gtahen ebenso wie der wasserunlOsliche Anteil ohne jede u etwas Wasser abgaben. Nur der aus der ~'Iatterlauge durch Alkoholf~tllung erhaltene ganz geringe Rest yon 0,011 g be- stand zu 70% aus organischer Substanz, deren Analyse aber das u des Kohlenhydrats Hefegummi ausschliel~t:

Bestimmung yon K o h l e n s t o f f und W a s s e r s t o f f : Angewandt 0,00366 g Substanz (auf aschefreie Substanz umgerechnet); gefunden 0,00436 g C0~; 0,0021S g H~0.

Bestimmung yon S t i c k s t off: Angewandt 0,00190 g Substanz (auf aschefreie Substanz umgerechnet); gefunden 0,039 ccm Stickstoff (716 ram, 21~

Kohlenstoff Wasserstoff Stickstoff Hiernach gefunden : 32,5 ~o 6,0 % 2,2 % Berechnet far C6H~o05 4~,~ ~ 6,2 ~o 0 ~o

Die Hauptmenge tier yon L e b b i n mit Hefegummi verwechselten Substanzen befindet sich in der alkoholischen LSsung. Sie enthhlt neben viel ~Natriumchlorid und dem Kupferchlorid auch reichlich organische Substanzen, und zwar Eiweil~abbau- produkte, die far die kolloide Form der Kupferf~llung die Ursache sind. Beim u dampfen des Alkohols krystallisierten 0,S00 g Natriumchlorid und Kupferchlorid aus; ausder alkoholischen Mutterlauge liel~en sich mit J~ther 0,165 g fhllen, die zu 80% aus organischer Substanz bestanden. Der Stickstoffgehalt yon 11,1% lhfit darauf schliel~en, da~ sich in dieser Fraktion hauptshchlich Ei~-eifiabbauprodukte befinden.

Bes t immung des S t i c k s t o f f e s : Angewandt 0,00271 g Substanz (auf aschefreie Substanz umgerechnet); gefunden 0,274 ccm Stiekstoff (716 mm, 21~).

Aus diesen Befunden geht hervor, dal~ L e b b i n ' s ~achweis yon Hefegummi im Eatan und mithin seine Behauptung, das Eatan enthalte Hefeextrakt, auf einem Analysenfehler beruht. Ich babe daraufhin auch noch seine Angabe fiber den Gehalt des Eatans an prhformiertem Kreatinin gepraft. Die fibliche Bestimmung des Kreati- nins nach F o l i n ergab einen Gehalt yon 0:325% Kreatinin, whhrend L e b b i n nur 0,06% gefnnden hat. Alle die weitgehenden Schlu6folgerungen auf eine angebliehe Abweichung des Eatans yon seiner Deklaration sind demnach auf Irrtamer zurfick- zuffihren, die L e b b i n bei tier Analyse des Eatans begangen hat.

Es schien mir erforderlich, die Zuverlassigkeit des ~=achweises yon Hefegummi im Eatan nach tier angewandten Methode noch besonders zu k0~trollieren. Dazu setzte ich dem kauflichen Eatan gewogene ~engen yon reinem Hefegummi zu und

.~4. Band. ] Nov./Dez. 1927.J Hefegnmmireaktion. 44:9

bestimmte die schlieBlich aufgefundenen Mengen dureh Polarisation nach dem ~/on R.' W i l l s t ~ t t e r , K. S c h n e i d e r und E. B a m a n n i) angegebenen Yerfahren.

Im Gang der 5I icko'schen Analyse f~llt der dem Eatan auf diese Weise zu- gesetzte Hef%o~mmi aus der salzsauren L0sung des Kupferniederschlags mit Alkohol aus, abet verunreinigt durch die schon ohne Hefegummiznsatz an dieser Stelle auf- tretenden Niederschl~ge. Ein einfaches Verfahren erlaubt ihre Trennung. Aus der salzsauren L6sung der Alkoholf~llnng l~I3t sich n~mlich mit 3 %-iger Natronlange eine starke F~llung erzeugen, die keine merklichen Anteile des in h-atronlauge glatt 10s- lichen Hefegummis mitnimmt, wenn man soviel Lauge langsam zufliei~en l ~ t , da$ gerade der ganze Niederschlag ausgef~llt ist. Da die den Hefegnmmi vol~usehenden Substanzen mit Natronlauge ausf~llbar sind, versuehte ich, sie yon vornherein arts der Eatan-L0sung durch Yerwendnng yon Natronlauge an Stelle des yon ~ i c k o ange- gebenen und yon L e b b i n angewandten Ammoniaks auszuf~llen. I)er mit Natron- lauge aus Eatan entstehende Niederschlag ist aber viel umfangreicher als der ammoniakalische und adsorbiert so gro$e Mengen yon Hefegummi~ dal3 die Sieher- heir des Nachweises dadurch in Frage gestellt wird (yon den zugesetzten 0,050 g ttefegummi in 100 ccm Eatan fanden sich z. B. 23% in der mit Natronlauge ent- stehenden F~llnng). Wenn man dagegen das Micko 'sche Yerfahren bis znr F~llung des Hefegummis mit Alkohol durchgefahrt hat, so sind offenbar diejenigen Begleit- stoffe sehon entfernt, an die bei der Fallung mit Natronlauge der Hefegummi adsor- biert wird. In dem nun mit 3%-iger Natronlauge hergestellten Niederschlag lie6 sieh kein Hefegummi mehr nachweisen.

Aus der filtrierten alkalischen L6sung f~llt der Hefegummi in der bekannten Weise mit F e h li ng' scher L0sung als hellblauer, sich rasch zusammenballender Nieder- schlag. Er wird in wenig verd0nnter Salzs~nre gelOst, mit Alkohol gef~llt und ist nun in Wasser glatt und vollst~ndig 16slich. I)a die aus dem Eatan stammenden Produkte das polarisierte Licht nieht gedreht hatten, konnte ich durch Polarisation direkt den wiedergewonnenen Iiefegummi bestimmen. Beim Zusatz yon 0,050 g Hefe- gummi zu 50 ccm Eatan waren 20 mg ~ 40% des angewandten nachzuweisen, naeh so vielen Operationen eine betr~chtliche Menge. Bei Zusatz yon 0,010 g Hefe- gummi zu 50 ccm Eatan entstand auf diese Weise noch ein deutlieher Niederschlag yon der typischen Beschaffenheit der Hefegummiknpferverbindung. Noch geringere Mengen lassen sich nicht mehr mit Sicherheit nachweisen. Arts Eatan, dem kein Hefegummi zugesetzt wurde, erh~lt man nach der Behandlung der Alkoholf~llnng mit 3%-iger Natronlauge beim Zusatz yon Feh l ing ' scher L6sung keine Spur eines Niederschlages.

Z u s a m m e n f a s s u n g .

1. Znm Nachweis yon Hefeextrakt in Gegenwart yon tierischen Abbauprodukten (lurch die Hefegummireaktion ist es notwendig, den nach dem Micko'schen Ver- fahren entstehenden Alkoholniederschlag auf seine Eigenschaften zu prttfen. Nach dieser Prtifung enth~lt das Eatan im Gegensatz zu den Angaben L e b b i n ' s keinen Hefeextrakt.

2. Zum sicheren Nachweis yon Hefegummi 10st man den Alkoholniederschlag in S~ure und f~llt ihn durch 3%-ige Natronlauge zum Tell wieder aus. Im Filtrat entsteht nur bei Anwesenheit yon Hefegummi eine F~llung mit F ehl ing 'scher L6sung.

~) Zeitschr. physiol. Chem. 1925, 147, 248, und zwar S. 251.

L. ~7. 30