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Herencia Mendeliana

A mediados del siglo XIX, un monje austriaco llamado Gregor Mendel nacido en

República Checa el 20 de Julio de 1822 , descubrió uno de los más importantes

aportes de la genética al experimentar con guisantes, específicamente una arveja

común denominada Pisum sativum. Escogió estas por su fácil cultivo y rapidez en el

crecimiento.

Lo impresionante es que Mendel estudiaba matemáticas y otras ciencias relacionadas

con esta graduándose, después, en Ciencias Naturales en la Universidad de Viena.

Pero prontamente fracasó. Entonces realizó y expresó lo que ahora se conoce como

Las leyes de la herencia con tal experimento crucial.

Indudablemente, Mendel era una persona muy humilde, de raíces campesinas y su

trabajo no fue tomado en cuenta hasta 20 años después de su muerte. Esto se debió a

que Mendel no difundió sus trabajos en una revista. En vez de aquello usó una no muy

buena o no muy específica para cierto tipo de investigadores.

Los secretos del monje en el éxito de sus experimentos

El austriaco tomó en cuenta tres aspectos principales para su experimento:

Elegir el organismo perfecto para el trabajo.

Planear y ejecutar correctamente el experimento.

Analizar los datos en forma adecuada.

¿Por qué Mendel escogió estos guisantes?

A parte de sus facilidades antes dichas, los chícharos pueden autopolinizarse, es

decir, cada flor de guisante suministra normalmente su propio polen, de tal forma que

los óvulos son fecundados por el esperma del polen de la misma flor.

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¿Qué hizo Mendel con los guisantes?

Mendel tuvo la brillante idea de no observar la planta completa, sino rasgos, o sea

características individuales que se manifiestan con diferentes formas distintivas.

Entonces reunió polen de una cepa parental y lo colocó sobre los estilos (órganos

femeninos) de la otra cepa cuyas anteras (órganos masculinos) habían sido

eliminadas de modo que la planta receptora no pudiera autofecundarse. Las plantas

que donaban y recibían el polen eran la generación parental, designada con una P,

cruzando una flor blanca con una flor púrpura.

Las semillas formadas por este cruce y las nuevas plantas, se las denominaba primera

generación filial, o F1. Esto dio como resultado, que todas las flores eran de color

púrpura.

Entonces salió a la luz un detalle muy interesante. El color blanco había desaparecido.

Mendel permitió a esta generación, que se

autopolinizara y produjera una segunda

generación filial, F2.

Exactamente las cifras fueron 705 púrpuras y

224 blancas. El color blanco apareció. Pero ¿por

qué en la F1 no y en la F2 si lo hizo?

Esta capacidad estaba oculta, pero no había

desaparecido.

Siguiendo con el proceso, permitió también que la

F2 se autopolinizara y de cómo resultado una

nueva generación, la F3.

Todas las flores blancas tuvieron descendientes

blancos, es decir de raza pura. Pero las flores

púrpura eran de dos tipos: 1/3 eran púrpuras y 2/3

eran híbridos, características de flor blanca y

púrpura.

Híbridos, es un organismo vivo procedente del

cruce de dos organismos de razas o de algunas

cualidades diferentes.

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Después de estos resultados, Mendel llego a estas conclusiones:

Cada rasgo está determinado por genes, pares de unidades físicas discretas.

Cuando un organismo tiene dos alelos diferentes, uno de ellos (dominante)

puede enmascarar la expresión del otro (alelo recesivo), sin embargo, el

recesivo sigue presente.

Los pares de genes de cromosomas homólogos se separan durante la

formación de los gametos, de tal forma que cada gameto recibe un solo alelo

de cada par.

El azar determina cual alelo se incluye en un gameto determinado.

Los organismos de raza pura tienen dos ejemplares del mismo alelo de un gen

determinado.

Pero ¿Qué es homocigoto, heterocigoto?

Se sabe que un gen contiene la información necesaria para determinar una

característica.

Entonces un organismo homocigoto tiene los dos cromosomas homólogos en un

mismo alelo en un locus de gen específico, mientras que heterocigótico es cuando sus

dos cromosomas homólogos tienen diferentes alelos en un locus. A estos también se

los conoce como híbridos.

Ahora ¿qué es alelo y locus?

Un alelo es cada una de las formas alternativas de un gen que ocupa la misma

posición en cada par de cromosomas homólogos

Locus es el lugar físico que ocupa un gen dentro de un cromosoma.

Cabe nombrar también lo que es un genotipo y fenotipo

Un genotipo son los alelos presentes en un individuo determinado teniendo relación

con el fenotipo que expresa los rasgos físicos del organismo a tratar.

Después de estudiar la variable color, Mendel comenzó por cruzar plantas que diferían

en dos rasgos, como color de la semilla y forma de ésta.

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Con base en los resultados de otras cruzas de plantas con otros rasgos, Mendel ya

sabía que el alelo liso del gen da la forma de la semilla (S) es dominante respecto al

alelo rugoso (r). Mendel cruzó una planta de raza pura con semillas lisas y amarillas

(SSYY) con una planta de raza pura con semillas rugosas y verdes (ssyy). Todas las

descendientes de la F1, por lo tanto, eran genotípicamente SsYy. Además todas

tenían el mismo fenotipo: semillas lisas y amarillas.

Una posibilidad era que el alelo de la forma y el alelo del color presentes en cada

progenitor se separaran y se transmitieran de forma independiente. Esta hipótesis se

llama combinación independiente, porque los dos alelos se separarían y combinarían

en los gametos independientes . Otra posibilidad era que el alelo de la forma y el alelo

del color se transmitieran juntos a los gametos. Esta hipótesis se puede llamar

combinación dependiente, porque la transmisión de un alelo dependería de la

transmisión de otro.

Al permitir la autopolinización de estas plantas de la F1, Mendel encontró que la

generación F2 consistía en 315 plantas con semillas lisas y amarillas, 101 con semillas

rugosas y amarillas, 108 con semillas lisas y verdes, y 32 con semillas rugosas y

verdes: una proporción de aproximadamente 9:3:3:1.

Los términos dominancia y recesivo identifican únicamente qué fenotipo se observa en

individuos que llevan dos determinantes genéticos diferentes.

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Las leyes de Mendel

Tras sus explicaciones, Gregor Mendel concluyó sus trabajos enunciando 3 leyes,

consideradas a día de hoy la base de la genética actual. Estas leyes, explican y

predicen cómo serán los fenotipos (caracteres físicos) de un nuevo individio.

Así pues, hay 3 leyes de Mendel que explican los caracteres de descendencia de dos

individuos, pero únicamente son dos de las leyes mendelianas las que se refieren a la

transmisión: la ley de segregación de caracteres independientes (segunda ley), y la ley

de herencia independiente de caracteres (tercera ley de Mendel)

Ley de la uniformidad

Si se cruzan dos líneas puras que difieren en un carácter, la primera generación filial

es uniforme y está formada por individuos idénticos que presentan solo uno de los

caracteres alternativos paternos.

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Ley de la segregación independiente de los caracteres

El carácter hereditario que se transmite como una unidad que no se combina, se

diluye o se pierde al pasar de una generación a otra, solo se agrega o se separa.Los

dos genes que rigen cada carácter no se mezcla ni se fusionan, sino que segregan a

la hora de formarse los gametos, teniendo cada gameto uno y sólo uno de los alelos

diferentes

Ley de la independencia de caracteres

Los diferentes rasgos son heredados de manera independiente entre ellos; esto es,

que el patrón de herencia de un rango no afectará al patrón de herencia de otro. Esta

afirmación solo se cumple en aquellos genes que no están ligados en diferentes

cromosomas o que están en regiones muy separadas del mismo cromosoma. Es decir

las proporciones 9:3:3:1.

Como consecuencia del principio de la transmisión independiente, si consideramos

dos caracteres a la vez, al cruzar individuos dihíbridos de la F1 (híbridos por ambos

caracteres), en la segunda generación filial F2 aparecen las proporciones 9 (ambos

caracteres dominantes): 3 (uno dominante):3(el otro dominante):1(ambos caracteres

recesivos).

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En resumen, Mendel demostró que:

En la primera Ley, al realizar los cruces de dos razas puras, la primera generación

filial resultarían heterocigotos y dominantes.

Con la segunda ley, al cruzar unos ejemplares del resultado de la F1 observó que las

características que habían desaparecido en la primera generación, volvían a

manifestarse en la segunda generación.

En la tercera ley, se hace referencia al caso de que se contemplen dos caracteres

distintos. Cada uno de ellos se transmite siguiendo de manera independiente las leyes

anteriores, como si no existiera presencia del otro carácter.

Las leyes de Mendel en los humanos

¿Cómo saber la descendencia de una familia? Pues los árboles familiares que

muestran la aparición de fenotipos en varias generaciones de individuos relacionados,

se llama genealogía.

En este proceso podemos encontrar casamientos entre dos familiares. Esta

observación es resultado de la rareza de los alelos recesivos que dan lugar a los

fenotipos anormales. Para que dos padres fenotípicamente normales tengan un niño

afectado, ambos deben ser heterocigóticos

Si la pareja tuviera docenas de niños, la cuarta parte de ellos serían homocigotos

recesivos. Pero, la descendencia de una pareja probablemente sea demasiada

pequeña para mostrar la proporción exacta de un cuarto.

Anomalías Humanas heredadas

Una mutación en un alelo del gen que codifica una de las enzimas que replican el

ADN, puede resultar desfavorable o inhibir la función.

En muchos genes, un alelo normal que codifica una proteína en condiciones de

funcionamiento es dominante respecto a un alelo mutante que codifica una proteína

disfuncional. Pero también existen alelos dominantes que causan anomalías. Para que

una enfermedad dominante se transmita a los descendientes es necesario que al

menos uno de los progenitores la padezca; es decir, que al menos algunos individuos

con enfermedades dominantes deben ser suficientemente sanos como para sobrevivir

hasta la edad adulta y tener hijos.

Existen anomalías humanas ligadas a los cromosomas sexuales. Estas aparecen más

en los varones y por lo regular afectan a generaciones salteadas, o sea, un varón

afectado transmite la característica a una hija portadora fenotípicamente normal, quien

a la vez tendrá hijos afectados.

El número anormal de cromosomas sexuales dada por la no disyunción de los

cromosomas sexuales en los varones produce espermatozoides con 22 autosomas y

ningún cromosoma sexual o con dos cromosomas sexuales (XX, XY, YY). La no

disyunción de los cromosomas sexuales en las mujeres produce óvulos XX en vez de

óvulos con un cromosoma X. Cuando estos se juntan pueden dar XO, XXX, XXY y

XYY.

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También un número anormal de autosomas representa anomalías. El más

representativo es el Síndrome de Down.

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Fundamentos de la biología molecular

Herencia, genes y ADN

Podría decirse que la característica principal que tienen los seres vivos es la

capacidad de reproducirse. Todo organismo hereda una específica estructura y

función a partir de la información genética dada por sus progenitores. En si, toda célula

provino de otra célula, es decir el material genético de una célula madre ya prexistente

fue replicado y transferido a una célula hija siendo así la división celular el punto

central de la Biología.

Genes y cromosomas

Los principios básicos fueron deducidos por Gregor Mendel a partir de un experimento

con guisantes para descubrir las reglas generales de la transmisión de los patrones

genéticos y asumió que cada carácter esta dado por un par de factores heredados

llamado genes.

Estos experimentos no fueron tomados en cuenta hasta 1900 y poco después se

propuso el papel de los cromosomas como portadores de genes y que la mayor parte

de las células animales y vegetales son diploides; que contienen 2 par de cada

cromosoma. Sin embargo las células germinales animales son haploides su único

cromosoma de cada par se transmite a la célula hija por medio de la meiosis.

A principios del siglo pasado las alteraciones genéticas fueron identificadas. Hay

genes cuyas mutaciones se heredan de forma independiente como la Drosophila y

otros juntos como características emparejadas. El número de grupos de genes ligados

equivale al número de cromosomas apoyando la hipótesis de que los cromosomas

eran portadores de genes.

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Genes y enzimas

La identificación y localización cromosómica de los genes que controlan una

características observable fueron los principales estudios en la enfermedad hereditaria

humana fenilcetonuria (relacionado con enzimas) consiste en la deficiencia de una

enzima para catalizar una reacción metabolica en el metabolismo de una aminoácido

llevando a la conclusión de que los genes especifican la síntesis de enzimas.

Los genes codifican la síntesis de una enzima única, muchas enzimas se

complementan de polipeptidos, por lo que se afirmo que cada gen codifica la

estructura de una cadena polipeptidica.

La simulación muestra una doble hélice de

ADN -verde y púrpura-, siendo separada

por un enzima helicasa -amarilla-. (Foto:

Chris Pelkie y Daniel Ripoll/Cornell Theory

Center)

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Identificación del ADN como el material genético

Los cromosomas poseen proteínas además de ADN, e inicialmente se creyó que los

genes eran proteínas. Se realizaron experimentes definiendo el papel del ADN; las

cepas virulentas de pneumococcus están rodeados por una capsula de polisacáridos

que protege a la bacteria del sistema inmune del huésped , la capsula tenia aspecto

liso se denominan L y las que han perdido su capacidad de sintetizar la capsula siendo

rugosas y no letales son R .cabe recalcar que las bacterias aisladas en el individuo

eran encapsuladas tipo S inactivas, todo individuo que contenía bacterias no

capsuladas y capsuladas inactivas con el calor desarrollaron neumonía y murieron por

lo tanto una sustancia en el extracto S era responsable de inducir la transformación

genética de bacteria R a S.

Cuando un virus afecta a una célula es preciso que el ADN viral penetrara en la

células pero no en las proteínas, ara que el virus se replicara, además las partículas

de las virales hijas se transmiten el ADN del virus progenitor y no de proteínas por lo

que concluye que el ADN es el material genético.

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Estructura del ADN

Se sabe que el ADN era un polímero compuestos de cuatro nucleótidos, dos purinas-

guanina y adenina- y dos pirimidinas- citosina y timina- unidas a azucares fosforilados.

Es una hélice que da giro cada 3,4 nm y la distancia entre cada base es de 0,34 nm,

en cada vuelta hay 10 bases. El diámetro de las bases es 2nm y compuesto no por

una sino por dos cadenas de ADN.

La principal característica del ADN tratada es el esqueleto de azúcar-fosfato en el

exterior de la molécula. Las bases del interior forman puentes de hidrógenos entre

purinas y pirimidinas de cadenas opuestas emparejando A con T y G con C. la

cantidad de adenina equivalía a la de timina así mismo con la guanina y citosina. Cada

hebra contiene información necesaria para especificar las secuencias de bases de la

otra.

Estructura

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Replicación del ADN

Es un proceso de división celular. Se propuso que la dos hebras de ADN se podían ser

parar servir como moldes para la síntesis de nuevas hebras complementarias cuya

secuencia seria dictada en el emparejamiento de bases. Es semiconservativa ya que

se conserva la hebra de ADN progenitor que fue usado como molde.

La capacidad del ADN de servir de molde para su propia replicación fue establecida

con la demostración de que una enzima purificada de E.coli podía catalizar la

replicación del ADN in vitro, la ADN polimerasa de este era capaz de dirigir la

incorporación de nucleótidos en una molécula de ADN codificante.

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Expresión de la información

genética

Los genes son secuencias de

ADN que determinan la estructura

de las proteínas, las cuales a su

vez son responsables de dirigir el

metabolismo celular a través de

su función como enzimas. Se

descubrió que la información

genética se especifica por el

orden de las cuatro bases

(Adenina, Guanina, Citosina,

Timina) que forman la molécula

de ADN a través de la

identificación del ADN como el material genético y la explicación de su estructura.

Las proteínas son secuencias de polímeros de 20 aminoácidos, cuya secuencia

determina su función y estructura. En 1957, se descubrió que los pacientes que tenían

anemia de células falciformes, una enfermedad hereditaria, tienen moléculas de

hemoglobina que se diferencian de las normales en una sola sustitución de un

aminoácido. Es aquí en donde se pudo obtener la primera relación directa entre una

alteración entre las secuencias de aminoácidos de una proteína y una mutación

genética. La bacteria E. coli y otros virus fueron fundamental para tener una mejor

entendimiento de la relación molecular entre ADN y proteínas tras una serie de

experimentos.

Colinealidad de genes y proteínas

Se creó una hipótesis a partir de los datos que se tenían para entender la relación

entre genes y enzimas. Ésta consistía en que el orden de los nucleótidos en el ADN

especificaba el orden de aminoácidos en la proteína. La hipótesis predecía que varias

mutaciones en el mismo gen alterarían distintos aminoácidos en la proteína codificada,

y que los lugares de las mutaciones en un gen se reflejarían en las posiciones de las

alteraciones en los aminoácidos a lo largo de la proteína.

La demostración de la relación lineal entre genes y proteínas fue posible gracias a la

bacteria E. coli debido a su crecimiento acelerado, la rapidez de su replicación y la

simplicidad de su sistema genético, con lo cual se hizo posible el mapeo y aislamiento

de mutaciones múltiples en el mismo gen. Charles Yanofsky y sus ayudantes

localizaron una serie de mutaciones en el gen que codifica una enzima necesaria para

la síntesis del aminoácido triptófano. Así como el orden de los nucleótidos en el ADN

especifica el orden de los aminoácidos en la proteína, es de esperarse que la

secuencia de aminoácidos en la proteína sea colineal con la de mutaciones en el gen.

Papel del ARN mensajero

La secuencia de nucleótidos en el ADN especifica el orden de los aminoácidos en las

proteínas pero esto no significa que el ADN dirige por sí mismo la síntesis de proteínas

puesto que el ADN se localiza en el núcelo de las células eucarióticas y la síntesis de

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proteínas se lleva a cabo en el citoplasma. Es aquí en donde vienen las dudas y se

investiga para saber que molécula hace posible la síntesis de proteínas en los

ribosomas.

El ARN era una buena opción para ser esa proteína debido a que la similitud de su

estructura con el ADN proponía que el ARN podía ser sintetizado a partir de un molde

de ADN. El ARN se diferencia del ADN en que posee una solo cadena en vez de ser

doble, contiene la base pirimidínica uracilo (U) en vez de timina (T) y sus azúcares son

ribosas en vez de desoxirribosas. A más de esto, el ARN se localiza en el citoplasma

por lo cual es un intermediario lógico para trasferir la información del ADN a los

ribosomas.

De acuerdo con el dogma central, una vía para el flujo de información genética, la

transcripción consiste en que las moléculas de ARN se sintetizan a partir de moldes de

ADN, y la traducción se basa en que las proteínas se sintetizan a partir de moldes de

ARN. De acuerdo a Francis Crick, la información fluye del ADN al ARN, y después del

ARN a la proteína.

Sidney Brenner, Francois JACOB Y Mathew Meselson obtuvieron evidencia

experimental sobre la intermediación del ARN postulada por el dogma central con

ayuda de estudios de E. coli infectados por el bacteriófago T4. Los ARN mensajeros

(ARNm) son moléculas intermediarias en el flujo de la información genética y sirven de

molde para la síntesis proteínica. Los ARN mensajeros son transcritos por el ARN

polimerasa, una enzima que cataliza la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN.

El ARN ribosómico (ARNr) es un componente de los ribosomas y el ARN de

transferencia

(ARNt) es una molécula adaptadora que alinea a los aminoácidos a lo largo del molde

de ARN mensajero.

Código genético

El ARN de transferencia se usa como adaptador entre los aminoácidos y el ARNm

durante la síntesis de proteínas. Cada aminoácido se une al extermo 3’ de una ARNt

por una enzima apropiada que en el caso de la histidina sería la aminoacil RNA

sintetasa). El ARNt se alinea sobre un molde de ARNm por complementariedad de

bases.

Son precisos al menos tres nucleótidos para codificar cada aminoácido dado que

cuatro nucleótidos deben codificar 20 aminoácidos. El código genético es la relación

entre tripletes de nucleótidos y aminoácidos en las proteínas. Un codón o triplete es la

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secuencia de tres bases o nucleótidos que codifican un aminoácido. En total hay 64

codones que codifican sólo 20 aminoácidos por lo cual es factible que haya más de un

codón por cada aminoácido. De los 64 codones, 61 codifican algún aminoácido. Los

tres que sobran (UAA, UGA y UAG) son codones de parada o stop que determinan la

terminación de la síntesis de proteínas. La adición o deleción de tres nucleótidos lleva

a la adición o deleción de un solo aminoácido

Para la evidencia genética del código de tripletes se estudió una serie de mutaciones

que consistían en la adición de uno, dos o tres nucleótidos en el gen rII del

bacteriófago T4. La adición de uno o dos nucleotidso altera el marco de lectura de todo

el resto del gen. Por lo tanto, tanto los aminoácidos son anormales y se produce una

proteína inactiva, dando lugar a un fago mutante. La adición de tres nucleótidos, por el

contrario, altera un único aminoácido. El marco de lectura del resto del gen es normal,

y se produce una proteína activa que da lugar al fago de tipo salvaje (TS). Una

mutación en un par de bases de la región codificante de un gen puede resultar en

polipéptido prematuramente terminado o en un polipéptido con una secuencia

aminoacídica errónea, dependiendo de la mutación correcta.

El triplete UUU codifica a la fenilalanina. La traducción in vitro es el uso de sistema in

vitro que realiza síntesis proteínica. Este tipo de traducción de un ARN sintético

compuesto de uracilos repetidos (un molde de poli-U) lleva a la síntesis de in

polipéptido compuesto únicamente por fenilalanina.

Virus ARN y transcripción inversa

De acuerdo con el dogma central, el material genético es el ADN, que es capaz de

autorreplicarse además de transcribirse a ARNm, que sirve a si vez de molde para la

síntesis de proteínas.

Los genomas de ARN fueron descubiertos en virus vegetales, los cuales en su

mayoría se componen solo de ARN y proteínas. Por medio de experimentos como el

de los años 50 en donde se demostró que el ARN purificado del virus del mosaico del

tabaco podía infectar nuevas células que dio lugar a una progenie de virus infectivos,

se obtuvo evidencia de que el ARN actúa como material genético.

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El modo de replicación de la mayoría de los genomas virales se determinó en estudios

de los bacteriófagos ARN de E. coli. Estos virus codifican una enzima específica que

cataliza la síntesis de ARN a partir de un molde de ARN (síntesis de ARN dirigida por

ARN), utilizando el mismo mecanismo de apareamiento de bases entre hebras

complementarias se da durante la replicación del ADN o durante la transcripción de

ARN a partir de ADN.

Los virus tumorales de ARN, denominados retrovirus, se replican por medio de la

síntesis de un ADN intermediario, llamado provirus de ADN. En 1970, Howard Temin y

Dvid Baltimore descubrieron una forma independiente que el ARN de los virus

tumorales contenía una enzima que cataliza la síntesis de ADN desde un molde de

ARN. La síntesis de ADN a partir de ARN, denominada transcripción inversa se

estableció con un nuevo modo de transferencia de información en sistemas biológicos.

La transcripción inversa es importante en la replicación de los retrovirus pero también

ocurre en las células y es responsable en la transposición de secuencias de ADN de

una localización cromosómica a otra. Las enzimas que catalizan la síntesis de ADN

dirigida por ARN, las transcriptasas inversas, se utilizan en experimentos para generar

copias de ADN a partir de una molécula de ARN. Los retrovirus contienen genomas de

ARN en sus partículas virales, cuando un retrovirus infecta una célula huésped se

sintetiza una copia de ADN del ARN viral por medio de la transcriptasa inversa. Este

ADN viral se integra en el ADN cromosómico del huésped para constituir un provirus

de ADN, que se transcribe para dar lugar a virus ARN hijos.

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Detección de ácidos nucleicos y proteínas

Las enzimas de restricción son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma

específica puentes fosfodiéster 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble

cadena de DNA

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos

cohesivos o adherentes son generados cuando la enzima corta las dos hebras

asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena

complementarias en Los fragmentos de DNA generados por digestión con enzimas de

restricción pueden ser determinados por electroforesis en gel de agarosa.

La DNA ligasa es una enzima que cataliza la formación de puentes fosfodiéster entre

los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la enzima

requiere Mg++ y una unión covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa

del bacteriófago T4.

El uso en la digestión / restricción del DNA

seguido por unión covalente de extremos

cohesivos de diferentes fragmentos de DNA

forma la base de la enzimología del DNA

recombinante

El DNA extraño clonado que está en esta

biblioteca son moléculas de DNA de doble

cadena sintetizadas por la enzima

transcriptasa inversa a partir de la población

de RNA mensajeros, moldes encontrados en

un tejido específico.

Amplificación de ADN con la reacción cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el método alternativo para conseguir un

gran número de fragmentos de material genético a partir de una copia de ADN.

Siempre que se conozca la secuencia de la molécula de ADN se lleva a cabo

completamente en in vitro

El numero de secuencia va aumentando doblando con cada ciclo de replicación puede

obtener las ADN iniciales

Los múltiples ciclos de calentamiento y enfriamiento por sistema de ciclos de

calentamiento y enfriamiento: TERMOCICLADORES. El ADN polimerasa empleadas

con enzimas termoestables de bacterias como la Thermus Aquaticus, , las polimerasa

son estables en temperaturas altas empleadas para separar las hebras del ADN de

doble hebra y la ampliación se de una manera rápido y automático

Las únicas moléculas de ADN que será amplificado por PCR proporcionan un método

muy poderoso de detección de pequeñas cantidades

Las únicas moléculas de ADN que serán amplificadas por el PCR son aquellas que

contengan secuencia complementaria de los cebadores empleados en la reacción

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Hibridación de Ácidos Nucleicos

La clave es que apareamiento de bases entre hebras de ARN o ADN en un proceso

de hibridación de ácidos nucleicos si puede hibridar entre sí dos hebras de ADN , 2

hebras de ARN y una de ADN con otra de ARN

La transferencia southerm s e utiliza de modo generalizado para la detección de genes

específicos en el ADN celular

La transferencia Northerm es utilizada para la detección de ARN en vez de ADN

La hibridación de ácidos nucleicos también puede emplearse para identificar clones

moleculares contiene insertos específicos de ADN celular, la hibridación a Microarrays

de ADN permite el análisis simultaneo de miles de genes, un Microarray de ADN

consiste en un lamina de cristal o membrana sobre a que se imprimen oligonucleótidos

o fragmentos de adnc por un sistema de robótica en pequeños puntos a elevada

intensidad.

La hibridación de ácidos nucleicos se emplea para detectar secuencias de ADN o ARN

homologas no solo en extractos celulares, también cromosomas o células intactas

llamado Hibridación in situ esta también puede emplearse para detectar ARNm

específicos en los distintos tipos celulares de un tejido

Bancos de Screening de clones

El screening es a menudo realizado por hibridación selectiva con una indagación de

DNA (DNA probe). La hibridación se refiere al proceso por el que bases apareadas o

fortalecidas ocurre entre cadenas complementarias de una sola hebra de DNA. La

indagación puede ser un fragmento de DNA o varios cientos de pares de bases o con

más homología al gen a ser aislado. También una indagación pequeña de hebra única

de DNA puede hacerse sintéticamente, el que hibridará con el código genético por una

secuencia aminoacídica conocida. Luego de transferir de una biblioteca de colonias

bacterianas de una o más placas de Petri a un papel de filtro o de nylon, el resto

bacteriano es removido dejando el DNA celular y el plásmido unidos al filtro en

precisamente la misma posición como la colonia bacteriana original (una réplica de la

placa bacteriana es retenida). El DNA en el filtro es luego desnaturalizado e

hibridizado con una indagación del DNA alterado marcado radiactivamente.

Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado.

Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el

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filtro y su visualización se realiza por medio de auto-radiografía, técnica en la cual

primero, cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad.

Durante el período de exposición, el radioisótopo libera energía que impacta la

emulsión fotográfica.

Las bibliotecas de genes de screening también pueden ser determinadas usando un

anticuerpo específico que reconocerá y unirá a la proteína del gen a ser aislado. El

anticuerpo puede ser contra la proteína entera o dirigida contra un péptido sintético

derivado de la secuencia primaria de la proteína. El anticuerpo puede ser marcado

radiactiva o enzimáticamente y usado para filtrar bancos de clones bacterianos en los

que los genes extraños han sido clonados en un plásmido de expresión especial. En

este plásmido el gen inserto es transcripto a RNAm y traducido a proteína por la RNA

polimerasa y ribosomas bacterianos. Las colonias bacterianas en el papel de filtro son

lisadas, así la proteína expresada en una colonia específica puede ser detectada por

el anticuerpo. Se han desarrollado nuevos métodos de marcaje de ácidos nucleicos

que usan compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse

o bien porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y

Sondas de anticuerpos para proteínas

La expresión y función génica de proteínas específicas. Los anticuerpos ocupan las

sondas de acido nucleicos como reactantes que interactúan de modo selectivo

La clonación molecular permita la obtención de anticuerpos dirigidos contra proteínas

eucarioticas de difícil aislamiento. También es posible crear anticuerpos contra

péptidos

Los anticuerpos pueden ser utilizados para detectarse proteína en extractos celulares

La inmunotransferencia y la inmunoprecipitacion, la proteínas precedentes de los

extractos celulares son separadas por electroforesis en gel según su tamaño, las

proteínas se separan por técnica electroforesis en gel de SDS-POLIACRILAMIDA

Tras un a electroforesis las proteínas se transfieren a un filtro que incuba con los

anticuerpos que reaccionan con la proteína de interés

La inmunoprecipitacion los anticuerpos son utilizados para aislar las proteínas contra

las que reaccionen también puede emplearse para detectar interacciones proteína-

proteína interior celular la co-inmunoprecipitacion de dos proteínas que se encuentran

interaccionando

Secuenciamiento del DNA.

La habilidad para secuenciar grandes fragmentos de DNA ha evolucionado la

biología. En los Estados Unidos se investigará en los próximos veinte años para lograr

el mapeo y secuenciamiento de las 3 x 109 pb del genoma humano.

Existen dos metodologías básicas para secuenciar el DNA: (1) Método de Maxam-

Gilbert: degradación química de fragmentos de DNA y (2) Método enzimático de

Sanger o dideoxi: reacciones de terminación de cadenas durante la síntesis de DNA

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dirigida por moldes. Los fragmentos de DNA a ser secuenciados son clonados en el

genoma de bacteriófago que 19

existe como una molécula de DNA de doble cadena durante la replicación, sino es una

cadena única. El fago de DNA de cadena única contiene una de las cadenas del DNA

extraño a ser secuenciado, y es sometido a una síntesis de DNA in Vitro usando la

DNA polimerasa y un oligonucleótido sintético específico como molde de hibridación

que une el molde del bacteriófago corriente arriba del DNA extraño insertado. La

síntesis in Vitro del DNA es realizada en cuatro recipientes separados de reacción,

cada uno conteniendo 4 dNTPS (uno marcado radiactivamente) más una pequeña

cantidad de solo un dideoxinucleótido (ddGTP - ddATP - ddCTP o ddTTP). El

deoxinucleótido contiene un azúcar 2'H y 3'OH y el dideoxinucleótido contiene

hidrógenos en posiciones 2' y 3'. Una vez que son incorporados a la cadena de DNA

en crecimiento durante la síntesis 5' fosfato se agrega a 3' OH, termina la síntesis de la

cadena porque bloquean el 3'OH requerido para la adición del próximo 5' fosfato

dNTP. Debido a que los dideoxinucleótidos están presentes en pequeñas

concentraciones en relación a los dNTPs en reacciones individuales, la terminación de

la cadena es al azar y resulta en un amplio rango de tamaños de cadenas nuevas

sintetizadas (20 a 1.000b). Como la electroforesis en gel de acrilamida es capaz de

determinar las cadenas individuales que difieren en una base, las cuatro mezclas de

reacción son sometidas a electroforesis a través de acrilamida polimerizada en

caminos adyacentes. Luego el gel es expuesto a una película de rayos X donde los

productos de terminación de la cadena radiactiva se revelan como bandas de diferente

movilidad electroforética. La secuencia nueva sintetizada es leída en incrementos de

una base a través de cuatro caminos de reacción (ddG, ddA, ddT, ddC) de arriba a

abajo la dirección 5' a 3'. El complemento de esta secuencia será la secuencia del

molde de DNA extraño en dirección 3' a 5'.

Otras técnicas relevantes de la Biología Molecular

En la técnica del Southern blott el DNA es sometido a electroforesis y luego transferido

al papel o nylon. RNA y proteínas pueden ser analizados en forma similar. La

electroforesis del RNA por agarosa o acrilamida seguida de transferencia al papel o

nylon se llama NORTHERN TRANSFER. El RNA transferido puede ser detectado por

hibridación con una PROBE radioactiva. El NORTHERN BLOTT revela el modelo de

expresión génica a nivel de RNA en células o tejidos. La electroforesis de proteínas

desnaturalizadas por acrilamida seguida por transferencia al papel se llama

WESTERN BLOTTING. La proteína transferida puede ser detectada más fácilmente

por métodos inmunológicos. Por ejemplo, un anticuerpo de conejo específico puede

24

unirse a su antígeno proteico en

el papel. Otro anticuerpo (anti-

conejo) conjugado con una

enzima (fosfatasa alcalina)

luego pueden unirse al

anticuerpo original del conejo en

el papel. Cuando el papel es

humedecido en una coloración

un precipitado oscuro se

depositará sobre la banda del

antígeno. El Western Blott se

usa para detectar la presencia

de antígenos HIV o anticuerpos para HIV en suero humano así como otros agentes

virales. La hibridación in situ es un proceso por el cual las PROBES de ácidos

nucleicos se hibridan a ácidos nucleicos complementarios dentro de células fijas y

cortes de tejidos (in situ).

Esto permite localizar secuencias específicas de DNA o RNA en células y tejidos

mediante el uso de sondas de ácidos nucleicos.

Organismos genéticamente modificados

Los organismos genéticamente modificados se

crean introduciendo uno o más genes,

pertenecientes a otros seres, o quitando uno o

más genes, pertenecientes al organismo.

Los organismos transgénicos están

genéticamente modificados, pero con genes

pertenecientes a otros organismos muy

distintos a ellos (distinta especie). Por ejemplo,

un organismo genéticamente modificado podría

ser una rata con genes de otra rata. Un

organismo transgénico sería una merluza

modificada con genes de un salmón. Los

organismos genéticamente modificados han

sido desarrollados para facilitar la mejora animal y vegetal, ya que acortan los tiempos

de espera en la depuración de la especie por selección de individuos. También, se ha

investigado en su desarrollo con otro fin distinto, el de crear organismos que, de otro

modo no se formarían en la Naturaleza, como por ejemplo permitir la incorporación de

ADN de otra especie. Las aplicaciones de los organismos genéticamente modificados

son muy variadas. Se pueden destacar las siguientes:

En investigación: para el estudio de la expresión de genes y la creación de genéticas.

En medicina: para la obtención de fármacos o proteínas cuya síntesis es difícil

conseguir "in Vitro". También, para la obtención de tejidos u órganos, o la reparación

de anomalías genéticas en humanos.

25

En agricultura y ganadería: para la mejora (no de forma tradicional) de plantas y

animales.

En la industria alimenticia: para la mejora de procesos biotecnológicos de elaboración

de alimentos (pan, vino, cerveza, yogur, etc.) y para la creación de alimentos nuevos.

La creación y utilización de organismos genéticamente modificados tiene muchas

trabas legales, debido al rechazo social existente. Los alimentos manufacturados a

partir de este tipo de organismos sólo se aceptan para el consumo humano si no

queda proteína o ADN del organismo genéticamente modificado. Si esto no se cumple,

debe ponerlo en la etiqueta. Por ejemplo, en la fabricación del pan utilizamos levadura.

Cuando el pan se cuece la levadura queda destruida. Esa levadura destruida puede

ser natural o genéticamente modificada, pero nunca lo sabremos.

26

VIH

Introducción

Las tres clases de retrovirus humanos son: oncornavirus, lentivirus y espumavirus, están integrados por virus RNA cubiertos con una envoltura de composición muy similar a la membrana celular. Los virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2, respectivamente) se clasifican como lentivirus por tener una organización genómica y por producir patologías similares a otros miembros de esta subfamilia, como el virus caprino Visna/Maevi.

El genoma de los retrovirus, un RNA de simple hebra, se replica a través de un proceso único. La enzima transcriptasa reversa, un producto viral, cataliza el ciclo de replicación tan peculiar de estos virus al convertir el RNA genómico en un DNA de doble hebra denominado provirus. Otro producto viral, la enzima integrase, incorpora el provirus al genoma celular, integración que constituye un evento esencial para la expresión de los genes virales, ya que además de permitir a los retrovirus persistir en las células de por vida, también contribuye a la extensa latencia que caracteriza las enfermedades producidas por los retrovirus humanos.

Los tipos de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), derivados de los lentivirus

primates, son el agente etiológico del SIDA. La enfermedad fue descrita por primera

vez en 1981. Desde entonces el SIDA se ha convertido en una epidemia mundial, la

cual se extiende en alcance y magnitud a medida que la infección por VIH afecta a

diferentes poblaciones y regiones geográficas. En la actualidad se ha infectado

millones de personas por todo el mundo; una vez infectados los individuos

permanecen así durante toda la vida. Sin tratamiento, antes de un decenio la gran

mayoría de personas infectadas con VIH desarrollan infecciones oportunistas mortales

como consecuencia de las deficiencias inducidas por este virus en el sistema

inmunitario. El SIDA es uno de los problemas más importantes de la salud pública en

todo el mundo en el comienzo del siglo XXI.

Propiedades del virus

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un lentivirus (de la

familia Retroviridae)

Propiedades importantes de los lentivirus (retrovirus no oncógenos)

Virión Esférico de 80 a 100 nm de diámetro, centro cilíndrico

Genoma RNA de cadena sencilla, lineal, de sentido positivo, 9 a 10 Kb,

diploe, genoma más complejo que el de los retrovirus oncógenos,

contiene hasta 6 genes adicionales de replicación.

Proteínas La glicoproteína de la envoltura sufre variación antigénica; los

viriones contienen la enzima transcriptasa inversa; se requiere una

proteasa para la producción de virus infectante.

Envoltura Presente

Replicación La transcriptasa inversa elabora copias del DNA del RNA genómico;

el provirus del DNA es la plantilla para el RNA viral.

Maduración Las partículas geman a través de la membrana plasmática.

27

Características notables

Infectan las células del sistema inmunitario.

Tienen expresión viral in vivo restringida en algunas células.

Causan enfermedad crónica levemente progresiva.

La replicación es muy específica de especie.

El grupo incluye el agente causal del SIDA.

Estructura (retrovirus)

Los retrovirus son virus de ARN de aproximadamente 80 a 100 nm. La envoltura

contiene glucoproteinas víricas y se adquiere por gemación a través de la membrana

plasmática. La envoltura rodea una capside que que contiene dos copias idénticas del

genoma de ARN de cadena positiva dentro de un centro vírico denso a los electrones.

El virión también contiene entre 10 y 50 copias de las enzimas trasncriptasa inversa e

integrasa y dos ARN celulares de transferencia (ARNt). Estos ARNt emparejan sus

bases con cada copia del genoma para ser usados como cebadores por la

transcriptasa inversa.

La morfología del centro vírico varía en distintos virus, lo que se estudia para clasificar

los retrovirus. Siendo el centro vírico del VIH un cono truncado.

El genoma del retrovirus tiene una cabeza en el extremo 5’ y una cola de poliadenina

en el extremo 3’. A pesar de que el genoma se asemeja a un ARN mensajero, no es

infeccioso debido a que no codifica ninguna polimerasa que pueda generar

directamente otras moléculas de ARN mensajero. El genoma de los retrovirus simples

se compone de tres genes principales que codifican poli proteínas para las siguientes

poli proteínas enzimáticas:

Gag (antígeno específico de grupo, proteínas de capside, matriz y unión de

ácidos nucleicos)

Pol (polimerasa, proteasa e integrasa)

Env (envoltura, glucoproteinas)

En cada extremo del genoma encontramos secuencias de repeticiones terminales

(LTR), estas estructuras contienen secuencias promotoras, potenciadoras y otras

secuencias genéticas utilizadas para generar distintos factores de transcripción celular.

Las glucoproteinas víricas se producen por escisión proteolítica de la poli proteína

codificada por el gen Env. Ejemplos:

La (glucoproteína) gp160 del VIH se escinde en la gp41 y gp120. Estas

glucoproteinas forman una punta de trímero que son visibles en la superficie

del virión. La glucoproteína mayor se une a los receptores de la superficie

celular, determina inicialmente el tropismo tisular del virus y es reconocido por

el anticuerpo neutralizante.

La glucoproteína menor en el VIH (la gp41) consiste en la base de la punta de

trímero y estimula la fusión de una cadena con otra.

28

La gp120 del VIH está intensamente glucosilada, y su antigenicidad y

especificidad de receptor pueden variar durante la infección crónica por VIH.

Estos factores impiden que la inmunidad sea capaz de eliminar al virus.

Replicación

1) La replicación del VIH empieza con la unión de

las puntas de glucoproteinas vírica (Trímero de

moléculas gp120 y gp41) a la proteína receptora

de superficie CD4 expresada en las células

como macrófagos, células dendríticas, linfocitos

T. Así mismo un segundo receptor, una

quimiocina receptora de transmembrana-7 unida

a la proteína G. En una fase posterior el virus

muta y la gp120 se une a la CD4 y a distintos

receptores de quimiocinas [CXCR4] y [CCR5] en

linfocitos T y otros linfocitos T cooperadores. La

unión al receptor de quimiocina pone en

contacto a la envoltura vírica y la membrana

plasmática de la célula y hace posible que la

gp41 interaccione y favorezca la fusión de

ambas membranas.

2) La fase precoz del proceso de replicación se

inicia tras la introducción del virus al citoplasma.

Donde se separan las 3 enzimas de replicación

del virus que son: la transcriptasa inversa, la

integrasa y la proteasa.

3) La transcriptasa inversa empieza la transcripción inversa del ARN viral, esta

posee dos puntos catalíticos que son: el sitio activo de RNAsa H y el citio activo

de la polimerasa; aquí la única cadena de ARN viral es transcrita en una doble

hélice ARN-ADN

29

4) La transcriptasa inversa actúa, igualmente con el sitio activo de RNAsa H, la

cual degrada la cadena de ARN y luego sintetiza la cadena positiva de ADN

complementario [ADNc]. La transcriptasa es muy propensa a cometer errores

se dice que puede cometer 1 error por cada 2000 pares de bases o

aproximadamente 5 errores por genoma.

5) El ADNc se introduce en el centro vírico y se inserta en el cromosoma del

anfitrión con la ayuda de una enzima codificada por el virus y transportada por

el virión, La integrasa.

6) La integración requiere la proliferación celular, aunque el ADNc del VIH puede

permanecer en el núcleo y el citoplasma en una forma circular no integrada de

ADN hasta que la célula este activada.

7) Una vez integrado comienza la fase tardía, y el ADN vírico es transcrito como

un gen celular por parte de la polimerasa de ARN II de la célula anfitriona. La

transcripción del genoma produce un ARNm que contiene las secuencias gag,

gag-pol o env.

8) El ARNm migra hacia el citoplasma donde se sintetizan los componentes de

nuevos virus.

9) Algunos de estos deben de ser procesados por la proteasa viral, ésta corta

proteínas largas en más cortas, proceso crucial para crear virus infecciosos.

10) Las glucoproteinas víricas también se sintetizan, glucosilan y procesan en el

retículo Endoplásmico y el aparato de Golgi, después estas se degradan para

formar una fracción transmembrana y subunidades extracelulares de la

proteína de una unión vírica la cual se asocia para formar los trímeros y

emigrar hacia la membrana plasmática.

11) Más tarde las enzimas de replicación, las proteínas infecciosas formadas, el

ARN viral y las glucoproteinas virales de reconocimiento se unen para formar el

nuevo virus infeccioso por medio del proceso de Gemación que es la expulsión

del virus por la membrana plasmática de la célula anfitriona.

El virus replicado está listo para infectar más células del organismo, el virus del VIH

tiene la capacidad de replicarse miles de millones de veces al día, provocando un

grave efecto sobre las células de sistema inmunológico.

30

Efectos inmunológicos de la infección

El principal efecto de la infección por el VIH en el organismo es una progresiva pérdida

del número de células T CD4+ en sangre periférica y en tejido linfoide. Se observan

defectos funcionales en las células, que incluyen fallos en la proliferación y en la

producción de citocinas en respuesta a antígenos comúnmente encontrados y anergia

para hipersensibilidad retardada en piel. Además de la profunda deficiencia inmune, el

VIH también induce un estado de activación inmune crónica en las células T CD4+, T

CD8+ y monocitos. Este hecho limita la capacidad del huésped para proveer defensas

contra patógenos oportunistas, potenciando la propagación del VIH ya que las células

T CD4+ activadas son más permisivas a la replicación del virus.

Enfermedades clínicas

El SIDA es una de las epidemias más devastadoras que se recuerdan. La mayoría de

los individuos infectados por VIH acaban presentando sintomatología y la inmensa

mayoría sucumbe finalmente a la enfermedad en ausencia de tratamiento.

Aunque es raro existen casos de supervivientes de larga duración. Algunos de estos

casos se deben a la infección por cepas del VIH que carecen de la proteína funcional

nef.

Los síntomas iniciales tras la infección por VIH (2 a 4 semanas después de la

infección) se pueden parecer a los de la gripe o la mononucleosis, con una meningitis

o un exantema que aparece hasta 3 meses después de la infección. Al igual que la

mononucleosis, los síntomas se derivan de las respuestas inmunitarias

desencadenadas por una extensa infección de células linfoides.

El deterioro de la respuesta inmunitaria está indicado por el aumento en la sensibilidad

a los microorganismos patógenos oportunistas, especialmente aquellas controladas

por los linfocitos T4, los macrófagos activados y los linfocitos T8.

Transmisión

La presencia del VIH en sangre, semen y secreciones vaginales de los individuos

infectados y el prolongado periodo de infección asintomático son los factores que han

31

favorecido la diseminación de la enfermedad por contacto sexual y contagio con

sangre y hemoderivados.

Sin embargo el VIH no se transmite por contacto casual, las manos abrazos, besos,

tos, estornudos, picaduras de insectos, agua, alimentos, utensilios, retretes, piscinas o

baños públicos.

Fármacos antivirales

Un número creciente de fármacos antivirales han sido aprobados para el tratamiento

por infección de VIH. Las clases de fármacos incluyen análogos de nucleosidos

inhibidores de la enzima proteasa viral. Los inhibidores de la proteasa viral son

antivirales potentes, debido a que la actividad de proteasa es absolutamente

indispensable para la producción de virus infectante y la enzima viral es distinta de las

proteasas de las células humanas.

32

Repartición de Temas

Carlos Pachucho:

Herencia Mendeliana

Experimentos con los guisantes

Genotipo y Fenotipo

Leyes de Mendel

Leyes de Mendel en los humanos

Anomalías humanas heredadas

Geovanna Cobo:

Fundamentos de la Biología molecular

Genes y cromosomas

Genes y enzimas

Identificación del ADN como el material genético

Estructura del ADN

Replicación del ADN

Belén Pimentel:

Expresión de la información genética

Colinealidad de genes y proteínas

Papel de ARN mensajero

Código genético

Virus, ARN y transcripción a la inversa

Ximena Ortega:

Detección de ácidos nucleicos y proteínas

Amplificación de ADN con la reacción cadena de la polimerasa

Hibridación de ácidos nucleicos

Bancos de Screening de clones

Sondas de anticuerpo para proteínas

Secuenciamiento del ADN

Otras técnicas relevantes de la biología molecular

Organismos genéticamente modificadas

Alex Cuzco:

VIH

Propiedades del virus

Estructura (retrovirus)

Replicación

Elementos inmunológicos de la infección

33

Enfermedades Clínicas

Transmisión

Fármacos antivirales

34

Bibliografía:

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España.

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7-46cb-4a4d-92d8-9651cde08448&ID=93003

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Microbiología y Parasitología Médicas, Alina Llop

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Revista chilena de pediatríaversión impresa ISSN 0370-4106 Rev. chil. pediatr. v.71 n.2 Santiago mar. 2000 doi: 10.4067/S0370-41062000000200002