tularemi: tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · tularemİ: polimeraz zincir reaksiyonu (pcr) y....
TRANSCRIPT
![Page 1: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/1.jpg)
Tularemi: Tanı yöntemleri
Doç.Dr. Aynur KaradenizliKocaeli Üniversitesi
Tıbbi Mikrobiyoloji AD
![Page 2: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/2.jpg)
Dünyada Tularemi
![Page 3: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/3.jpg)
Francisella tularensis: Taksonomi
Bacterium tularensisTulare kasabası, Kaliforniya,Dr. Edward Francis, 1919
16SrRNA hibridizasyonu sonucunda;◦ Sınıf: Proteobacteria-γ altsınıfı◦ Takım: Thiotrichales◦ Family: Francisellaceae◦ Cins: Francisella◦ Türler: F. tularensis, F. philomiragie, F.novicida (?)
![Page 4: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/4.jpg)
Francisella tularensis
Küçük (0,2-0,5 x 0,7-1µm),Aerob, pleomorfik, hareketsizHücreiçi ve hücredıșında yerleșebilen gram negatif bir kokobasildir.
![Page 5: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/5.jpg)
Tanı Yöntemleri: Gram boyamaFrancisella tularensis Gramla çok zayıf boyanır.Gram negatif kısa basiller ve kokoidformlar șeklinde görülür.
![Page 6: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/6.jpg)
Tanı Yöntemleri: KültürBu amaçla sistein/sistin gibi sulfidrilbileșikleri, glukoz ve ferrik pirofosfat yada İsoVitalex içeren besiyerleri kullanılır.◦ Sistein-glukoz içeren kanlı agar (Francis besiyeri)◦ Sistein’li kalp agar (CHAB)+%9 ısıtılmıș koyun
kanı eklenmiș ◦ Sisteinle zenginleștirilmiș çukulatamsı agar, ◦ GC agar base II +%1 hemoglobin - %1
IsoVitaleX◦ Thioglycollate - glucose blood agar (TGBA)..
![Page 7: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/7.jpg)
Francisella tularensis: Kültür
•Sistein-glukoz içeren kanlı agar (Francis besiyeri)
•Sisteinli kalp agar (CHAB)+%9 ısıtılmıș koyun kanı
P3 Lab yada glove-box kullanımı
![Page 8: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/8.jpg)
Francisella tularensis: Kültür
Sık kullanılan örnekler;◦ Boğaz sürüntüsü (Orofaringeal form)◦ Lezyondan sürüntü, aspirat yada biyopsi ◦ Çevresel örnekler
SuToprakÇamurHayvan dıșkıları ya da leșleri
![Page 9: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/9.jpg)
Francisella tularensis: KültürSu örnekleri 0,20μm çapında sellüloz asetat membranlardan filtre edilir. Membranlar antibiyotikli sistein kalp agaramembran ekimi yapılır. 37ºC, %5 CO2,4-10 gün inkube edilir.
![Page 10: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/10.jpg)
Tanı Yöntemleri: Fare inokulasyonu
Kontamine örneklerden F. tularensis’inizolasyonunda kullanıșlı bir metoddur.Örnek SF ile homojenize edilir ve 0,1-0,5 ml alt abdomenden subkutan olarak uygulanır.3-5 gün içinde hastalanır.KC ve dalak dokusundan yapılan kültürler ile bakteri izolasyonu sağlanır.
![Page 11: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/11.jpg)
Tanı Yöntemleri: Antijen saptanmasına yönelik testler
DFA (Direk floresan antikor testi)FITC ile ișaretli, tavșan poliklonalF. tularensis antikorları kullanılır.Örneklerden yada kültürden ince bir preparat hazırlanır. Kurutulur ve üzerini kaplayacak kadar konjugat eklenir.
DFA testi hızlı ve özgün bir testtir (duyarlılık sınırı ~106 hücre/ml).
![Page 12: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/13.jpg)
Tanı Yöntemleri:capture ELISA (cELISA)
Solid bir faz üzerine monoklonal antikorlar kaplanırAntijen (F. tularensis LPS’i yada tüm hücre) ile bağlanır. Bağlı antijenin peroksidaz ile ișaretli antikorun kullanılarak saptanması ișlemidir.Bu ișlem șüpheli kültürlerin ve hayvan dokularında etken varlığının araștırılmasında kullanılır.
Grunow et al. 2000
![Page 14: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/14.jpg)
14
TULAREMİ: Serolojik Tanı
Tanıda en yaygın kullanılan yöntem mikroagglütinasyon yada tüp aglütinasyonudur. ELISA yöntemi de kullanılabilir.Antijen olarak FopA, LPS, dıș membrankarbohidrat fraksiyonu (OMP) ve ölü bakteri hücresi kullanılır. Dezavantajı antikorların genellikle hastalığın 2. haftasına kadar saptanamaması ve bazı bakterilerle çapraz reaksiyonlar göstermesidir.
![Page 15: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/15.jpg)
15
TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. Son yıllarda Real-Time PCR teknikleri tercih edilmektedir. F. tularensis’e ait hedeflenen bașlıca genler: ◦ Tul4, fopA (Dıș membran proteinlerini kodlar), ◦ ISFtu2◦ 23kDa gen (Makrofaj infeksiyonunda eksprese edilen
bir proteini kodlar)
![Page 16: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/16.jpg)
TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Üç farklı genomik lokusu (ISFtu2, 23kDa, tul4) hedefleyen multitarget TaqManassay sayesinde bir adet F. tularensis’idahi saptamak mümkündür.
J Versage et al. 2003
![Page 17: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/17.jpg)
TUBİTAK KAMAG (107G255) projesi:Kocaeli Üniversitesi ve RSHM
![Page 18: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/18.jpg)
Kitin çalıșma sonuçları
Kitin Deneme SonuçlarıKaradeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
![Page 19: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/19.jpg)
F. tularensis sușlarının tiplendirilmesi
Klinik özellikleri ve mortalite oranları farklı olması, biyoteror etkeni olma potansiyeli nedeniyle alttür ayırımı önemlidir.Alttür ayırımında kullanılan yöntemler◦ RNA helikazı kodlayan gen◦ Insersiyon sekans (ISFtu2);
alttür holarctica 1248bp,alttür tularensis 390bp
◦ pdpD gen varlığı (alttür tularensis)
![Page 20: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/20.jpg)
Svensson et al. J Bacteriol 2005;187(11):3903-8
![Page 21: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/21.jpg)
Sușların tanımlanmasında kullanılan yöntemler
Farlow et al 2001, Johansson et al 2001, 2004
![Page 22: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/22.jpg)
Multi locus variable number tandem repeats
F. tularensis genomundaki 25-50 sayıda farklı tekrarlar arasındaki farklılığı araștırır.Bu lokusların PCR ile amplifikasyonu yapılır.HerbirVNTR lokusunda tüm izolatlardan elde edilen amplikon büyüklüğü ile ilgili skorlamalaryapılır.VNTR’lerdeki allelik farklılıklara göre izolatlargenetik olarak gruplandırılır (dendogram).
![Page 23: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/23.jpg)
F. tularensis: Proteomiks çalıșmaları
Proteomik analiz sayesinde bakterinin virulansı ve patojenisitesi anlamak amaçlanmaktadır.Bu yöntemle membran proteinlerinin düșük yoğunlukta bulunması tam anlașılamamıștır. Membran proteinlerinin konak parazit ilișkisinde, virulans ve invazyonda önemli rolleri olduğu bilinmektedir.
![Page 24: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/24.jpg)
F. tularensis: Proteomiks çalıșmaları
PH: 5-8, F. tularensis alttür holarctica, Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Araștırma laboratuvarı
![Page 25: Tularemi: Tanı yöntemleri · 2010. 12. 15. · TULAREMİ: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) y. Duyarlı, özgün ve personel için güvenli bir yöntemdir. y. Son yıllarda Real-Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022053123/60ac0a2b819ad91e122c1a96/html5/thumbnails/25.jpg)
Boncuk Karadenizli, 7 yaș