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VICKY GAGNON ÉTUDE DES INTERACTIONS ENTRE LES NERFS SENSORIELS ET LES FOLLICULES PILEUX DANS UN MODÈLE IN VITRO DE PEAU
RECONSTRUITE PAR GÉNIE TISSULAIRE
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
AOÛT 2005 © Vicky Gagnon, 2005
Résumé L’objectif du présent projet était d’optimiser le modèle de peau reconstruite par génie
tissulaire déjà mis au point par notre équipe afin qu’il stimule le processus de régénération
nerveuse après greffe pour améliorer la récupération tactile des grands brûlés. Nous avons
utilisé des follicules pileux murins et des neurones sensoriels extraits des ganglions de la
racine dorsale de fœtus de souris et avons posé comme hypothèse que les poils avaient une
influence positive sur la migration axonale. Une élongation vigoureuse des neurites a été
détectée à l’intérieur du derme reconstruit. En présence de cellules épithéliales, il y a eu une
migration préférentielle des axones vers les follicules pileux immatures implantés dans le
modèle, migration qui a été suivie d’une association étroite des axones et des follicules
pileux. Nous avons donc développé avec succès un modèle nous permettant d’étudier les
effets de l’épiderme et des follicules pileux sur la croissance des nerfs.
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Avant-Propos Je tiens d’abord à remercier le Dr François Auger pour m’avoir accueillie au Laboratoire
d’Organogénèse Expérimentale (LOEX). Un merci particulier aussi à mon directeur de
recherche, le Dr François Berthod, pour m’avoir donné la chance de me joindre à l’équipe
du LOEX afin d’y effectuer ma maîtrise, et pour m’avoir permis de travailler sur un projet
de recherche passionnant. Je souligne également la grande disponibilité dont il fait preuve
envers tous les membres de son équipe, encadrement qui fut grandement apprécié!
Je remercie également les autres membres de « Berthod et al. », notamment Marie-France
Champigny pour avoir répondu à mes mille et une questions, Marie Gingras pour son
éternel positivisme et toutes ses connaissances scientifiques et Sara Belmonte pour son
soutien et son aide.
Un gros merci à Danielle Larouche et à Kristine Cuffley pour toute leur expertise au niveau
des follicules pileux et des feuillets, ainsi qu’à Anne-Marie Moisan pour tous les mercredi-
DRG-9h. Merci enfin à Alexandre Deschambeault pour son aide au niveau des
présentations, des photos et des affiches, pour son encouragement constant et ses conseils,
et enfin, pour la patience dont il fait preuve au travail comme à la maison…
À tous les membres de « Berthod et al. »…
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Table des matières Résumé.................................................................................................................................. ii
Avant-Propos....................................................................................................................... iii
Table des matières ................................................................................................................v
Liste des figures et des tableaux ....................................................................................... vii
Liste des abréviations ....................................................................................................... viii
Chapitre 1. Introduction..........................................................................................................1 1.1 Peau normale humaine..................................................................................................2
1.1.1 Épiderme................................................................................................................3 1.1.2 Derme.....................................................................................................................4 1.1.3 Hypoderme.............................................................................................................5 1.1.4 Annexes cutanées...................................................................................................6
1.1.4.1 Follicules pileux..............................................................................................6 1.1.4.2 Structure des follicules pileux.........................................................................7 1.1.4.3 Distribution et croissance des poils ................................................................9 1.1.4.4 Développement des follicules pileux............................................................10
1.1.5 Particularités de la peau murine...........................................................................12 1.2 Filaments intermédiaires.............................................................................................13
1.2.1 Kératines ..............................................................................................................13 1.2.2 Neurofilaments.....................................................................................................14
1.3 Système nerveux périphérique cutané ........................................................................15 1.3.1 Innervation cutanée..............................................................................................16 1.3.2 Régénération nerveuse périphérique....................................................................18 1.3.3 Rôles trophiques des nerfs périphériques ............................................................20
1.3.3.1 Neurotrophines..............................................................................................21 1.3.3.2 Neuropeptides ...............................................................................................22
1.3.4 Revue de littérature sur les connaissances actuelles concernant la réinnervation de peaux greffées ..........................................................................................................23 1.3.5 Revue de littérature sur les modèles in vitro pour l’étude de la régénération nerveuse ........................................................................................................................24
1.4 Problématique et objectifs ..........................................................................................24 1.4.1 Intérêt clinique .....................................................................................................24 1.4.2 Intérêt fondamental ..............................................................................................26
Chapitre 2. Matériel et méthodes..........................................................................................28 2.1 Culture cellulaire.........................................................................................................29
2.1.1 Fibroblastes..........................................................................................................29 2.1.2 Follicules pileux immatures et kératinocytes murins ..........................................29
2.2 Préparation du biopolymère de collagène/chitosane ..................................................31 2.3 Préparation des feuillets dermiques ............................................................................33 2.4 Extraction des neurones sensoriels .............................................................................34 2.5 Ensemencement des peaux reconstruites....................................................................34
2.5.1 Ensemencement des éponges de collagène..........................................................34 2.5.2 Ensemencement des feuillets dermiques .............................................................36
vi
2.6 Procédure pour la greffe des peaux reconstruites .......................................................37 2.7 Histologie....................................................................................................................39 2.8 Marquages en immunofluorescence indirecte ............................................................39
Chapitre 3. Résultats .............................................................................................................41 3.1 Peau normale de souris ...............................................................................................42 3.2 Éponges de collagène..................................................................................................44
3.2.1 Modèle 1 ..............................................................................................................44 3.2.2 Modèle 2 ..............................................................................................................48 3.2.3 Modèle 3 ..............................................................................................................50 3.2.4 Colonisation de l’éponge par les fibroblastes ......................................................53
3.3 Feuillets dermiques .....................................................................................................55 3.4 Greffe de peaux reconstruites .....................................................................................58
3.4.1 Feuillets dermiques ..............................................................................................58 3.4.2 Éponges de collagène...........................................................................................60
Chapitre 4. Discussion ..........................................................................................................62 4.1 Éponges de collagène..................................................................................................64 4.2 Feuillets dermiques .....................................................................................................68 4.3 Greffe chez la souris athymique .................................................................................69 4.4 Contributions aux connaissances actuelles .................................................................70 4.5 Perspectives ................................................................................................................71
Chapitre 5. Conclusion .........................................................................................................73 Chapitre 6. Bibliographie......................................................................................................75
Liste des figures et des tableaux Figure 1. La peau normale humaine .......................................................................................2 Figure 2. Différenciation de la peau .......................................................................................4 Figure 3. Schéma des différents degrés de brûlure de la peau................................................7 Figure 4. Structure des poils ...................................................................................................8 Figure 5. Le cycle du poil .....................................................................................................10 Figure 6. La morphogenèse des poils ...................................................................................12 Figure 7. Structure des neurones...........................................................................................16 Figure 8. Innervation de la peau ...........................................................................................18 Figure 9. Dégénérescence wallérienne .................................................................................20 Figure 10. Extraction des FPI et des kératinocytes murins...................................................31 Figure 11. Préparation du biopolymère de collagène/chitosane ...........................................32 Figure 12. Éponges de collagène ..........................................................................................33 Figure 13. Visualisation de la structure de l’éponge en microscopie électronique ..............33 Figure 14. Extraction des DRG.............................................................................................34 Figure 15. Ensemencement des éponges de collagène .........................................................36 Figure 16. Préparation des feuillets dermiques par la méthode d’autoassemblage ..............37 Figure 17. Greffe chez la souris athymique..........................................................................38 Figure 18. Principe de l’immunofluorescence......................................................................40 Figure 19. Aspect histologique de la peau normale de souris ..............................................43 Figure 20. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des
neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1)...................................................45 Figure 21. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des
neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1)...................................................47 Figure 22 : Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des
neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 2)...................................................49 Figure 23. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et
des neurones (modèle 3) ...............................................................................................51 Figure 24. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et des
neurones (modèle 3)......................................................................................................52 Figure 25. Aspect histologique de l’éponge pleine épaisseur ensemencée avec des
fibroblastes, des neurones et des FPI ou des kératinocytes ..........................................54 Figure 26. Aspect histologique des feuillets dermiques ensemencés avec des neurones et
des FPI ou des kératinocytes.........................................................................................56 Figure 27. Innervation dans les feuillets dermiques en présence ou non de cellules
épithéliales ....................................................................................................................57 Figure 28. Greffe de feuillets ensemencés de FPI chez la souris athymique........................58 Figure 29. Immunomarquages des feuillets dermiques ensemencés de FPI ou de
kératinocytes et greffés chez la souris athymique ........................................................59 Figure 30. Greffe d’éponges ensemencées de FPI chez la souris athymique .......................60 Figure 31. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes et des FPI et
greffée chez la souris athymique ..................................................................................61
Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés .................................................................................40
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Liste des abréviations BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor (Facteur Neurotrophique
Dérivé du Cerveau)
BSA Bovine Serum Albumin (Albumine Sérique Bovine)
CE Cellule Endothéliale
CGRP Calcitonin-Gene-Related Peptide (Peptide Dérivé du Gène de la Calcitonine)
DRG Dorsal Root Ganglia (Ganglion de la Racine Dorsale)
EGF Epidermal Growth Factor (Facteur de Croissance Épidermique)
FPI Follicule Pileux Immature
GFE Gaine Folliculaire Externe
GFI Gaine Folliculaire Interne
K14 Kératine 14
L1 CAM Cell Adhesion Molecule L1 (Molécule d’Adhérence Cellulaire L1)
MEC Matrice Extracellulaire
NCAM Neural Cell Adhesion Molecule (Molécule d’Adhérence Cellulaire Neuronale)
NF Neurofilament
NGF Nerve Growth Factor (Facteur de Croissance Neuronal)
NKA Neurokinine A
NP Neuropeptide
NT Neurotrophine
PBS Phosphate Buffer Saline (Tampon Saline Phosphate)
p75NTR p75 Neurotrophin Receptor (Récepteur à Neurotrophine p75)
SNC Système Nerveux Central
SNP Système Nerveux Périphérique
SP Substance P
SVF Sérum de Veau Fœtal
TM Trichrome de Masson
TrK Tyrosine Kinase
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (Facteur de Croissance de l'Endothélium
Vasculaire)
VIP Vasoactive Intestinal Polypeptide (Peptide Intestinal Vasoactif)
Chapitre 1
Introduction
2
1.1 Peau normale humaine Plus qu’une simple enveloppe, la peau est un organe à part entière qui recouvre
complètement le corps et qui possède une superficie variant entre 1,5 et 2 m2 (Wysocki,
1999). Selon la région du corps et les conditions auxquelles la peau est soumise, son
épaisseur varie de 1,5 à 4 mm (Marieb, 1993). Elle représente donc le plus gros organe du
corps, soit environ 16% du poids corporel (Wysocki, 1999). La peau est formée de deux
tissus distincts, soit l’épiderme et le derme, solidement soudés l’un à l’autre par
l’intermédiaire de la membrane basilaire, le tout supporté par l’hypoderme (figure 1)
(Holbrook, 1987).
La peau assure plusieurs fonctions essentielles. Véritable interface avec le monde extérieur,
elle protège les autres organes en dressant au moins trois types de barrières entre l’individu
et l’environnement externe : une barrière chimique, physique et biologique (Marieb, 1993).
Elle joue aussi un rôle au niveau de l’excrétion des déchets, de la régulation de la
température corporelle, de la perception tactile et de la synthèse de la vitamine D (Blank,
1987; Wysocki, 1999). Elle est enfin un important réservoir sanguin.
Figure 1. La peau normale humaine La peau normale humaine est composée de l’épiderme et du derme;
l’hypoderme est le tissu sous-jacent au derme (modifié de (Geras, 1990)).
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1.1.1 Épiderme Dérivé de l’ectoderme embryonnaire, l’épiderme, couche externe de la peau, est formé d’un
épais épithélium pavimenteux stratifié kératinisé dont l’épaisseur varie entre
0,04 et 1,5 mm (Holbrook, 1987). Composé de cellules épithéliales, il est la principale
structure protectrice du corps. L’épiderme est constitué à 90% de kératinocytes, lesquels
sont constitués principalement de kératines, protéines fibreuses et insolubles dans l’eau,
conférant aux cellules de l’épiderme leurs propriétés protectrices (Marieb, 1993; Wysocki,
1999). Trois autres types cellulaires, soit les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les
cellules de Merkel, cohabitent dans l’épiderme (Holbrook, 1987). Chacun d’eux possède
des fonctions spécifiques et non moins indispensables. Les mélanocytes ont pour fonction
de synthétiser la mélanine, pigment contribuant à la couleur de la peau et protégeant les
kératinocytes de la couche basale de l’épiderme des rayons ultra-violets (Lanza, 1997). Les
cellules de Langerhans constituent quant à elles des éléments essentiels du système de
défense de l’organisme. Enfin, les cellules de Merkel jouent un rôle de mécanorécepteur et
sont impliquées dans la fonction du toucher. L’épiderme n’est pas vascularisé et il dépend
donc des capillaires du derme pour l’alimenter en oxygène et autres nutriments (Wysocki,
1999).
L’épiderme de la peau épaisse se compose de cinq couches distinctes qui, de la plus
profonde à la plus superficielle, sont les suivantes : la couche basale (ou stratum
germinativum), la couche épineuse (ou stratum spinosum), la couche granuleuse (ou
stratum granulosum), la couche de transition (couche claire ou stratum lucidum) et la
couche cornée (ou stratum corneum) (figure 2) (Holbrook, 1987; Marieb, 1993; Wysocki,
1999). La peau fine ne contient quant à elle pas de couche claire. Au cours de leur
progression de la couche basale vers la couche cornée, les kératinocytes passent par les
différentes étapes du processus de différenciation terminale. Cette maturation prend en
moyenne 28 jours et permet à l’épiderme de se renouveler continuellement.
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Figure 2. Différenciation de la peau L’épiderme est constitué de plusieurs couches cellulaires qui, de la plus
profonde à la plus superficielle, sont les suivantes : la couche basale, la couche
épineuse, la couche granuleuse, la couche de transition (seulement dans la
peau épaisse) et la couche cornée (modifié de (Geras, 1990)).
1.1.2 Derme Le derme, adhérant fortement à l’épiderme par l’intermédiaire de la membrane basilaire, est
un tissu conjonctif de soutien constituant la partie la plus profonde de la peau et qui
provient du mésoderme embryonnaire (Holbrook, 1987). Son épaisseur varie entre
2 et 4 mm (Wysocki, 1999). Les fibroblastes sont les principales cellules du derme. Ils sont
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spécialisés dans la synthèse de plusieurs types de fibres protéiques : les fibres de collagène,
les fibres du système élastique dont l’élastine, les glycoprotéines et les protéoglycanes
(Holbrook, 1987; Lanza, 1997). Toutes ces protéines forment un réseau fibreux
macromoléculaire appelé matrice extracellulaire (MEC). Les fibres de collagène confèrent
au derme sa résistance aux tractions, les fibres du système élastique lui donnent ses
propriétés élastiques et les protéoglycanes sont responsables de sa résistance à la
compression (Holbrook, 1987; Marieb, 1993). Il est également à noter que les principaux
types de collagène retrouvés dans le derme sont les collagènes fibrillaires de types I et III
(Holbrook, 1987). Le collagène de type I représente environ 80% du collagène présent dans
le derme, l’autre 20% étant principalement composé de collagène de type III (Wysocki,
1999). D’autres cellules sont également présentes dans le derme, soit des macrophages, des
lymphocytes et des mastocytes (Holbrook, 1987; Lanza, 1997). À la différence de
l’épiderme, le derme est vascularisé, ce qui lui permet non seulement d’apporter à
l’épiderme énergie et nutriments, mais aussi de jouer un rôle primordial dans la
thermorégulation et la cicatrisation. Il est également pourvu d’un important réseau de
terminaisons nerveuses, de glandes sébacées et sudoripares, ainsi que de follicules pileux,
bien que ces derniers proviennent de l’épiderme. Le derme se compose de deux zones de
tissu conjonctif dense, soit le derme papillaire (superficiel) et le derme réticulaire (profond)
(Holbrook, 1987; Wysocki, 1999).
1.1.3 Hypoderme L’hypoderme, aussi appelé fascia superficiel, représente le tissu adipeux sous-cutané et il
est constitué de tissu conjonctif lâche (Wysocki, 1999). Bien qu’il ne fasse pas
véritablement partie de la peau, l’hypoderme est en interaction fonctionnelle avec la peau et
il lui permet ainsi d’assurer certaines de ses fonctions de protection (Marieb, 1993). Il
s’invagine dans le derme et y est rattaché par des fibres de collagène et d’élastine. Il est
essentiellement constitué d’adipocytes, un type de cellules spécialisées dans l’accumulation
et le stockage des graisses (Holbrook, 1987). L’hypoderme joue donc un rôle de réserve
énergétique. L’hypoderme participe également à la thermorégulation, la graisse étant un
isolant thermique (Holbrook, 1987).
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1.1.4 Annexes cutanées Les annexes cutanées, des structures réparties dans le derme et l’épiderme, interviennent
dans le maintien de l’homéostasie de la peau. Ces structures sont les poils, les ongles, et
deux types de glandes exocrines, les glandes sudoripares et sébacées (Marieb, 1993). Seuls
les poils seront discutés étant donné leur intérêt dans le cadre de cette étude.
1.1.4.1 Follicules pileux Bien que ces tout petits organes ne soient responsables d’aucune fonction vitale chez
l’humain, les poils confèrent plusieurs fonctions importantes aux mammifères comme par
exemple de maintenir la température corporelle et de fournir des sensations tactiles (Ebling,
1987). Diverses conditions sont associées à un défaut au niveau des poils, par exemple
l’hirsutisme (excès de poils survenant à la suite d’un dérèglement hormonal) ainsi que
l’alopécie (absence de poil survenant également à la suite d’un dérèglement hormonal, mais
pouvant aussi être causée par des mutations dans certains gènes) (Marieb, 1993).
Les follicules pileux sont également d’importants réservoirs de cellules souches pouvant
régénérer l’épiderme et ils jouent donc probablement un rôle important dans la guérison des
plaies (Morasso, 2005). Les plaies du premier degré n’affectent que l’épiderme (figure 3)
(Marieb, 1993). Il n’y a pas destruction des follicules pileux et la réépithélialisation,
processus par lequel les kératinocytes migrent pour couvrir la plaie, se fait par foyers
multiples à partir des poils. Dans le cas d’une brûlure au second degré, une portion saine du
derme et des annexes cutanées persiste (figure 3), et la réépithélialisation s’effectue à partir
de ces annexes (Marieb, 1993). Les plaies du troisième degré se caractérisent quant à elles
par la destruction complète de l’épiderme et du derme (figure 3) (Marieb, 1993). Puisque
les annexes cutanées et l’épiderme sont détruits, la réépithélialisation se fait à partir des
marges de la plaie plutôt qu’en foyers multiples à partir des follicules pileux, comme c’est
le cas dans les plaies du second degré. La qualité de la cicatrisation est donc affectée chez
les personnes ayant subi une destruction de leurs follicules pileux.
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Figure 3. Schéma des différents degrés de brûlure de la peau Une brûlure du premier degré affecte uniquement l’épiderme, alors qu’une
brûlure du second degré atteint le derme à un niveau variable (superficiel ou
profond). Dans une brûlure du troisième degré, l’épiderme et le derme sont
complètement détruits (François Berthod, LOEX).
1.1.4.2 Structure des follicules pileux Le poil, structure produite par le follicule pileux et constituée de cellules kératinisées, est
implanté obliquement dans le derme par invagination de l’épiderme (figure 4) (Marieb,
1993). Les principales parties du poil sont la tige, partie visible à la surface du tégument, et
la racine, partie invisible enchâssée dans le derme dont l’extrémité en cupule (le bulbe
pileux) reçoit la papille vasculaire nourricière (papille dermique) (Marieb, 1993). Le bulbe
pileux est entouré d’un enchevêtrement de terminaisons nerveuses sensitives s’enroulant
autour de chaque follicule et appelées plexus de la racine du poil (Marieb, 1993). Les poils
sont donc également des récepteurs sensoriels du toucher. La papille dermique est quant à
elle composée de tissu dermique et est vascularisée par des capillaires qui apportent aux
cellules du follicule pileux les nutriments essentiels à sa croissance (Marieb, 1993). Le poil
comporte aussi des annexes : une glande sébacée, l’ensemble formant l’unité pilo-sébacée,
et le muscle arrecteur, dont la contraction, sous l’influence du froid ou d’une émotion, est à
l’origine du phénomène de la « chair de poule ». Observée en coupe longitudinale, l’unité
pilo-sébacée du follicule se divise en plusieurs compartiments : l’infundibulum (portion
superficielle au-dessus du conduit de la glande sébacée en continuité avec l’épiderme
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interfolliculaire), l’isthmus (courte portion entre le conduit de la glande sébacée et la
protubérance du muscle arrecteur), le renflement où s’attache le muscle arrecteur du poil, et
le segment inférieur se terminant par le bulbe pileux (Moll, 1994; Luelmo-Aguilar, 2004).
Durant le développement des follicules pileux, les mélanocytes provenant de la crête
neurale migrent dans le poil, se différencient et produisent la mélanine. Ce pigment est
ensuite transmis des mélanocytes aux kératinocytes de la tige du poil, ce qui détermine la
couleur du poil (Botchkarev, 2003).
Figure 4. Structure des poils Le follicules pileux et la glande sébacée forme l’appareil pilo-sébacé (modifié
de (Geras, 1990)).
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1.1.4.3 Distribution et croissance des poils On divise généralement les poils en deux catégories : le duvet et les poils adultes. Le duvet,
fin et pâle, est celui que l’on retrouve habituellement chez les enfants et au niveau de
certains sites anatomiques des femmes adultes. Les poils adultes, plus épais, longs et
foncés, forment les sourcils et les cheveux. À la puberté, ils apparaissent aux aisselles, au
pubis, et chez les hommes, sur le visage, la poitrine, les bras et les jambes. Seules certaines
régions sont complètement dépourvues de poils : les lèvres, les mamelons, certaines parties
des organes génitaux externes, la paume des mains et la plante des pieds (Marieb, 1993).
Le follicule passe par plusieurs cycles de croissance au cours desquels chaque poil subit
trois phases successives (figure 5). En fait, c’est la portion inférieur du follicule pileux qui
subit le plus de transformations lors de ces cycles de croissance. Il y a d’abord la phase
anagène qui est la phase de croissance au cours de laquelle le poil croît de façon continue et
qui est caractérisée par une intense activité mitotique dans le bulbe vascularisé (Stenn,
2001). Les cellules de la matrice prolifèrent et se différencient donc pour former la gaine
folliculaire interne (GFI) et la tige du poil. La vitesse de croissance du poil est d’environ
0,25 à 0,50 mm/jour; elle varie en fonction de nombreux facteurs, mais diffère peu d’une
région à l’autre du corps. En revanche, la durée de la phase de croissance, facteur
déterminant la longueur moyenne des poils dans une zone déterminée, est très variable
selon la région du corps. La phase de croissance active est suivie d’une phase de transition
qui dure environ deux semaines durant lesquelles les mitoses s’arrêtent brutalement : c’est
la phase catagène (Stenn, 2001). Pendant cette phase, les deux tiers inférieurs du poil
entrent en mort cellulaire programmée; il y alors régression et raccourcissement du poil
(Weedon, 1981; Fuchs, 2001; Stenn, 2001). La phase de repos, période pendant laquelle la
matrice est inactive et le follicule s’atrophie, est appelée phase télogène et elle dure environ
trois mois (Stenn, 2001). Après la phase de repos, la matrice se réactive et forme un
nouveau poil qui remplacera celui qui est tombé ou qui le délogera s’il est encore présent.
Au moment où le poil entre dans un nouveau cycle de croissance, les cellules souches
épithéliales du follicule sont stimulées afin qu’elles se divisent grâce à un signal provenant
de la papille dermique (Fuchs, 2001).
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Figure 5. Le cycle du poil La croissance du poil est cyclique et se déroule en trois phases : anagène
(croissance), catagène (régression) et télogène (repos) (tiré de (Fuchs, 2001)).
1.1.4.4 Développement des follicules pileux L’initiation du développement des follicules pileux chez les mammifères est contrôlée par
une série d’interactions réciproques entre l’épithélium et le mésenchyme (figure 6) (Hardy,
1992; Millar, 2002). Le premier signe visible de la formation des poils est la présence d’une
placode. Celle-ci est formée à la suite d’un épaississement de l’ectoderme embryonnaire
induit par ce qu’on appelle le « premier signal » provenant du mésenchyme sous-jacent
(Hardy, 1992; Millar, 2002). La formation de la placode implique un changement au niveau
de la forme des cellules épithéliales qui deviennent alors plus allongées que les cellules
adjacentes ne faisant pas partie de la placode. Un signal provenant de la placode provoque
par la suite une condensation des cellules du mésenchyme. Ensuite, ce qu’on appelle
« le deuxième signal » qui provient du mésoderme induit quant à lui la prolifération des
cellules épithéliales de la placode qui vont alors croître vers l’intérieur du mésenchyme,
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formant ainsi la matrice germinale qui est à l’origine même du poil (Millar, 2002). En effet,
en proliférant, les cellules de la matrice repoussent les cellules superficielles vers
l’extérieur, soit dans la dépression produite par l’invagination tubulaire de l’épiderme qui
s’enfonce dans le derme. Cette invagination épidermique, constituant la gaine épithéliale du
poil, se renfle à son extrémité profonde et constitue là un amas de cellules matricielles
coiffant une papille de tissu conjonctif vascularisé. Cette papille dermique est formée par
les cellules épithéliales qui entourent le condensa de cellules mésodermiques et elle
représente une structure permanente à la base des follicules qui contrôle la croissance et la
différenciation des poils (Millar, 2002).
Une fois la structure primaire du poil établie, la différenciation des couches concentriques
de kératinocytes peut commencer (Kulessa, 2000). En effet, les cellules épithéliales
contenues dans la matrice du poil recouvrent la papille, se divisent par mitose et donnent
des cellules qui se remplissent de kératines et qui permettent l’allongement du poil grâce à
l’addition à sa base d’autres cellules qui vont elles aussi se kératiniser. Ce sont des signaux
chimiques en provenance de la papille dermique qui stimulent la division des cellules
épithéliales de la matrice. Au fur et à mesure que la matrice produit de nouvelles cellules, la
partie la plus ancienne du poil est poussée vers le haut; ces cellules deviennent de plus en
plus kératinisées et meurent. La couche en périphérie forme ainsi la gaine folliculaire
externe (GFE) qui est en continuité avec la couche basale de l’épiderme (Kulessa, 2000;
Fuchs, 2001). À l’intérieur même du poil, deux autres couches se développent à partir des
cellules de la matrice entourant la papille dermique, soit la gaine folliculaire interne
(couche de Henley, couche de Huxley et cuticule de la gaine) et la tige du poil qui se
compose presque totalement de kératines dures (Kulessa, 2000; Fuchs, 2001). Les cellules
épithéliales finissent par arrêter de se diviser et elles se différencient selon leur
emplacement dans le follicule (Botchkarev, 2003). Les cellules proches de la GFE forment
la GFI alors que les cellules localisées au centre donnent la tige du poil qui se compose de
la medulla au centre, du cortex et de la cuticule vers l’extérieur (Kulessa, 2000;
Botchkarev, 2003).
12
Figure 6. La morphogenèse des poils Séquence d’évènements menant à la formation des follicules pileux (modifié de
(Millar, 2002)).
1.1.5 Particularités de la peau murine Comme la plupart des expériences effectuées lors de cette étude ont été réalisées avec des
cellules murines ainsi qu’avec des modèles murins, il importe de préciser quelques
particularités de la peau murine par rapport à la peau humaine décrite précédemment. Bien
que les deux types de peau soient semblables au niveau histologique, il existe bien sûr de
nombreuses distinctions.
La différence majeure est évidemment la grande densité de follicules pileux qui recouvrent
la souris. L’épiderme interfolliculaire est en effet pratiquement inexistant. De plus, les
souris possèdent certains types de poils qu’on ne retrouve pas chez l’humain, comme par
exemple les vibrisses. Les poils murins ont également un cycle de vie différent de celui des
humains. En effet, la plupart des follicules pileux murins adultes demeurent dans la phase
télogène pour de longues périodes, ce qui explique le fait que la longueur des poils est
constante chez les souris adultes alors que chez les humains, les poils poussent
continuellement. L’épiderme murin est aussi très mince et ne possède que quelques couches
13
de cellules vivantes, soit 2 à 3 couches, comparativement à 10 à 15 chez l’humain. Les
souris sont également dépourvues de glandes apocrines (Sundberg, 1996). Les dômes
tactiles contenant les cellules de Merkel sont toutefois beaucoup plus nombreux chez les
souris que chez les humains et leur distribution est aussi différente. En effet, contrairement
à ce qui est retrouvé dans la peau humaine, les cellules de Merkel sont toujours absentes de
l’épithélium des poils de souris (Moll, 1996). On les retrouve plutôt au niveau de la GFE
des vibrisses ainsi que dans les coussinets plantaires (Moll, 1996).
Bien que l’utilisation de souris en tant que modèle animal présente plusieurs avantages, il
est important de demeurer conscient des nombreuses différences existant entre les deux
espèces. La prudence est de mise dans l’interprétation des résultats obtenus chez la souris;
ces derniers ne peuvent pas toujours être extrapolés à l’humain.
1.2 Filaments intermédiaires Les trois catégories de fibres cytosquelettiques qui ont pour rôle de maintenir l’intégrité et
la structure cellulaire dans les cellules eucaryotes sont les microfilaments d’actine, les
microtubules et les filaments intermédiaires (Omary, 2002). Ces derniers tirent leur nom du
fait que leur taille (10 nm) est intermédiaire entre la taille des microtubules (24 nm) et celle
des microfilaments (7 nm) (Lee, 1993). Contrairement au rôle moteur des microtubules, le
rôle des filaments intermédiaires est surtout structural car on ne les a jamais vus intervenir
directement (Lodish, 1997). Ils servent donc à renforcer les membranes de la cellule au
moment des déformations subies lors des mouvements cellulaires. Chez les vertébrés
supérieurs, les filaments intermédiaires comprennent une superfamille de protéines
essentiellement α-hélicoïdales, divisée en cinq groupes principaux (types I à V) basés sur
leurs caractéristiques structurales (Lodish, 1997; Omary, 2002). Dans le cadre de cette
étude, un intérêt particulier fut porté aux filaments intermédiaires de types I, II et IV.
1.2.1 Kératines Les plus grands sous-groupes de filaments intermédiaires sont les kératines de types I et II
qui incluent entre autres les kératines spécifiques aux cellules épithéliales, soit les
kératines 9 à 20 (K9-K20, type I) et les kératines 1 à 8 (K1-K8, type II) (Coulombe, 2002;
14
Ku, 2004). Toutes les cellules épithéliales expriment au moins une combinaison de
kératines de type I (kératines acides) et de type II (kératines basiques). Les kératines sont en
effet des hétérodimères obligés formés d’un mélange, dans le rapport 1/1, de chaînes
polypeptidiques basiques et acides (Coulombe, 1993; Omary, 2002; Ku, 2004). Un seul
type ne forme donc pas à lui seul de filament de kératines. Exprimés de façon typique dans
les cellules épithéliales, les filaments intermédiaires de kératines sont habituellement
connectés aux desmosomes et aux hémidesmosomes qui représentent respectivement les
endroits par lesquels une cellule s’accroche à sa voisine ou à la matrice (Lodish, 1997).
L’expression des kératines est caractéristique non seulement du type de tissu mais aussi
d’un stade de différenciation donné, ce qui en font des marqueurs de choix pour distinguer
différentes sous-populations cellulaires (Moll, 1982). Lors de cette étude, quelques
marquages à la kératine 14 (K14; 50 kDa) ont été effectués. Il est à noter que celle-ci se
retrouve en paire avec la kératine 5 (K5; 58 kDa) et que l’ensemble K5/K14 est exprimé
dans les kératinocytes des couches basales des épithéliums stratifiés et des follicules pileux
humains et murins (Freedberg, 1987). À 24 semaines de gestation, les K5 et K14 sont des
composants majeurs de l’épiderme pluristratifié (Moll, 1982).
1.2.2 Neurofilaments Les neurofilaments, des filaments intermédiaires de type IV, constituent l’un des principaux
éléments du cytosquelette des cellules nerveuses. On les retrouve au niveau des neurones
centraux et périphériques matures. Les neurofilaments sont formés par la co-polymérisation
de trois protéines de la famille des filaments intermédiaires appelées NF-L, NF-M et NF-H
respectivement de poids moléculaires apparent de 68, de 150 et de 200 kDa (L, M et H
représentant respectivement des classes de masse peu, moyennement et très élevée)
(Steinert, 1988; Betts, 1997; Lodish, 1997). Aucune de ces sous-unités n’est capable de
s’assembler en filaments en l’absence des deux autres. Les neurofilaments représentent
donc des marqueurs de choix pour détecter la présence de prolongements axonaux dans la
peau.
15
1.3 Système nerveux périphérique cutané Les nerfs qui transmettent les messages moteurs et sensitifs entre le système nerveux
central (SNC) et le reste de l’organisme font partie du système nerveux périphérique (SNP).
Le SNP comprend en fait deux ensembles distincts de cellules. Il y a d’abord le système
nerveux sensitif qui se compose de neurones qui acheminent les stimulis nociceptifs
(douleur, chaleur, perception tactile) qui proviennent du milieu externe vers le SNC
(Campbell, 1995). Le système nerveux moteur conduit quant à lui l’information en
provenance du SNC vers les cellules effectrices (Campbell, 1995). La voie motrice
comprend entre autres le système nerveux autonome, aussi appelé système nerveux
involontaire, qui comprend quant à lui le système nerveux sympathique. Ce dernier relie le
SNC aux muscles lisses et aux glandes des viscères ainsi qu’aux vaisseaux et à la peau
(Purves, 1999).
Par ses fonctions sensorielles, la peau est une source primordiale d’informations pour
l’individu. Les nerfs périphériques sont responsables de l’innervation de la peau et ils
possèdent des axones dont les corps cellulaires se trouvent le long de la moelle épinière
(Lanza, 1997). En plus des axones, les neurones possèdent un autre type de prolongement,
soit des dendrites. Ces dernières, qui sont nombreuses et très ramifiées chez la plupart des
neurones (neurones moteurs et interneurones), ont pour fonction d’acheminer divers
signaux vers le corps du neurone (figure 7A) (Campbell, 1995). En ce qui a trait aux
neurones sensitifs de la peau, un prolongement émerge du corps cellulaire et forme un
prolongement central et un prolongement périphérique qui, à eux deux, constituent l’axone
(figure 7B) (Marieb, 1993). Seules les terminaisons distales du prolongement périphérique
sont des dendrites. Les corps cellulaires des neurones sensoriels sont localisés dans les
ganglions de la racine dorsale (DRG) adjacents à la moelle épinière (Lanza, 1997). Ces
différents neurones transmettent les influx (potentiel d’action) des récepteurs sensoriels de
la peau ou des organes internes vers le SNC où s’effectue l’analyse des informations
sensorielles. Les neurones moteurs et sensoriels sont uniques entre autres à cause du
processus d’élongation axonale qui peut atteindre jusqu’à 1 mètre et plus de longueur. Les
axones sont entourés par les cellules de Schwann, lesquelles fournissent un support
16
structural et chimique à tous les neurones du SNP en plus d’accroître la conductivité via la
gaine de myéline (Lanza, 1997).
Figure 7. Structure des neurones Les neurones moteurs et les interneurones possèdent de nombreux
prolongements émergeant du corps cellulaire : un grand nombre de dendrites
et un seul axone (A). Les neurones sensitifs de la peau contiennent un
prolongement unique qui émerge du corps cellulaire et qui constitue l’axone
(B) (tiré de (Marieb, 1993)).
1.3.1 Innervation cutanée L’innervation cutanée comprend entre autres des fibres nerveuses sensitives et autonomes
sympathiques. On distingue cinq types de structures spécialisées qui fonctionnent comme
récepteurs du toucher, de la douleur, de la température, de la démangeaison et des
17
stimulations mécaniques (figure 8) (Holbrook, 1987). Il y a d’abord les terminaisons
nerveuses libres superficielles qui sont des fibres sensitives seules qui pénètrent jusqu’à
l’intérieur de l’épiderme. Elles sont sans aucun doute les récepteurs sensoriels les plus
répandus et les plus importants du corps humain (Holbrook, 1987). D’autres de ces fibres
se situent sous les glandes sébacées et tout autour de la racine du poil : c’est le plexus de la
racine du follicule pileux (Marieb, 1993). Ces récepteurs sont sensibles aux mouvements
des poils. Les autres fibres nerveuses sont quant à elles associées à des récepteurs cutanés
(ou corpuscules sensoriels) dont il existe plusieurs formes (Johnson, 2001). On retrouve
d’abord les corpuscules de Meissner qui sont situés dans les papilles du derme de la peau
glabre et qui détectent les contacts légers. Puis il y a les corpuscules de Pacini qui sont plus
volumineux et qui sont présents dans le derme profond et dans les tissus conjonctifs sous-
cutanés. Ils réagissent quant à eux rapidement aux pressions intenses. Juste sous l’épiderme
se trouvent les corpuscules de Rufini qui détectent les pressions intenses et l’étirement.
Enfin, il y a les dômes tactiles de Merkel qui sont formés par l’association d’un groupe de
cellules de Merkel et d’une terminaison nerveuse libre et qui sont des récepteurs
superficiels qui répondent à des pressions localisées.
Il existe également une corrélation entre le développement des follicules pileux et le
développement de l’innervation de la peau. L’équipe du Dr Munger a en effet démontré que
l’innervation cutanée précédait le développement du premier follicule pileux
morphologiquement reconnaissable par au moins deux jours (Munger, 1991). Les fibres
nerveuses approcheraient donc l’endroit exact où les follicules pileux vont se développer
avant même l’initiation du développement des poils (Peters, 2002). Ils ont également
démontré que la formation des différents types de terminaisons nerveuses et la séquence de
leur développement sont dictées par les follicules pileux plutôt que par un signal provenant
des DRG (Munger, 1991).
18
Figure 8. Innervation de la peau L’innervation cutanée comprend différents types de structures spécialisées tels
que les terminaisons nerveuses libres, les corpuscules de Meissner, les
corpuscules de Pacini, les corpuscules de Rufini et les dômes tactiles de
Merkel, qui fonctionnent comme récepteurs du toucher, de la douleur, de la
température, de la démangeaison et des stimulations mécaniques (tiré de
(Tortora, 1994)).
1.3.2 Régénération nerveuse périphérique Le développement du SNP requiert des interactions spécifiques cellules-cellules et cellules-
MEC qui dirigent la migration des axones vers leurs cibles (Gingras, 2003a). Dans des
situations pathologiques, la régénération des nerfs endommagés suit un processus similaire.
Si la lésion survient proche du corps cellulaire, le neurone risque de mourir puisqu’un large
19
segment axonal est perdu (Lanza, 1997). Cependant, lorsque la lésion survient plus en
périphérie, les axones ont plus de chance de se régénérer (Lanza, 1997). La régénération
des nerfs périphériques comprend la formation des bourgeons axonaux, leur élongation,
ainsi que la réinnervation de leurs cibles d’origine (Ide, 1996).
Les extrémités d’un axone périphérique endommagé gonflent rapidement après une lésion à
cause de l’accumulation de substances transportées dans l’axone (Marieb, 1993). Il y a
alors diminution de la production de neurotransmetteurs et augmentation de la production
des substrats nécessaires à la reconstitution de l’axone (Lanza, 1997). La partie de l’axone
et de sa gaine de myéline située en aval de la lésion commence alors à se désintégrer
puisqu’elle ne reçoit plus du corps cellulaire les nutriments et les autres substances qui lui
sont essentielles (Ide, 1996). Ce processus est appelé dégénérescence wallérienne
(figure 9). Des cellules de Schwann et des macrophages migrent par la suite dans la zone du
traumatisme et commencent à phagocyter la myéline en décomposition et les débris de
l’axone (Ide, 1996). Une fois les débris nettoyés, les cellules de Schwann prolifèrent et
forment des cordons cellulaires (band of Büngner) qui guident les repousses de l’axone
(cônes de croissance) en voie de régénération vers leurs points de contact antérieurs
(Marieb, 1993; Ide, 1996). Ces mêmes cellules ont pour fonction de protéger, de soutenir et
de remyéliniser l’axone tout en libérant des facteurs favorisant sa croissance.
Plusieurs protéines exprimées durant la dégénérescence wallérienne stimulent l’élongation
des neurites in vitro, incluant le facteur de croissance neuronale (NGF), le facteur
neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), la molécule d’adhérence cellulaire neuronale
(NCAM) et la molécule d’adhérence cellulaire L1 (L1 CAM), de même qu’un composant
de la MEC, la laminine (Tonge, 1997). Dans le SNP, les cônes de croissance des neurones
en développement et en régénération peuvent s’attacher activement aux molécules de la
MEC comme la laminine, le collagène ou la fibronectine, ce qui facilite l’élongation des
neurites vers leurs propres cibles (Borkenhagen, 1998; Purves, 1999). Les cellules
neuronales ont l’habileté d’interagir avec ces molécules par le biais de la grande famille des
récepteurs aux intégrines.
20
Figure 9. Dégénérescence wallérienne Lorsqu’une fibre nerveuse est sectionnée, la partie séparée du corps cellulaire
dégénère. C'est le phénomène de la dégénérescence wallérienne. Par contre, la
partie encore reliée au corps cellulaire peut régénérer (tiré de (Tortora,
1994)).
1.3.3 Rôles trophiques des nerfs périphériques Les neurones sont, jusqu’à un certain point, dépendants de la présence de leur cible pour
leur maintien en vie. Cette dépendance est qualifiée d’interaction trophique et est fondée
sur des molécules signalétiques spécifiques auxquelles on a donné le nom de facteurs
neurotrophiques. Ceux-ci proviennent des tissus cibles et régulent la survie des neurones
ainsi que leur croissance et leur différenciation ultérieure (Purves, 1999). Bien que les
fibres nerveuses cutanées aient des fonctions sensorielles, elles jouent également un rôle au
niveau de l’inflammation neurogène. Les neurotrophines (NT) et les neuropeptides (NP)
sont reconnus pour être impliqués dans la guérison des plaies et dans la réparation des
tissus (Paus, 1997). Plusieurs suggèrent même qu’elles auraient des effets trophiques. Paus
et al. ont en effet caractérisé les nerfs périphériques comme ayant un rôle trophique dans la
croissance de l’épithélium (Paus, 1997). Étant la structure de la peau la plus innervée, le
follicule pileux représente à ce niveau un modèle de choix pour l’étude de ces effets
neurotrophiques et des interactions neuroépithéliales.
21
1.3.3.1 Neurotrophines L’épithélium de la peau est une source de NT de la famille des facteurs de croissance
neuronale tels que le NGF, le BDNF, la NT3 et la NT4/5 (Paus, 1997). Ces facteurs sont
connus pour leur influence sur la différenciation, le développement et la survie d’une
grande variété de neurones dans le SNP, particulièrement durant le développement
embryonnaire de la peau (Davies, 1987; Di Marco, 1991). Les NT jouent également un rôle
majeur dans la régulation de la croissance neuronale, et particulièrement dans la
régénération à la suite d’une lésion (Kimpinski, 1997). Toutefois, les NT exercent plusieurs
fonctions de croissance et de régulation au-delà du système nerveux (Botchkarev, 1998). En
effet, dans la peau, le NGF contrôle non seulement le développement de l’innervation des
cibles sensorielles et autonomiques, mais stimule aussi la prolifération des kératinocytes
tout en inhibant leur apoptose (Botchkarev, 1999). De plus, les follicules pileux murins
démontrent une expression contrôlée de NT, incluant NGF, BDNF, NT3 et NT4/5, ainsi
que leur récepteur TrkA, TrkB, TrkC (tyrosine kinase A-C) et p75NTR (récepteur à la
neurotrophine p75) (Botchkarev, 2004).
Les NT sont également impliquées dans la morphogenèse des poils (Botchkarev, 1998).
Dans la biologie des poils, les NT représentent une famille de polypeptides structurellement
et fonctionnellement reliés dont les quatre membres (NGF, BDNF, NT3 et NT4/5) ont une
taille d’environ 13 kDa et partagent environ 50% d’homologie de séquence en acides
aminés (Ibanez, 1998; Botchkarev, 2004). Lorsqu’elles s’associent en dimères, les NT
exercent leurs effets biologiques en interagissant avec des récepteurs spécifiques (Ibanez,
1998; Botchkarev, 2004). Les poils sont donc une source périphérique importante de NT. Il
est également à noter qu’en plus d’être une source de NT, les poils sont aussi une cible pour
les NT puisqu’ils expriment des récepteurs aux NT (Paus, 1997).
Il est fort probable que les facteurs de croissance qui gouvernent le développement, le
maintien et l’élongation des axones sont également impliqués dans la morphogenèse de la
peau et dans le développement des appendices de la peau (Botchkarev, 2004). Une série
d’études a démontré que les NT pouvaient être générées localement dans la peau, par
exemple par les cellules gliales (cellules de Schwann), les cellules épithéliales, les
fibroblastes et les cellules de Merkel, et que le NGF et les autres NT sont importants pour
22
une bonne innervation de cet organe sensoriel périphérique (Lewin, 1996; Botchkarev,
2004). En effet, des défectuosités dans la signalisation des NT sont souvent associées à des
anomalies sensorielles sévères de la peau, inhibant ainsi la guérison des plaies (Lambiase,
2000; Botchkarev, 2004). De plus, il y a environ quinze ans, la peau a été identifiée comme
étant une source riche en NGF et l’épiderme a été reconnu comme étant un site
d’expression du NGF (Davies, 1987; Weskamp, 1987). Peu de temps après, il devint clair
que les kératinocytes épidermiques étaient non seulement d’importantes sources de NGF,
mais qu’ils étaient également des cibles pour les NT, du moins en culture (Di Marco, 1991;
Botchkarev, 2004).
1.3.3.2 Neuropeptides Les NP sont un groupe hétérogène de plus de 50 molécules qui jouent un rôle au niveau de
diverses fonctions cutanées et qui sont impliqués dans certaines maladies. Ils servent de
neuromodulateurs, de neurotransmetteurs, de neurohormones et même d’hormones. Dans la
peau, les NP sont synthétisés localement et transportés par des fibres nerveuses ou des
cellules immunitaires (Lotti, 1995). Les fibres nerveuses sensitives contiennent des NP
synthétisés dans le corps cellulaire et qui sont transportés par des vésicules vers les
terminaisons nerveuses périphériques. Plusieurs NP sont exprimés dans les neurones
sensoriels, incluant le peptide dérivé du gène de la calcitonine (CGRP), la neurokinine A
(NKA), la somatostatine, la substance P (SP) et le peptide intestinal vasoactif (VIP) (Lotti,
1995; Sternini, 1997; Altun, 2001). Il est également à noter que le CGRP, un NP retrouvé
principalement au niveau des fibres sensorielles de petit diamètre et impliqué dans
l’inflammation neurogène, ainsi que la SP, laquelle coexiste fréquemment avec le CGRP,
sont deux marqueurs peptidiques largement utilisés pour la révélation des fibres nerveuses
sensitives (Sternini, 1997; Peters, 2001; Hall, 2002).
Plusieurs études suggèrent que le système nerveux de la peau contribuerait à la guérison
des plaies, principalement grâce aux effets biologiques du relarguage des NP (Altun, 2001).
Les NP jouent effectivement un rôle important durant les étapes de la guérison des plaies,
non seulement en affectant la vasodilatation et la réponse inflammatoire, mais également en
stimulant la prolifération des cellules des tissus épithélial, vasculaire et conjonctif (Altun,
2001). Depuis quelques années déjà, il y a un intérêt croissant concernant les fonctions
23
trophiques de l’innervation de la peau, comme par exemple la guérison des plaies ou encore
le maintien de diverses structures épithéliales comme l’épiderme ou les poils. Plusieurs
observations suggèrent même que les fibres nerveuses sensitives joueraient un rôle dans le
contrôle de la croissance des poils (Paus, 1997).
1.3.4 Revue de littérature sur les connaissances actuelles concernant la réinnervation de peaux greffées Lorsqu’une plaie nécessite une greffe de peau, par exemple à la suite d’une brûlure
profonde au troisième degré, il existe principalement deux options : la greffe de peau
autologue ou l’utilisation d’équivalents cutanés. Dans le cas de greffes de peau autologues,
c’est-à-dire à partir d’un prélèvement de peau d’un site donneur du patient, il a été décrit
dans la littérature qu’une régénération des terminaisons nerveuses libres s’effectuait à partir
du lit et des marges de la plaie. Cette régénération est toutefois lente, incomplète,
désordonnée et très variable d’une greffe à l’autre. Weiss-Becker et al. ont également
démontré qu’elle variait selon le type et l’épaisseur de la greffe, la plaie, la chirurgie et les
soins post-opératoires (Weiss-Becker, 1998). La réhabilitation des corpuscules déjà
existants serait toutefois possible (Brunelli, 1995). Uno et Montagna ont en effet démontré
sur des modèles animaux qu’il pouvait y avoir réinnervation des follicules pileux et des
corpuscules de Meissner en présence d’une greffe de peau poilue (Uno, 1982).
Dans le cas d’un manque de disponibilité d’un site donneur, on peut alors avoir recours à
l’utilisation d’équivalents cutanés produits in vitro. Deux types d’équivalents ont entre
autres été décrits dans la littérature. Kangesu et al. travaillent sur des dermes autologues
ensemencés de kératinocytes autologues (greffe kérato-dermique) (Kangesu, 1998), alors
que l’équipe du Dr English travaille sur des équivalents cutanés également autologues
préparés à partir de kératinocytes en culture et d’un gel de collagène ensemencé de
fibroblastes (English, 1992a; English, 1992b). Ces deux types d’équivalents cutanés
permettent une certaine régénération nerveuse. Malheureusement, la peau générée in vitro
ne possède pas d’annexe cutanée et donc pas de terminaison nerveuse spécialisée qui leur
est associée. Il existe très peu d’études concernant la réinnervation de tels équivalents.
24
Le relarguage de facteurs neurotrophiques comme le NGF à partir de cellules cibles de la
greffe peut influencer la qualité de la réinnervation. Des études antérieures ont suggéré que
les appendices de la greffe, comme par exemple les follicules pileux et les glandes
sébacées, seraient une cible pour le neurotropisme (Kangesu, 1998). Pendant la guérison
des plaies, l’angiogenèse pourrait également jouer un rôle important dans la régénération
nerveuse cutanée.
1.3.5 Revue de littérature sur les modèles in vitro pour l’étude de la régénération nerveuse Il existe des modèles en deux et en trois dimensions pour l’étude in vitro de la régénération
nerveuse. Les modèles en deux dimensions consistent à cultiver les neurones in vitro. Une
façon de cultiver des neurones est de placer des explants de DRG sur des lamelles ou sur du
plastique tapissé de collagène, de laminine ou de poly-D-lysine (Macias, 2000). Une autre
méthode décrite dans la littérature est celle de l’utilisation de chambres de culture
compartimentées dans lesquelles sont placés des DRG au centre et différentes molécules
neurotrophiques dans les autres compartiments (Kimpinski, 1997). Différents modèles en
trois dimensions ont également été proposés pour étudier le phénomène d’extension des
neurites, tels que des modèles de gel d’agarose contenant des éléments spécifiques de la
MEC (Borkenhagen, 1998), des modèles composés de molécules biodégradables diverses
(Maquet, 2000), ainsi que des hydrogels d’agarose (Bellamkonda, 1995).
1.4 Problématique et objectifs
1.4.1 Intérêt clinique La brûlure représente probablement la blessure la plus sévère pour le corps humain. Dans le
cas d’une brûlure profonde, les fibres nerveuses sont détruites. Dépendamment du type de
recouvrement de la plaie, lors de la cicatrisation, il y a une réinnervation des nerfs
sous-cutanés périphériques, des récepteurs et des terminaisons nerveuses cutanées qui est
souvent médiocre, voire même absente, et il y a alors une récupération incomplète de
sensibilité tactile (Waris, 1978; Hermanson, 1986; Ward, 1991; Stella, 1994; Malenfant,
1996; Malenfant, 1998; Watanabe, 2000). Une fois qu’il y a eu destruction d’un tissu, la
25
seule régénération possible est la régénération axonale à partir du lit de la plaie. La
croissance des neurites pendant la guérison de la plaie peut prendre plusieurs mois et
dépend de la qualité du remodelage de la peau. Il y a également plusieurs facteurs pouvant
influencer la régénération nerveuse dont l’âge, la présence de facteurs neurotrophiques, la
MEC, les interactions cellules-cellules et bien d’autres. En effet, la structure dense et
anarchique de la MEC des cicatrices ainsi que le processus de rétraction de la plaie
induisent une dégénérescence des fibres nerveuses en cours de régénération et sont
probablement en partie responsables de la déficience de cette réinnervation (Waris, 1978;
Kishimoto, 1982; Wallengren, 1999). La régénération anarchique du derme, responsable de
la formation des cicatrices hypertrophiques et rétractiles et de l’absence de réinnervation,
peut être évitée en greffant sur la plaie une peau complète avec un derme suffisamment
épais, comme c’est le cas pour le modèle de peau reconstruite sous forme d’éponge.
Le modèle de peau reconstruite sur lequel travaille notre équipe est basé sur l’utilisation
d’une éponge de collagène composée de collagène bovin de types I et III et de chitosane
(Shahabeddin, 1990; Berthod, 1994). Ce dernier est un polysaccharide dérivé de la carapace
des crustacés permettant d’établir des liaisons ioniques avec les groupements carboxyles du
collagène grâce à ses nombreux groupements aminés (Singla, 2001). En comparaison avec
d’autres types d’éponge, l’utilisation du chitosane représente une innovation majeure de ce
modèle puisque les autres modèles sont habituellement réticulés au glutaraldéhyde, produit
hautement toxique (Yannas, 1980; Boyce, 1988). Cette éponge présente également
l’avantage d’être faiblement rétractée par les fibroblastes et d’avoir une épaisseur et des
dimensions facilement modulables et se rapprochant de l’épaisseur de la peau normale
humaine (Berthod, 1994). Un autre modèle utilisé dans le cadre du présent projet est celui
de la peau reconstruite par la méthode d’autoassemblage exclusive au Laboratoire
d’Organogénèse Expérimentale (LOEX) (Michel, 1999). L’intérêt de ce modèle réside dans
le fait qu’il peut être constitué uniquement de matériel humain entièrement sécrété par les
cellules obtenues d’une biopsie de peau humaine. Le fait d’avoir un modèle constitué de
cellules humaines est très important dans le cadre d’études in vitro puisque l’objectif
principal est d’extrapoler les résultats à l’humain.
26
Il existe différents modèles de peaux reconstruites in vitro développés par plusieurs
laboratoires dans le monde (Berthod, 1997c). La principale innovation de notre modèle par
rapport aux modèles actuellement commercialisés est la possibilité de produire des peaux
reconstruites autologues, c’est-à-dire constituées avec les propres cellules du patient, plutôt
qu’hétérologues. Cette différence majeure permet donc de réaliser une greffe de peau
permanente, contrairement aux transplantations de peaux reconstruites hétérologues qui
sont plutôt utilisées comme des pansements temporaires de haute technologie.
Notre modèle de peau reconstruite a donc pour objectif clinique d’être appliqué sur des
brûlures profondes, là où aucune autogreffe n’aurait été possible dans des délais
raisonnables en raison du manque de surface de peau saine, dans le cas de patients brûlés à
plus de 50% de leur surface corporelle totale par exemple. Le présent projet a pour objectif
d’optimiser le modèle de peau reconstruite déjà mis au point par notre équipe afin qu’il
stimule le processus de régénération nerveuse après greffe. Ceci permettrait d’améliorer la
récupération sensitive des grands brûlés, dans l’espoir de faire mieux qu’une autogreffe, et
ce, grâce à l’incorporation de molécules neurotrophiques, de cellules ou d’appendices dans
le biomatériau. Dans le cadre du présent projet, nous avons utilisé des follicules pileux et
avons posé comme hypothèse que les poils avaient une influence positive sur la migration
axonale. À long terme, la greffe de peaux reconstruites enrichies en follicules pileux
autologues pourrait améliorer la récupération tactile du greffon.
1.4.2 Intérêt fondamental La réinnervation du SNP après une lésion ou une dégénérescence est un processus essentiel
pour permettre une récupération sensitive, motrice ou végétative des organes lésés. Le
processus de réinnervation demeure toutefois encore mal compris, bien qu’il fasse l’objet
de nombreuses études (Song, 2001; Yu, 2001a; Patel, 2002). En effet, de nombreuses
équipes dans le monde essaient de percer les mystères de la régénération nerveuse afin de la
stimuler à volonté pour traiter efficacement de nombreuses pathologies. La progression du
cône de croissance de l’axone est en effet un phénomène extrêmement complexe modulé
par la combinaison de molécules attractives et répulsives, ainsi que par l’établissement de
gradients nutritionnels (Madison, 2000; Pasterkamp, 2001; Yu, 2001a; Patel, 2002). La
27
compréhension des différents mécanismes régulant la migration axonale est donc
essentielle pour pouvoir éventuellement stimuler la régénération nerveuse périphérique
chez des patients souffrant d’une lésion ou d’une dégénérescence nerveuse.
Dans la peau avec poils, les follicules pileux sont enrobés d’une terminaison nerveuse
sensitive, soit le récepteur folliculaire des poils, qui représente un des composants majeurs
du toucher de la peau poilue. Le processus par lequel la terminaison nerveuse vient
s’enrouler autour du follicule pileux demeure toutefois inconnu. De plus, dans le cas d’une
brûlure profonde, les follicule pileux et les fibres nerveuse sont détruits. Notre objectif
fondamental est donc de mettre au point un modèle de régénération du SNP sensoriel le
plus fidèle possible à la réalité physiologique, de façon à mieux comprendre le processus de
migration axonale, et donc, à mieux le maîtriser. Pour y parvenir, nous avons utilisé le
modèle de peau reconstruite mis au point par notre équipe qui permet d’étudier la migration
des axones dans un environnement tridimensionnel bien contrôlé et mimant un tissu
conjonctif. Puis, nous avons incorporé des follicules pileux immatures (FPI) murins afin
d’étudier leur effet positif ou négatif sur l’élongation axonale, le tout, dans un tissu
composé de fibroblastes et de la MEC que ces fibroblastes ont déposée. L’addition de
follicules pileux dans ces peaux reconstruites, en plus d’un épiderme, devrait permettre
d’orienter la migration des axones autour des follicules, et éventuellement, ces axones
pourraient stimuler en retour le développement du follicule.
Chapitre 2
Matériel et méthodes
29
2.1 Culture cellulaire
2.1.1 Fibroblastes L’extraction des fibroblastes humains a été effectuée à partir d’un morceau de peau
provenant d’une réduction mammaire, tel que décrit précédemment (Auger, 1995). Selon
une technique adaptée des travaux de Germain et al., les fibroblastes murins ont quant à
eux été isolés à partir de biopsies de peau de souris adultes et nouveau-nées (Germain,
1995). Brièvement, les morceaux de peau ont été incubés 3 h à 37°C dans une solution de
thermolysine (Sigma, Oakville, On, Canada) à une concentration de 500 µg/ml dans de
l’HEPES (ICN Biomedicals, Saint-Laurent, Québec, Canada). L’épiderme a ensuite été
séparé mécaniquement du derme à l’aide de pinces. Le derme a été incubé 16 h à 37°C dans
0,125 U/ml de collagénase H (Boehringer Mannheim, Laval, Qc, Canada) pour récupérer
les fibroblastes.
Les fibroblastes humains et murins ont été cultivés dans du milieu DME complet, soit du
Dulbecco-Vogt modification of Eagle’s medium (DMEM; Gibco, Burlington, On, Canada)
contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF; Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U/ml de
pénicilline G (Sigma) et 25 µg/ml de gentamycine (Schering, Pointe-Claire, Qc, Canada).
Les fibroblastes ont été utilisés à leur quatrième passage. Les cellules ont été incubées à
37°C dans 8% de CO2 et le milieu de culture a été changé tous les 2 jours.
2.1.2 Follicules pileux immatures et kératinocytes murins Le jour de leur naissance, la peau des souriceaux d’une même portée (une portée de souris
CD-1 ou C3H par expérience; Charles River Laboratories, Lasalle, Qc, Canada) a été
prélevée et incubée 16 h dans une solution de trypsine (Intergen, Toronto, On, Canada) à
4°C (figure 10). L’épiderme a ensuite été mécaniquement séparé du derme et la trame
épidermique a été grattée délicatement à l’aide de pinces courbes afin de libérer les cellules
de la trame. Les kératinocytes murins ont donc été fraîchement extraits de ces épidermes
selon la méthode décrite par Yuspa et Harris (Yuspa, 1974). Les cellules épidermiques ont
d’abord été lavées dans du milieu DME-Ham complet, soit une combinaison des milieux
DMEM et Ham’s F12 dans une proportion 3:1 (Gibco) contenant 5% de sérum Fetal Clone
30
II (Hyclone), 24,3 µg/ml d’adénine (Sigma), 5 µg/ml d’insuline (Sigma), 2 X 10-9 M de
3,3’,5’ triiodo-L-thyronine (Sigma), 5 µg/ml de transferrine humaine (Roche, Laval, Qc,
Canada), 0,4 µg/ml d’hydrocortisone (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), 10-10 M de toxine
du choléra (Sigma), 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique murin (EGF;
Invitrogen, Burlington, On, Canada), 100 UI/ml de pénicilline G et 25 µg/ml de
gentamicine. Les cellules ont ensuite été filtrées avec un filtre de nylon de 100 µm de
porosité (Becton Dickinson, Toronto, On, Canada). Puis, la suspension de cellules
épithéliales a été centrifugée (318 g, 10 min) et l’utilisation d’un gradient de lympholyte M
(Cedarlane, Hornby, On, Canada) a permis d’isoler les kératinocytes qui ont finalement été
traités 10 minutes avec de la trypsine 0,1% et lavés avec du milieu DME-Ham complet.
Les FPI ont quant à eux été extraits à partir des dermes obtenus le même jour, tel que décrit
précédemment (Lichti, 1993; Weinberg, 1993) et adapté par D. Larouche (Larouche, En
préparation) (figure 10). Brièvement, les dermes ont été digérés 30 minutes dans une unité
de trypsination contenant de la collagénase 0,35% (Sigma) à 37°C et la suspension a été
filtrée avec un filtre de nylon de 100 µm de porosité pour se débarrasser des débris. Trois
centrifugations à basse vitesse (37 g, 3 min), chacune d’entre elles séparée par des lavages
au DME-Ham pour enlever la collagénase, ont été effectuées pour permettre aux FPI de
sédimenter en premier. La suspension finale a ensuite été filtrée sur un filtre de nylon de
40 µm de porosité (Becton Dickinson) afin de séparer les FPI des fibroblastes.
31
Figure 10. Extraction des FPI et des kératinocytes murins Dès leur naissance, la peau des souriceaux est prélevée et mise dans une
solution de trypsine, et l’épiderme est séparé du derme. Par centrifugation avec
un gradient de lympholyte M, les kérarinocytes murins sont isolés de
l’épiderme, tandis que les FPI sont isolés du derme par une digestion à la
collagénase suivie de centrifugations différentielles (Danielle Larouche,
LOEX).
2.2 Préparation du biopolymère de collagène/chitosane Les éponges de collagène ont été préparées tel que décrit précédemment (Berthod, 1994;
Berthod, 1997c), sans toutefois ajouter de sulfates de chondroïtine 4-6 (figure 11).
Brièvement, du collagène bovin de type I et III (Symatese, Chaponost, France) et du
chitosane (SADUC, Lyon, France) ont été dissous séparément dans de l’acide acétique
0,1% (EMD, Durham, NC, USA) et ensuite mélangés. La solution finale obtenue a ensuite
été versée dans des plaques 12 puits (Becton Dickinson) à raison de 1 ml/puit pour les
études in vitro ou dans des plaques 6 puits à raison de 2,5 ml/puit pour les études in vivo, et
congelée à -80°C pour 1 h. Les éponges ont enfin été lyophilisées dans un lyophilisateur
Genesis 12EL (VirTis, Gardiner, NY, USA). Pour les stériliser, les éponges ont d’abord été
32
immergées 48 h dans l’éthanol 70%, rincées, puis mises 24 h dans du DMEM additionné de
300 U/ml de pénicilline G, de 75 µg/ml de gentamycine et de 1,5 µg/ml fungizone (Sigma)
à raison de 3 ml/puit à 37°C dans 8% de CO2. Elles ont finalement été incubées un dernier
24 h dans du DMEM vierge, également à raison de 3 ml/puit à 37°C dans 8% de CO2. Une
fois l’éponge ensemencée de fibroblastes, ces derniers remodèlent la MEC, ce qui permet
d’obtenir une peau ressemblant au derme de la peau normale humaine (figure 12). La
structure des éponges en microscopie électronique montre les nombreuses pores variant
entre 50 et 150 µm (figure 13) (Berthod, 1994).
Figure 11. Préparation du biopolymère de collagène/chitosane Le collagène et le chitosane sont dissous dans de l’acide acétique 0,1% et la
solution est versée dans des plaques. Les éponges sont ensuite congelées à
-70°C, puis lyophilisées (Annie Black, LOEX).
33
Figure 12. Éponges de collagène Aspect macroscopique des éponges de collagène (Marie Gingras, LOEX).
Figure 13. Visualisation de la structure de l’éponge en microscopie électronique L’éponge de collagène est constituée de nombreuses pores variant entre 50 et
150 µm (François Berthod, LOEX)
2.3 Préparation des feuillets dermiques Des fibroblastes murins ou humains ont été cultivés pendant 28 jours dans du milieu DME
complet en présence de 50 µg/ml d’acide ascorbique (Sigma) pour permettre la production
de MEC et la formation des feuillets dermiques. Selon la méthode d’autoassemblage
développée au LOEX (Michel, 1999; Pouliot, 2002), quatre feuillets de fibroblastes ont été
superposés pour obtenir un derme reconstruit maintenu une semaine en immersion, toujours
dans du milieu DME complet additionné de 50 µg/ml d’acide ascorbique (figure 16).
34
2.4 Extraction des neurones sensoriels Les neurones sensoriels ont été extraits à partir des DRG de fœtus de souris (E13), tel que
décrit précédemment (Durham, 1997; Gingras, 2003a) (figure 14). Brièvement, des souris
gestantes CD-1 (Charles River Laboratories) ont été sacrifiées par inhalation de CO2 et les
fœtus ont été disséqués pour obtenir les DRG qui ont été isolés de la moelle épinière, lavés,
puis trypsinés. Les corps cellulaires des neurones sensoriels obtenus ont alors été
fraîchement ensemencés sur les modèles de peau reconstruite. Toutes les manipulations
impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux règles établies par le Conseil
Canadien de Protection des Animaux (CCPA).
Figure 14. Extraction des DRG La moelle épinière est d’abord isolée des fœtus murins et dissectée (A et B). Les
DRG présents le long des moelles sont ensuite séparés de celles-ci (C). Par un
traitement à la trypsine, les corps cellulaires des neurones sont extraits des
DRG (Marie Gingras et Anne-Marie Moisan, LOEX).
2.5 Ensemencement des peaux reconstruites
2.5.1 Ensemencement des éponges de collagène Des fibroblastes murins ou humains ont d’abord été ensemencés sur le dessus des éponges
de collagène à raison de 0,8 millions de cellules par éponge (surface de 3,8 cm2), et les
35
éponges ont ensuite été cultivées 14 jours en immersion dans le même milieu utilisé pour la
culture des fibroblastes dans lequel 100 µg/ml d’acide ascorbique ont été ajoutés, tel que
décrit précédemment (Berthod, 1993; Gingras, 2003a) (figure 15). Il est à noter que lorsque
les éponges étaient ensemencées de CE en même temps que de fibroblastes, les CE
provenaient de cordons ombilicaux et ont été ensemencées à leur sixième passage
également à raison de 0,8 millions de cellules par éponge. Les peaux reconstruites ont par
la suite été placées à l’interface air/liquide, ensemencées avec 0,8 millions de neurones
sensoriels et cultivées ainsi pendant 14 jours dans du milieu air/liquide, soit du milieu
DME-Ham contenant 10% de SVF, 0,4 µg/ml d’hydrocortisone, 5 µg/ml d’insuline,
100 UI/ml de pénicilline G et 25 µg/ml de gentamicine. La mise en air/liquide a pour but
d’établir un gradient de nutriments et de facteurs de croissance pouvant favoriser la
croissance des neurites d’un côté à l’autre de l’éponge (Gingras, 2003a), ainsi que de
favoriser la différenciation épidermique. Après 14 jours de culture avec les neurones à
l’interface air/liquide, 3 millions de kératinocytes murins de nouveau-nés ou l’équivalent de
1/2 derme d’une suspension de FPI obtenue à la suite de la digestion à la collagénase des
dermes (voir figure 10) ont été ensemencés sur le côté opposé du modèle. Il est à noter que
les kératinocytes et les FPI utilisés étaient fraîchement isolés. Après 7 jours en immersion
dans du milieu à kératinocytes, la peau reconstruite a de nouveau été placée à l’interface
air/liquide et cultivée pendant 14 jours additionnels dans du milieu air/liquide. À partir du
moment où les neurones ont été ensemencés sur les modèles, 10 ng/ml de NGF 2.5S
(Invitrogen, Burlington, On, Canada) ont été ajoutés au milieu de culture. Les neurones
périphériques requièrent effectivement du NGF pour survivre in vitro (Snider, 1996; Patel,
2000).
36
Figure 15. Ensemencement des éponges de collagène Les éponges sont d’abord ensemencées de fibroblastes et laissées 7 jours en
immersion. Puis, elles sont ensemencées avec les neurones et mises 14 jours à
l’interface air/liquide. Les éponges sont ensuite retournées et ensemencées
avec les FPI ou avec les kératinocytes et laissées 7 jours en immersion, suivi de
14 jours à l’interface air/liquide (Alexandre Deschambeault, LOEX).
2.5.2 Ensemencement des feuillets dermiques Une fois les équivalents dermiques obtenus par la superposition de quatre feuillets, les
neurones sensoriels ont alors été ensemencés sur les peaux reconstruites (surface de
4,15 cm2) qui ont ensuite été mises à l’interface air/liquide pour 14 jours dans du milieu
air/liquide (figure 16). À partir du moment où les neurones ont été ensemencés sur les
modèles, 10 ng/ml de NGF 2.5S ont été ajoutés au milieu de culture. Une fois les feuillets
quadruples retournés, 3 millions de kératinocytes murins ou l’équivalent de 1/2 derme
d’une suspension de FPI obtenue à la suite de la digestion à la collagénase des dermes (voir
figure 10) ont été ensemencés sur le dessus et les dermes reconstruits ont été laissés 7 jours
en immersion dans du DME complet, soit jusqu’à la formation de 2 à 3 couches
d’épithélium, suivi de 14 jours additionnels à l’interface air/liquide dans du milieu
air/liquide pour obtenir une peau reconstruite. Il est à noter que les kératinocytes et les FPI
utilisés étaient fraîchement isolés. Les équivalents ont été incubés à 37°C dans 8% de CO2
et le milieu de culture a été changé à tous les 2 jours.
37
Figure 16. Préparation des feuillets dermiques par la méthode d’autoassemblage Des fibroblastes sont cultivés 28 jours en présence d'acide ascorbique pour
permettre la production de MEC et la formation de feuillets dermiques. 4
feuillets sont ensuite superposés pour obtenir un derme reconstruit maintenu 7
jours en immersion avant de recevoir les neurones. Puis, les feuillets
quadruples sont placés 14 jours à l’interface air/liquide et retournés. Les FPI
ou les kératinocytes sont ensemencés et les feuillets sont laissés 7 jours en
immersion, suivi de 14 jours à l’interface air/liquide (Danielle Larouche et
Alexandre Deschambeault, LOEX).
2.6 Procédure pour la greffe des peaux reconstruites Trois millions de kératinocytes murins ou l’équivalent de 1/2 derme d’une suspension de
FPI obtenue à la suite de la digestion à la collagénase des dermes (voir figure 10) ont été
ensemencés sur le dessus des dermes reconstruits (Larouche, En préparation). Dans le cas
des éponges de collagène, celles-ci avaient été préalablement ensemencées de fibroblastes
humains ou murins pour permettre la production de MEC avant de pouvoir recevoir les
kératinocytes ou les FPI. Afin d’obtenir une maturation complète in vivo des peaux
reconstruites, celles-ci ont été cultivées 10 jours en immersion dans du DME-Ham complet
38
avant la greffe (Germain, 1995; Pouliot, 2002). Des souris athymiques mâles adultes (âgées
de 50 jours) (Charles River Laboratories) ont été utilisées comme modèle pour les
chirurgies, tel que décrit précédemment (Lopez Valle, 1992; Berthod, 1996; Xu, 1996)
(figure 17). Brièvement, une biopsie de peau pleine épaisseur de 2,5 X 2,5 cm2 a été excisée
jusqu’au muscle sur le dos de la souris. Une chambre de Fusenig a ensuite été insérée dans
la plaie et suturée sur la peau de la souris. Une peau reconstruite de 9,1 cm2 a alors été
placée sur le lit de la plaie, et la chambre a été refermée avec un capuchon ajouré pour les 4
premiers jours. Ce capuchon a par la suite été remplacé par un autre capuchon doté d’un
filtre. La chambre de Fusenig a été enlevée après 21 jours. Un minimum de 2 souris par
condition ont été greffées. Les souris ont été sacrifiées 49 jours après la transplantation
lorsque des éponges étaient greffées et 28 jours lorsque des feuillets étaient greffés. Toutes
les manipulations impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux règles
établies par le Conseil Canadien de Protection des Animaux (CCPA).
Figure 17. Greffe chez la souris athymique Une plaie est créée sur le dos de la souris et une chambre de Fusenig y est
insérée. La peau reconstruite est ensuite déposée à l’intérieur de la chambre,
laquelle est enfin refermée avec un capuchon ajouré (Marie Gingras, LOEX).
39
2.7 Histologie Les biopsies des peaux reconstruites et des peaux normales de souris ont été fixées au
moins 24 h dans une solution d’Histochoice (Amresco, Solon, OH, USA), puis enrobées
dans la paraffine. Des coupes de 5 µm ont finalement été colorées au trichrome de Masson
(TM) pour l’analyse histologique des tissus.
2.8 Marquages en immunofluorescence indirecte Les biopsies des peaux reconstruites ont été enrobées dans une solution d’OCT (Somagen,
Edmonton, Ab, Canada), puis congelées à -80°C. Des coupes de 5 µm d’épaisseur pour les
analyses en microscopie à fluorescence et de 25 µm pour les analyses en microscopie
confocale ont d’abord été fixées dans du tampon saline phosphate (PBS) contenant
1% (v/v) de formol (Fisher, Nepean, On, Canada), suivi d’une fixation dans du méthanol
100% (Fisher). Les coupes ont ensuite été traitées dans du PBS contenant 1% (v/v)
d’albumine sérique bovine (BSA; Sigma) pour bloquer les sites non-spécifiques, et
incubées avec les anticorps. Les anticorps primaires utilisés ont été incubés 45 minutes sur
les coupes et les anticorps secondaires, 30 minutes (figure 18 et tableau 1). Les contrôles
négatifs pour les immunomarquages ont été obtenus par omission du premier anticorps. Un
marquage des noyaux cellulaires au Hoechst 33258 (Sigma) a aussi été effectué par une
incubation de 10 minutes. Les coupes ont été visualisées avec des microscopes à
épifluorescence Nikon Eclipse E600 (Nikon, Tokyo, Japon) et Nikon Eclipse TE2000-U
(Nikon), ainsi qu’avec un microscope confocal Nikon Eclipse E800 combiné au système
Nikon D-Eclipse C1 (Nikon). Les séries d’images obtenues à travers une coupe de 25 µm
en microscopie confocale ont été superposées pour donner une représentation en deux
dimensions de l’épaisseur totale du champ photographié, et ce, à raison d’une dizaine
d’images pour un grossissement de 20X et d’une trentaine pour un grossissement de 40X.
La luminosité et/ou le contraste des images ont été ajustés avec Adobe® Photoshop® 6.0
(Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA).
40
Figure 18. Principe de l’immunofluorescence Un anticorps primaire est d’abord incubé 45 minutes sur les coupes. Puis, un
anticorps secondaire couplé à un fluorochrome est incubé 30 minutes sur les
coupes (Vicky Gagnon, LOEX).
Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés
Anticorps primaires Compagnie Dilution
Ac polyclonal de lapin anti-neurofilament 150 kDa (NF150) Chemicon 1/400
Ac monoclonal de souris (IgG1) anti-neurofilament 160 kDa (NF160) Chemicon 1/800
Ac de lapin anti-peptide de la kératine 14 (K14) Don du Dr Normand Marceau 1/2000
Anticorps secondaires Compagnie Dilution
Ac de chèvre anti-IgG-IgM de souris (DTAF) Chemicon 1/100
Ac de poulet anti-IgG de lapin (Alexa 594) Molecular Probes 1/800
Ac de chèvre anti-IgG de lapin (Alexa 488) Molecular Probes 1/400
Chapitre 3
Résultats
42
Le présent projet avait deux objectifs principaux : étudier l’influence des follicules pileux
sur la migration axonale in vitro et analyser le processus de régénération nerveuse dans une
peau reconstruite contenant des poils, après implantation chez la souris immunodéficiente.
À long terme, la greffe de peaux reconstruites enrichies en follicules pileux autologues
pourrait améliorer la récupération tactile du greffon. Nous avons donc mis au point deux
types de peaux reconstruites par génie tissulaire pour l’étude de la régénération nerveuse
périphérique.
3.1 Peau normale de souris Afin de mieux interpréter les résultats qui seront présentés, il convient d’abord d’examiner
en histologie la peau de souris nouveau-née (figure 19A) et adulte (figure 19B) colorée au
TM, et la peau de souris adulte en immunofluorescence (figure 19C). La figure 19A révèle
plusieurs amas cellulaires (noyaux cellulaires colorés en mauve) caractéristiques des
follicules pileux en devenir et correspondant aux FPI qui sont extraits de la peau des
souriceaux. La figure 19B révèle également plusieurs amas cellulaires (noyaux cellulaires
colorés en mauve) caractéristiques des follicules pileux matures. La couleur bleu pâle
correspond au collagène synthétisé par les fibroblastes présents dans le derme. Le
marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu) de la figure 19C révèle quant à lui
plusieurs regroupements cellulaires en forme de cercle caractéristiques des poils matures.
Le marquage du neurofilament 150 kDa (NF150; en vert) met quant à lui en évidence
l’innervation et le fait que les neurites migrent vers les poils et s’enroulent autour d’eux.
43
Figure 19. Aspect histologique de la peau normale de souris La morphologie de la peau de souris a été observée en histochimie sur une
coupe de 5 µm colorée au TM pour les souris nouveau-nées (A) et les souris
adultes (B), et en immunofluorescence sur une coupe de 5 µm par le marquage
du NF150 (C; en vert) et par la révélation des noyaux cellulaires par un
marquage au Hoechst (C; en bleu) pour les souris adultes. Barre : 50 µm.
44
3.2 Éponges de collagène Afin d’étudier les interactions in vitro entre les follicules pileux et les neurones sensoriels,
trois modèles d’éponges de collagène ont d’abord été développés.
3.2.1 Modèle 1 Le premier modèle (modèle 1) a été préparé en cultivant des neurones sensoriels pendant
14 jours sur un côté de l’éponge de collagène préalablement ensemencée de fibroblastes et
de cellules endothéliales (CE), et en cultivant des FPI ou des kératinocytes sur l’autre côté,
également ensemencé de fibroblastes, pendant 21 jours additionnels. Les deux côtés de
l’éponge ont été ensemencés de fibroblastes dans le but d’obtenir le plus de MEC possible.
Les fibroblastes et les CE étaient d’origine humaine alors que les FPI, les kératinocytes et
les neurones sensoriels étaient murins. Les fibroblastes utilisés provenaient d’un donneur
âgé de 24 ans et ont été ensemencés à leur cinquième passage à raison de 0,8 millions de
cellules par éponge. Les CE provenaient quant à elles de cordons ombilicaux et ont été
ensemencées à leur sixième passage également à raison de 0,8 millions de cellules par
éponge. Après un total de 49 jours de culture, une analyse histochimique du modèle 1
coloré au TM a d’abord été effectuée (figure 20). Bien que quelques cellules aient pénétré
plus profondément dans le modèle, les fibroblastes ont généralement peu pénétré dans
l’éponge. En effet, les noyaux cellulaires colorés en mauve et la couleur bleu pâle du
collagène synthétisé par les fibroblastes sont présents principalement au niveau de la
portion supérieure du modèle (figure 20A et B). Il est à noter que le collagène bovin
constituant l’éponge est quant à lui coloré en bleu foncé. Dans le modèle avec CE, il y a eu
formation d’un réseau de pseudo-capillaires visible par la présence de tubules (figure 20C),
tel que décrit précédemment (Black, 1998). Les tubules sont reconnaissables par la
présence de trous bordés de cellules (en mauve) dans la MEC. En présence de FPI, il y a eu
formation d’inclusions intradermiques qui ont légèrement pénétré dans l’éponge
(figure 20B et D). Un mince épiderme attaché à l’équivalent dermique ensemencé de FPI a
également été obtenu (figure 20B et D). Le contrôle (peau reconstruite avec kératinocytes,
sans FPI) présentait un épiderme pluristratifié, mais aucune inclusion intradermique
(figure 20A). L’expérience a été effectuée un total de trois fois à raison de 6 équivalents par
condition et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois à l’autre.
45
Figure 20. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1) La morphologie des peaux reconstruites, après un total de 49 jours de
maturation in vitro, a été observée en histochimie sur une coupe de 5 µm
colorée au TM. En présence de FPI, il y a formation d’inclusions
intradermiques et d’un mince épiderme (B, D). En présence de kératinocytes, il
y a formation d’un épiderme pluristratifié (A). En présence de CE, il y a
formation d’un réseau de pseudo-capillaires (C; flèches). Barre : 50 µm.
46
Une analyse en immunofluorescence du modèle 1 a également été effectuée par le
marquage de la K14 (en rouge), du neurofilament 160 kDa (NF160; en vert) ainsi que par
un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu) (figure 21). Rappelons que la K14
est un marqueur des kératinocytes alors que le NF160 est un marqueur de choix pour
détecter la présence de prolongements axonaux dans la peau. Tout comme l’avait démontré
l’analyse histochimique (figure 20), il y a formation d’un grand nombre d’inclusions
intradermiques et d’un mince épiderme en présence de FPI (figure 21A). Seul un épiderme
pluristratifié est observé dans le contrôle ensemencé de kératinocytes (figure 21C). La
révélation des noyaux confirme que les fibroblastes ont peu pénétré dans l’éponge,
demeurant dans la partie supérieure (figure 21A et C) et inférieure du derme (figure 21B).
Bien que les corps cellulaires des neurones sensoriels et plusieurs neurites soient restés à la
surface de l’éponge, de nombreuses neurites ont pénétré plus profondément dans le modèle
(figure 21B).
47
Figure 21. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en immunofluorescence
sur une coupe de 5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en
vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu),
après un total de 49 jours de maturation in vitro. En présence de FPI, il y a
formation d’inclusions intradermiques et d’un mince épiderme (A). En
présence de kératinocytes, il y a formation d’un épiderme pluristratifié (C). En
présence de cellules nerveuses, il y a élongation des neurites en surface du
modèle et plus profondément (B; flèches). Barre : 50 µm.
48
3.2.2 Modèle 2 Le deuxième modèle (modèle 2) a d’abord été préparé en cultivant des neurones sensoriels
pendant 14 jours sur un côté de l’éponge de collagène préalablement ensemencé de
fibroblastes et de CE. Par la suite, des FPI ou des kératinocytes ont été ajoutés de l’autre
côté du modèle pendant 21 jours additionnels. Les fibroblastes et les CE étaient d’origine
humaine alors que les FPI, les kératinocytes et les neurones sensoriels étaient murins. Les
fibroblastes utilisés provenaient d’un donneur âgé de 24 ans et ont été ensemencés à leur
sixième passage à raison de 0,8 millions de cellules par éponge. Les CE provenaient quant
à elles de cordons ombilicaux et ont été ensemencées à leur cinquième passage également à
raison de 0,8 millions de cellules par éponge. La seule différence par rapport au modèle 1
réside dans le fait qu’un seul côté de l’éponge a été ensemencé de fibroblastes, soit celui
recevant les cellules nerveuses. Le but de ce changement était de voir si le fait de ne pas
avoir de fibroblastes du côté des FPI permettait à ces derniers de pénétrer un peu plus
profondément dans l’éponge. Après un total de 49 jours de culture, le modèle 2 a été
analysé en histochimie par une coloration au TM (figure 22A, C et E) et en
immunofluorescence (figure 22B, D et F) par le marquage de la K14 (en rouge), du NF160
(en vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu).
Les caractéristiques de ce deuxième modèle sont comparables à celles du premier. En effet,
il y a bel et bien eu formation d’un réseau de pseudo-capillaires en présence des CE
(figure 22E) et d’inclusions intradermiques en présence de FPI (figure 22A et B). Les
éponges ensemencées de kératinocytes présentent également un épithélium pluristratifié
(figure 22C et D). La différence notable entre les deux modèles réside dans la quantité de
MEC sécrétée par les fibroblastes. En effet, il y a un peu moins de fibroblastes et de MEC
dans ce modèle-ci, comme l’indique la quantité plus faible de collagène (en bleu pâle)
présent surtout dans la portion supérieure du modèle (figure 22A, C et E). Le fait d’avoir
ensemencé des fibroblastes d’un seul côté est sans doute responsable de cette diminution de
MEC. Les inclusions ne semblent pas avoir pénétré plus profondément dans l’éponge
(figure 22A et B). Étant donné que les résultats obtenus avec le modèle 2 n’étaient pas plus
positifs que ceux obtenus avec le modèle 1, l’expérience n’a pas été répétée. L’expérience
n’a donc été effectuée qu’une seule fois à raison de 6 équivalents par condition.
49
Figure 22 : Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 2) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en histochimie sur une
coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de
5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en vert) ainsi que par
un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu), après un total de 49
jours de maturation in vitro. En présence de FPI, il y a formation d’inclusions
intradermiques et d’un mince épiderme (A, B). En présence de kératinocytes, il
y a formation d’un épiderme pluristratifié (C, D). En présence de CE, il y a
formation d’un réseau de pseudo-capillaires (E; flèches). En présence de
cellules nerveuses, il y a élongation des neurites en surface du modèle et plus
profondément (F; flèches). Barre : 50 µm.
50
3.2.3 Modèle 3 Pour le troisième modèle (modèle 3), des fibroblastes murins adultes ont été utilisés au lieu
de fibroblastes humains, et ils ont été ensemencés à leur cinquième passage à raison de 1,6
millions de cellules par éponge. Nous espérions ainsi favoriser l’établissement
d’interactions cellules-cellules provenant de la même espèce et activer le plus de voies de
signalisation possible. Tout comme pour le modèle 1, le modèle 3 a été préparé en cultivant
des neurones sensoriels sur un côté de l’éponge de collagène préalablement ensemencé de
fibroblastes et en cultivant des FPI sur l’autre côté également ensemencé de fibroblastes.
Étant donné qu’une plus grande quantité de MEC était présente dans le modèle 1
ensemencé des deux côtés avec des fibroblastes, nous avons décidé de continuer avec cette
technique. Toutefois, nous n’avons pas ensemencé de CE sur ce modèle-ci. En effet,
puisque nous voulions avoir un modèle entièrement composé de cellules murines, nous
avons arrêté d’utiliser des CE étant donné que nous ne possédions pas de CE murines à
cette date. C’est également pour cette raison que nous avons ensemencé le double de
cellules sur les éponges (1,6 au lieu de 0,8 millions). L’expérience a été effectuée deux fois
à raison de 6 équivalents par condition et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois
à l’autre.
Après un total de 49 jours de culture, une analyse histochimique du modèle 3 coloré au TM
a été effectuée (figure 23). En présence de FPI, il y a eu formation de quelques inclusions
intradermiques qui ont peu pénétré dans l’éponge (figure 23A et B). Les inclusions formées
étaient mal définies et l’épiderme formé, plus différencié que celui des modèles précédents.
En effet, les inclusions formées possèdent plus ou moins cette forme de cercle
caractéristique des poils matures qu’on a pu observer précédemment dans les modèles 1 et
2. De plus, l’épiderme formé en présence de fibroblastes murins est plus mince que celui
formé en présence de fibroblastes humains. En effet, l’épiderme murin est très mince et ne
possède que quelques couches de cellules vivantes, soit 2 à 3 couches, comparativement à
10 à 15 chez l’humain. La présence de collagène (en bleu pâle) sur le dessus du modèle
indique qu’il y a eu une sécrétion importante de MEC par les fibroblastes (figure 23A).
51
Figure 23. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et des neurones (modèle 3) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en histochimie sur une
coupe de 5 µm colorée au TM après un total de 49 jours de maturation
in vitro. En présence de FPI, il y a formation de quelques inclusions
intradermiques et d’un mince épiderme pluristratifié (A, B). Barre : 50 µm.
Une analyse en immunofluorescence du modèle 3 a également été effectuée par le
marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en vert) ainsi que par un marquage des noyaux
cellulaires au Hoechst (en bleu) (figure 24). Tout comme l’avait démontré l’analyse
histologique (figure 23), les inclusions intradermiques formées sont mal définies et
ressemblent plus à des amas de kératinocytes qu’à des petits cercles caractéristiques de la
présence de poils (figure 24B). Dans certains cas, très peu d’inclusions étaient présentes
(figure 24A). En présence de cellules nerveuses, il y a eu pénétration des neurites à
l’intérieur du modèle (figure 24C).
52
Figure 24. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et des neurones (modèle 3) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en immunofluorescence
sur une coupe de 5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en
vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu),
après un total de 49 jours de maturation in vitro. En présence de FPI, il y a
formation d’inclusions intradermiques et d’un mince épiderme (A, B). En
présence de cellules nerveuses, il y a élongation des neurites à l’intérieur du
modèle (C). Barre : 50 µm.
53
3.2.4 Colonisation de l’éponge par les fibroblastes Afin d’analyser la pénétration des fibroblastes dans l’éponge, une analyse histologique a été
effectuée sur l’épaisseur totale des éponges (figure 25). De plus, une comparaison a été
effectuée entre les éponges ensemencées de fibroblastes humains et les éponges
ensemencées de fibroblastes murins adultes (figure 25A et B). Bien que quelques cellules
aient pénétré plus profondément dans le modèle, les fibroblastes ont généralement peu
pénétré dans l’éponge et la majorité des cellules est restée au niveau de la portion
supérieure ou inférieure de l’éponge. En effet, la formation de collagène par les fibroblastes
s’est effectuée principalement au niveau des portions inférieure et supérieure du modèle,
comme l’indique la couleur bleu pâle du collagène synthétisé par les fibroblastes en
comparaison avec le collagène bovin constituant l’éponge, représenté en bleu foncé (figure
25A, B et C). De plus, nous avons constaté que les fibroblastes murins produisent beaucoup
moins de MEC que les fibroblastes humains (figure 25A et B).
54
Figure 25. Aspect histologique de l’éponge pleine épaisseur ensemencée avec des fibroblastes, des neurones et des FPI ou des kératinocytes La morphologie des peaux reconstruites a été observée en histochimie sur une
coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de
5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en vert) ainsi que par
un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu). En présence de
fibroblastes humains (A), il a y une plus grande quantité de MEC sécrétée
qu’en présence de fibroblastes murins (B). La majorité des cellules se trouve
au niveau des portions inférieure et supérieure de l’éponge (C, D). Barre :
50 µm.
55
3.3 Feuillets dermiques En parallèle avec les expériences in vitro effectuées sur les éponges de collagène, nous
avons vérifié le potentiel des feuillets produits par la méthode d’autoassemblage, un
deuxième modèle in vitro de peau reconstruite mis au point dans notre laboratoire, pour
l’étude de la régénération nerveuse. Les fibroblastes utilisés provenaient d’une souris âgée
de 2 jours et ils ont été utilisés à leur quatrième passage. L’expérience a été effectuée deux
fois et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois à l’autre.
Une analyse histologique des feuillets dermiques ensemencés de cellules nerveuses ainsi
que de kératinocytes (figure 26A et B) ou de FPI (figure 26C et D) a ensuite été effectuée.
Une migration préférentielle des axones vers les kératinocytes et les FPI implantés dans le
modèle a été observée (figure 26B et D). De plus, cette migration a été suivie d’une
association étroite des axones et des follicules pileux en développement (figure 26D).
56
Figure 26. Aspect histologique des feuillets dermiques ensemencés avec des neurones et des FPI ou des kératinocytes La morphologie de la peau reconstruite a été observée en histochimie sur une
coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de
5 µm par un marquage de la K14 (en rouge) et du NF160 (en vert). En
présence de kératinocytes, il y a formation d’un épiderme pluristratifié (A, B),
tandis qu’en présence de FPI, il y a formation d’inclusions intradermiques et
d’un mince épiderme (C, D). Dans les deux cas, une forte élongation des
neurites a été observée. Barre : 20 µm.
Une analyse en immunofluorescence des feuillets dermiques a été effectuée en microscopie
confocale pour mettre en évidence l’innervation (NF160; en vert) en présence de
kératinocytes (Figure 27B), de FPI (C) ou sans cellule épithéliale (A). En l’absence de
cellule épithéliale, les fibres nerveuses migrent de façon aléatoire dans le modèle
(figure 27A). On remarque cependant que les neurites ont tendance à pénétrer
profondément dans les feuillets. Toutefois, en présence de kératinocytes (figure 27B) et de
FPI (figure 27C), il y a migration préférentielle des axones vers les cellules épithéliales. De
plus, ces axones ont tendance à s’organiser juste au-dessous de l’épiderme.
57
Figure 27. Innervation dans les feuillets dermiques en présence ou non de cellules épithéliales La morphologie de la peau reconstruite a été observée en immunofluorescence
sur une coupe de 25 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en
vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu).
Sans cellule épithéliale, il y a désorganisation des fibres nerveuses (A). En
présence de kératinocytes (B) et de FPI (C), il y a migration préférentielle des
axones vers les cellules épithéliales. Barre : 50 µm.
58
3.4 Greffe de peaux reconstruites
3.4.1 Feuillets dermiques D’après les travaux précédemment effectués par Danielle Larouche, des feuillets dermiques
produits par la méthode d’autoassemblage et ensemencés de kératinocytes (figure 28A) ou
de FPI (figure 28B et C) ont été greffés pendant un mois sur des souris athymiques afin de
vérifier si les feuillets pouvaient supporter la croissance de poils. Comme le démontre la
figure 28, les feuillets ont en effet permis le développement de follicules pileux complets.
Figure 28. Greffe de feuillets ensemencés de FPI chez la souris athymique Aspect macroscopique des dermes reconstruits ensemencés avec des
kératinocytes (A) ou des FPI (B, C), 1 mois après la greffe sur des souris
immunodéficientes. Le développement de follicules pileux complets a été
observée en présence de FPI (B, C). (Gracieuseté de Danielle Larouche)
Bien que les biopsies ont été effectuées par Danielle Larouche sur ses propres échantillons,
j’ai personnellement effectué les marquages immunologiques. Les peaux reconstruites
greffées ont donc été observées en immunofluorescence par un marquage des fibres
nerveuses au NF150 (en vert) et par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en
bleu) afin d’analyser le processus d’innervation du greffon. Il est à noter que pour les
études in vivo, le NF160 (un anticorps de souris) a été remplacé par le NF150 (un anticorps
de lapin). En effet, un anticorps de souris ne peut pas être utilisé sur une souris puisqu’il y
aurait trop de marquage non-spécifique. En présence de FPI, une élongation vigoureuse des
neurites provenant de la souris a été observée, de même qu’une étroite association de ces
fibres nerveuses avec les follicules pileux (figure 29C-E), et ce, de façon similaire à ce qui
est observé dans la peau normale de souris (figure 29B). Dans les greffes de peaux
reconstruites ensemencées de kératinocytes (contrôle), une très faible colonisation par les
59
fibres nerveuses a été observée (figure 29A). Il est à noter que trois souris par condition ont
été utilisées pour la greffe.
Figure 29. Immunomarquages des feuillets dermiques ensemencés de FPI ou de kératinocytes et greffés chez la souris athymique Des peaux reconstruites contenant (C, D, E) ou non (A) des FPI ont été
transplantées pendant 1 mois sur des souris immunodéficientes. Une migration
de fibres nerveuses positives au NF150 (en vert) a été observée dans les peaux
reconstruites contenant des FPI (C, E; D est un agrandissement du cadre en
C), contrairement à une colonisation pratiquement nulle observée dans les
peaux reconstruites sans FPI (A). Une colocalisation systématique des fibres
nerveuses avec les follicules pileux (reconnaissable par la concentration
typique des noyaux cellulaires des kératinocytes les constituant, marqués par le
Hoechst) a été observée (D, E) selon une organisation similaire à la peau de
souris normale (B). Barre A-C : 100 µm, barre D : 50 µm, barre E : 25 µm.
60
3.4.2 Éponges de collagène Étant donné que la greffe de feuillets dermiques enrichis de FPI (sans cellule nerveuse) a
permis le développement de follicules pileux complets, nous avons par la suite tenté de
reproduire l’expérience avec les éponges de collagène également ensemencées de FPI. Pour
ce faire, les fibroblastes utilisés étaient les mêmes que ceux utilisés par Danielle Larouche
pour les expériences de greffes de feuillets dermiques, soit des fibroblastes de souris
nouveau-nées (2 jours) à leur quatrième passage. Bien qu’il y ait eu réépithélialisation de la
plaie, il n’y a eu formation d’aucun follicule pileux (figure 30). L’expérience a été effectuée
deux fois et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois à l’autre.
Figure 30. Greffe d’éponges ensemencées de FPI chez la souris athymique Des éponges de collagène contenant des FPI ont été transplantées pendant
49 jours sur des souris immunodéficientes. Il n’y a eu aucune formation de
follicules pileux, mais il y a eu réépithélialisation de la plaie.
Une analyse histologique des éponges greffées a donc été effectuée pour tenter d’expliquer
pourquoi l’éponge ne semble pas permettre le développement de follicules pileux. Bien
qu’il y ait eu réépithélialisation après greffe (C; visualisable par la présence d’un épiderme
pluristratifié au-dessus de la trame partiellement dégradée de l’éponge), aucun follicule
pileux n’a poussé (figure 31C et D).
61
Figure 31. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes et des FPI et greffée chez la souris athymique La morphologie de l’éponge greffée a été observée en histochimie sur une
coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de
5 µm par un marquage de la K14 (en vert) ainsi que par un marquage des
noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu), 49 jours après la greffe. En présence
de FPI, il y a eu réépithélialisation, mais aucun follicule pileux ne s’est
développé (C, D). La peau de souris athymique est quant à elle parsemée de
duvet (A, B). Barre : 50 µm.
Chapitre 4
Discussion
63
En plus de l’importance de son aspect esthétique, la peau joue de nombreux rôles
importants dont la perception des sensations par ses nombreux récepteurs sensoriels. Dans
le cas d’une brûlure profonde, il y a destruction totale ou partielle des fibres nerveuses.
Lors de la cicatrisation, la réinnervation est souvent médiocre, voire même absente, et la
récupération de la sensibilité tactile demeure incomplète. De plus, il arrive que le patient
souffre de névralgie caractérisée par une douleur ressentie sur le parcours d'un nerf sensitif
ou dans le territoire qu'il innerve. Le patient souffre alors de sensations anormales dont une
hypersensibilité. La qualité de la régénération nerveuse dépend toutefois de la procédure de
greffe appliquée (Brunelli, 1995). Dans le cas d’une greffe pleine épaisseur (derme et
épiderme), qui représente la meilleure façon de couvrir une brûlure profonde, il y a
rétablissement partiel de la régénération nerveuse et de la sensation, celle-ci se limitant à
une sensation grossière de même qu’à une perception de la température (Schliephake, 1994;
Lutz, 1998; Malenfant, 1998; Bayramicli, 2000). Cette technique est en fait une autogreffe
contenant déjà son propre réseau nerveux, ce qui facilite grandement la régénération
nerveuse. De plus, elle contient des appendices tels que des follicules pileux, des glandes
sébacées et des dômes tactiles de Merkel, représentant tous d’importantes cibles dans le
processus de la migration axonale (Waris, 1983; English, 1992b). Cette méthode est
toutefois grandement limitée par la disponibilité des sites donneurs. La greffe d’épiderme,
qui représente une méthode de choix pour le traitement des brûlures profondes et étendues,
ne permet quant à elle qu’un rétablissement de la sensation tactile beaucoup plus faible
(Lutz, 1998; Juma, 2002).
La meilleure solution pour recouvrir les plaies profondes et étendues serait la production
in vitro d’une peau reconstruite avec les propres cellules du patient, par les techniques du
génie tissulaire (Berthod, 1997c). En effet, la production de peaux reconstruites autologues
permet de réaliser des greffes de peau permanentes, contrairement aux peaux reconstruites
hétérologues qui sont utilisées comme des pansements temporaires de haute technologie.
Toutefois, les peaux reconstruites actuelles ne contiennent pas d’appendice, de dôme tactile
ou encore de réseau nerveux agissant comme cibles et supportant la migration axonale. Le
but du projet était de développer une peau reconstruite enrichie de FPI. Nous voulions
évaluer le potentiel des poils comme cible dans la régénération nerveuse dans un modèle
in vitro, et après transplantation chez la souris athymique. Pour ce faire, nous avons utilisé
64
deux marqueurs de l’innervation cutanée, soit le NF160 et le NF150, de même qu’un
marqueur des kératinocytes, la K14.
4.1 Éponges de collagène Notre équipe a mis au point un premier modèle in vitro de peau reconstruite qui consiste en
une éponge de collagène (Berthod, 1993). Ce modèle comporte de nombreux avantages par
rapport aux différents modèles de peaux reconstruites développés jusqu’à ce jour. En effet,
l’éponge est facile et rapide à produire, faiblement rétractée par les fibroblastes et possède
une épaisseur et des dimensions facilement modulables. De plus, elle permet l’intégration
de différentes molécules dans sa matrice, l’ajout de facteurs neurotrophiques, et elle peut
servir de modèle pour différents tissus conjonctifs. Elle permet aussi la reconstruction d’un
réseau capillaire in vitro lorsqu’elle est ensemencée de CE (Black, 1998). L’utilisation du
chitosane dans la composition de l’éponge représente également une innovation majeure de
ce modèle par rapport à d’autres types d’éponges réticulées au glutaraldéhyde, ce dernier
étant un produit hautement toxique (Yannas, 1980; Boyce, 1988). Le remodelage dans
l’éponge d’une MEC hautement organisée ressemblant au derme de la peau normale
humaine (Berthod, 2001) facilite la migration axonale après la transplantation (Gingras,
2003b), de même que dans les expériences in vitro (Gingras, 2003a). En effet, la
régénération nerveuse est connue pour être grandement inhibée par l’architecture
désorganisée des fibres de collagène, de même que par le processus de rétraction observé
dans les cicatrices hypertrophiques au cours de la guérison des plaies (Waris, 1978;
Kishimoto, 1982; Wallengren, 1999).
Dans le cadre de ce projet, nous avons donc optimisé notre modèle d’éponge permettant
d’étudier la migration des axones dans un environnement tridimensionnel contrôlé et
mimant un tissu conjonctif. Trois modèles d’éponge de collagène ont d’abord été
développés. Le modèle 1 contenait des cellules humaines (fibroblastes et CE), ainsi que des
cellules de souris (DRG, FPI et kératinocytes). De plus, il avait été ensemencé de
fibroblastes des deux côtés. Le modèle 2 était identique au modèle 1, mais n’était
ensemencé de fibroblastes que d’un seul côté de l’éponge, soit sur le côté recevant les
neurones. Nous voulions ainsi vérifier si le fait de ne pas ensemencer de fibroblastes sur le
65
côté recevant les FPI permettrait à ces derniers de pénétrer plus profondément dans
l’éponge. Nous voulions également vérifier si les inclusions intradermiques formées en
présence de FPI étaient plus nombreuses que ce qui avait été observé dans le modèle 1, et si
elles avaient une structure plus caractéristique des poils matures. Les inclusions formées
n’étaient pas plus nombreuses et ne pénétraient pas plus profondément dans le derme
reconstruit. Toutefois, nous avons observé une diminution de la quantité de MEC sécrétée
par les fibroblastes, ce qui s’explique par le fait que moins de fibroblastes étaient
ensemencés dans le modèle 2 (un côté au lieu de deux). Pour cette raison, nous avons
décidé de continuer par la suite à ensemencer des fibroblastes des deux côtés de l’éponge,
puisque la production de MEC est un facteur déterminant dans la colonisation de l’éponge
par les neurites. Étant donné que les molécules produites par les fibroblastes humains sont
différentes de celles produites par les fibroblastes murins, il se pourrait que ces molécules
d’origine humaine ne soient pas reconnues par les cellules épithéliales murines. Dans le
modèle 3, nous avons donc substitué les fibroblastes humains par des fibroblastes murins
pour avoir un modèle entièrement murin. Nous espérions ainsi faire en sorte qu’il y ait une
meilleure interaction entre tous les types cellulaires et s’assurer qu’un maximum de voies
de signalisation étaient activées. Depuis quelques années déjà, plusieurs évidences pointent
vers la voie de signalisation WNT comme étant une voie clef dans le développement des
poils (Millar, 1999; Reddy, 2001). Pour favoriser le développement de poils matures, il
serait donc intéressant de vérifier l’activation de cette voie signalétique dans les peaux
reconstruites in vitro. L’utilisation de cellules provenant du même organisme est
susceptible d’activer cette voie puisque tous les bons récepteurs et ligands risquent alors
d’être présents.
Dans les éponges, des fibroblastes de souris adultes ont été utilisés. Il aurait probablement
été plus avantageux d’utiliser des fibroblastes de souriceaux nouveau-nés. En effet, étant
donné que les souris ont une espérance de vie d’environ 2 à 3 ans, leurs cellules, à l’âge
adulte, ont probablement un pouvoir prolifératif beaucoup plus faible que les mêmes
cellules humaines adultes. Ceci pourrait entre autres expliquer le fait qu’il y a beaucoup
moins de MEC sécrétée dans l’éponge en présence de fibroblastes de souris adultes
comparativement à la quantité de matrice sécrétée en présence de fibroblastes humains. De
plus, le derme de la peau de souris est beaucoup plus mince que le derme de la peau
66
humaine, ce qui pourrait également expliquer la petite quantité de MEC sécrétée par les
fibroblastes murins. Enfin, il serait intéressant d’utiliser des fibroblastes nouveau-nés, ceux-
ci produisant plus de MEC que les fibroblastes adultes et sécrétant probablement plus de
facteurs (NGF, FGF, EGF, etc.).
Par ailleurs, l’éponge de collagène permet d’étudier les interactions qui s’effectuent entre
les CE et les autres types cellulaires ou avec les protéines de la MEC, ces interactions étant
essentielles lors de la formation des vaisseaux in vivo et in vitro. La formation spontanée de
structures ressemblant aux capillaires observés in vivo a été associée en partie à la présence
d’une MEC mature et aux facteurs de croissance néosynthétisés dans l’environnement dans
lequel évoluent les cellules (Berthod, 1993; Berthod, 1996). Les CE, les fibroblastes et la
MEC qu’ils sécrètent jouent probablement un rôle important dans le maintien et la
régénération des nerfs par les interactions cellules-cellules et cellules-MEC, ainsi que par le
relarguage de facteurs de croissance et de molécules signalétiques (Gingras, 2003a). Les
fibroblastes et les CE sont effectivement connus pour produire du facteur de croissance de
l'endothélium vasculaire (VEGF) (Steinbrech, 1999; D'Arcangelo, 2000; Pinney, 2000),
lequel a été démontré comme pouvant activer la croissance axonale (Sondell, 1999;
Sondell, 2000). Il a été démontré dans l’éponge que la présence de CE favorisait
l’élongation des neurites (Gingras, 2003a). De plus, les axones pourraient avoir une
influence sur l’organisation et le niveau de différenciation du réseau de pseudo-capillaires,
tel que démontré récemment dans la peau (Mukouyama, 2002). Toutefois, à partir du
modèle 3, nous avons arrêté d’ensemencer des CE. En effet, puisque nous voulions avoir un
modèle entièrement composé de cellules murines, nous avons arrêté d’utiliser des CE étant
donné que nous ne possédions pas de CE murines à cette date. De plus, il devint clair que
l’évaluation de l’influence des neurones sur la maturation in vitro du réseau de capillaires,
ainsi que l’étude de l’influence des capillaires sur la migration axonale, comportaient assez
d’éléments pour constituer un projet en soi. Cette partie fut donc prise en charge par un
autre étudiant de notre laboratoire.
En ce qui a trait à la MEC, il reste encore de l’optimisation à faire dans l’éponge pour faire
en sorte qu’elle soit colonisée de façon uniforme par les fibroblastes. Une répartition plus
uniforme des fibroblastes ferait en sorte que la MEC qu’ils sécrètent serait présente partout
67
dans la peau reconstruite. La trame de l’éponge sert effectivement de soutien et d’ancrage
aux fibroblastes pour la sécrétion de MEC. Des cellules nerveuses exprimant le NF160 et le
NF150 ont été observées dans les trois modèles d’éponge, soit en surface et plus
profondément. Toutefois, le fait que nous n’ayons pas observé de migration préférentielle
des fibres nerveuses vers les inclusions intradermiques réside sans doute dans le fait qu’il y
avait un manque de MEC. En effet, les fibres nerveuses ont besoin de la MEC pour leur
élongation. Le dépôt de grandes quantités de MEC dans notre modèle d’éponge (Berthod,
1993; Berthod, 1996) devrait effectivement aider à supporter la croissance des neurites
(Snow, 2002).
Un moyen de permettre une meilleure pénétration des fibroblastes dans l’éponge serait de
mieux contrôler la dimension de ses pores (O'Brien, 2005). Tel que mentionné
précédemment, les pores de l’éponge varient entre 50 et 150 µm. De plus, les pores du
dessus sont souvent plus gros que ceux du centre, ce qui résulte en une meilleure
colonisation de l’éponge par les fibroblastes sur le dessus. En ayant une meilleure
uniformité des pores, les fibroblastes auraient probablement plus de facilité a pénétrer plus
profondément dans l’éponge et ils pourraient ainsi sécréter de la MEC sur toute l’épaisseur
de l’éponge.
En plus du problème de colonisation uniforme, un autre problème technique rencontré avec
les éponges fut leur mise à l’interface air/liquide. En effet, lorsque les éponges sont
retournées de 180° pour recevoir les FPI, le côté de l’éponge préalablement ensemencé de
cellules nerveuses se retrouve alors en contact avec le filtre supportant l’éponge. Il se
pourrait donc que les neurones soient écrasées par le reste de l’éponge, nuisant ainsi à leur
survie. De plus, l’éponge adhère légèrement au support et lorsqu’il est temps de décoller
l’éponge pour prendre les biopsies, et une petite portion de l’éponge déchire et reste collée
sur le filtre. Sans cette déchirure, il y aurait sans doute un plus grand nombre de neurones
visibles en immunofluorescence. Il faut donc développer une méthode de culture à
l’interface air/liquide non-dommageable pour les éponges.
68
4.2 Feuillets dermiques En parallèle avec les expériences effectuées avec l’éponge de collagène, nous avons
développé un deuxième type de modèle pour l’étude de la régénération nerveuse
périphérique in vitro. Pour ce faire, nous avons tiré avantage d’un autre type de peau
reconstruite développée dans notre laboratoire, soit les feuillets dermiques produits par la
méthode d’autoassemblage (Michel, 1999). Cette méthode consiste à faire produire par les
fibroblastes leur propre MEC grâce à l’ajout d’acide ascorbique, cofacteur essentiel à un
enzyme impliqué dans la synthèse du collagène, puis à superposer quatre feuillets pour
obtenir un derme reconstruit. Étant donné que les feuillets dermiques sont entièrement
composés de fibroblastes et de la MEC qu’ils sécrètent, on ne retrouve pas ici le problème
du manque de MEC. Les fibres nerveuses ont alors tout le support nécessaire pour migrer
vers les cellules épithéliales. C’est d’ailleurs ce qu’on a pu observer lorsque les feuillets
étaient ensemencés de FPI ou de kératinocytes.
En plus d’une migration préférentielle des fibres nerveuses vers les cellules épithéliales, il y
a eu étroite association entre ces fibres et les inclusions intradermiques formées en présence
de FPI. Comme les kératinocytes sont connus pour produire du NGF (Pincelli, 1997),
l’épiderme joue sans doute un rôle dans la migration axonale. Une autre raison qui a
probablement influencé la migration des fibres nerveuses vers les inclusions est l’épaisseur
des feuillets qui est d’environ 300 µm pour un feuillet quadruple. En effet, la méthode
d’autoassemblage résulte de l’empilement de plusieurs feuillets de MEC qui sont beaucoup
plus minces que l’éponge. Les fibres nerveuses ont alors moins de MEC à traverser pour
atteindre leur cible. Cependant, l’épaisseur des feuillets représente probablement une limite
du modèle. En effet, l’épaisseur de l’éponge s’apparente beaucoup plus à celle de la peau
que l’épaisseur des feuillets. Il se pourrait toutefois que l’épaisseur de l’éponge affecte le
gradient de molécules trophiques produites par les cellules épithéliales. Ces molécules ne se
rendent peut-être pas jusqu’aux neurones sensoriels. Dans le but de créer un modèle in vitro
de peau reconstruite le plus près possible de la peau normale humaine, l’éponge présente ici
un gros avantage par rapport à la méthode des feuillets. Il est également à noter que
l’éponge est beaucoup plus rapide et facile à produire que les feuillets dermiques. En effet,
ces derniers ont besoin de 28 jours de maturation in vitro avant de pouvoir être superposés
69
pour produire un feuillet quadruple. L’éponge ne nécessite quant à elle que 14 jours, soit
2 jours pour sa préparation, 5 jours pour sa stérilisation et 7 jours en immersion à la suite de
l’ensemencement des fibroblastes.
4.3 Greffe chez la souris athymique Nous avons greffé l’éponge de collagène et les feuillets dermiques chez la souris athymique
afin de vérifier si ces deux types de peaux reconstruites permettaient la croissance de
follicules pileux complets lorsque ensemencés de FPI. Nous voulions également vérifier si
ces peaux reconstruites enrichies de FPI avaient une influence sur la régénération nerveuse
provenant du lit de la plaie. En ce qui concerne l’éponge de collagène, il n’y a eu croissance
d’aucun follicule pileux. Ceci est sans doute dû à la mauvaise répartition de la MEC dans
l’éponge. En effet, tous les facteurs provenant de la souris ne pouvaient pas venir activer les
voies de signalisation nécessaires à la croissance des poils. Nous n’avons donc pas pu
vérifier avec l’éponge si l’ensemencement de FPI favorisait l’élongation axonale.
Mentionnons toutefois qu’il a déjà été démontré que notre modèle d’éponge permettait la
régénération nerveuse provenant du lit de la plaie 90 jours après la greffe chez la souris
athymique (Gingras, 2003b). Comme nous savions que les follicules pileux seraient
présents dans les peaux reconstruites greffées après un mois, nous avons donc arrêté
l’expérience après un mois, quand il devint évident qu’aucun poil ne pousserait. Il est donc
normal qu’aucune neurite n’ait été observée dans l’éponge greffée après un mois. Il est
donc permis de croire qu’une fois la colonisation de l’éponge par les fibroblastes optimisée,
notre biopolymère pourrait constituer une matrice favorable à la formation de follicules
pileux complets. En effet, la MEC représente un support essentiel pour la migration
cellulaire et si les cellules ne peuvent pas migrer dans l’éponge, il y aura un manque au
niveau des interactions cellules-cellules. Les voies de signalisation nécessaires ne seront
alors pas activées et les poils ne se développeront pas. Nous espérons également observer
une migration préférentielle des axones vers les FPI implantés dans le modèle, migration
qui devrait éventuellement être suivie d’une association étroite des axones et des follicules
pileux. En effet, c’est exactement ce qui a été observé après la greffe de feuillets dermiques
effectuée par Danielle Larouche. Un mois seulement après la greffe, il y avait présence de
poils matures au niveau des feuillets enrichis de FPI. Comme l’a démontré l’analyse en
70
immunofluorescence, en présence de FPI, une élongation vigoureuse des neurites
exprimant le NF150 et provenant de la souris a été observée, de même qu’une étroite
association de ces fibres nerveuses avec les follicules pileux marqués à la K14, et ce, de
façon similaire à ce qui est observé dans la peau normale de souris (Larouche, En
préparation).
Ainsi, de nombreux efforts ont été concentrés sur le développement des modèles in vivo et
in vitro afin d’étudier la régénération nerveuse périphérique. Bien que les modèles in vivo
aient permis d’accroître considérablement les connaissances sur la régénération nerveuse,
l’utilisation de ces derniers comporte d’importantes limitations : des manipulations
difficiles sur les animaux, une certaine variabilité au niveau des résultats, un coût élevé et
des réponses non-spécifiques de l’hôte entraînant l’apparition de faux positifs. Ces
limitations justifient donc l’intérêt de développer des modèles in vitro avec des cellules
humaines.
4.4 Contributions aux connaissances actuelles Ces résultats permettront de faire progresser le développement de tissus reconstruits par
génie tissulaire et le traitement des grands brûlés. Aujourd’hui encore, le recouvrement des
brûlures profondes s’effectue surtout avec des feuillets d’épiderme, même si la greffe de
peaux reconstruites pourrait offrir une meilleure alternative pour le traitement des grands
brûlés (Berthod, 1997a). En effet, la transplantation d’une peau reconstruite chez les grands
brûlés semble être une solution prometteuse pour le traitement des brûlures profondes,
surtout en tant qu’alternative à la greffe de peau dans le cas d’un manque au niveau des
sites donneurs (Berthod, 1997a; Berthod, 1997c; Muhart, 1999). En effet, différentes études
ont mis en évidence l’importance du derme pour améliorer la guérison de la greffe, en
comparaison avec les transplantations de feuillets épithéliaux (Kangesu, 1993; Lamme,
1996; Lamme, 1998). Les peaux reconstruites ne sont toutefois pas encore couramment
utilisées dans le traitement des brûlures profondes puisque tous les paramètres ne sont pas
encore bien contrôlés. De plus, avant de greffer chez l’humain, il faudra avoir une peau
reconstruite uniquement avec des composants humains.
71
4.5 Perspectives La régénération nerveuse obtenue dans les peaux reconstruites pourrait également être
améliorée par l’incorporation dans la structure du biomatériau de molécules
neurotrophiques comme du NGF (Terenghi, 1999), ou encore des glycoprotéines favorisant
la migration axonale, comme la laminine (Rangappa, 2000). L’objectif de la préparation
d’un biomatériau enrichi en molécules neurotrophiques serait d’obtenir une meilleure
récupération de la sensibilité tactile, et d’ainsi faire mieux qu’une autogreffe
conventionnelle. La fonctionnalité de la réinnervation obtenue dans les greffes de peaux
reconstruites enrichies sera éventuellement évaluée chez la souris par un test de
récupération tactile non-invasif à l’aide d’un Neurometer© (Kiso, 2001).
Nous projetons maintenant de décortiquer le processus par lequel les fibres nerveuses
migrent de façon préférentielle vers les inclusions intradermiques pour ensuite s’enrouler
autour d’elles. Il serait en effet intéressant d’analyser séparément l’effet du follicule entier,
des cellules souches folliculaires, ou des fibroblastes de la papille folliculaire, et d’analyser
les substances neurotrophiques qu’ils sécrètent, les récepteurs qu’ils expriment ou les
molécules de la MEC qu’ils déposent. De plus, la démonstration d’une stimulation de la
croissance des follicules par une interaction avec les axones serait également d’une
importance majeure dans la compréhension globale de la croissance des poils (Peters,
2001). En effet, il existe de nombreuses interrogations à savoir si ce sont les poils qui
attirent les nerfs ou si, au contraire, ce sont les nerfs qui favorisent la croissance des poils.
Dans le cas où les cellules souches des follicules pileux démontreraient un potentiel
d’attraction majeur sur les axones, nous envisagerons de développer un nouveau modèle de
peau reconstruite contenant ce type de cellules extraites à partir de prélèvements capillaires
autologues sur les patients. Un tel modèle pourrait alors constituer une voie d’avenir dans le
traitement des brûlures profondes, puisqu’il pourrait entre autres stimuler la récupération
tactile cutanée.
Dans notre souci de reproduire un modèle aussi proche que possible du SNP humain, nous
projetons d’utiliser des neurones humains pour développer un modèle complètement
humain. L’utilisation, dans les modèles, de neurones embryonnaires de souris peut être
critiquable du fait qu’ils ne se comportent pas nécessairement comme les cellules adultes
72
humaines. En effet, tant et aussi longtemps que les modèles contiendront des cellules
murines, ils ne pourront pas être greffés chez l’humain. À la suite de la découverte par
l’équipe du Dr Miller que la peau humaine contenait des cellules souches multipotentes
pouvant se différencier en neurones et en cellules de Schwann (Toma, 2001), nous avons
entrepris de reproduire et d’améliorer la technique qu’ils ont mis au point, afin d’obtenir
une source importante de cellules nerveuses humaines pour produire un modèle de
régénération nerveuse périphérique de type humain. L’utilisation de neurones humains
obtenus à partir de cellules souches multipotentes cutanées est d’un intérêt capital dans le
développement d’un modèle entièrement humain de régénération nerveuse périphérique. De
plus, l’utilisation de neurones humains adultes ne soulève pas de problème éthique,
contrairement à l’utilisation de neurones humains embryonnaires.
Afin d’améliorer le modèle de régénération nerveuse, l’addition, dans ce futur modèle, de
cellules de Schwann devrait permettre de stabiliser le réseau nerveux et éventuellement de
conduire à la myélinisation des axones. L’addition de cellules de Schwann autologues dans
une peau reconstruite pour traiter les brûlures profondes pourrait améliorer la récupération
tactile du greffon. En effet, les cellules de Schwann sont des composants essentiels des
nerfs périphériques puisqu’elles assurent la myélinisation des axones. Elles influent en
particulier sur le diamètre des axones et la densité de leurs neurofilaments (Martini, 2001).
Elles jouent surtout un rôle majeur lors de la régénération nerveuse, en proliférant pour
préparer la voie à la migration de l’axone situé en amont de la lésion (Ide, 1996; Torigoe,
1997; Sulaiman, 2000). L’incorporation des cellules de Schwann dans les modèles
d’éponge de collagène et de feuillets dermiques devrait donc être une étape majeure pour
leur optimisation.
Chapitre 5
Conclusion
74
Ce projet avait deux objectifs principaux : étudier l’influence des follicules pileux sur la
migration axonale in vitro et analyser le processus de régénération nerveuse dans une peau
reconstruite contenant des poils, après implantation chez la souris immunodéficiente. Nous
avons mis au point deux types de peaux reconstruites par génie tissulaire pour l’étude de la
régénération nerveuse périphérique. Ces modèles permettent en effet une forte croissance
des neurites, qui traversent les équivalents dermiques, à partir des neurones extraits des
DRG. Cette migration axonale a eu lieu grâce au pouvoir d’attraction du NGF ajouté au
milieu de culture, et possiblement grâce à la présence d’inclusions intradermiques et d’un
épiderme. Les axones ont également migré à travers une MEC dense sécrétée par les
fibroblastes et ressemblant à la matrice retrouvée dans les tissus conjonctifs in situ
(Berthod, 1996; Berthod, 1997b). De plus, cette matrice devrait reproduire un
environnement tridimensionnel ressemblant à celui retrouvé in vivo beaucoup plus
fidèlement que l’environnement reproduit par un gel de collagène, un gel d’agarose ou
encore MatrigelTM (Borkenhagen, 1998; Balgude, 2001; Cao, 2001; Yu, 2001b; Cheng,
2002). Nous avons également démontré, aussi bien in vivo qu’in vitro, que les FPI
incorporés dans les modèles de peau étaient une cible autour de laquelle les axones des
neurones sensitifs se réorganisaient préférentiellement. Étant donné que ces peaux
reconstruites permettent la régénération nerveuse, les patients traités à l’aide de ces peaux
reconstruites pourraient retrouver une certaine perception de la chaleur, du froid et de la
douleur, tel qu’observé dans les greffes conventionnelles (Lutz, 1998). Avec l’addition de
follicules pileux dans les modèles, les patients pourraient en plus retrouver une certaine
sensibilité tactile.
Puisque ces peaux reconstruites présentent une grande flexibilité, différents types de
cellules pourront éventuellement y être ajoutées pour étudier leurs effets sur la croissance
des neurites à long terme. Notons par exemple des neurones moteurs ou sympathiques, des
cellules dendritiques, des cellules de Schwann et bien d’autres molécules inhibitrices,
attractives ou répulsives. Dans le cas de l’éponge de collagène, ces molécules pourraient en
effet être ajoutées au milieu de culture ou encore incorporées directement dans la structure
de l’éponge.
Chapitre 6
Bibliographie
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