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VICKY GAGNON ÉTUDE DES INTERACTIONS ENTRE LES NERFS SENSORIELS ET LES FOLLICULES PILEUX DANS UN MODÈLE IN VITRO DE PEAU RECONSTRUITE PAR GÉNIE TISSULAIRE Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC AOÛT 2005 © Vicky Gagnon, 2005

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VICKY GAGNON ÉTUDE DES INTERACTIONS ENTRE LES NERFS SENSORIELS ET LES FOLLICULES PILEUX DANS UN MODÈLE IN VITRO DE PEAU

RECONSTRUITE PAR GÉNIE TISSULAIRE

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

AOÛT 2005 © Vicky Gagnon, 2005

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Résumé L’objectif du présent projet était d’optimiser le modèle de peau reconstruite par génie

tissulaire déjà mis au point par notre équipe afin qu’il stimule le processus de régénération

nerveuse après greffe pour améliorer la récupération tactile des grands brûlés. Nous avons

utilisé des follicules pileux murins et des neurones sensoriels extraits des ganglions de la

racine dorsale de fœtus de souris et avons posé comme hypothèse que les poils avaient une

influence positive sur la migration axonale. Une élongation vigoureuse des neurites a été

détectée à l’intérieur du derme reconstruit. En présence de cellules épithéliales, il y a eu une

migration préférentielle des axones vers les follicules pileux immatures implantés dans le

modèle, migration qui a été suivie d’une association étroite des axones et des follicules

pileux. Nous avons donc développé avec succès un modèle nous permettant d’étudier les

effets de l’épiderme et des follicules pileux sur la croissance des nerfs.

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Avant-Propos Je tiens d’abord à remercier le Dr François Auger pour m’avoir accueillie au Laboratoire

d’Organogénèse Expérimentale (LOEX). Un merci particulier aussi à mon directeur de

recherche, le Dr François Berthod, pour m’avoir donné la chance de me joindre à l’équipe

du LOEX afin d’y effectuer ma maîtrise, et pour m’avoir permis de travailler sur un projet

de recherche passionnant. Je souligne également la grande disponibilité dont il fait preuve

envers tous les membres de son équipe, encadrement qui fut grandement apprécié!

Je remercie également les autres membres de « Berthod et al. », notamment Marie-France

Champigny pour avoir répondu à mes mille et une questions, Marie Gingras pour son

éternel positivisme et toutes ses connaissances scientifiques et Sara Belmonte pour son

soutien et son aide.

Un gros merci à Danielle Larouche et à Kristine Cuffley pour toute leur expertise au niveau

des follicules pileux et des feuillets, ainsi qu’à Anne-Marie Moisan pour tous les mercredi-

DRG-9h. Merci enfin à Alexandre Deschambeault pour son aide au niveau des

présentations, des photos et des affiches, pour son encouragement constant et ses conseils,

et enfin, pour la patience dont il fait preuve au travail comme à la maison…

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À tous les membres de « Berthod et al. »…

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Table des matières Résumé.................................................................................................................................. ii

Avant-Propos....................................................................................................................... iii

Table des matières ................................................................................................................v

Liste des figures et des tableaux ....................................................................................... vii

Liste des abréviations ....................................................................................................... viii

Chapitre 1. Introduction..........................................................................................................1 1.1 Peau normale humaine..................................................................................................2

1.1.1 Épiderme................................................................................................................3 1.1.2 Derme.....................................................................................................................4 1.1.3 Hypoderme.............................................................................................................5 1.1.4 Annexes cutanées...................................................................................................6

1.1.4.1 Follicules pileux..............................................................................................6 1.1.4.2 Structure des follicules pileux.........................................................................7 1.1.4.3 Distribution et croissance des poils ................................................................9 1.1.4.4 Développement des follicules pileux............................................................10

1.1.5 Particularités de la peau murine...........................................................................12 1.2 Filaments intermédiaires.............................................................................................13

1.2.1 Kératines ..............................................................................................................13 1.2.2 Neurofilaments.....................................................................................................14

1.3 Système nerveux périphérique cutané ........................................................................15 1.3.1 Innervation cutanée..............................................................................................16 1.3.2 Régénération nerveuse périphérique....................................................................18 1.3.3 Rôles trophiques des nerfs périphériques ............................................................20

1.3.3.1 Neurotrophines..............................................................................................21 1.3.3.2 Neuropeptides ...............................................................................................22

1.3.4 Revue de littérature sur les connaissances actuelles concernant la réinnervation de peaux greffées ..........................................................................................................23 1.3.5 Revue de littérature sur les modèles in vitro pour l’étude de la régénération nerveuse ........................................................................................................................24

1.4 Problématique et objectifs ..........................................................................................24 1.4.1 Intérêt clinique .....................................................................................................24 1.4.2 Intérêt fondamental ..............................................................................................26

Chapitre 2. Matériel et méthodes..........................................................................................28 2.1 Culture cellulaire.........................................................................................................29

2.1.1 Fibroblastes..........................................................................................................29 2.1.2 Follicules pileux immatures et kératinocytes murins ..........................................29

2.2 Préparation du biopolymère de collagène/chitosane ..................................................31 2.3 Préparation des feuillets dermiques ............................................................................33 2.4 Extraction des neurones sensoriels .............................................................................34 2.5 Ensemencement des peaux reconstruites....................................................................34

2.5.1 Ensemencement des éponges de collagène..........................................................34 2.5.2 Ensemencement des feuillets dermiques .............................................................36

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2.6 Procédure pour la greffe des peaux reconstruites .......................................................37 2.7 Histologie....................................................................................................................39 2.8 Marquages en immunofluorescence indirecte ............................................................39

Chapitre 3. Résultats .............................................................................................................41 3.1 Peau normale de souris ...............................................................................................42 3.2 Éponges de collagène..................................................................................................44

3.2.1 Modèle 1 ..............................................................................................................44 3.2.2 Modèle 2 ..............................................................................................................48 3.2.3 Modèle 3 ..............................................................................................................50 3.2.4 Colonisation de l’éponge par les fibroblastes ......................................................53

3.3 Feuillets dermiques .....................................................................................................55 3.4 Greffe de peaux reconstruites .....................................................................................58

3.4.1 Feuillets dermiques ..............................................................................................58 3.4.2 Éponges de collagène...........................................................................................60

Chapitre 4. Discussion ..........................................................................................................62 4.1 Éponges de collagène..................................................................................................64 4.2 Feuillets dermiques .....................................................................................................68 4.3 Greffe chez la souris athymique .................................................................................69 4.4 Contributions aux connaissances actuelles .................................................................70 4.5 Perspectives ................................................................................................................71

Chapitre 5. Conclusion .........................................................................................................73 Chapitre 6. Bibliographie......................................................................................................75

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Liste des figures et des tableaux Figure 1. La peau normale humaine .......................................................................................2 Figure 2. Différenciation de la peau .......................................................................................4 Figure 3. Schéma des différents degrés de brûlure de la peau................................................7 Figure 4. Structure des poils ...................................................................................................8 Figure 5. Le cycle du poil .....................................................................................................10 Figure 6. La morphogenèse des poils ...................................................................................12 Figure 7. Structure des neurones...........................................................................................16 Figure 8. Innervation de la peau ...........................................................................................18 Figure 9. Dégénérescence wallérienne .................................................................................20 Figure 10. Extraction des FPI et des kératinocytes murins...................................................31 Figure 11. Préparation du biopolymère de collagène/chitosane ...........................................32 Figure 12. Éponges de collagène ..........................................................................................33 Figure 13. Visualisation de la structure de l’éponge en microscopie électronique ..............33 Figure 14. Extraction des DRG.............................................................................................34 Figure 15. Ensemencement des éponges de collagène .........................................................36 Figure 16. Préparation des feuillets dermiques par la méthode d’autoassemblage ..............37 Figure 17. Greffe chez la souris athymique..........................................................................38 Figure 18. Principe de l’immunofluorescence......................................................................40 Figure 19. Aspect histologique de la peau normale de souris ..............................................43 Figure 20. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des

neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1)...................................................45 Figure 21. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des

neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1)...................................................47 Figure 22 : Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des

neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 2)...................................................49 Figure 23. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et

des neurones (modèle 3) ...............................................................................................51 Figure 24. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et des

neurones (modèle 3)......................................................................................................52 Figure 25. Aspect histologique de l’éponge pleine épaisseur ensemencée avec des

fibroblastes, des neurones et des FPI ou des kératinocytes ..........................................54 Figure 26. Aspect histologique des feuillets dermiques ensemencés avec des neurones et

des FPI ou des kératinocytes.........................................................................................56 Figure 27. Innervation dans les feuillets dermiques en présence ou non de cellules

épithéliales ....................................................................................................................57 Figure 28. Greffe de feuillets ensemencés de FPI chez la souris athymique........................58 Figure 29. Immunomarquages des feuillets dermiques ensemencés de FPI ou de

kératinocytes et greffés chez la souris athymique ........................................................59 Figure 30. Greffe d’éponges ensemencées de FPI chez la souris athymique .......................60 Figure 31. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes et des FPI et

greffée chez la souris athymique ..................................................................................61

Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés .................................................................................40

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Liste des abréviations BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor (Facteur Neurotrophique

Dérivé du Cerveau)

BSA Bovine Serum Albumin (Albumine Sérique Bovine)

CE Cellule Endothéliale

CGRP Calcitonin-Gene-Related Peptide (Peptide Dérivé du Gène de la Calcitonine)

DRG Dorsal Root Ganglia (Ganglion de la Racine Dorsale)

EGF Epidermal Growth Factor (Facteur de Croissance Épidermique)

FPI Follicule Pileux Immature

GFE Gaine Folliculaire Externe

GFI Gaine Folliculaire Interne

K14 Kératine 14

L1 CAM Cell Adhesion Molecule L1 (Molécule d’Adhérence Cellulaire L1)

MEC Matrice Extracellulaire

NCAM Neural Cell Adhesion Molecule (Molécule d’Adhérence Cellulaire Neuronale)

NF Neurofilament

NGF Nerve Growth Factor (Facteur de Croissance Neuronal)

NKA Neurokinine A

NP Neuropeptide

NT Neurotrophine

PBS Phosphate Buffer Saline (Tampon Saline Phosphate)

p75NTR p75 Neurotrophin Receptor (Récepteur à Neurotrophine p75)

SNC Système Nerveux Central

SNP Système Nerveux Périphérique

SP Substance P

SVF Sérum de Veau Fœtal

TM Trichrome de Masson

TrK Tyrosine Kinase

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (Facteur de Croissance de l'Endothélium

Vasculaire)

VIP Vasoactive Intestinal Polypeptide (Peptide Intestinal Vasoactif)

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Chapitre 1

Introduction

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2

1.1 Peau normale humaine Plus qu’une simple enveloppe, la peau est un organe à part entière qui recouvre

complètement le corps et qui possède une superficie variant entre 1,5 et 2 m2 (Wysocki,

1999). Selon la région du corps et les conditions auxquelles la peau est soumise, son

épaisseur varie de 1,5 à 4 mm (Marieb, 1993). Elle représente donc le plus gros organe du

corps, soit environ 16% du poids corporel (Wysocki, 1999). La peau est formée de deux

tissus distincts, soit l’épiderme et le derme, solidement soudés l’un à l’autre par

l’intermédiaire de la membrane basilaire, le tout supporté par l’hypoderme (figure 1)

(Holbrook, 1987).

La peau assure plusieurs fonctions essentielles. Véritable interface avec le monde extérieur,

elle protège les autres organes en dressant au moins trois types de barrières entre l’individu

et l’environnement externe : une barrière chimique, physique et biologique (Marieb, 1993).

Elle joue aussi un rôle au niveau de l’excrétion des déchets, de la régulation de la

température corporelle, de la perception tactile et de la synthèse de la vitamine D (Blank,

1987; Wysocki, 1999). Elle est enfin un important réservoir sanguin.

Figure 1. La peau normale humaine La peau normale humaine est composée de l’épiderme et du derme;

l’hypoderme est le tissu sous-jacent au derme (modifié de (Geras, 1990)).

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1.1.1 Épiderme Dérivé de l’ectoderme embryonnaire, l’épiderme, couche externe de la peau, est formé d’un

épais épithélium pavimenteux stratifié kératinisé dont l’épaisseur varie entre

0,04 et 1,5 mm (Holbrook, 1987). Composé de cellules épithéliales, il est la principale

structure protectrice du corps. L’épiderme est constitué à 90% de kératinocytes, lesquels

sont constitués principalement de kératines, protéines fibreuses et insolubles dans l’eau,

conférant aux cellules de l’épiderme leurs propriétés protectrices (Marieb, 1993; Wysocki,

1999). Trois autres types cellulaires, soit les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les

cellules de Merkel, cohabitent dans l’épiderme (Holbrook, 1987). Chacun d’eux possède

des fonctions spécifiques et non moins indispensables. Les mélanocytes ont pour fonction

de synthétiser la mélanine, pigment contribuant à la couleur de la peau et protégeant les

kératinocytes de la couche basale de l’épiderme des rayons ultra-violets (Lanza, 1997). Les

cellules de Langerhans constituent quant à elles des éléments essentiels du système de

défense de l’organisme. Enfin, les cellules de Merkel jouent un rôle de mécanorécepteur et

sont impliquées dans la fonction du toucher. L’épiderme n’est pas vascularisé et il dépend

donc des capillaires du derme pour l’alimenter en oxygène et autres nutriments (Wysocki,

1999).

L’épiderme de la peau épaisse se compose de cinq couches distinctes qui, de la plus

profonde à la plus superficielle, sont les suivantes : la couche basale (ou stratum

germinativum), la couche épineuse (ou stratum spinosum), la couche granuleuse (ou

stratum granulosum), la couche de transition (couche claire ou stratum lucidum) et la

couche cornée (ou stratum corneum) (figure 2) (Holbrook, 1987; Marieb, 1993; Wysocki,

1999). La peau fine ne contient quant à elle pas de couche claire. Au cours de leur

progression de la couche basale vers la couche cornée, les kératinocytes passent par les

différentes étapes du processus de différenciation terminale. Cette maturation prend en

moyenne 28 jours et permet à l’épiderme de se renouveler continuellement.

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Figure 2. Différenciation de la peau L’épiderme est constitué de plusieurs couches cellulaires qui, de la plus

profonde à la plus superficielle, sont les suivantes : la couche basale, la couche

épineuse, la couche granuleuse, la couche de transition (seulement dans la

peau épaisse) et la couche cornée (modifié de (Geras, 1990)).

1.1.2 Derme Le derme, adhérant fortement à l’épiderme par l’intermédiaire de la membrane basilaire, est

un tissu conjonctif de soutien constituant la partie la plus profonde de la peau et qui

provient du mésoderme embryonnaire (Holbrook, 1987). Son épaisseur varie entre

2 et 4 mm (Wysocki, 1999). Les fibroblastes sont les principales cellules du derme. Ils sont

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spécialisés dans la synthèse de plusieurs types de fibres protéiques : les fibres de collagène,

les fibres du système élastique dont l’élastine, les glycoprotéines et les protéoglycanes

(Holbrook, 1987; Lanza, 1997). Toutes ces protéines forment un réseau fibreux

macromoléculaire appelé matrice extracellulaire (MEC). Les fibres de collagène confèrent

au derme sa résistance aux tractions, les fibres du système élastique lui donnent ses

propriétés élastiques et les protéoglycanes sont responsables de sa résistance à la

compression (Holbrook, 1987; Marieb, 1993). Il est également à noter que les principaux

types de collagène retrouvés dans le derme sont les collagènes fibrillaires de types I et III

(Holbrook, 1987). Le collagène de type I représente environ 80% du collagène présent dans

le derme, l’autre 20% étant principalement composé de collagène de type III (Wysocki,

1999). D’autres cellules sont également présentes dans le derme, soit des macrophages, des

lymphocytes et des mastocytes (Holbrook, 1987; Lanza, 1997). À la différence de

l’épiderme, le derme est vascularisé, ce qui lui permet non seulement d’apporter à

l’épiderme énergie et nutriments, mais aussi de jouer un rôle primordial dans la

thermorégulation et la cicatrisation. Il est également pourvu d’un important réseau de

terminaisons nerveuses, de glandes sébacées et sudoripares, ainsi que de follicules pileux,

bien que ces derniers proviennent de l’épiderme. Le derme se compose de deux zones de

tissu conjonctif dense, soit le derme papillaire (superficiel) et le derme réticulaire (profond)

(Holbrook, 1987; Wysocki, 1999).

1.1.3 Hypoderme L’hypoderme, aussi appelé fascia superficiel, représente le tissu adipeux sous-cutané et il

est constitué de tissu conjonctif lâche (Wysocki, 1999). Bien qu’il ne fasse pas

véritablement partie de la peau, l’hypoderme est en interaction fonctionnelle avec la peau et

il lui permet ainsi d’assurer certaines de ses fonctions de protection (Marieb, 1993). Il

s’invagine dans le derme et y est rattaché par des fibres de collagène et d’élastine. Il est

essentiellement constitué d’adipocytes, un type de cellules spécialisées dans l’accumulation

et le stockage des graisses (Holbrook, 1987). L’hypoderme joue donc un rôle de réserve

énergétique. L’hypoderme participe également à la thermorégulation, la graisse étant un

isolant thermique (Holbrook, 1987).

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1.1.4 Annexes cutanées Les annexes cutanées, des structures réparties dans le derme et l’épiderme, interviennent

dans le maintien de l’homéostasie de la peau. Ces structures sont les poils, les ongles, et

deux types de glandes exocrines, les glandes sudoripares et sébacées (Marieb, 1993). Seuls

les poils seront discutés étant donné leur intérêt dans le cadre de cette étude.

1.1.4.1 Follicules pileux Bien que ces tout petits organes ne soient responsables d’aucune fonction vitale chez

l’humain, les poils confèrent plusieurs fonctions importantes aux mammifères comme par

exemple de maintenir la température corporelle et de fournir des sensations tactiles (Ebling,

1987). Diverses conditions sont associées à un défaut au niveau des poils, par exemple

l’hirsutisme (excès de poils survenant à la suite d’un dérèglement hormonal) ainsi que

l’alopécie (absence de poil survenant également à la suite d’un dérèglement hormonal, mais

pouvant aussi être causée par des mutations dans certains gènes) (Marieb, 1993).

Les follicules pileux sont également d’importants réservoirs de cellules souches pouvant

régénérer l’épiderme et ils jouent donc probablement un rôle important dans la guérison des

plaies (Morasso, 2005). Les plaies du premier degré n’affectent que l’épiderme (figure 3)

(Marieb, 1993). Il n’y a pas destruction des follicules pileux et la réépithélialisation,

processus par lequel les kératinocytes migrent pour couvrir la plaie, se fait par foyers

multiples à partir des poils. Dans le cas d’une brûlure au second degré, une portion saine du

derme et des annexes cutanées persiste (figure 3), et la réépithélialisation s’effectue à partir

de ces annexes (Marieb, 1993). Les plaies du troisième degré se caractérisent quant à elles

par la destruction complète de l’épiderme et du derme (figure 3) (Marieb, 1993). Puisque

les annexes cutanées et l’épiderme sont détruits, la réépithélialisation se fait à partir des

marges de la plaie plutôt qu’en foyers multiples à partir des follicules pileux, comme c’est

le cas dans les plaies du second degré. La qualité de la cicatrisation est donc affectée chez

les personnes ayant subi une destruction de leurs follicules pileux.

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Figure 3. Schéma des différents degrés de brûlure de la peau Une brûlure du premier degré affecte uniquement l’épiderme, alors qu’une

brûlure du second degré atteint le derme à un niveau variable (superficiel ou

profond). Dans une brûlure du troisième degré, l’épiderme et le derme sont

complètement détruits (François Berthod, LOEX).

1.1.4.2 Structure des follicules pileux Le poil, structure produite par le follicule pileux et constituée de cellules kératinisées, est

implanté obliquement dans le derme par invagination de l’épiderme (figure 4) (Marieb,

1993). Les principales parties du poil sont la tige, partie visible à la surface du tégument, et

la racine, partie invisible enchâssée dans le derme dont l’extrémité en cupule (le bulbe

pileux) reçoit la papille vasculaire nourricière (papille dermique) (Marieb, 1993). Le bulbe

pileux est entouré d’un enchevêtrement de terminaisons nerveuses sensitives s’enroulant

autour de chaque follicule et appelées plexus de la racine du poil (Marieb, 1993). Les poils

sont donc également des récepteurs sensoriels du toucher. La papille dermique est quant à

elle composée de tissu dermique et est vascularisée par des capillaires qui apportent aux

cellules du follicule pileux les nutriments essentiels à sa croissance (Marieb, 1993). Le poil

comporte aussi des annexes : une glande sébacée, l’ensemble formant l’unité pilo-sébacée,

et le muscle arrecteur, dont la contraction, sous l’influence du froid ou d’une émotion, est à

l’origine du phénomène de la « chair de poule ». Observée en coupe longitudinale, l’unité

pilo-sébacée du follicule se divise en plusieurs compartiments : l’infundibulum (portion

superficielle au-dessus du conduit de la glande sébacée en continuité avec l’épiderme

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interfolliculaire), l’isthmus (courte portion entre le conduit de la glande sébacée et la

protubérance du muscle arrecteur), le renflement où s’attache le muscle arrecteur du poil, et

le segment inférieur se terminant par le bulbe pileux (Moll, 1994; Luelmo-Aguilar, 2004).

Durant le développement des follicules pileux, les mélanocytes provenant de la crête

neurale migrent dans le poil, se différencient et produisent la mélanine. Ce pigment est

ensuite transmis des mélanocytes aux kératinocytes de la tige du poil, ce qui détermine la

couleur du poil (Botchkarev, 2003).

Figure 4. Structure des poils Le follicules pileux et la glande sébacée forme l’appareil pilo-sébacé (modifié

de (Geras, 1990)).

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1.1.4.3 Distribution et croissance des poils On divise généralement les poils en deux catégories : le duvet et les poils adultes. Le duvet,

fin et pâle, est celui que l’on retrouve habituellement chez les enfants et au niveau de

certains sites anatomiques des femmes adultes. Les poils adultes, plus épais, longs et

foncés, forment les sourcils et les cheveux. À la puberté, ils apparaissent aux aisselles, au

pubis, et chez les hommes, sur le visage, la poitrine, les bras et les jambes. Seules certaines

régions sont complètement dépourvues de poils : les lèvres, les mamelons, certaines parties

des organes génitaux externes, la paume des mains et la plante des pieds (Marieb, 1993).

Le follicule passe par plusieurs cycles de croissance au cours desquels chaque poil subit

trois phases successives (figure 5). En fait, c’est la portion inférieur du follicule pileux qui

subit le plus de transformations lors de ces cycles de croissance. Il y a d’abord la phase

anagène qui est la phase de croissance au cours de laquelle le poil croît de façon continue et

qui est caractérisée par une intense activité mitotique dans le bulbe vascularisé (Stenn,

2001). Les cellules de la matrice prolifèrent et se différencient donc pour former la gaine

folliculaire interne (GFI) et la tige du poil. La vitesse de croissance du poil est d’environ

0,25 à 0,50 mm/jour; elle varie en fonction de nombreux facteurs, mais diffère peu d’une

région à l’autre du corps. En revanche, la durée de la phase de croissance, facteur

déterminant la longueur moyenne des poils dans une zone déterminée, est très variable

selon la région du corps. La phase de croissance active est suivie d’une phase de transition

qui dure environ deux semaines durant lesquelles les mitoses s’arrêtent brutalement : c’est

la phase catagène (Stenn, 2001). Pendant cette phase, les deux tiers inférieurs du poil

entrent en mort cellulaire programmée; il y alors régression et raccourcissement du poil

(Weedon, 1981; Fuchs, 2001; Stenn, 2001). La phase de repos, période pendant laquelle la

matrice est inactive et le follicule s’atrophie, est appelée phase télogène et elle dure environ

trois mois (Stenn, 2001). Après la phase de repos, la matrice se réactive et forme un

nouveau poil qui remplacera celui qui est tombé ou qui le délogera s’il est encore présent.

Au moment où le poil entre dans un nouveau cycle de croissance, les cellules souches

épithéliales du follicule sont stimulées afin qu’elles se divisent grâce à un signal provenant

de la papille dermique (Fuchs, 2001).

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Figure 5. Le cycle du poil La croissance du poil est cyclique et se déroule en trois phases : anagène

(croissance), catagène (régression) et télogène (repos) (tiré de (Fuchs, 2001)).

1.1.4.4 Développement des follicules pileux L’initiation du développement des follicules pileux chez les mammifères est contrôlée par

une série d’interactions réciproques entre l’épithélium et le mésenchyme (figure 6) (Hardy,

1992; Millar, 2002). Le premier signe visible de la formation des poils est la présence d’une

placode. Celle-ci est formée à la suite d’un épaississement de l’ectoderme embryonnaire

induit par ce qu’on appelle le « premier signal » provenant du mésenchyme sous-jacent

(Hardy, 1992; Millar, 2002). La formation de la placode implique un changement au niveau

de la forme des cellules épithéliales qui deviennent alors plus allongées que les cellules

adjacentes ne faisant pas partie de la placode. Un signal provenant de la placode provoque

par la suite une condensation des cellules du mésenchyme. Ensuite, ce qu’on appelle

« le deuxième signal » qui provient du mésoderme induit quant à lui la prolifération des

cellules épithéliales de la placode qui vont alors croître vers l’intérieur du mésenchyme,

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formant ainsi la matrice germinale qui est à l’origine même du poil (Millar, 2002). En effet,

en proliférant, les cellules de la matrice repoussent les cellules superficielles vers

l’extérieur, soit dans la dépression produite par l’invagination tubulaire de l’épiderme qui

s’enfonce dans le derme. Cette invagination épidermique, constituant la gaine épithéliale du

poil, se renfle à son extrémité profonde et constitue là un amas de cellules matricielles

coiffant une papille de tissu conjonctif vascularisé. Cette papille dermique est formée par

les cellules épithéliales qui entourent le condensa de cellules mésodermiques et elle

représente une structure permanente à la base des follicules qui contrôle la croissance et la

différenciation des poils (Millar, 2002).

Une fois la structure primaire du poil établie, la différenciation des couches concentriques

de kératinocytes peut commencer (Kulessa, 2000). En effet, les cellules épithéliales

contenues dans la matrice du poil recouvrent la papille, se divisent par mitose et donnent

des cellules qui se remplissent de kératines et qui permettent l’allongement du poil grâce à

l’addition à sa base d’autres cellules qui vont elles aussi se kératiniser. Ce sont des signaux

chimiques en provenance de la papille dermique qui stimulent la division des cellules

épithéliales de la matrice. Au fur et à mesure que la matrice produit de nouvelles cellules, la

partie la plus ancienne du poil est poussée vers le haut; ces cellules deviennent de plus en

plus kératinisées et meurent. La couche en périphérie forme ainsi la gaine folliculaire

externe (GFE) qui est en continuité avec la couche basale de l’épiderme (Kulessa, 2000;

Fuchs, 2001). À l’intérieur même du poil, deux autres couches se développent à partir des

cellules de la matrice entourant la papille dermique, soit la gaine folliculaire interne

(couche de Henley, couche de Huxley et cuticule de la gaine) et la tige du poil qui se

compose presque totalement de kératines dures (Kulessa, 2000; Fuchs, 2001). Les cellules

épithéliales finissent par arrêter de se diviser et elles se différencient selon leur

emplacement dans le follicule (Botchkarev, 2003). Les cellules proches de la GFE forment

la GFI alors que les cellules localisées au centre donnent la tige du poil qui se compose de

la medulla au centre, du cortex et de la cuticule vers l’extérieur (Kulessa, 2000;

Botchkarev, 2003).

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Figure 6. La morphogenèse des poils Séquence d’évènements menant à la formation des follicules pileux (modifié de

(Millar, 2002)).

1.1.5 Particularités de la peau murine Comme la plupart des expériences effectuées lors de cette étude ont été réalisées avec des

cellules murines ainsi qu’avec des modèles murins, il importe de préciser quelques

particularités de la peau murine par rapport à la peau humaine décrite précédemment. Bien

que les deux types de peau soient semblables au niveau histologique, il existe bien sûr de

nombreuses distinctions.

La différence majeure est évidemment la grande densité de follicules pileux qui recouvrent

la souris. L’épiderme interfolliculaire est en effet pratiquement inexistant. De plus, les

souris possèdent certains types de poils qu’on ne retrouve pas chez l’humain, comme par

exemple les vibrisses. Les poils murins ont également un cycle de vie différent de celui des

humains. En effet, la plupart des follicules pileux murins adultes demeurent dans la phase

télogène pour de longues périodes, ce qui explique le fait que la longueur des poils est

constante chez les souris adultes alors que chez les humains, les poils poussent

continuellement. L’épiderme murin est aussi très mince et ne possède que quelques couches

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de cellules vivantes, soit 2 à 3 couches, comparativement à 10 à 15 chez l’humain. Les

souris sont également dépourvues de glandes apocrines (Sundberg, 1996). Les dômes

tactiles contenant les cellules de Merkel sont toutefois beaucoup plus nombreux chez les

souris que chez les humains et leur distribution est aussi différente. En effet, contrairement

à ce qui est retrouvé dans la peau humaine, les cellules de Merkel sont toujours absentes de

l’épithélium des poils de souris (Moll, 1996). On les retrouve plutôt au niveau de la GFE

des vibrisses ainsi que dans les coussinets plantaires (Moll, 1996).

Bien que l’utilisation de souris en tant que modèle animal présente plusieurs avantages, il

est important de demeurer conscient des nombreuses différences existant entre les deux

espèces. La prudence est de mise dans l’interprétation des résultats obtenus chez la souris;

ces derniers ne peuvent pas toujours être extrapolés à l’humain.

1.2 Filaments intermédiaires Les trois catégories de fibres cytosquelettiques qui ont pour rôle de maintenir l’intégrité et

la structure cellulaire dans les cellules eucaryotes sont les microfilaments d’actine, les

microtubules et les filaments intermédiaires (Omary, 2002). Ces derniers tirent leur nom du

fait que leur taille (10 nm) est intermédiaire entre la taille des microtubules (24 nm) et celle

des microfilaments (7 nm) (Lee, 1993). Contrairement au rôle moteur des microtubules, le

rôle des filaments intermédiaires est surtout structural car on ne les a jamais vus intervenir

directement (Lodish, 1997). Ils servent donc à renforcer les membranes de la cellule au

moment des déformations subies lors des mouvements cellulaires. Chez les vertébrés

supérieurs, les filaments intermédiaires comprennent une superfamille de protéines

essentiellement α-hélicoïdales, divisée en cinq groupes principaux (types I à V) basés sur

leurs caractéristiques structurales (Lodish, 1997; Omary, 2002). Dans le cadre de cette

étude, un intérêt particulier fut porté aux filaments intermédiaires de types I, II et IV.

1.2.1 Kératines Les plus grands sous-groupes de filaments intermédiaires sont les kératines de types I et II

qui incluent entre autres les kératines spécifiques aux cellules épithéliales, soit les

kératines 9 à 20 (K9-K20, type I) et les kératines 1 à 8 (K1-K8, type II) (Coulombe, 2002;

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Ku, 2004). Toutes les cellules épithéliales expriment au moins une combinaison de

kératines de type I (kératines acides) et de type II (kératines basiques). Les kératines sont en

effet des hétérodimères obligés formés d’un mélange, dans le rapport 1/1, de chaînes

polypeptidiques basiques et acides (Coulombe, 1993; Omary, 2002; Ku, 2004). Un seul

type ne forme donc pas à lui seul de filament de kératines. Exprimés de façon typique dans

les cellules épithéliales, les filaments intermédiaires de kératines sont habituellement

connectés aux desmosomes et aux hémidesmosomes qui représentent respectivement les

endroits par lesquels une cellule s’accroche à sa voisine ou à la matrice (Lodish, 1997).

L’expression des kératines est caractéristique non seulement du type de tissu mais aussi

d’un stade de différenciation donné, ce qui en font des marqueurs de choix pour distinguer

différentes sous-populations cellulaires (Moll, 1982). Lors de cette étude, quelques

marquages à la kératine 14 (K14; 50 kDa) ont été effectués. Il est à noter que celle-ci se

retrouve en paire avec la kératine 5 (K5; 58 kDa) et que l’ensemble K5/K14 est exprimé

dans les kératinocytes des couches basales des épithéliums stratifiés et des follicules pileux

humains et murins (Freedberg, 1987). À 24 semaines de gestation, les K5 et K14 sont des

composants majeurs de l’épiderme pluristratifié (Moll, 1982).

1.2.2 Neurofilaments Les neurofilaments, des filaments intermédiaires de type IV, constituent l’un des principaux

éléments du cytosquelette des cellules nerveuses. On les retrouve au niveau des neurones

centraux et périphériques matures. Les neurofilaments sont formés par la co-polymérisation

de trois protéines de la famille des filaments intermédiaires appelées NF-L, NF-M et NF-H

respectivement de poids moléculaires apparent de 68, de 150 et de 200 kDa (L, M et H

représentant respectivement des classes de masse peu, moyennement et très élevée)

(Steinert, 1988; Betts, 1997; Lodish, 1997). Aucune de ces sous-unités n’est capable de

s’assembler en filaments en l’absence des deux autres. Les neurofilaments représentent

donc des marqueurs de choix pour détecter la présence de prolongements axonaux dans la

peau.

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1.3 Système nerveux périphérique cutané Les nerfs qui transmettent les messages moteurs et sensitifs entre le système nerveux

central (SNC) et le reste de l’organisme font partie du système nerveux périphérique (SNP).

Le SNP comprend en fait deux ensembles distincts de cellules. Il y a d’abord le système

nerveux sensitif qui se compose de neurones qui acheminent les stimulis nociceptifs

(douleur, chaleur, perception tactile) qui proviennent du milieu externe vers le SNC

(Campbell, 1995). Le système nerveux moteur conduit quant à lui l’information en

provenance du SNC vers les cellules effectrices (Campbell, 1995). La voie motrice

comprend entre autres le système nerveux autonome, aussi appelé système nerveux

involontaire, qui comprend quant à lui le système nerveux sympathique. Ce dernier relie le

SNC aux muscles lisses et aux glandes des viscères ainsi qu’aux vaisseaux et à la peau

(Purves, 1999).

Par ses fonctions sensorielles, la peau est une source primordiale d’informations pour

l’individu. Les nerfs périphériques sont responsables de l’innervation de la peau et ils

possèdent des axones dont les corps cellulaires se trouvent le long de la moelle épinière

(Lanza, 1997). En plus des axones, les neurones possèdent un autre type de prolongement,

soit des dendrites. Ces dernières, qui sont nombreuses et très ramifiées chez la plupart des

neurones (neurones moteurs et interneurones), ont pour fonction d’acheminer divers

signaux vers le corps du neurone (figure 7A) (Campbell, 1995). En ce qui a trait aux

neurones sensitifs de la peau, un prolongement émerge du corps cellulaire et forme un

prolongement central et un prolongement périphérique qui, à eux deux, constituent l’axone

(figure 7B) (Marieb, 1993). Seules les terminaisons distales du prolongement périphérique

sont des dendrites. Les corps cellulaires des neurones sensoriels sont localisés dans les

ganglions de la racine dorsale (DRG) adjacents à la moelle épinière (Lanza, 1997). Ces

différents neurones transmettent les influx (potentiel d’action) des récepteurs sensoriels de

la peau ou des organes internes vers le SNC où s’effectue l’analyse des informations

sensorielles. Les neurones moteurs et sensoriels sont uniques entre autres à cause du

processus d’élongation axonale qui peut atteindre jusqu’à 1 mètre et plus de longueur. Les

axones sont entourés par les cellules de Schwann, lesquelles fournissent un support

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structural et chimique à tous les neurones du SNP en plus d’accroître la conductivité via la

gaine de myéline (Lanza, 1997).

Figure 7. Structure des neurones Les neurones moteurs et les interneurones possèdent de nombreux

prolongements émergeant du corps cellulaire : un grand nombre de dendrites

et un seul axone (A). Les neurones sensitifs de la peau contiennent un

prolongement unique qui émerge du corps cellulaire et qui constitue l’axone

(B) (tiré de (Marieb, 1993)).

1.3.1 Innervation cutanée L’innervation cutanée comprend entre autres des fibres nerveuses sensitives et autonomes

sympathiques. On distingue cinq types de structures spécialisées qui fonctionnent comme

récepteurs du toucher, de la douleur, de la température, de la démangeaison et des

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stimulations mécaniques (figure 8) (Holbrook, 1987). Il y a d’abord les terminaisons

nerveuses libres superficielles qui sont des fibres sensitives seules qui pénètrent jusqu’à

l’intérieur de l’épiderme. Elles sont sans aucun doute les récepteurs sensoriels les plus

répandus et les plus importants du corps humain (Holbrook, 1987). D’autres de ces fibres

se situent sous les glandes sébacées et tout autour de la racine du poil : c’est le plexus de la

racine du follicule pileux (Marieb, 1993). Ces récepteurs sont sensibles aux mouvements

des poils. Les autres fibres nerveuses sont quant à elles associées à des récepteurs cutanés

(ou corpuscules sensoriels) dont il existe plusieurs formes (Johnson, 2001). On retrouve

d’abord les corpuscules de Meissner qui sont situés dans les papilles du derme de la peau

glabre et qui détectent les contacts légers. Puis il y a les corpuscules de Pacini qui sont plus

volumineux et qui sont présents dans le derme profond et dans les tissus conjonctifs sous-

cutanés. Ils réagissent quant à eux rapidement aux pressions intenses. Juste sous l’épiderme

se trouvent les corpuscules de Rufini qui détectent les pressions intenses et l’étirement.

Enfin, il y a les dômes tactiles de Merkel qui sont formés par l’association d’un groupe de

cellules de Merkel et d’une terminaison nerveuse libre et qui sont des récepteurs

superficiels qui répondent à des pressions localisées.

Il existe également une corrélation entre le développement des follicules pileux et le

développement de l’innervation de la peau. L’équipe du Dr Munger a en effet démontré que

l’innervation cutanée précédait le développement du premier follicule pileux

morphologiquement reconnaissable par au moins deux jours (Munger, 1991). Les fibres

nerveuses approcheraient donc l’endroit exact où les follicules pileux vont se développer

avant même l’initiation du développement des poils (Peters, 2002). Ils ont également

démontré que la formation des différents types de terminaisons nerveuses et la séquence de

leur développement sont dictées par les follicules pileux plutôt que par un signal provenant

des DRG (Munger, 1991).

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Figure 8. Innervation de la peau L’innervation cutanée comprend différents types de structures spécialisées tels

que les terminaisons nerveuses libres, les corpuscules de Meissner, les

corpuscules de Pacini, les corpuscules de Rufini et les dômes tactiles de

Merkel, qui fonctionnent comme récepteurs du toucher, de la douleur, de la

température, de la démangeaison et des stimulations mécaniques (tiré de

(Tortora, 1994)).

1.3.2 Régénération nerveuse périphérique Le développement du SNP requiert des interactions spécifiques cellules-cellules et cellules-

MEC qui dirigent la migration des axones vers leurs cibles (Gingras, 2003a). Dans des

situations pathologiques, la régénération des nerfs endommagés suit un processus similaire.

Si la lésion survient proche du corps cellulaire, le neurone risque de mourir puisqu’un large

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segment axonal est perdu (Lanza, 1997). Cependant, lorsque la lésion survient plus en

périphérie, les axones ont plus de chance de se régénérer (Lanza, 1997). La régénération

des nerfs périphériques comprend la formation des bourgeons axonaux, leur élongation,

ainsi que la réinnervation de leurs cibles d’origine (Ide, 1996).

Les extrémités d’un axone périphérique endommagé gonflent rapidement après une lésion à

cause de l’accumulation de substances transportées dans l’axone (Marieb, 1993). Il y a

alors diminution de la production de neurotransmetteurs et augmentation de la production

des substrats nécessaires à la reconstitution de l’axone (Lanza, 1997). La partie de l’axone

et de sa gaine de myéline située en aval de la lésion commence alors à se désintégrer

puisqu’elle ne reçoit plus du corps cellulaire les nutriments et les autres substances qui lui

sont essentielles (Ide, 1996). Ce processus est appelé dégénérescence wallérienne

(figure 9). Des cellules de Schwann et des macrophages migrent par la suite dans la zone du

traumatisme et commencent à phagocyter la myéline en décomposition et les débris de

l’axone (Ide, 1996). Une fois les débris nettoyés, les cellules de Schwann prolifèrent et

forment des cordons cellulaires (band of Büngner) qui guident les repousses de l’axone

(cônes de croissance) en voie de régénération vers leurs points de contact antérieurs

(Marieb, 1993; Ide, 1996). Ces mêmes cellules ont pour fonction de protéger, de soutenir et

de remyéliniser l’axone tout en libérant des facteurs favorisant sa croissance.

Plusieurs protéines exprimées durant la dégénérescence wallérienne stimulent l’élongation

des neurites in vitro, incluant le facteur de croissance neuronale (NGF), le facteur

neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), la molécule d’adhérence cellulaire neuronale

(NCAM) et la molécule d’adhérence cellulaire L1 (L1 CAM), de même qu’un composant

de la MEC, la laminine (Tonge, 1997). Dans le SNP, les cônes de croissance des neurones

en développement et en régénération peuvent s’attacher activement aux molécules de la

MEC comme la laminine, le collagène ou la fibronectine, ce qui facilite l’élongation des

neurites vers leurs propres cibles (Borkenhagen, 1998; Purves, 1999). Les cellules

neuronales ont l’habileté d’interagir avec ces molécules par le biais de la grande famille des

récepteurs aux intégrines.

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Figure 9. Dégénérescence wallérienne Lorsqu’une fibre nerveuse est sectionnée, la partie séparée du corps cellulaire

dégénère. C'est le phénomène de la dégénérescence wallérienne. Par contre, la

partie encore reliée au corps cellulaire peut régénérer (tiré de (Tortora,

1994)).

1.3.3 Rôles trophiques des nerfs périphériques Les neurones sont, jusqu’à un certain point, dépendants de la présence de leur cible pour

leur maintien en vie. Cette dépendance est qualifiée d’interaction trophique et est fondée

sur des molécules signalétiques spécifiques auxquelles on a donné le nom de facteurs

neurotrophiques. Ceux-ci proviennent des tissus cibles et régulent la survie des neurones

ainsi que leur croissance et leur différenciation ultérieure (Purves, 1999). Bien que les

fibres nerveuses cutanées aient des fonctions sensorielles, elles jouent également un rôle au

niveau de l’inflammation neurogène. Les neurotrophines (NT) et les neuropeptides (NP)

sont reconnus pour être impliqués dans la guérison des plaies et dans la réparation des

tissus (Paus, 1997). Plusieurs suggèrent même qu’elles auraient des effets trophiques. Paus

et al. ont en effet caractérisé les nerfs périphériques comme ayant un rôle trophique dans la

croissance de l’épithélium (Paus, 1997). Étant la structure de la peau la plus innervée, le

follicule pileux représente à ce niveau un modèle de choix pour l’étude de ces effets

neurotrophiques et des interactions neuroépithéliales.

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1.3.3.1 Neurotrophines L’épithélium de la peau est une source de NT de la famille des facteurs de croissance

neuronale tels que le NGF, le BDNF, la NT3 et la NT4/5 (Paus, 1997). Ces facteurs sont

connus pour leur influence sur la différenciation, le développement et la survie d’une

grande variété de neurones dans le SNP, particulièrement durant le développement

embryonnaire de la peau (Davies, 1987; Di Marco, 1991). Les NT jouent également un rôle

majeur dans la régulation de la croissance neuronale, et particulièrement dans la

régénération à la suite d’une lésion (Kimpinski, 1997). Toutefois, les NT exercent plusieurs

fonctions de croissance et de régulation au-delà du système nerveux (Botchkarev, 1998). En

effet, dans la peau, le NGF contrôle non seulement le développement de l’innervation des

cibles sensorielles et autonomiques, mais stimule aussi la prolifération des kératinocytes

tout en inhibant leur apoptose (Botchkarev, 1999). De plus, les follicules pileux murins

démontrent une expression contrôlée de NT, incluant NGF, BDNF, NT3 et NT4/5, ainsi

que leur récepteur TrkA, TrkB, TrkC (tyrosine kinase A-C) et p75NTR (récepteur à la

neurotrophine p75) (Botchkarev, 2004).

Les NT sont également impliquées dans la morphogenèse des poils (Botchkarev, 1998).

Dans la biologie des poils, les NT représentent une famille de polypeptides structurellement

et fonctionnellement reliés dont les quatre membres (NGF, BDNF, NT3 et NT4/5) ont une

taille d’environ 13 kDa et partagent environ 50% d’homologie de séquence en acides

aminés (Ibanez, 1998; Botchkarev, 2004). Lorsqu’elles s’associent en dimères, les NT

exercent leurs effets biologiques en interagissant avec des récepteurs spécifiques (Ibanez,

1998; Botchkarev, 2004). Les poils sont donc une source périphérique importante de NT. Il

est également à noter qu’en plus d’être une source de NT, les poils sont aussi une cible pour

les NT puisqu’ils expriment des récepteurs aux NT (Paus, 1997).

Il est fort probable que les facteurs de croissance qui gouvernent le développement, le

maintien et l’élongation des axones sont également impliqués dans la morphogenèse de la

peau et dans le développement des appendices de la peau (Botchkarev, 2004). Une série

d’études a démontré que les NT pouvaient être générées localement dans la peau, par

exemple par les cellules gliales (cellules de Schwann), les cellules épithéliales, les

fibroblastes et les cellules de Merkel, et que le NGF et les autres NT sont importants pour

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une bonne innervation de cet organe sensoriel périphérique (Lewin, 1996; Botchkarev,

2004). En effet, des défectuosités dans la signalisation des NT sont souvent associées à des

anomalies sensorielles sévères de la peau, inhibant ainsi la guérison des plaies (Lambiase,

2000; Botchkarev, 2004). De plus, il y a environ quinze ans, la peau a été identifiée comme

étant une source riche en NGF et l’épiderme a été reconnu comme étant un site

d’expression du NGF (Davies, 1987; Weskamp, 1987). Peu de temps après, il devint clair

que les kératinocytes épidermiques étaient non seulement d’importantes sources de NGF,

mais qu’ils étaient également des cibles pour les NT, du moins en culture (Di Marco, 1991;

Botchkarev, 2004).

1.3.3.2 Neuropeptides Les NP sont un groupe hétérogène de plus de 50 molécules qui jouent un rôle au niveau de

diverses fonctions cutanées et qui sont impliqués dans certaines maladies. Ils servent de

neuromodulateurs, de neurotransmetteurs, de neurohormones et même d’hormones. Dans la

peau, les NP sont synthétisés localement et transportés par des fibres nerveuses ou des

cellules immunitaires (Lotti, 1995). Les fibres nerveuses sensitives contiennent des NP

synthétisés dans le corps cellulaire et qui sont transportés par des vésicules vers les

terminaisons nerveuses périphériques. Plusieurs NP sont exprimés dans les neurones

sensoriels, incluant le peptide dérivé du gène de la calcitonine (CGRP), la neurokinine A

(NKA), la somatostatine, la substance P (SP) et le peptide intestinal vasoactif (VIP) (Lotti,

1995; Sternini, 1997; Altun, 2001). Il est également à noter que le CGRP, un NP retrouvé

principalement au niveau des fibres sensorielles de petit diamètre et impliqué dans

l’inflammation neurogène, ainsi que la SP, laquelle coexiste fréquemment avec le CGRP,

sont deux marqueurs peptidiques largement utilisés pour la révélation des fibres nerveuses

sensitives (Sternini, 1997; Peters, 2001; Hall, 2002).

Plusieurs études suggèrent que le système nerveux de la peau contribuerait à la guérison

des plaies, principalement grâce aux effets biologiques du relarguage des NP (Altun, 2001).

Les NP jouent effectivement un rôle important durant les étapes de la guérison des plaies,

non seulement en affectant la vasodilatation et la réponse inflammatoire, mais également en

stimulant la prolifération des cellules des tissus épithélial, vasculaire et conjonctif (Altun,

2001). Depuis quelques années déjà, il y a un intérêt croissant concernant les fonctions

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trophiques de l’innervation de la peau, comme par exemple la guérison des plaies ou encore

le maintien de diverses structures épithéliales comme l’épiderme ou les poils. Plusieurs

observations suggèrent même que les fibres nerveuses sensitives joueraient un rôle dans le

contrôle de la croissance des poils (Paus, 1997).

1.3.4 Revue de littérature sur les connaissances actuelles concernant la réinnervation de peaux greffées Lorsqu’une plaie nécessite une greffe de peau, par exemple à la suite d’une brûlure

profonde au troisième degré, il existe principalement deux options : la greffe de peau

autologue ou l’utilisation d’équivalents cutanés. Dans le cas de greffes de peau autologues,

c’est-à-dire à partir d’un prélèvement de peau d’un site donneur du patient, il a été décrit

dans la littérature qu’une régénération des terminaisons nerveuses libres s’effectuait à partir

du lit et des marges de la plaie. Cette régénération est toutefois lente, incomplète,

désordonnée et très variable d’une greffe à l’autre. Weiss-Becker et al. ont également

démontré qu’elle variait selon le type et l’épaisseur de la greffe, la plaie, la chirurgie et les

soins post-opératoires (Weiss-Becker, 1998). La réhabilitation des corpuscules déjà

existants serait toutefois possible (Brunelli, 1995). Uno et Montagna ont en effet démontré

sur des modèles animaux qu’il pouvait y avoir réinnervation des follicules pileux et des

corpuscules de Meissner en présence d’une greffe de peau poilue (Uno, 1982).

Dans le cas d’un manque de disponibilité d’un site donneur, on peut alors avoir recours à

l’utilisation d’équivalents cutanés produits in vitro. Deux types d’équivalents ont entre

autres été décrits dans la littérature. Kangesu et al. travaillent sur des dermes autologues

ensemencés de kératinocytes autologues (greffe kérato-dermique) (Kangesu, 1998), alors

que l’équipe du Dr English travaille sur des équivalents cutanés également autologues

préparés à partir de kératinocytes en culture et d’un gel de collagène ensemencé de

fibroblastes (English, 1992a; English, 1992b). Ces deux types d’équivalents cutanés

permettent une certaine régénération nerveuse. Malheureusement, la peau générée in vitro

ne possède pas d’annexe cutanée et donc pas de terminaison nerveuse spécialisée qui leur

est associée. Il existe très peu d’études concernant la réinnervation de tels équivalents.

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24

Le relarguage de facteurs neurotrophiques comme le NGF à partir de cellules cibles de la

greffe peut influencer la qualité de la réinnervation. Des études antérieures ont suggéré que

les appendices de la greffe, comme par exemple les follicules pileux et les glandes

sébacées, seraient une cible pour le neurotropisme (Kangesu, 1998). Pendant la guérison

des plaies, l’angiogenèse pourrait également jouer un rôle important dans la régénération

nerveuse cutanée.

1.3.5 Revue de littérature sur les modèles in vitro pour l’étude de la régénération nerveuse Il existe des modèles en deux et en trois dimensions pour l’étude in vitro de la régénération

nerveuse. Les modèles en deux dimensions consistent à cultiver les neurones in vitro. Une

façon de cultiver des neurones est de placer des explants de DRG sur des lamelles ou sur du

plastique tapissé de collagène, de laminine ou de poly-D-lysine (Macias, 2000). Une autre

méthode décrite dans la littérature est celle de l’utilisation de chambres de culture

compartimentées dans lesquelles sont placés des DRG au centre et différentes molécules

neurotrophiques dans les autres compartiments (Kimpinski, 1997). Différents modèles en

trois dimensions ont également été proposés pour étudier le phénomène d’extension des

neurites, tels que des modèles de gel d’agarose contenant des éléments spécifiques de la

MEC (Borkenhagen, 1998), des modèles composés de molécules biodégradables diverses

(Maquet, 2000), ainsi que des hydrogels d’agarose (Bellamkonda, 1995).

1.4 Problématique et objectifs

1.4.1 Intérêt clinique La brûlure représente probablement la blessure la plus sévère pour le corps humain. Dans le

cas d’une brûlure profonde, les fibres nerveuses sont détruites. Dépendamment du type de

recouvrement de la plaie, lors de la cicatrisation, il y a une réinnervation des nerfs

sous-cutanés périphériques, des récepteurs et des terminaisons nerveuses cutanées qui est

souvent médiocre, voire même absente, et il y a alors une récupération incomplète de

sensibilité tactile (Waris, 1978; Hermanson, 1986; Ward, 1991; Stella, 1994; Malenfant,

1996; Malenfant, 1998; Watanabe, 2000). Une fois qu’il y a eu destruction d’un tissu, la

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25

seule régénération possible est la régénération axonale à partir du lit de la plaie. La

croissance des neurites pendant la guérison de la plaie peut prendre plusieurs mois et

dépend de la qualité du remodelage de la peau. Il y a également plusieurs facteurs pouvant

influencer la régénération nerveuse dont l’âge, la présence de facteurs neurotrophiques, la

MEC, les interactions cellules-cellules et bien d’autres. En effet, la structure dense et

anarchique de la MEC des cicatrices ainsi que le processus de rétraction de la plaie

induisent une dégénérescence des fibres nerveuses en cours de régénération et sont

probablement en partie responsables de la déficience de cette réinnervation (Waris, 1978;

Kishimoto, 1982; Wallengren, 1999). La régénération anarchique du derme, responsable de

la formation des cicatrices hypertrophiques et rétractiles et de l’absence de réinnervation,

peut être évitée en greffant sur la plaie une peau complète avec un derme suffisamment

épais, comme c’est le cas pour le modèle de peau reconstruite sous forme d’éponge.

Le modèle de peau reconstruite sur lequel travaille notre équipe est basé sur l’utilisation

d’une éponge de collagène composée de collagène bovin de types I et III et de chitosane

(Shahabeddin, 1990; Berthod, 1994). Ce dernier est un polysaccharide dérivé de la carapace

des crustacés permettant d’établir des liaisons ioniques avec les groupements carboxyles du

collagène grâce à ses nombreux groupements aminés (Singla, 2001). En comparaison avec

d’autres types d’éponge, l’utilisation du chitosane représente une innovation majeure de ce

modèle puisque les autres modèles sont habituellement réticulés au glutaraldéhyde, produit

hautement toxique (Yannas, 1980; Boyce, 1988). Cette éponge présente également

l’avantage d’être faiblement rétractée par les fibroblastes et d’avoir une épaisseur et des

dimensions facilement modulables et se rapprochant de l’épaisseur de la peau normale

humaine (Berthod, 1994). Un autre modèle utilisé dans le cadre du présent projet est celui

de la peau reconstruite par la méthode d’autoassemblage exclusive au Laboratoire

d’Organogénèse Expérimentale (LOEX) (Michel, 1999). L’intérêt de ce modèle réside dans

le fait qu’il peut être constitué uniquement de matériel humain entièrement sécrété par les

cellules obtenues d’une biopsie de peau humaine. Le fait d’avoir un modèle constitué de

cellules humaines est très important dans le cadre d’études in vitro puisque l’objectif

principal est d’extrapoler les résultats à l’humain.

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26

Il existe différents modèles de peaux reconstruites in vitro développés par plusieurs

laboratoires dans le monde (Berthod, 1997c). La principale innovation de notre modèle par

rapport aux modèles actuellement commercialisés est la possibilité de produire des peaux

reconstruites autologues, c’est-à-dire constituées avec les propres cellules du patient, plutôt

qu’hétérologues. Cette différence majeure permet donc de réaliser une greffe de peau

permanente, contrairement aux transplantations de peaux reconstruites hétérologues qui

sont plutôt utilisées comme des pansements temporaires de haute technologie.

Notre modèle de peau reconstruite a donc pour objectif clinique d’être appliqué sur des

brûlures profondes, là où aucune autogreffe n’aurait été possible dans des délais

raisonnables en raison du manque de surface de peau saine, dans le cas de patients brûlés à

plus de 50% de leur surface corporelle totale par exemple. Le présent projet a pour objectif

d’optimiser le modèle de peau reconstruite déjà mis au point par notre équipe afin qu’il

stimule le processus de régénération nerveuse après greffe. Ceci permettrait d’améliorer la

récupération sensitive des grands brûlés, dans l’espoir de faire mieux qu’une autogreffe, et

ce, grâce à l’incorporation de molécules neurotrophiques, de cellules ou d’appendices dans

le biomatériau. Dans le cadre du présent projet, nous avons utilisé des follicules pileux et

avons posé comme hypothèse que les poils avaient une influence positive sur la migration

axonale. À long terme, la greffe de peaux reconstruites enrichies en follicules pileux

autologues pourrait améliorer la récupération tactile du greffon.

1.4.2 Intérêt fondamental La réinnervation du SNP après une lésion ou une dégénérescence est un processus essentiel

pour permettre une récupération sensitive, motrice ou végétative des organes lésés. Le

processus de réinnervation demeure toutefois encore mal compris, bien qu’il fasse l’objet

de nombreuses études (Song, 2001; Yu, 2001a; Patel, 2002). En effet, de nombreuses

équipes dans le monde essaient de percer les mystères de la régénération nerveuse afin de la

stimuler à volonté pour traiter efficacement de nombreuses pathologies. La progression du

cône de croissance de l’axone est en effet un phénomène extrêmement complexe modulé

par la combinaison de molécules attractives et répulsives, ainsi que par l’établissement de

gradients nutritionnels (Madison, 2000; Pasterkamp, 2001; Yu, 2001a; Patel, 2002). La

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27

compréhension des différents mécanismes régulant la migration axonale est donc

essentielle pour pouvoir éventuellement stimuler la régénération nerveuse périphérique

chez des patients souffrant d’une lésion ou d’une dégénérescence nerveuse.

Dans la peau avec poils, les follicules pileux sont enrobés d’une terminaison nerveuse

sensitive, soit le récepteur folliculaire des poils, qui représente un des composants majeurs

du toucher de la peau poilue. Le processus par lequel la terminaison nerveuse vient

s’enrouler autour du follicule pileux demeure toutefois inconnu. De plus, dans le cas d’une

brûlure profonde, les follicule pileux et les fibres nerveuse sont détruits. Notre objectif

fondamental est donc de mettre au point un modèle de régénération du SNP sensoriel le

plus fidèle possible à la réalité physiologique, de façon à mieux comprendre le processus de

migration axonale, et donc, à mieux le maîtriser. Pour y parvenir, nous avons utilisé le

modèle de peau reconstruite mis au point par notre équipe qui permet d’étudier la migration

des axones dans un environnement tridimensionnel bien contrôlé et mimant un tissu

conjonctif. Puis, nous avons incorporé des follicules pileux immatures (FPI) murins afin

d’étudier leur effet positif ou négatif sur l’élongation axonale, le tout, dans un tissu

composé de fibroblastes et de la MEC que ces fibroblastes ont déposée. L’addition de

follicules pileux dans ces peaux reconstruites, en plus d’un épiderme, devrait permettre

d’orienter la migration des axones autour des follicules, et éventuellement, ces axones

pourraient stimuler en retour le développement du follicule.

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Chapitre 2

Matériel et méthodes

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29

2.1 Culture cellulaire

2.1.1 Fibroblastes L’extraction des fibroblastes humains a été effectuée à partir d’un morceau de peau

provenant d’une réduction mammaire, tel que décrit précédemment (Auger, 1995). Selon

une technique adaptée des travaux de Germain et al., les fibroblastes murins ont quant à

eux été isolés à partir de biopsies de peau de souris adultes et nouveau-nées (Germain,

1995). Brièvement, les morceaux de peau ont été incubés 3 h à 37°C dans une solution de

thermolysine (Sigma, Oakville, On, Canada) à une concentration de 500 µg/ml dans de

l’HEPES (ICN Biomedicals, Saint-Laurent, Québec, Canada). L’épiderme a ensuite été

séparé mécaniquement du derme à l’aide de pinces. Le derme a été incubé 16 h à 37°C dans

0,125 U/ml de collagénase H (Boehringer Mannheim, Laval, Qc, Canada) pour récupérer

les fibroblastes.

Les fibroblastes humains et murins ont été cultivés dans du milieu DME complet, soit du

Dulbecco-Vogt modification of Eagle’s medium (DMEM; Gibco, Burlington, On, Canada)

contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF; Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U/ml de

pénicilline G (Sigma) et 25 µg/ml de gentamycine (Schering, Pointe-Claire, Qc, Canada).

Les fibroblastes ont été utilisés à leur quatrième passage. Les cellules ont été incubées à

37°C dans 8% de CO2 et le milieu de culture a été changé tous les 2 jours.

2.1.2 Follicules pileux immatures et kératinocytes murins Le jour de leur naissance, la peau des souriceaux d’une même portée (une portée de souris

CD-1 ou C3H par expérience; Charles River Laboratories, Lasalle, Qc, Canada) a été

prélevée et incubée 16 h dans une solution de trypsine (Intergen, Toronto, On, Canada) à

4°C (figure 10). L’épiderme a ensuite été mécaniquement séparé du derme et la trame

épidermique a été grattée délicatement à l’aide de pinces courbes afin de libérer les cellules

de la trame. Les kératinocytes murins ont donc été fraîchement extraits de ces épidermes

selon la méthode décrite par Yuspa et Harris (Yuspa, 1974). Les cellules épidermiques ont

d’abord été lavées dans du milieu DME-Ham complet, soit une combinaison des milieux

DMEM et Ham’s F12 dans une proportion 3:1 (Gibco) contenant 5% de sérum Fetal Clone

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30

II (Hyclone), 24,3 µg/ml d’adénine (Sigma), 5 µg/ml d’insuline (Sigma), 2 X 10-9 M de

3,3’,5’ triiodo-L-thyronine (Sigma), 5 µg/ml de transferrine humaine (Roche, Laval, Qc,

Canada), 0,4 µg/ml d’hydrocortisone (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), 10-10 M de toxine

du choléra (Sigma), 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique murin (EGF;

Invitrogen, Burlington, On, Canada), 100 UI/ml de pénicilline G et 25 µg/ml de

gentamicine. Les cellules ont ensuite été filtrées avec un filtre de nylon de 100 µm de

porosité (Becton Dickinson, Toronto, On, Canada). Puis, la suspension de cellules

épithéliales a été centrifugée (318 g, 10 min) et l’utilisation d’un gradient de lympholyte M

(Cedarlane, Hornby, On, Canada) a permis d’isoler les kératinocytes qui ont finalement été

traités 10 minutes avec de la trypsine 0,1% et lavés avec du milieu DME-Ham complet.

Les FPI ont quant à eux été extraits à partir des dermes obtenus le même jour, tel que décrit

précédemment (Lichti, 1993; Weinberg, 1993) et adapté par D. Larouche (Larouche, En

préparation) (figure 10). Brièvement, les dermes ont été digérés 30 minutes dans une unité

de trypsination contenant de la collagénase 0,35% (Sigma) à 37°C et la suspension a été

filtrée avec un filtre de nylon de 100 µm de porosité pour se débarrasser des débris. Trois

centrifugations à basse vitesse (37 g, 3 min), chacune d’entre elles séparée par des lavages

au DME-Ham pour enlever la collagénase, ont été effectuées pour permettre aux FPI de

sédimenter en premier. La suspension finale a ensuite été filtrée sur un filtre de nylon de

40 µm de porosité (Becton Dickinson) afin de séparer les FPI des fibroblastes.

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31

Figure 10. Extraction des FPI et des kératinocytes murins Dès leur naissance, la peau des souriceaux est prélevée et mise dans une

solution de trypsine, et l’épiderme est séparé du derme. Par centrifugation avec

un gradient de lympholyte M, les kérarinocytes murins sont isolés de

l’épiderme, tandis que les FPI sont isolés du derme par une digestion à la

collagénase suivie de centrifugations différentielles (Danielle Larouche,

LOEX).

2.2 Préparation du biopolymère de collagène/chitosane Les éponges de collagène ont été préparées tel que décrit précédemment (Berthod, 1994;

Berthod, 1997c), sans toutefois ajouter de sulfates de chondroïtine 4-6 (figure 11).

Brièvement, du collagène bovin de type I et III (Symatese, Chaponost, France) et du

chitosane (SADUC, Lyon, France) ont été dissous séparément dans de l’acide acétique

0,1% (EMD, Durham, NC, USA) et ensuite mélangés. La solution finale obtenue a ensuite

été versée dans des plaques 12 puits (Becton Dickinson) à raison de 1 ml/puit pour les

études in vitro ou dans des plaques 6 puits à raison de 2,5 ml/puit pour les études in vivo, et

congelée à -80°C pour 1 h. Les éponges ont enfin été lyophilisées dans un lyophilisateur

Genesis 12EL (VirTis, Gardiner, NY, USA). Pour les stériliser, les éponges ont d’abord été

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immergées 48 h dans l’éthanol 70%, rincées, puis mises 24 h dans du DMEM additionné de

300 U/ml de pénicilline G, de 75 µg/ml de gentamycine et de 1,5 µg/ml fungizone (Sigma)

à raison de 3 ml/puit à 37°C dans 8% de CO2. Elles ont finalement été incubées un dernier

24 h dans du DMEM vierge, également à raison de 3 ml/puit à 37°C dans 8% de CO2. Une

fois l’éponge ensemencée de fibroblastes, ces derniers remodèlent la MEC, ce qui permet

d’obtenir une peau ressemblant au derme de la peau normale humaine (figure 12). La

structure des éponges en microscopie électronique montre les nombreuses pores variant

entre 50 et 150 µm (figure 13) (Berthod, 1994).

Figure 11. Préparation du biopolymère de collagène/chitosane Le collagène et le chitosane sont dissous dans de l’acide acétique 0,1% et la

solution est versée dans des plaques. Les éponges sont ensuite congelées à

-70°C, puis lyophilisées (Annie Black, LOEX).

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33

Figure 12. Éponges de collagène Aspect macroscopique des éponges de collagène (Marie Gingras, LOEX).

Figure 13. Visualisation de la structure de l’éponge en microscopie électronique L’éponge de collagène est constituée de nombreuses pores variant entre 50 et

150 µm (François Berthod, LOEX)

2.3 Préparation des feuillets dermiques Des fibroblastes murins ou humains ont été cultivés pendant 28 jours dans du milieu DME

complet en présence de 50 µg/ml d’acide ascorbique (Sigma) pour permettre la production

de MEC et la formation des feuillets dermiques. Selon la méthode d’autoassemblage

développée au LOEX (Michel, 1999; Pouliot, 2002), quatre feuillets de fibroblastes ont été

superposés pour obtenir un derme reconstruit maintenu une semaine en immersion, toujours

dans du milieu DME complet additionné de 50 µg/ml d’acide ascorbique (figure 16).

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34

2.4 Extraction des neurones sensoriels Les neurones sensoriels ont été extraits à partir des DRG de fœtus de souris (E13), tel que

décrit précédemment (Durham, 1997; Gingras, 2003a) (figure 14). Brièvement, des souris

gestantes CD-1 (Charles River Laboratories) ont été sacrifiées par inhalation de CO2 et les

fœtus ont été disséqués pour obtenir les DRG qui ont été isolés de la moelle épinière, lavés,

puis trypsinés. Les corps cellulaires des neurones sensoriels obtenus ont alors été

fraîchement ensemencés sur les modèles de peau reconstruite. Toutes les manipulations

impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux règles établies par le Conseil

Canadien de Protection des Animaux (CCPA).

Figure 14. Extraction des DRG La moelle épinière est d’abord isolée des fœtus murins et dissectée (A et B). Les

DRG présents le long des moelles sont ensuite séparés de celles-ci (C). Par un

traitement à la trypsine, les corps cellulaires des neurones sont extraits des

DRG (Marie Gingras et Anne-Marie Moisan, LOEX).

2.5 Ensemencement des peaux reconstruites

2.5.1 Ensemencement des éponges de collagène Des fibroblastes murins ou humains ont d’abord été ensemencés sur le dessus des éponges

de collagène à raison de 0,8 millions de cellules par éponge (surface de 3,8 cm2), et les

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35

éponges ont ensuite été cultivées 14 jours en immersion dans le même milieu utilisé pour la

culture des fibroblastes dans lequel 100 µg/ml d’acide ascorbique ont été ajoutés, tel que

décrit précédemment (Berthod, 1993; Gingras, 2003a) (figure 15). Il est à noter que lorsque

les éponges étaient ensemencées de CE en même temps que de fibroblastes, les CE

provenaient de cordons ombilicaux et ont été ensemencées à leur sixième passage

également à raison de 0,8 millions de cellules par éponge. Les peaux reconstruites ont par

la suite été placées à l’interface air/liquide, ensemencées avec 0,8 millions de neurones

sensoriels et cultivées ainsi pendant 14 jours dans du milieu air/liquide, soit du milieu

DME-Ham contenant 10% de SVF, 0,4 µg/ml d’hydrocortisone, 5 µg/ml d’insuline,

100 UI/ml de pénicilline G et 25 µg/ml de gentamicine. La mise en air/liquide a pour but

d’établir un gradient de nutriments et de facteurs de croissance pouvant favoriser la

croissance des neurites d’un côté à l’autre de l’éponge (Gingras, 2003a), ainsi que de

favoriser la différenciation épidermique. Après 14 jours de culture avec les neurones à

l’interface air/liquide, 3 millions de kératinocytes murins de nouveau-nés ou l’équivalent de

1/2 derme d’une suspension de FPI obtenue à la suite de la digestion à la collagénase des

dermes (voir figure 10) ont été ensemencés sur le côté opposé du modèle. Il est à noter que

les kératinocytes et les FPI utilisés étaient fraîchement isolés. Après 7 jours en immersion

dans du milieu à kératinocytes, la peau reconstruite a de nouveau été placée à l’interface

air/liquide et cultivée pendant 14 jours additionnels dans du milieu air/liquide. À partir du

moment où les neurones ont été ensemencés sur les modèles, 10 ng/ml de NGF 2.5S

(Invitrogen, Burlington, On, Canada) ont été ajoutés au milieu de culture. Les neurones

périphériques requièrent effectivement du NGF pour survivre in vitro (Snider, 1996; Patel,

2000).

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36

Figure 15. Ensemencement des éponges de collagène Les éponges sont d’abord ensemencées de fibroblastes et laissées 7 jours en

immersion. Puis, elles sont ensemencées avec les neurones et mises 14 jours à

l’interface air/liquide. Les éponges sont ensuite retournées et ensemencées

avec les FPI ou avec les kératinocytes et laissées 7 jours en immersion, suivi de

14 jours à l’interface air/liquide (Alexandre Deschambeault, LOEX).

2.5.2 Ensemencement des feuillets dermiques Une fois les équivalents dermiques obtenus par la superposition de quatre feuillets, les

neurones sensoriels ont alors été ensemencés sur les peaux reconstruites (surface de

4,15 cm2) qui ont ensuite été mises à l’interface air/liquide pour 14 jours dans du milieu

air/liquide (figure 16). À partir du moment où les neurones ont été ensemencés sur les

modèles, 10 ng/ml de NGF 2.5S ont été ajoutés au milieu de culture. Une fois les feuillets

quadruples retournés, 3 millions de kératinocytes murins ou l’équivalent de 1/2 derme

d’une suspension de FPI obtenue à la suite de la digestion à la collagénase des dermes (voir

figure 10) ont été ensemencés sur le dessus et les dermes reconstruits ont été laissés 7 jours

en immersion dans du DME complet, soit jusqu’à la formation de 2 à 3 couches

d’épithélium, suivi de 14 jours additionnels à l’interface air/liquide dans du milieu

air/liquide pour obtenir une peau reconstruite. Il est à noter que les kératinocytes et les FPI

utilisés étaient fraîchement isolés. Les équivalents ont été incubés à 37°C dans 8% de CO2

et le milieu de culture a été changé à tous les 2 jours.

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37

Figure 16. Préparation des feuillets dermiques par la méthode d’autoassemblage Des fibroblastes sont cultivés 28 jours en présence d'acide ascorbique pour

permettre la production de MEC et la formation de feuillets dermiques. 4

feuillets sont ensuite superposés pour obtenir un derme reconstruit maintenu 7

jours en immersion avant de recevoir les neurones. Puis, les feuillets

quadruples sont placés 14 jours à l’interface air/liquide et retournés. Les FPI

ou les kératinocytes sont ensemencés et les feuillets sont laissés 7 jours en

immersion, suivi de 14 jours à l’interface air/liquide (Danielle Larouche et

Alexandre Deschambeault, LOEX).

2.6 Procédure pour la greffe des peaux reconstruites Trois millions de kératinocytes murins ou l’équivalent de 1/2 derme d’une suspension de

FPI obtenue à la suite de la digestion à la collagénase des dermes (voir figure 10) ont été

ensemencés sur le dessus des dermes reconstruits (Larouche, En préparation). Dans le cas

des éponges de collagène, celles-ci avaient été préalablement ensemencées de fibroblastes

humains ou murins pour permettre la production de MEC avant de pouvoir recevoir les

kératinocytes ou les FPI. Afin d’obtenir une maturation complète in vivo des peaux

reconstruites, celles-ci ont été cultivées 10 jours en immersion dans du DME-Ham complet

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avant la greffe (Germain, 1995; Pouliot, 2002). Des souris athymiques mâles adultes (âgées

de 50 jours) (Charles River Laboratories) ont été utilisées comme modèle pour les

chirurgies, tel que décrit précédemment (Lopez Valle, 1992; Berthod, 1996; Xu, 1996)

(figure 17). Brièvement, une biopsie de peau pleine épaisseur de 2,5 X 2,5 cm2 a été excisée

jusqu’au muscle sur le dos de la souris. Une chambre de Fusenig a ensuite été insérée dans

la plaie et suturée sur la peau de la souris. Une peau reconstruite de 9,1 cm2 a alors été

placée sur le lit de la plaie, et la chambre a été refermée avec un capuchon ajouré pour les 4

premiers jours. Ce capuchon a par la suite été remplacé par un autre capuchon doté d’un

filtre. La chambre de Fusenig a été enlevée après 21 jours. Un minimum de 2 souris par

condition ont été greffées. Les souris ont été sacrifiées 49 jours après la transplantation

lorsque des éponges étaient greffées et 28 jours lorsque des feuillets étaient greffés. Toutes

les manipulations impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux règles

établies par le Conseil Canadien de Protection des Animaux (CCPA).

Figure 17. Greffe chez la souris athymique Une plaie est créée sur le dos de la souris et une chambre de Fusenig y est

insérée. La peau reconstruite est ensuite déposée à l’intérieur de la chambre,

laquelle est enfin refermée avec un capuchon ajouré (Marie Gingras, LOEX).

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39

2.7 Histologie Les biopsies des peaux reconstruites et des peaux normales de souris ont été fixées au

moins 24 h dans une solution d’Histochoice (Amresco, Solon, OH, USA), puis enrobées

dans la paraffine. Des coupes de 5 µm ont finalement été colorées au trichrome de Masson

(TM) pour l’analyse histologique des tissus.

2.8 Marquages en immunofluorescence indirecte Les biopsies des peaux reconstruites ont été enrobées dans une solution d’OCT (Somagen,

Edmonton, Ab, Canada), puis congelées à -80°C. Des coupes de 5 µm d’épaisseur pour les

analyses en microscopie à fluorescence et de 25 µm pour les analyses en microscopie

confocale ont d’abord été fixées dans du tampon saline phosphate (PBS) contenant

1% (v/v) de formol (Fisher, Nepean, On, Canada), suivi d’une fixation dans du méthanol

100% (Fisher). Les coupes ont ensuite été traitées dans du PBS contenant 1% (v/v)

d’albumine sérique bovine (BSA; Sigma) pour bloquer les sites non-spécifiques, et

incubées avec les anticorps. Les anticorps primaires utilisés ont été incubés 45 minutes sur

les coupes et les anticorps secondaires, 30 minutes (figure 18 et tableau 1). Les contrôles

négatifs pour les immunomarquages ont été obtenus par omission du premier anticorps. Un

marquage des noyaux cellulaires au Hoechst 33258 (Sigma) a aussi été effectué par une

incubation de 10 minutes. Les coupes ont été visualisées avec des microscopes à

épifluorescence Nikon Eclipse E600 (Nikon, Tokyo, Japon) et Nikon Eclipse TE2000-U

(Nikon), ainsi qu’avec un microscope confocal Nikon Eclipse E800 combiné au système

Nikon D-Eclipse C1 (Nikon). Les séries d’images obtenues à travers une coupe de 25 µm

en microscopie confocale ont été superposées pour donner une représentation en deux

dimensions de l’épaisseur totale du champ photographié, et ce, à raison d’une dizaine

d’images pour un grossissement de 20X et d’une trentaine pour un grossissement de 40X.

La luminosité et/ou le contraste des images ont été ajustés avec Adobe® Photoshop® 6.0

(Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA).

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40

Figure 18. Principe de l’immunofluorescence Un anticorps primaire est d’abord incubé 45 minutes sur les coupes. Puis, un

anticorps secondaire couplé à un fluorochrome est incubé 30 minutes sur les

coupes (Vicky Gagnon, LOEX).

Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés

Anticorps primaires Compagnie Dilution

Ac polyclonal de lapin anti-neurofilament 150 kDa (NF150) Chemicon 1/400

Ac monoclonal de souris (IgG1) anti-neurofilament 160 kDa (NF160) Chemicon 1/800

Ac de lapin anti-peptide de la kératine 14 (K14) Don du Dr Normand Marceau 1/2000

Anticorps secondaires Compagnie Dilution

Ac de chèvre anti-IgG-IgM de souris (DTAF) Chemicon 1/100

Ac de poulet anti-IgG de lapin (Alexa 594) Molecular Probes 1/800

Ac de chèvre anti-IgG de lapin (Alexa 488) Molecular Probes 1/400

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Chapitre 3

Résultats

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42

Le présent projet avait deux objectifs principaux : étudier l’influence des follicules pileux

sur la migration axonale in vitro et analyser le processus de régénération nerveuse dans une

peau reconstruite contenant des poils, après implantation chez la souris immunodéficiente.

À long terme, la greffe de peaux reconstruites enrichies en follicules pileux autologues

pourrait améliorer la récupération tactile du greffon. Nous avons donc mis au point deux

types de peaux reconstruites par génie tissulaire pour l’étude de la régénération nerveuse

périphérique.

3.1 Peau normale de souris Afin de mieux interpréter les résultats qui seront présentés, il convient d’abord d’examiner

en histologie la peau de souris nouveau-née (figure 19A) et adulte (figure 19B) colorée au

TM, et la peau de souris adulte en immunofluorescence (figure 19C). La figure 19A révèle

plusieurs amas cellulaires (noyaux cellulaires colorés en mauve) caractéristiques des

follicules pileux en devenir et correspondant aux FPI qui sont extraits de la peau des

souriceaux. La figure 19B révèle également plusieurs amas cellulaires (noyaux cellulaires

colorés en mauve) caractéristiques des follicules pileux matures. La couleur bleu pâle

correspond au collagène synthétisé par les fibroblastes présents dans le derme. Le

marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu) de la figure 19C révèle quant à lui

plusieurs regroupements cellulaires en forme de cercle caractéristiques des poils matures.

Le marquage du neurofilament 150 kDa (NF150; en vert) met quant à lui en évidence

l’innervation et le fait que les neurites migrent vers les poils et s’enroulent autour d’eux.

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Figure 19. Aspect histologique de la peau normale de souris La morphologie de la peau de souris a été observée en histochimie sur une

coupe de 5 µm colorée au TM pour les souris nouveau-nées (A) et les souris

adultes (B), et en immunofluorescence sur une coupe de 5 µm par le marquage

du NF150 (C; en vert) et par la révélation des noyaux cellulaires par un

marquage au Hoechst (C; en bleu) pour les souris adultes. Barre : 50 µm.

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3.2 Éponges de collagène Afin d’étudier les interactions in vitro entre les follicules pileux et les neurones sensoriels,

trois modèles d’éponges de collagène ont d’abord été développés.

3.2.1 Modèle 1 Le premier modèle (modèle 1) a été préparé en cultivant des neurones sensoriels pendant

14 jours sur un côté de l’éponge de collagène préalablement ensemencée de fibroblastes et

de cellules endothéliales (CE), et en cultivant des FPI ou des kératinocytes sur l’autre côté,

également ensemencé de fibroblastes, pendant 21 jours additionnels. Les deux côtés de

l’éponge ont été ensemencés de fibroblastes dans le but d’obtenir le plus de MEC possible.

Les fibroblastes et les CE étaient d’origine humaine alors que les FPI, les kératinocytes et

les neurones sensoriels étaient murins. Les fibroblastes utilisés provenaient d’un donneur

âgé de 24 ans et ont été ensemencés à leur cinquième passage à raison de 0,8 millions de

cellules par éponge. Les CE provenaient quant à elles de cordons ombilicaux et ont été

ensemencées à leur sixième passage également à raison de 0,8 millions de cellules par

éponge. Après un total de 49 jours de culture, une analyse histochimique du modèle 1

coloré au TM a d’abord été effectuée (figure 20). Bien que quelques cellules aient pénétré

plus profondément dans le modèle, les fibroblastes ont généralement peu pénétré dans

l’éponge. En effet, les noyaux cellulaires colorés en mauve et la couleur bleu pâle du

collagène synthétisé par les fibroblastes sont présents principalement au niveau de la

portion supérieure du modèle (figure 20A et B). Il est à noter que le collagène bovin

constituant l’éponge est quant à lui coloré en bleu foncé. Dans le modèle avec CE, il y a eu

formation d’un réseau de pseudo-capillaires visible par la présence de tubules (figure 20C),

tel que décrit précédemment (Black, 1998). Les tubules sont reconnaissables par la

présence de trous bordés de cellules (en mauve) dans la MEC. En présence de FPI, il y a eu

formation d’inclusions intradermiques qui ont légèrement pénétré dans l’éponge

(figure 20B et D). Un mince épiderme attaché à l’équivalent dermique ensemencé de FPI a

également été obtenu (figure 20B et D). Le contrôle (peau reconstruite avec kératinocytes,

sans FPI) présentait un épiderme pluristratifié, mais aucune inclusion intradermique

(figure 20A). L’expérience a été effectuée un total de trois fois à raison de 6 équivalents par

condition et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois à l’autre.

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Figure 20. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1) La morphologie des peaux reconstruites, après un total de 49 jours de

maturation in vitro, a été observée en histochimie sur une coupe de 5 µm

colorée au TM. En présence de FPI, il y a formation d’inclusions

intradermiques et d’un mince épiderme (B, D). En présence de kératinocytes, il

y a formation d’un épiderme pluristratifié (A). En présence de CE, il y a

formation d’un réseau de pseudo-capillaires (C; flèches). Barre : 50 µm.

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Une analyse en immunofluorescence du modèle 1 a également été effectuée par le

marquage de la K14 (en rouge), du neurofilament 160 kDa (NF160; en vert) ainsi que par

un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu) (figure 21). Rappelons que la K14

est un marqueur des kératinocytes alors que le NF160 est un marqueur de choix pour

détecter la présence de prolongements axonaux dans la peau. Tout comme l’avait démontré

l’analyse histochimique (figure 20), il y a formation d’un grand nombre d’inclusions

intradermiques et d’un mince épiderme en présence de FPI (figure 21A). Seul un épiderme

pluristratifié est observé dans le contrôle ensemencé de kératinocytes (figure 21C). La

révélation des noyaux confirme que les fibroblastes ont peu pénétré dans l’éponge,

demeurant dans la partie supérieure (figure 21A et C) et inférieure du derme (figure 21B).

Bien que les corps cellulaires des neurones sensoriels et plusieurs neurites soient restés à la

surface de l’éponge, de nombreuses neurites ont pénétré plus profondément dans le modèle

(figure 21B).

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Figure 21. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 1) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en immunofluorescence

sur une coupe de 5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en

vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu),

après un total de 49 jours de maturation in vitro. En présence de FPI, il y a

formation d’inclusions intradermiques et d’un mince épiderme (A). En

présence de kératinocytes, il y a formation d’un épiderme pluristratifié (C). En

présence de cellules nerveuses, il y a élongation des neurites en surface du

modèle et plus profondément (B; flèches). Barre : 50 µm.

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48

3.2.2 Modèle 2 Le deuxième modèle (modèle 2) a d’abord été préparé en cultivant des neurones sensoriels

pendant 14 jours sur un côté de l’éponge de collagène préalablement ensemencé de

fibroblastes et de CE. Par la suite, des FPI ou des kératinocytes ont été ajoutés de l’autre

côté du modèle pendant 21 jours additionnels. Les fibroblastes et les CE étaient d’origine

humaine alors que les FPI, les kératinocytes et les neurones sensoriels étaient murins. Les

fibroblastes utilisés provenaient d’un donneur âgé de 24 ans et ont été ensemencés à leur

sixième passage à raison de 0,8 millions de cellules par éponge. Les CE provenaient quant

à elles de cordons ombilicaux et ont été ensemencées à leur cinquième passage également à

raison de 0,8 millions de cellules par éponge. La seule différence par rapport au modèle 1

réside dans le fait qu’un seul côté de l’éponge a été ensemencé de fibroblastes, soit celui

recevant les cellules nerveuses. Le but de ce changement était de voir si le fait de ne pas

avoir de fibroblastes du côté des FPI permettait à ces derniers de pénétrer un peu plus

profondément dans l’éponge. Après un total de 49 jours de culture, le modèle 2 a été

analysé en histochimie par une coloration au TM (figure 22A, C et E) et en

immunofluorescence (figure 22B, D et F) par le marquage de la K14 (en rouge), du NF160

(en vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu).

Les caractéristiques de ce deuxième modèle sont comparables à celles du premier. En effet,

il y a bel et bien eu formation d’un réseau de pseudo-capillaires en présence des CE

(figure 22E) et d’inclusions intradermiques en présence de FPI (figure 22A et B). Les

éponges ensemencées de kératinocytes présentent également un épithélium pluristratifié

(figure 22C et D). La différence notable entre les deux modèles réside dans la quantité de

MEC sécrétée par les fibroblastes. En effet, il y a un peu moins de fibroblastes et de MEC

dans ce modèle-ci, comme l’indique la quantité plus faible de collagène (en bleu pâle)

présent surtout dans la portion supérieure du modèle (figure 22A, C et E). Le fait d’avoir

ensemencé des fibroblastes d’un seul côté est sans doute responsable de cette diminution de

MEC. Les inclusions ne semblent pas avoir pénétré plus profondément dans l’éponge

(figure 22A et B). Étant donné que les résultats obtenus avec le modèle 2 n’étaient pas plus

positifs que ceux obtenus avec le modèle 1, l’expérience n’a pas été répétée. L’expérience

n’a donc été effectuée qu’une seule fois à raison de 6 équivalents par condition.

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Figure 22 : Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des CE, des neurones et des FPI ou des kératinocytes (modèle 2) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en histochimie sur une

coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de

5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en vert) ainsi que par

un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu), après un total de 49

jours de maturation in vitro. En présence de FPI, il y a formation d’inclusions

intradermiques et d’un mince épiderme (A, B). En présence de kératinocytes, il

y a formation d’un épiderme pluristratifié (C, D). En présence de CE, il y a

formation d’un réseau de pseudo-capillaires (E; flèches). En présence de

cellules nerveuses, il y a élongation des neurites en surface du modèle et plus

profondément (F; flèches). Barre : 50 µm.

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50

3.2.3 Modèle 3 Pour le troisième modèle (modèle 3), des fibroblastes murins adultes ont été utilisés au lieu

de fibroblastes humains, et ils ont été ensemencés à leur cinquième passage à raison de 1,6

millions de cellules par éponge. Nous espérions ainsi favoriser l’établissement

d’interactions cellules-cellules provenant de la même espèce et activer le plus de voies de

signalisation possible. Tout comme pour le modèle 1, le modèle 3 a été préparé en cultivant

des neurones sensoriels sur un côté de l’éponge de collagène préalablement ensemencé de

fibroblastes et en cultivant des FPI sur l’autre côté également ensemencé de fibroblastes.

Étant donné qu’une plus grande quantité de MEC était présente dans le modèle 1

ensemencé des deux côtés avec des fibroblastes, nous avons décidé de continuer avec cette

technique. Toutefois, nous n’avons pas ensemencé de CE sur ce modèle-ci. En effet,

puisque nous voulions avoir un modèle entièrement composé de cellules murines, nous

avons arrêté d’utiliser des CE étant donné que nous ne possédions pas de CE murines à

cette date. C’est également pour cette raison que nous avons ensemencé le double de

cellules sur les éponges (1,6 au lieu de 0,8 millions). L’expérience a été effectuée deux fois

à raison de 6 équivalents par condition et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois

à l’autre.

Après un total de 49 jours de culture, une analyse histochimique du modèle 3 coloré au TM

a été effectuée (figure 23). En présence de FPI, il y a eu formation de quelques inclusions

intradermiques qui ont peu pénétré dans l’éponge (figure 23A et B). Les inclusions formées

étaient mal définies et l’épiderme formé, plus différencié que celui des modèles précédents.

En effet, les inclusions formées possèdent plus ou moins cette forme de cercle

caractéristique des poils matures qu’on a pu observer précédemment dans les modèles 1 et

2. De plus, l’épiderme formé en présence de fibroblastes murins est plus mince que celui

formé en présence de fibroblastes humains. En effet, l’épiderme murin est très mince et ne

possède que quelques couches de cellules vivantes, soit 2 à 3 couches, comparativement à

10 à 15 chez l’humain. La présence de collagène (en bleu pâle) sur le dessus du modèle

indique qu’il y a eu une sécrétion importante de MEC par les fibroblastes (figure 23A).

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Figure 23. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et des neurones (modèle 3) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en histochimie sur une

coupe de 5 µm colorée au TM après un total de 49 jours de maturation

in vitro. En présence de FPI, il y a formation de quelques inclusions

intradermiques et d’un mince épiderme pluristratifié (A, B). Barre : 50 µm.

Une analyse en immunofluorescence du modèle 3 a également été effectuée par le

marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en vert) ainsi que par un marquage des noyaux

cellulaires au Hoechst (en bleu) (figure 24). Tout comme l’avait démontré l’analyse

histologique (figure 23), les inclusions intradermiques formées sont mal définies et

ressemblent plus à des amas de kératinocytes qu’à des petits cercles caractéristiques de la

présence de poils (figure 24B). Dans certains cas, très peu d’inclusions étaient présentes

(figure 24A). En présence de cellules nerveuses, il y a eu pénétration des neurites à

l’intérieur du modèle (figure 24C).

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Figure 24. Immunomarquages de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes, des FPI et des neurones (modèle 3) La morphologie des peaux reconstruites a été observée en immunofluorescence

sur une coupe de 5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en

vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu),

après un total de 49 jours de maturation in vitro. En présence de FPI, il y a

formation d’inclusions intradermiques et d’un mince épiderme (A, B). En

présence de cellules nerveuses, il y a élongation des neurites à l’intérieur du

modèle (C). Barre : 50 µm.

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3.2.4 Colonisation de l’éponge par les fibroblastes Afin d’analyser la pénétration des fibroblastes dans l’éponge, une analyse histologique a été

effectuée sur l’épaisseur totale des éponges (figure 25). De plus, une comparaison a été

effectuée entre les éponges ensemencées de fibroblastes humains et les éponges

ensemencées de fibroblastes murins adultes (figure 25A et B). Bien que quelques cellules

aient pénétré plus profondément dans le modèle, les fibroblastes ont généralement peu

pénétré dans l’éponge et la majorité des cellules est restée au niveau de la portion

supérieure ou inférieure de l’éponge. En effet, la formation de collagène par les fibroblastes

s’est effectuée principalement au niveau des portions inférieure et supérieure du modèle,

comme l’indique la couleur bleu pâle du collagène synthétisé par les fibroblastes en

comparaison avec le collagène bovin constituant l’éponge, représenté en bleu foncé (figure

25A, B et C). De plus, nous avons constaté que les fibroblastes murins produisent beaucoup

moins de MEC que les fibroblastes humains (figure 25A et B).

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Figure 25. Aspect histologique de l’éponge pleine épaisseur ensemencée avec des fibroblastes, des neurones et des FPI ou des kératinocytes La morphologie des peaux reconstruites a été observée en histochimie sur une

coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de

5 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en vert) ainsi que par

un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu). En présence de

fibroblastes humains (A), il a y une plus grande quantité de MEC sécrétée

qu’en présence de fibroblastes murins (B). La majorité des cellules se trouve

au niveau des portions inférieure et supérieure de l’éponge (C, D). Barre :

50 µm.

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3.3 Feuillets dermiques En parallèle avec les expériences in vitro effectuées sur les éponges de collagène, nous

avons vérifié le potentiel des feuillets produits par la méthode d’autoassemblage, un

deuxième modèle in vitro de peau reconstruite mis au point dans notre laboratoire, pour

l’étude de la régénération nerveuse. Les fibroblastes utilisés provenaient d’une souris âgée

de 2 jours et ils ont été utilisés à leur quatrième passage. L’expérience a été effectuée deux

fois et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois à l’autre.

Une analyse histologique des feuillets dermiques ensemencés de cellules nerveuses ainsi

que de kératinocytes (figure 26A et B) ou de FPI (figure 26C et D) a ensuite été effectuée.

Une migration préférentielle des axones vers les kératinocytes et les FPI implantés dans le

modèle a été observée (figure 26B et D). De plus, cette migration a été suivie d’une

association étroite des axones et des follicules pileux en développement (figure 26D).

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Figure 26. Aspect histologique des feuillets dermiques ensemencés avec des neurones et des FPI ou des kératinocytes La morphologie de la peau reconstruite a été observée en histochimie sur une

coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de

5 µm par un marquage de la K14 (en rouge) et du NF160 (en vert). En

présence de kératinocytes, il y a formation d’un épiderme pluristratifié (A, B),

tandis qu’en présence de FPI, il y a formation d’inclusions intradermiques et

d’un mince épiderme (C, D). Dans les deux cas, une forte élongation des

neurites a été observée. Barre : 20 µm.

Une analyse en immunofluorescence des feuillets dermiques a été effectuée en microscopie

confocale pour mettre en évidence l’innervation (NF160; en vert) en présence de

kératinocytes (Figure 27B), de FPI (C) ou sans cellule épithéliale (A). En l’absence de

cellule épithéliale, les fibres nerveuses migrent de façon aléatoire dans le modèle

(figure 27A). On remarque cependant que les neurites ont tendance à pénétrer

profondément dans les feuillets. Toutefois, en présence de kératinocytes (figure 27B) et de

FPI (figure 27C), il y a migration préférentielle des axones vers les cellules épithéliales. De

plus, ces axones ont tendance à s’organiser juste au-dessous de l’épiderme.

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Figure 27. Innervation dans les feuillets dermiques en présence ou non de cellules épithéliales La morphologie de la peau reconstruite a été observée en immunofluorescence

sur une coupe de 25 µm par un marquage de la K14 (en rouge), du NF160 (en

vert) ainsi que par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu).

Sans cellule épithéliale, il y a désorganisation des fibres nerveuses (A). En

présence de kératinocytes (B) et de FPI (C), il y a migration préférentielle des

axones vers les cellules épithéliales. Barre : 50 µm.

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58

3.4 Greffe de peaux reconstruites

3.4.1 Feuillets dermiques D’après les travaux précédemment effectués par Danielle Larouche, des feuillets dermiques

produits par la méthode d’autoassemblage et ensemencés de kératinocytes (figure 28A) ou

de FPI (figure 28B et C) ont été greffés pendant un mois sur des souris athymiques afin de

vérifier si les feuillets pouvaient supporter la croissance de poils. Comme le démontre la

figure 28, les feuillets ont en effet permis le développement de follicules pileux complets.

Figure 28. Greffe de feuillets ensemencés de FPI chez la souris athymique Aspect macroscopique des dermes reconstruits ensemencés avec des

kératinocytes (A) ou des FPI (B, C), 1 mois après la greffe sur des souris

immunodéficientes. Le développement de follicules pileux complets a été

observée en présence de FPI (B, C). (Gracieuseté de Danielle Larouche)

Bien que les biopsies ont été effectuées par Danielle Larouche sur ses propres échantillons,

j’ai personnellement effectué les marquages immunologiques. Les peaux reconstruites

greffées ont donc été observées en immunofluorescence par un marquage des fibres

nerveuses au NF150 (en vert) et par un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst (en

bleu) afin d’analyser le processus d’innervation du greffon. Il est à noter que pour les

études in vivo, le NF160 (un anticorps de souris) a été remplacé par le NF150 (un anticorps

de lapin). En effet, un anticorps de souris ne peut pas être utilisé sur une souris puisqu’il y

aurait trop de marquage non-spécifique. En présence de FPI, une élongation vigoureuse des

neurites provenant de la souris a été observée, de même qu’une étroite association de ces

fibres nerveuses avec les follicules pileux (figure 29C-E), et ce, de façon similaire à ce qui

est observé dans la peau normale de souris (figure 29B). Dans les greffes de peaux

reconstruites ensemencées de kératinocytes (contrôle), une très faible colonisation par les

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59

fibres nerveuses a été observée (figure 29A). Il est à noter que trois souris par condition ont

été utilisées pour la greffe.

Figure 29. Immunomarquages des feuillets dermiques ensemencés de FPI ou de kératinocytes et greffés chez la souris athymique Des peaux reconstruites contenant (C, D, E) ou non (A) des FPI ont été

transplantées pendant 1 mois sur des souris immunodéficientes. Une migration

de fibres nerveuses positives au NF150 (en vert) a été observée dans les peaux

reconstruites contenant des FPI (C, E; D est un agrandissement du cadre en

C), contrairement à une colonisation pratiquement nulle observée dans les

peaux reconstruites sans FPI (A). Une colocalisation systématique des fibres

nerveuses avec les follicules pileux (reconnaissable par la concentration

typique des noyaux cellulaires des kératinocytes les constituant, marqués par le

Hoechst) a été observée (D, E) selon une organisation similaire à la peau de

souris normale (B). Barre A-C : 100 µm, barre D : 50 µm, barre E : 25 µm.

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60

3.4.2 Éponges de collagène Étant donné que la greffe de feuillets dermiques enrichis de FPI (sans cellule nerveuse) a

permis le développement de follicules pileux complets, nous avons par la suite tenté de

reproduire l’expérience avec les éponges de collagène également ensemencées de FPI. Pour

ce faire, les fibroblastes utilisés étaient les mêmes que ceux utilisés par Danielle Larouche

pour les expériences de greffes de feuillets dermiques, soit des fibroblastes de souris

nouveau-nées (2 jours) à leur quatrième passage. Bien qu’il y ait eu réépithélialisation de la

plaie, il n’y a eu formation d’aucun follicule pileux (figure 30). L’expérience a été effectuée

deux fois et les résultats obtenus étaient semblables d’une fois à l’autre.

Figure 30. Greffe d’éponges ensemencées de FPI chez la souris athymique Des éponges de collagène contenant des FPI ont été transplantées pendant

49 jours sur des souris immunodéficientes. Il n’y a eu aucune formation de

follicules pileux, mais il y a eu réépithélialisation de la plaie.

Une analyse histologique des éponges greffées a donc été effectuée pour tenter d’expliquer

pourquoi l’éponge ne semble pas permettre le développement de follicules pileux. Bien

qu’il y ait eu réépithélialisation après greffe (C; visualisable par la présence d’un épiderme

pluristratifié au-dessus de la trame partiellement dégradée de l’éponge), aucun follicule

pileux n’a poussé (figure 31C et D).

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61

Figure 31. Aspect histologique de l’éponge ensemencée avec des fibroblastes et des FPI et greffée chez la souris athymique La morphologie de l’éponge greffée a été observée en histochimie sur une

coupe de 5 µm colorée au TM et en immunofluorescence sur une coupe de

5 µm par un marquage de la K14 (en vert) ainsi que par un marquage des

noyaux cellulaires au Hoechst (en bleu), 49 jours après la greffe. En présence

de FPI, il y a eu réépithélialisation, mais aucun follicule pileux ne s’est

développé (C, D). La peau de souris athymique est quant à elle parsemée de

duvet (A, B). Barre : 50 µm.

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Chapitre 4

Discussion

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63

En plus de l’importance de son aspect esthétique, la peau joue de nombreux rôles

importants dont la perception des sensations par ses nombreux récepteurs sensoriels. Dans

le cas d’une brûlure profonde, il y a destruction totale ou partielle des fibres nerveuses.

Lors de la cicatrisation, la réinnervation est souvent médiocre, voire même absente, et la

récupération de la sensibilité tactile demeure incomplète. De plus, il arrive que le patient

souffre de névralgie caractérisée par une douleur ressentie sur le parcours d'un nerf sensitif

ou dans le territoire qu'il innerve. Le patient souffre alors de sensations anormales dont une

hypersensibilité. La qualité de la régénération nerveuse dépend toutefois de la procédure de

greffe appliquée (Brunelli, 1995). Dans le cas d’une greffe pleine épaisseur (derme et

épiderme), qui représente la meilleure façon de couvrir une brûlure profonde, il y a

rétablissement partiel de la régénération nerveuse et de la sensation, celle-ci se limitant à

une sensation grossière de même qu’à une perception de la température (Schliephake, 1994;

Lutz, 1998; Malenfant, 1998; Bayramicli, 2000). Cette technique est en fait une autogreffe

contenant déjà son propre réseau nerveux, ce qui facilite grandement la régénération

nerveuse. De plus, elle contient des appendices tels que des follicules pileux, des glandes

sébacées et des dômes tactiles de Merkel, représentant tous d’importantes cibles dans le

processus de la migration axonale (Waris, 1983; English, 1992b). Cette méthode est

toutefois grandement limitée par la disponibilité des sites donneurs. La greffe d’épiderme,

qui représente une méthode de choix pour le traitement des brûlures profondes et étendues,

ne permet quant à elle qu’un rétablissement de la sensation tactile beaucoup plus faible

(Lutz, 1998; Juma, 2002).

La meilleure solution pour recouvrir les plaies profondes et étendues serait la production

in vitro d’une peau reconstruite avec les propres cellules du patient, par les techniques du

génie tissulaire (Berthod, 1997c). En effet, la production de peaux reconstruites autologues

permet de réaliser des greffes de peau permanentes, contrairement aux peaux reconstruites

hétérologues qui sont utilisées comme des pansements temporaires de haute technologie.

Toutefois, les peaux reconstruites actuelles ne contiennent pas d’appendice, de dôme tactile

ou encore de réseau nerveux agissant comme cibles et supportant la migration axonale. Le

but du projet était de développer une peau reconstruite enrichie de FPI. Nous voulions

évaluer le potentiel des poils comme cible dans la régénération nerveuse dans un modèle

in vitro, et après transplantation chez la souris athymique. Pour ce faire, nous avons utilisé

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64

deux marqueurs de l’innervation cutanée, soit le NF160 et le NF150, de même qu’un

marqueur des kératinocytes, la K14.

4.1 Éponges de collagène Notre équipe a mis au point un premier modèle in vitro de peau reconstruite qui consiste en

une éponge de collagène (Berthod, 1993). Ce modèle comporte de nombreux avantages par

rapport aux différents modèles de peaux reconstruites développés jusqu’à ce jour. En effet,

l’éponge est facile et rapide à produire, faiblement rétractée par les fibroblastes et possède

une épaisseur et des dimensions facilement modulables. De plus, elle permet l’intégration

de différentes molécules dans sa matrice, l’ajout de facteurs neurotrophiques, et elle peut

servir de modèle pour différents tissus conjonctifs. Elle permet aussi la reconstruction d’un

réseau capillaire in vitro lorsqu’elle est ensemencée de CE (Black, 1998). L’utilisation du

chitosane dans la composition de l’éponge représente également une innovation majeure de

ce modèle par rapport à d’autres types d’éponges réticulées au glutaraldéhyde, ce dernier

étant un produit hautement toxique (Yannas, 1980; Boyce, 1988). Le remodelage dans

l’éponge d’une MEC hautement organisée ressemblant au derme de la peau normale

humaine (Berthod, 2001) facilite la migration axonale après la transplantation (Gingras,

2003b), de même que dans les expériences in vitro (Gingras, 2003a). En effet, la

régénération nerveuse est connue pour être grandement inhibée par l’architecture

désorganisée des fibres de collagène, de même que par le processus de rétraction observé

dans les cicatrices hypertrophiques au cours de la guérison des plaies (Waris, 1978;

Kishimoto, 1982; Wallengren, 1999).

Dans le cadre de ce projet, nous avons donc optimisé notre modèle d’éponge permettant

d’étudier la migration des axones dans un environnement tridimensionnel contrôlé et

mimant un tissu conjonctif. Trois modèles d’éponge de collagène ont d’abord été

développés. Le modèle 1 contenait des cellules humaines (fibroblastes et CE), ainsi que des

cellules de souris (DRG, FPI et kératinocytes). De plus, il avait été ensemencé de

fibroblastes des deux côtés. Le modèle 2 était identique au modèle 1, mais n’était

ensemencé de fibroblastes que d’un seul côté de l’éponge, soit sur le côté recevant les

neurones. Nous voulions ainsi vérifier si le fait de ne pas ensemencer de fibroblastes sur le

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65

côté recevant les FPI permettrait à ces derniers de pénétrer plus profondément dans

l’éponge. Nous voulions également vérifier si les inclusions intradermiques formées en

présence de FPI étaient plus nombreuses que ce qui avait été observé dans le modèle 1, et si

elles avaient une structure plus caractéristique des poils matures. Les inclusions formées

n’étaient pas plus nombreuses et ne pénétraient pas plus profondément dans le derme

reconstruit. Toutefois, nous avons observé une diminution de la quantité de MEC sécrétée

par les fibroblastes, ce qui s’explique par le fait que moins de fibroblastes étaient

ensemencés dans le modèle 2 (un côté au lieu de deux). Pour cette raison, nous avons

décidé de continuer par la suite à ensemencer des fibroblastes des deux côtés de l’éponge,

puisque la production de MEC est un facteur déterminant dans la colonisation de l’éponge

par les neurites. Étant donné que les molécules produites par les fibroblastes humains sont

différentes de celles produites par les fibroblastes murins, il se pourrait que ces molécules

d’origine humaine ne soient pas reconnues par les cellules épithéliales murines. Dans le

modèle 3, nous avons donc substitué les fibroblastes humains par des fibroblastes murins

pour avoir un modèle entièrement murin. Nous espérions ainsi faire en sorte qu’il y ait une

meilleure interaction entre tous les types cellulaires et s’assurer qu’un maximum de voies

de signalisation étaient activées. Depuis quelques années déjà, plusieurs évidences pointent

vers la voie de signalisation WNT comme étant une voie clef dans le développement des

poils (Millar, 1999; Reddy, 2001). Pour favoriser le développement de poils matures, il

serait donc intéressant de vérifier l’activation de cette voie signalétique dans les peaux

reconstruites in vitro. L’utilisation de cellules provenant du même organisme est

susceptible d’activer cette voie puisque tous les bons récepteurs et ligands risquent alors

d’être présents.

Dans les éponges, des fibroblastes de souris adultes ont été utilisés. Il aurait probablement

été plus avantageux d’utiliser des fibroblastes de souriceaux nouveau-nés. En effet, étant

donné que les souris ont une espérance de vie d’environ 2 à 3 ans, leurs cellules, à l’âge

adulte, ont probablement un pouvoir prolifératif beaucoup plus faible que les mêmes

cellules humaines adultes. Ceci pourrait entre autres expliquer le fait qu’il y a beaucoup

moins de MEC sécrétée dans l’éponge en présence de fibroblastes de souris adultes

comparativement à la quantité de matrice sécrétée en présence de fibroblastes humains. De

plus, le derme de la peau de souris est beaucoup plus mince que le derme de la peau

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66

humaine, ce qui pourrait également expliquer la petite quantité de MEC sécrétée par les

fibroblastes murins. Enfin, il serait intéressant d’utiliser des fibroblastes nouveau-nés, ceux-

ci produisant plus de MEC que les fibroblastes adultes et sécrétant probablement plus de

facteurs (NGF, FGF, EGF, etc.).

Par ailleurs, l’éponge de collagène permet d’étudier les interactions qui s’effectuent entre

les CE et les autres types cellulaires ou avec les protéines de la MEC, ces interactions étant

essentielles lors de la formation des vaisseaux in vivo et in vitro. La formation spontanée de

structures ressemblant aux capillaires observés in vivo a été associée en partie à la présence

d’une MEC mature et aux facteurs de croissance néosynthétisés dans l’environnement dans

lequel évoluent les cellules (Berthod, 1993; Berthod, 1996). Les CE, les fibroblastes et la

MEC qu’ils sécrètent jouent probablement un rôle important dans le maintien et la

régénération des nerfs par les interactions cellules-cellules et cellules-MEC, ainsi que par le

relarguage de facteurs de croissance et de molécules signalétiques (Gingras, 2003a). Les

fibroblastes et les CE sont effectivement connus pour produire du facteur de croissance de

l'endothélium vasculaire (VEGF) (Steinbrech, 1999; D'Arcangelo, 2000; Pinney, 2000),

lequel a été démontré comme pouvant activer la croissance axonale (Sondell, 1999;

Sondell, 2000). Il a été démontré dans l’éponge que la présence de CE favorisait

l’élongation des neurites (Gingras, 2003a). De plus, les axones pourraient avoir une

influence sur l’organisation et le niveau de différenciation du réseau de pseudo-capillaires,

tel que démontré récemment dans la peau (Mukouyama, 2002). Toutefois, à partir du

modèle 3, nous avons arrêté d’ensemencer des CE. En effet, puisque nous voulions avoir un

modèle entièrement composé de cellules murines, nous avons arrêté d’utiliser des CE étant

donné que nous ne possédions pas de CE murines à cette date. De plus, il devint clair que

l’évaluation de l’influence des neurones sur la maturation in vitro du réseau de capillaires,

ainsi que l’étude de l’influence des capillaires sur la migration axonale, comportaient assez

d’éléments pour constituer un projet en soi. Cette partie fut donc prise en charge par un

autre étudiant de notre laboratoire.

En ce qui a trait à la MEC, il reste encore de l’optimisation à faire dans l’éponge pour faire

en sorte qu’elle soit colonisée de façon uniforme par les fibroblastes. Une répartition plus

uniforme des fibroblastes ferait en sorte que la MEC qu’ils sécrètent serait présente partout

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dans la peau reconstruite. La trame de l’éponge sert effectivement de soutien et d’ancrage

aux fibroblastes pour la sécrétion de MEC. Des cellules nerveuses exprimant le NF160 et le

NF150 ont été observées dans les trois modèles d’éponge, soit en surface et plus

profondément. Toutefois, le fait que nous n’ayons pas observé de migration préférentielle

des fibres nerveuses vers les inclusions intradermiques réside sans doute dans le fait qu’il y

avait un manque de MEC. En effet, les fibres nerveuses ont besoin de la MEC pour leur

élongation. Le dépôt de grandes quantités de MEC dans notre modèle d’éponge (Berthod,

1993; Berthod, 1996) devrait effectivement aider à supporter la croissance des neurites

(Snow, 2002).

Un moyen de permettre une meilleure pénétration des fibroblastes dans l’éponge serait de

mieux contrôler la dimension de ses pores (O'Brien, 2005). Tel que mentionné

précédemment, les pores de l’éponge varient entre 50 et 150 µm. De plus, les pores du

dessus sont souvent plus gros que ceux du centre, ce qui résulte en une meilleure

colonisation de l’éponge par les fibroblastes sur le dessus. En ayant une meilleure

uniformité des pores, les fibroblastes auraient probablement plus de facilité a pénétrer plus

profondément dans l’éponge et ils pourraient ainsi sécréter de la MEC sur toute l’épaisseur

de l’éponge.

En plus du problème de colonisation uniforme, un autre problème technique rencontré avec

les éponges fut leur mise à l’interface air/liquide. En effet, lorsque les éponges sont

retournées de 180° pour recevoir les FPI, le côté de l’éponge préalablement ensemencé de

cellules nerveuses se retrouve alors en contact avec le filtre supportant l’éponge. Il se

pourrait donc que les neurones soient écrasées par le reste de l’éponge, nuisant ainsi à leur

survie. De plus, l’éponge adhère légèrement au support et lorsqu’il est temps de décoller

l’éponge pour prendre les biopsies, et une petite portion de l’éponge déchire et reste collée

sur le filtre. Sans cette déchirure, il y aurait sans doute un plus grand nombre de neurones

visibles en immunofluorescence. Il faut donc développer une méthode de culture à

l’interface air/liquide non-dommageable pour les éponges.

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4.2 Feuillets dermiques En parallèle avec les expériences effectuées avec l’éponge de collagène, nous avons

développé un deuxième type de modèle pour l’étude de la régénération nerveuse

périphérique in vitro. Pour ce faire, nous avons tiré avantage d’un autre type de peau

reconstruite développée dans notre laboratoire, soit les feuillets dermiques produits par la

méthode d’autoassemblage (Michel, 1999). Cette méthode consiste à faire produire par les

fibroblastes leur propre MEC grâce à l’ajout d’acide ascorbique, cofacteur essentiel à un

enzyme impliqué dans la synthèse du collagène, puis à superposer quatre feuillets pour

obtenir un derme reconstruit. Étant donné que les feuillets dermiques sont entièrement

composés de fibroblastes et de la MEC qu’ils sécrètent, on ne retrouve pas ici le problème

du manque de MEC. Les fibres nerveuses ont alors tout le support nécessaire pour migrer

vers les cellules épithéliales. C’est d’ailleurs ce qu’on a pu observer lorsque les feuillets

étaient ensemencés de FPI ou de kératinocytes.

En plus d’une migration préférentielle des fibres nerveuses vers les cellules épithéliales, il y

a eu étroite association entre ces fibres et les inclusions intradermiques formées en présence

de FPI. Comme les kératinocytes sont connus pour produire du NGF (Pincelli, 1997),

l’épiderme joue sans doute un rôle dans la migration axonale. Une autre raison qui a

probablement influencé la migration des fibres nerveuses vers les inclusions est l’épaisseur

des feuillets qui est d’environ 300 µm pour un feuillet quadruple. En effet, la méthode

d’autoassemblage résulte de l’empilement de plusieurs feuillets de MEC qui sont beaucoup

plus minces que l’éponge. Les fibres nerveuses ont alors moins de MEC à traverser pour

atteindre leur cible. Cependant, l’épaisseur des feuillets représente probablement une limite

du modèle. En effet, l’épaisseur de l’éponge s’apparente beaucoup plus à celle de la peau

que l’épaisseur des feuillets. Il se pourrait toutefois que l’épaisseur de l’éponge affecte le

gradient de molécules trophiques produites par les cellules épithéliales. Ces molécules ne se

rendent peut-être pas jusqu’aux neurones sensoriels. Dans le but de créer un modèle in vitro

de peau reconstruite le plus près possible de la peau normale humaine, l’éponge présente ici

un gros avantage par rapport à la méthode des feuillets. Il est également à noter que

l’éponge est beaucoup plus rapide et facile à produire que les feuillets dermiques. En effet,

ces derniers ont besoin de 28 jours de maturation in vitro avant de pouvoir être superposés

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69

pour produire un feuillet quadruple. L’éponge ne nécessite quant à elle que 14 jours, soit

2 jours pour sa préparation, 5 jours pour sa stérilisation et 7 jours en immersion à la suite de

l’ensemencement des fibroblastes.

4.3 Greffe chez la souris athymique Nous avons greffé l’éponge de collagène et les feuillets dermiques chez la souris athymique

afin de vérifier si ces deux types de peaux reconstruites permettaient la croissance de

follicules pileux complets lorsque ensemencés de FPI. Nous voulions également vérifier si

ces peaux reconstruites enrichies de FPI avaient une influence sur la régénération nerveuse

provenant du lit de la plaie. En ce qui concerne l’éponge de collagène, il n’y a eu croissance

d’aucun follicule pileux. Ceci est sans doute dû à la mauvaise répartition de la MEC dans

l’éponge. En effet, tous les facteurs provenant de la souris ne pouvaient pas venir activer les

voies de signalisation nécessaires à la croissance des poils. Nous n’avons donc pas pu

vérifier avec l’éponge si l’ensemencement de FPI favorisait l’élongation axonale.

Mentionnons toutefois qu’il a déjà été démontré que notre modèle d’éponge permettait la

régénération nerveuse provenant du lit de la plaie 90 jours après la greffe chez la souris

athymique (Gingras, 2003b). Comme nous savions que les follicules pileux seraient

présents dans les peaux reconstruites greffées après un mois, nous avons donc arrêté

l’expérience après un mois, quand il devint évident qu’aucun poil ne pousserait. Il est donc

normal qu’aucune neurite n’ait été observée dans l’éponge greffée après un mois. Il est

donc permis de croire qu’une fois la colonisation de l’éponge par les fibroblastes optimisée,

notre biopolymère pourrait constituer une matrice favorable à la formation de follicules

pileux complets. En effet, la MEC représente un support essentiel pour la migration

cellulaire et si les cellules ne peuvent pas migrer dans l’éponge, il y aura un manque au

niveau des interactions cellules-cellules. Les voies de signalisation nécessaires ne seront

alors pas activées et les poils ne se développeront pas. Nous espérons également observer

une migration préférentielle des axones vers les FPI implantés dans le modèle, migration

qui devrait éventuellement être suivie d’une association étroite des axones et des follicules

pileux. En effet, c’est exactement ce qui a été observé après la greffe de feuillets dermiques

effectuée par Danielle Larouche. Un mois seulement après la greffe, il y avait présence de

poils matures au niveau des feuillets enrichis de FPI. Comme l’a démontré l’analyse en

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70

immunofluorescence, en présence de FPI, une élongation vigoureuse des neurites

exprimant le NF150 et provenant de la souris a été observée, de même qu’une étroite

association de ces fibres nerveuses avec les follicules pileux marqués à la K14, et ce, de

façon similaire à ce qui est observé dans la peau normale de souris (Larouche, En

préparation).

Ainsi, de nombreux efforts ont été concentrés sur le développement des modèles in vivo et

in vitro afin d’étudier la régénération nerveuse périphérique. Bien que les modèles in vivo

aient permis d’accroître considérablement les connaissances sur la régénération nerveuse,

l’utilisation de ces derniers comporte d’importantes limitations : des manipulations

difficiles sur les animaux, une certaine variabilité au niveau des résultats, un coût élevé et

des réponses non-spécifiques de l’hôte entraînant l’apparition de faux positifs. Ces

limitations justifient donc l’intérêt de développer des modèles in vitro avec des cellules

humaines.

4.4 Contributions aux connaissances actuelles Ces résultats permettront de faire progresser le développement de tissus reconstruits par

génie tissulaire et le traitement des grands brûlés. Aujourd’hui encore, le recouvrement des

brûlures profondes s’effectue surtout avec des feuillets d’épiderme, même si la greffe de

peaux reconstruites pourrait offrir une meilleure alternative pour le traitement des grands

brûlés (Berthod, 1997a). En effet, la transplantation d’une peau reconstruite chez les grands

brûlés semble être une solution prometteuse pour le traitement des brûlures profondes,

surtout en tant qu’alternative à la greffe de peau dans le cas d’un manque au niveau des

sites donneurs (Berthod, 1997a; Berthod, 1997c; Muhart, 1999). En effet, différentes études

ont mis en évidence l’importance du derme pour améliorer la guérison de la greffe, en

comparaison avec les transplantations de feuillets épithéliaux (Kangesu, 1993; Lamme,

1996; Lamme, 1998). Les peaux reconstruites ne sont toutefois pas encore couramment

utilisées dans le traitement des brûlures profondes puisque tous les paramètres ne sont pas

encore bien contrôlés. De plus, avant de greffer chez l’humain, il faudra avoir une peau

reconstruite uniquement avec des composants humains.

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71

4.5 Perspectives La régénération nerveuse obtenue dans les peaux reconstruites pourrait également être

améliorée par l’incorporation dans la structure du biomatériau de molécules

neurotrophiques comme du NGF (Terenghi, 1999), ou encore des glycoprotéines favorisant

la migration axonale, comme la laminine (Rangappa, 2000). L’objectif de la préparation

d’un biomatériau enrichi en molécules neurotrophiques serait d’obtenir une meilleure

récupération de la sensibilité tactile, et d’ainsi faire mieux qu’une autogreffe

conventionnelle. La fonctionnalité de la réinnervation obtenue dans les greffes de peaux

reconstruites enrichies sera éventuellement évaluée chez la souris par un test de

récupération tactile non-invasif à l’aide d’un Neurometer© (Kiso, 2001).

Nous projetons maintenant de décortiquer le processus par lequel les fibres nerveuses

migrent de façon préférentielle vers les inclusions intradermiques pour ensuite s’enrouler

autour d’elles. Il serait en effet intéressant d’analyser séparément l’effet du follicule entier,

des cellules souches folliculaires, ou des fibroblastes de la papille folliculaire, et d’analyser

les substances neurotrophiques qu’ils sécrètent, les récepteurs qu’ils expriment ou les

molécules de la MEC qu’ils déposent. De plus, la démonstration d’une stimulation de la

croissance des follicules par une interaction avec les axones serait également d’une

importance majeure dans la compréhension globale de la croissance des poils (Peters,

2001). En effet, il existe de nombreuses interrogations à savoir si ce sont les poils qui

attirent les nerfs ou si, au contraire, ce sont les nerfs qui favorisent la croissance des poils.

Dans le cas où les cellules souches des follicules pileux démontreraient un potentiel

d’attraction majeur sur les axones, nous envisagerons de développer un nouveau modèle de

peau reconstruite contenant ce type de cellules extraites à partir de prélèvements capillaires

autologues sur les patients. Un tel modèle pourrait alors constituer une voie d’avenir dans le

traitement des brûlures profondes, puisqu’il pourrait entre autres stimuler la récupération

tactile cutanée.

Dans notre souci de reproduire un modèle aussi proche que possible du SNP humain, nous

projetons d’utiliser des neurones humains pour développer un modèle complètement

humain. L’utilisation, dans les modèles, de neurones embryonnaires de souris peut être

critiquable du fait qu’ils ne se comportent pas nécessairement comme les cellules adultes

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humaines. En effet, tant et aussi longtemps que les modèles contiendront des cellules

murines, ils ne pourront pas être greffés chez l’humain. À la suite de la découverte par

l’équipe du Dr Miller que la peau humaine contenait des cellules souches multipotentes

pouvant se différencier en neurones et en cellules de Schwann (Toma, 2001), nous avons

entrepris de reproduire et d’améliorer la technique qu’ils ont mis au point, afin d’obtenir

une source importante de cellules nerveuses humaines pour produire un modèle de

régénération nerveuse périphérique de type humain. L’utilisation de neurones humains

obtenus à partir de cellules souches multipotentes cutanées est d’un intérêt capital dans le

développement d’un modèle entièrement humain de régénération nerveuse périphérique. De

plus, l’utilisation de neurones humains adultes ne soulève pas de problème éthique,

contrairement à l’utilisation de neurones humains embryonnaires.

Afin d’améliorer le modèle de régénération nerveuse, l’addition, dans ce futur modèle, de

cellules de Schwann devrait permettre de stabiliser le réseau nerveux et éventuellement de

conduire à la myélinisation des axones. L’addition de cellules de Schwann autologues dans

une peau reconstruite pour traiter les brûlures profondes pourrait améliorer la récupération

tactile du greffon. En effet, les cellules de Schwann sont des composants essentiels des

nerfs périphériques puisqu’elles assurent la myélinisation des axones. Elles influent en

particulier sur le diamètre des axones et la densité de leurs neurofilaments (Martini, 2001).

Elles jouent surtout un rôle majeur lors de la régénération nerveuse, en proliférant pour

préparer la voie à la migration de l’axone situé en amont de la lésion (Ide, 1996; Torigoe,

1997; Sulaiman, 2000). L’incorporation des cellules de Schwann dans les modèles

d’éponge de collagène et de feuillets dermiques devrait donc être une étape majeure pour

leur optimisation.

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Chapitre 5

Conclusion

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74

Ce projet avait deux objectifs principaux : étudier l’influence des follicules pileux sur la

migration axonale in vitro et analyser le processus de régénération nerveuse dans une peau

reconstruite contenant des poils, après implantation chez la souris immunodéficiente. Nous

avons mis au point deux types de peaux reconstruites par génie tissulaire pour l’étude de la

régénération nerveuse périphérique. Ces modèles permettent en effet une forte croissance

des neurites, qui traversent les équivalents dermiques, à partir des neurones extraits des

DRG. Cette migration axonale a eu lieu grâce au pouvoir d’attraction du NGF ajouté au

milieu de culture, et possiblement grâce à la présence d’inclusions intradermiques et d’un

épiderme. Les axones ont également migré à travers une MEC dense sécrétée par les

fibroblastes et ressemblant à la matrice retrouvée dans les tissus conjonctifs in situ

(Berthod, 1996; Berthod, 1997b). De plus, cette matrice devrait reproduire un

environnement tridimensionnel ressemblant à celui retrouvé in vivo beaucoup plus

fidèlement que l’environnement reproduit par un gel de collagène, un gel d’agarose ou

encore MatrigelTM (Borkenhagen, 1998; Balgude, 2001; Cao, 2001; Yu, 2001b; Cheng,

2002). Nous avons également démontré, aussi bien in vivo qu’in vitro, que les FPI

incorporés dans les modèles de peau étaient une cible autour de laquelle les axones des

neurones sensitifs se réorganisaient préférentiellement. Étant donné que ces peaux

reconstruites permettent la régénération nerveuse, les patients traités à l’aide de ces peaux

reconstruites pourraient retrouver une certaine perception de la chaleur, du froid et de la

douleur, tel qu’observé dans les greffes conventionnelles (Lutz, 1998). Avec l’addition de

follicules pileux dans les modèles, les patients pourraient en plus retrouver une certaine

sensibilité tactile.

Puisque ces peaux reconstruites présentent une grande flexibilité, différents types de

cellules pourront éventuellement y être ajoutées pour étudier leurs effets sur la croissance

des neurites à long terme. Notons par exemple des neurones moteurs ou sympathiques, des

cellules dendritiques, des cellules de Schwann et bien d’autres molécules inhibitrices,

attractives ou répulsives. Dans le cas de l’éponge de collagène, ces molécules pourraient en

effet être ajoutées au milieu de culture ou encore incorporées directement dans la structure

de l’éponge.

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Chapitre 6

Bibliographie

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