1

TUBERCOLOSI

La tubercolosi è

un’infezione causata da due

specie di micobatteri:

Mycobacterium tuberculosis e

Mycobacterium bovis.

Nonostante questi

microorganismi possano

infettare qualsiasi organo, in

pratica è di gran lunga

preminente la localizzazione

polmonare, caratterizzata

istologicamente dalla

formazione del tipico

granuloma.

2

MICOBATTERI

Bacilli molto sottili Immobili, non sporigeni, aerobi obbligati alcune specie producono forme filamentose con ramificazioni mico-batteri : simili ai funghi peculiari involucri esterni ricchi di lipidi difficilmente penetrabili dai coloranti e una volta colorati difficilmente decolorabili anche con l’uso di acidi acido-resistenza rallentamento negli scambi di nutrienti- rallentamento crescita (t. duplicazione 18-24h, colonie visibili in 3-6 sett.)

MICOBATTERI

3

MICOBATTERI Diverse specie innocui saprofiti nel suolo o

commensali nell’uomo (M. smegmatis) Mycobacterium tuberculosis complex: -M. tuberculosis (b. di Koch) tubercolosi umana -M. bovis tubercolosi bovina, trasmissibile all’uomo -M. africanum, M. canetti tubercolosi umana MOTT: (Mycobacterium other than tuberculosis) micobatteri opportunisti, hanno assunto rilievo negli ultimi anni: una delle più frequenti cause di morte nel pz. malato di AIDS es. MAC (Mycobacterium avium complex) M. leprae lebbra

4

M.tuberculosis M.kansasii complex M. kansasii

M.tuberculosis complex M.bovis M.gastri (M. africanum) M.terrae M.avium M.terrae complex M.nonchromogenicum M. avium complex M.intracellulare M.triviale M. xenopi M foruitum complex M. fortuitum M.scrofolaceum complex M.scrofolaceum M.chelonae M.simie M.parafortuitum

complex M.parafortuitum

M.gordonae complex M.gordonae M.vaccae M.szulgai

Classificazione dei principali micobatteri

5

M.tuberculosis

epidemiologia

Tubercolosi: ogni anno alcuni milioni di nuovi casi

Mortalità: 2-3milioni/anno

patologia riemergente a causa di:

- flussi migratori, nuove sacche di povertà anche in paesi industrializzati, aumento patologie da immunosoppressione

Caratteri antigeni

2 caratteri antigeni: di natura polisaccaridica e proteine citoplasmatiche

cere (acidi micolici + glicolipidi fenolici) con azione adiuvante l’immunogenicità dei 2 tipi di Ag favoriscono la risposta cellulo-mediata

6

PATOGENICITA’

Questo microorganismo non produce esotossine, quindi

l’azione patogena sembra imputabile ad una sua tossicità

intrinseca legata ad alcuni lipidi della parete cellulare

presenti in grande quantità.

Questi lipidi risultano essere in parte vere e proprie cere,

in parte glicolipidi, questi ultimi denominati micosidi dei

quali uno in particolare è considerato essere direttamente

correlato con la virulenza: il fattore cordale.

Un altro micoside di notevole importanza è la cera D,

sostanza localizzata nello strato basale della parete

formata da acidi micolici e da un glicopeptide. Ha il

potere di aumentare l’immunogenicità

7

M.tuberculosis

Glicolipidi fenolici

cere

8

M.tuberculosis fattori di patogenicità

produzione di emolisine e lipasi, ma non vere tossine

Catalasi, perossidasi e lipoarabinomannani aiutano a resistere alla risposta cell-ossidativa capacità di resistere al killing intracellulare:

-inibizione fusione fagosoma-lisosoma

-inibizione acidificazione contenuto del fagolisosoma

Acidi micolici + glicolipidi, cere D, trealoso 6,6 dimicolato (fattore cordale) causano la formazione di granulomi nei tessuti animali

fattore cordale tossico per i macrofagi

9

Patogenicità

Le lesioni istopatologiche caratteristiche della

malattia possono essere di tipo essudativo o

produttivo. Le prime sono presenti nelle fasi

iniziali del contagio o quando il

microorganismo prolifera in carenza di

risposta immune adeguata da parte

dell’organismo infettato, mentre le seconde

sono tipiche della fase in cui il soggetto

infettato ha sviluppato una ipersensibilità alle

proteine tubercolari.

10

11

12

M.tuberculosis

patogenesi

trasmesso per via aerogena si deposita negli spazi alveolari infiammazione essudativa e accumulo di macrofagi macrofagi fagocitano micobatteri uccisione bacilli e presentazione antigene innesco risposta immune CD4 CD8 citotossico lisi e liberazione micobatteri macrofagi attivati fagocitosi e processo infiamm. di tipo granulomatoso tubercolo, circondato da connettivo e porzione centrale in necrosi, segue precipitazione di sali di calcio complesso primario

13

M.tuberculosis patogenesi

complesso primario sterilizzazione infezione cronica paucibacillare asintomatica, che richiede macrofagi attivati, CD4 e CD8 diminuita efficienza del sistema immunitario riattivazione, moltiplicazione, lesioni granulomatose confluenti, necrosi e colliquazione della parte centrale contenuto in circolo e diffusione dell’infezione in sede polmonare ed extrapolmonare (tubercolosi miliare, meningea, renale, ossea)- espettorato + trasmissione ad altri individui Rischio di riattivazione più grande entro 2 anni dalla infezione primaria

14

Diagnosi

Primo passo nella diagnosi laboratoristica consiste

nell’allestimento del preparato microscopico: strisci

colorati con metodiche che evidenzino l’alcool-acido

resistenza tipica dei Micobatteri come la metodica di

Ziehl-Neelsen

La sensibilità dell’esame microscopico è purtroppo

bassa e richiede perché sia positiva una carica di

oltre 10.000 bacilli/ml,

15

Diagnosi

La diagnosi definitiva si ottiene però tramite l’esame colturale ostacolato dall’esasperante lentezza di crescita dei micobatteri. Primo passo è la liquefazione e decontaminazione del campione, che solitamente viene eseguita utilizzando N acetil cisteina come mucolitico in soluzione con idrossido di sodio all’ 1%: quest’ultimo garantisce l’uccisione di tutti gli altri microorganismi, mentre i micobatteri risultano protetti grazie alla particolare ricchezza in acidi grassi.

16

M.tuberculosis diagnosi microbiologica

ricerca microscopica

ricerca di bacilli acido-resistenti in espettorato, liquor, materiale bioptico, urine (possibilità di confondere con M.smegmatis saprofita dell’apparato genito-urinario)

ricerca colturale

il materiale deve essere decontaminato dalla popolazione microbica accessoria (NAC + NaOH 2-3% poi HCl)- incubazione 2-3 settimane a 37°C colonie con leggera pigmentazione giallastra

apparecchiature automatizzate: terreno liquido con palmitato(14C) che viene metabolizzato dai micobatteri con liberazione di CO2 radioattiva

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Colorazione di Ziehl-Neelsen

Organismo acido-

resistente Organismo non acido-resistente

Batteri sospesi in SF e

fissati sul vetrino

Carbol-fucsina e

fenolo 3 min e

sciacquare con H2O

Decolorare con HCl 3%

in alcool 70% 2min e

sciacquare con H2O

Blu di metilene 30 sec

sciacquare con H2O e

asciugare

18 Colorazione di Ziehl-Neelsen

19

DIAGNOSI

Per la ricerca di M. tuberculosis

nell’espettorato si consiglia di

raccogliere il campione del mattino per

tre giorni consecutivi, mentre in presenza

di una sospetta localizzazione alle vie

urinarie sarà opportuno raccogliere la

totalità di urine emesse nelle 72 ore.

20

MICOBATTERI terreni di coltura

3 tipi di terreni:

al tuorlo d’uovo (sorgente di lipidi) (IUTM, Lowenstein-Jensen), verde malachite, glicerolo (M.tubercolosis), piruvato (M.bovis)

a composizione chimica sol. tampone + acido oleico (sorgente di lipidi), albumina bovina, destrosio e catalasi (Middelbrook)

liquidi formazioni cordali: bacilli allineati in file parallele a causa della idrofobicità batterica

21

M.tuberculosis diagnosi microbiologica

sonde molecolari

amplificazione con PCR e ibridizzazione con sonde: identificazione definitiva a livello di specie (1-2gg)

ricerca di anticorpi non affidabile

Biologia molecolare anche per ricerca di antibiotico-resistenza

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M.tuberculosis reazione di Mantoux -tubercolina

Utile a fini epidemiologici

accerta la presenza di immunità-cellulo mediata

tubercolina: proteine micobatteriche purificate

si inietta tubercolina per via intradermica (0.1 ml di opportuna concentrazione) nella faccia volare dell’avambraccio

è possibile anche utilizzare cerotti per l’assorbimento percutaneo

si osserva dopo 24-48h di incubazione allergia ritardata ( papula eritematosa) nei pz che hanno subito un’infezione reazione positiva

non ha senso diagnostico a meno che non si dimostri un passaggio da reazione negativa a positiva nello stesso soggetto in un breve periodo

23

M.tuberculosis reazione di Mantoux -tubercolina

24

M. tuberculosis

Il test cutaneo alla tubercolina presenta problemi di scarsa sensibilità, la bassa specificità, il rischio di inadeguato follow-up del paziente per la lettura (esame standard per la diagnosi)

Falsopositivi con micobatteri non-tubercolotici, vaccinazioni con il bacillo di Calmette-Guérin (BCG) (in particolare se recenti), errate interpretazioni soggettive

Saggi basati sull’interferone gamma antigenespecifico individuano il rilascio di interferone gamma da parte di cellule T “di memoria” precedentemente sensibilizzate mediante stimolazione in vitro con proteine specifiche del M. tuberculosis. Questi esami non generano risultati falso-positivi in pazienti precedentemente vaccinati con BCG o affetti dalla maggior parte delle infezioni micobatteriche non-tubercolotiche; ciò consente una maggiore specificità dell’identificazione del M. tuberculosis.

25

Infezioni Latenti Circa un terzo della popolazione mondiale, compresi 11 milioni di pazienti negli Stati Uniti, presentano un’infezione latente da Mycobacterium tuberculosis.

Pazienti provenienti da paesi in cui la malattia è endemica.

Popolazioni economicamente svantaggiate e nei pazienti immunodepressi.

Ritardi nell’individuazione e nel trattamento dell’infezione ne facilitano la trasmissione.

Rilascio di interferone gamma e sull’amplificazione degli acidi nucleici consentono un’identificazione più rapida e specifica, rispettivamente, dell’infezione da M. tuberculosis e della presenza di una malattia attiva.

26

Resistenze e terapie

La terapia della tubercolosi si protrae

usualmente per periodi molto lunghi (6-9

mesi), questo perché le molecole

utilizzate necessitano per agire di

organismi metabolicamente attivi,

mentre M. tuberculosis cresce molto

lentamente.

27

Resistenze e terapie

Nel paziente affetto da tubercolosi è verosimile suddividere i bacilli in tre differenti sottopopolazioni:

microorganismi che si sviluppano attivamente in ambiente extracellulare.

una seconda sottopopolazione intracellulare si riproduce più lentamente della precedente nel contesto della necrosi caseosa.

la terza, anch’esse a lenta crescita, si riproduce in ambiente intracellulare ed è quella presente all’interno dei macrofagi e dei monociti

28

Resistenze e terapie

Non tutti i farmaci antitubercolari dimostrano la

stessa efficacia nei confronti di queste tre

sottopopolazioni, infatti isoniazide, streptomicina ed

etambutolo risultano essere particolarmente attivi nei

confronti delle popolazioni extracellulari

metabolicamente attive; la rifampicina sembrerebbe

attiva unicamente nei confronti della porzione di

bacilli extracellulari. I micobatteri intracellulari sono

invece sensibili alla pirazinamide che

sperimentalmente si è dimostrata molto efficace

Meccanismo d’azione

Isoniazide: inibizione sintesi ac micolici

Rifampicina: RNA polimerasi

Etambutolo: sintesi arabinofuranosilgalattosio

componente della parete micobatterica.

Pirazinamide abbassa il pH citoplasmatico e

disabilita alcuni sistemi di captazione attiva di

nutrienti (quali basi pirimidiniche ed

aminoacidi).

29

30

M.tuberculosis terapia

terapia iniziale: isoniazide 300mg rifampicina 600mg pirazinamide 2000mg etambutolo 1200mg

giornalmente per 2 mesi terapia di mantenimento: isoniazide 600mg rifampicina 600mg

3 volte alla settimana per 4 mesi

31

Vaccinazione

La vaccinazione contro la tubercolosi utilizzando vaccini preparati utilizzando vari ceppi dei bacilli di Calmette e Guèrin ha dato

risultati controversi. Recenti studi hanno infatti dimostrato come il grado di protezione conferito possa variare notevolmente. Molto

probabilmente la vaccinazione è utile nel prevenire le forme più aggressive evitando la

disseminazione.

32

M.tuberculosis resistenza ai farmaci antitubercolari

emergono facilmente varianti farmaco-resistenti (necessità multi-terapia)

resistenza naturale: M.bovis e pirazinamide

resistenza acquisita: durante la replicazione batterica, le mutazioni avvengono con frequenza nota 10-7-10-10 es. R alla rif 10-8, R all’isoniazide 10-6

Il trattamento con gli antibiotici favorisce la pressione selettiva, i ceppi possono accumulare più resistenze e una volta resistenti come tali possono essere trasmessi ad altri soggetti (R primaria il pz non è mai stato trattato con anti-tubercolari)

la farmaco-resistenza è molto variabile nelle diverse aree geografiche

33

Best drug treatment for multidrug-resistant

and extensively drug-resistant tuberculosis

José A Caminero, Giovanni Sotgiu,

Alimuddin Zumla, Giovanni Battista

Migliori

Lancet Infect Dis 2010;

10: 621–29

Clofazimina, si lega alla guanina, blocca sintesi DNA (specie per lebbra) tioacetazone simile etamb. Ma non cosi attivo.

34

Lancet Infect Dis

2010;

10: 621–29

Best drug treatment for multidrug-resistant

and extensively drug-resistant tuberculosis

José A Caminero, Giovanni Sotgiu,

Alimuddin Zumla, Giovanni Battista

Migliori

35

Nanotecnologie

Per inviare ai macrofagi

I farmaci direttamente

Resa >3,5 volte

DDS, drug delivery systems

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Delamanid (OPC-67683) is a novel mycolic acid biosynthesis inhibitor active against

Mycobacterium tuberculosis

PA-824 is a new chemical entity and a member of a class of compounds known as nitroimidazo-

oxazines, with significant antituberculosis activity and a unique mechanism of action ,

nitroimidazopyrans inhibited the synthesis of protein and cell wall lipid. In contrast to current

antitubercular drugs, nitroimidazopyrans exhibited bactericidal activity against both replicating and

static M. tuberculosis. Lead compound PA-824 showed potent bactericidal activity against

multidrug-resistant M. tuberculosis and promising oral activity in animal infection models.

Bedaquiline affects the proton pump for ATP synthase. This mechanism is unlike that of the

quinolones, whose target is DNA gyrase. (on combination with moxifloxacin)

Nuovi antibiotici

37

Bedaquilina

Position paper italiano relativo ad utilizzo di

SIRTURO® (Bedaquilina) in pazienti affetti

da Tubercolosi multi-resistente complessa

http://www.amcli.it/documenti/position-paper/

38

39

40

M.tuberculosis profilassi

Isoniazide per 9 mesi o rifampicina per 4 mesi

Il vaccino è costituito da una variante apatogena di M.bovis scoperta da Calmette e Guerin BCG

inoculazione intracutanea

Vaccinazione di massa non praticata nei paesi industrializzati

vaccinazione di massa nei paesi in via di sviluppo

41

M.leprae

Bacillo di Hansen

Si moltiplica nei macrofagi e nelle cellule di Schwann

Lebbra: malattia cronica a lungo decorso (incubaz. 5-7anni) decorso caratterizzato da lesioni granulomatose cutanee o mucose (noduli leprosi) che vanno incontro a ulcerazioni provocando spesso mutilazioni deformanti LEBBRA LEPROMATOSA

42

M.leprae

Lebbra: caratterizzata da lesioni che coinvolgono varie terminazioni nervose periferiche con comparsa di vaste aree di ipoestesia e ipopigmentate LEBBRA TUBERCOLARE

43

M.leprae

Trasmissione interumana mediante inalazione o contatto diretto con le lesioni

Lebbra tubercolare: forte reazione cellulo-mediata (pochi bacilli nelle lesioni)

Lebbra lepromatosa: forte reazione anticorpale

Contagiosità:

lebbra t. bassa

Lebbra l. molto alta: numerosi bacilli nelle lesioni

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M.leprae

Non coltivabile in vitro (armadillo e zampa di topo)

Diagnosi mediante dimostrazione dal reperto microscopico di bacilli acido-resistenti nei materiali provenienti dai granulomi cutanei o mucosi o test cutaneo specifico (forma tubercolare)

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M.avium complex Comune patogeno ambientale. Almeno 30 tipi: sierotipi 4-8 infez. nei pz. AIDS, 11-20 nei pz. non-AIDS

Trasmissione per inalazione o ingestione di H2O o cibo contaminati

Si lega e invade cellule oro-faringee e gastro-intestinali, sopravvive nei macrofagi

Causa:

1-tubercolosi polmonare in pz. Con funzione resp.compromessa (es. BPCO) o in pz.immunocompromessi

2- linfoadenite nei bambini

3-malattia disseminata nei pz. AIDS: febbre, sudorazione, perdita di peso, anoressia, dolore addominale, diarrea cronica, linfoadenite e polmonite, nessun organo è risparmiato. La massa dei bacilli replicanti compromette la funzionalità dell’organo

È la più comune micobatteriosi nei pz. AIDS

Trattamento: claritromicina + altri 2 farmaci (etambutolo, rif., cip..) isoniazide non attiva

46

I micobatteri devono il loro nome (una

risposta):

Alla struttura della parete

Alla loro forma

Al tipo di crescita

Al tipo di metabolismo

x

47

L’alcool-acido resistenza dei micobatteri

dipende (una risposta):

Dall’impermeabilità degli involucri esterni

Dalla permeabilità degli involucri esterni

Dal tipo di crescita

Dal metabolismo rallentato

x

48

Sono terreni per la coltivazione dei

micobatteri (risposta multipla):

IUTM

McConkey

Mueller Hinton

Middlebrook

x

x

49

Quali delle seguenti affermazioni sono vere sulle

formazioni cordali dei Micobatteri (risposte

multiple):

Si formano nei terreni liquidi

Si formano nei terreni solidi

Dipendono dall’idrofobicità batterica

Sono formate da batteri

Sono formate da materiale mucopolisaccaridico

x

x

x

50

Sono tutte caratteristiche dei micobatteri

tranne una:

Sono bacilli molto sottili

Sono alcool-resistenti

Sono cocchi molto allungati

Crescono lentamente

Crescono in terreni ricchi di lipidi

x

51

I micobatteri possono essere definiti (una

risposta):

Saprofiti

Commensali

Patogeni

Opportunisti

Tutte le precedenti x

52

Sono tutti micobatteri tranne uno:

M.smegmatis

M.influenzae

M.tubercolosis

M.bovis

M.leprae

x

53

Il termine Bacillo di Koch è sinonimo di (una

risposta):

M.tubercolosis

M.avium

M.bovis

M.leprae

M.smegmatis

x

54

La tubercolosi è una patologia (una risposta):

Scomparsa in Europa

Riemergente in Europa

Molto diffusa in Europa

x

55

Contribuiscono ad aumentare l’incidenza della

tubercolosi (risposta multipla):

Flussi migratori

Terapie immunosopprimenti

Denutrizione e condizioni igieniche

scadenti

Uso degli antibiotici

x

x

x

56

Sono tutte caratteristiche delle cere tranne una:

Sono lipidi degli involucri esterni

Sono costituite da acidi micolici e glicolipidi

fenolici

Coadiuvano l’azione immunogena degli antigeni

Stimolano la risposta cellulo-mediata

Conferiscono termo-resistenza x

57

Il principale fattore di virulenza di

M.tubercolosis è (una risposta):

La produzione di una potente tossina

La produzione di enzimi idrolitici

La capacità di resistere al killing

intracellulare

La capsula

x

58

Sono tutti fattori di virulenza di

M.tubercolosis tranne uno:

Emolisina

Lipasi

Fattore cordale

Invasina x

59

La tubercolosi si trasmette (una risposta):

Per via oro-fecale

Per via sessuale

Per via aerogena

Per via ematica

x

60

Quali cellule del sistema immunitario sono

implicate nella patogenesi della tubercolosi

(risposta multipla):

Linfociti TCD4

Macrofagi

Linfociti TCD8

Linfociti B

x

x

x

61

Il complesso primario è (una risposta):

Il primo micobatterio che instaura

l’infezione

Il primo alveolo polmonare infettato

Un tubercolo con sali di calcio precipitati x

62

Sono materiali utili per la ricerca di

M.tubercolosis tutti tranne uno:

Espettorato

Liquor

Materiale bioptico

Urine

Feci x

63

La diagnosi microbiologica di M.tubercolosis

può essere di tipo (risposta multipla):

Microscopica

Colturale

Ricerca anticorpi

Ricerca acidi nucleici

x

x

x

64

Queste caratteristiche della reazione di Mantoux sono tutte vere tranne una:

È utile a fini epidemiologici

Si esegue con proteine micobatteriche purificate

Si ha reazione positiva nei pazienti che hanno subito un’infezione

È sempre utile a fini diagnostici x

65

Contro M.tubercolosis si usa una multiterapia

perché (una risposta):

L’infezione è spesso polimicrobica

Emergono facilmente varianti resistenti

Occorrono dosi massicce di antibiotico

Non si conoscono i tassi di resistenza alle

varie molecole

x

66

Tutte le affermazioni seguenti sulla terapia

sono vere tranne una:

La terapia iniziale è giornaliera

La terapia iniziale dura 2 mesi

La terapia iniziale dura 4 mesi

La terapia di mantenimento è Isoniazide e

Rifamicina

x