trovanja gram + bakterijamanamirnice.vet.bg.ac.rs/001 studentski folder/newsas_bhap... · 2020. 4....

25.3.2020.

1

TROVANJA HRANOM PROUZROKOVANA GRAM POZITIVNIM SPOROGENIM BAKTERIJAMA

Fakultet veterinarske medicine u Beogradu

Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla

Prof. dr Dragan Vasilev

BACILLUS CEREUS

1906 – prvi izveštaj o trovanju hranom čiji uzročnik je Bacillus spp

Lubenau – 300 ljudi u sanatorijumu obolelo sa simptomima

profuzne dijareje, stomačnih grčeva i povraćanja. Izvor trovanja- ćufte

1950 – Bacillus cereus prvi put ustanovljen kao uzročnik trovanja hranom

Hauge – 600 ljudi oboleleo u Norveškoj. Izvor trovanja - sos od vanile

1971 – prvi put opisana dva različita oblika trovanja B. cereus

- dijareja sindrom

- emetik sindrom

Od 1975 - Pored B. cereus – B. licheniformis, B. pumilis, B. subtilis, B. thuringiensis



BACILLUS CEREUS – KARAKTERISTIKE

Gram pozitivan štapić, 1 – 5 µm

Formira spore

Aerob, fakultativni anaerob

Raste u opsegu 8 – 55 oC, optimum 28 - 35 oC

Ne raste ispod pH 5,0 i aw 0,95

Široko rasprostranjen – zemlja, voda, biljke



25.3.2020.

2

DIJAREA SINDROM EMETIK SINDROM

Mesto stvaranja toksina

tanko crevo hrana

Otpornost toksina na toplotu

56 oC , 5 min 126 oC, 90 min

Otpornost toksina na pH

nestabilnan pri < 4 i > 11 stabilan od 2 - 11

Inkubacija 8 -16h 0.5 - 5 h

Simptomi bol u abdomenu, profuzne vodenaste stolice, rektalni

tenezmus

mučnina i povraćanje

Trajanje simptoma 12 - 24 h 6 - 24 h

Izvor trovanja proizvodi od mesa, supe, povrće, pudinzi, sosevi,

mleko i proizvodi od mleka

prženi i kuvani pirinač, testenine, pecivo, knedle

Sličnost sa trovanjima druge etiologije

Clostridium perfringens Staphylococcus aureus

BACILLUS CEREUS – karakeristike dva tipa oboljenja



Dijarea sindrom

Hemolitični enterotoksin HBL – sastoji se od tri proteina B, L1 i L2

Nehemolitični enterotoksin NHE

Produkcija toksina – kasna eksponencijalna faza / rana stacionarna faza rasta

Delovanje – vezuju se za epitelijalne ćelije i razaraju membrane

Emetik sindrom

- Cereulid – ciklični peptid

Produkcija toksina – kasna eksponencijalna faza i stacionarna faza rasta

Delovanje – vezuje se za Nervus vagus i izaziva njegovu stimulaciju

Građa i delovanje toksina B. cereus

{



B. Cereus – hrana kao izvor trovanja

Emetik sindrom - hrana koja sadrži skrob (pirinač, testenine)



u Velikoj Britaniji “sindrom kineskih restorana”

- pirinač se priprema unapred u velikoj količini tako da hlađenje ispod 8 oC nije dovoljno da spreči stvaranje toksina u središnjim partijama.- toplotna obrada porcije pre serviranja nije dovoljna da uništi termostabilni emetik toksin.

25.3.2020.

3

Dijarea sindrom – širi spektar namirnica: - proizvodi od mesa, - supe, - povrće, - pudinzi i sosovi

Sušeno bilje i začini – najčešći izvor putem koga spore B. cereus dospevaju u hranu

Toplotna obrada hrane (pasterizacija) dovodi do selekcije sporogenih bakterija koje preživljavaju u manjem broju (< 103 / g) – skladištenje na neadekvatnim temperaturama hlađenja dovodi do germinacije spora u povećanja njihovog broja



B. Cereus – hrana kao izvor trovanja



Namirnica Broj slučajeva Uzrok

Pirinač sa mesnim sosom i povrćem

30 Neadekvatno hlađenje, dugo skladištenje na neadekvatnoj temperaturi

Palačinke 5 Dugo skladištenje testa za palačinke na sobnoj temperaturi

Svinjetina sa roštilja 139 Neadekvatno hlađenje, dugo skladištenje na sobnoj temperaturi

Sos od vanile 600 Dugo skladištenje na sobnoj temperaturi

Neki slučajevi trovanja toksinima B. Cereus (Novi Zeland)



Kuvanje mesa-Mleveno meso (govedina, teletina, jagnjetina, svinjetina) + svinjetina u komadima........................

-Mleveno živinsko meso.........................................-Meso u komadima (govedina, teletina, jagnjetina), riba, plodovi mora................................-Belo meso živine...................................................

-Živina, ceo trup.....................................................

Temperatura u dubini

Vreme

71 oC74 oC

63 oC77 oC

82 oC

15 sec

Hladiti kuvanu hranu na sobnoj temperaturi do:.....Nastaviti sa hlađenjem u frižideru:.........................Nastaviti hlađenje:..................................................

≥ 55 oC55 oC do 25 oC25 oC do 5 oC

do 5 hdo 10 h

Čuvanje kuvane hrane: ≤ 5 oC ili ≥ 60 oC

Podgrevanje kuvane hrane: 74 oC trenutno

Smanjiti pH hrane do ≤ 4,3

Smanjiti aw do 0,912

Mere za sprečavanje trovanja toksinima B. cereus

25.3.2020.

4

Izolacija i identifikacija B. cereus

-Nije neophodno obogaćenje - prisutan veliki broj bakterija (> 105 /g)

-Krvni agar, eventualno dodatak polimiksina (sprečava razmnožavanje Gram - )

- 24 h pri 37 oC,

- kolonije 3-7 mm,

- ravne, blago uzdignute, sivo-zelene,

sitno-zrnaste strukture,

- okružene zonom α ili β hemolize



PEMBA (polymyksin / pyruvate / eggyolk / mannitol / bromthymol blue / agar)

- kolonije tirkizno plave (ne fermentišu manitol)

-okružene zonom precipitacije žumanceta (lecitinaza aktivnost)piruvat pomaže precipitaciju žumanceta




- mikroskopski preparat – spore zelene, telo bakterije crveno, crne lipidne granule

biohemijski niz: glukoza +, manitol –, ksiloza –, arabinoza –




komercijalni kitovi za detekciju toksina u hrani - detekcija L2 jedinice iz HBL- detekcija proteina iz NHE

25.3.2020.

5

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

1892 – američki bakteriolog Welch - stari naziv Bacillus welchii

– poznat kao uzrok infekcija rana – gasna gangrena

1895 i 1899 – doveden u vezu sa gastroenteritisima u bolnici u Londonu

1943 – školski obroci u Engleskoj

1945 – jela od piletine u USA

Pet tipova – A, B, C, D, E na osnovu četiri glavna enterotoksina α, β, ε, ז i osam manjih.

} Clostridium perfringens



Tip Toksin

α β ε ז

A + - - -

B + + + -

C + + - -

D + - + -

E + - - +

Klasifikacija C. perfringens na osnovu stvaranja toksina



Gasna gangrena – C. perfringens tip A – α toksin

α toksin – lecitinaza aktivnost (fosfolipaza C) - hidroliza lecitina i fosfolipida ćelijskih

membrana – oštećenje tkiva

Enteritis necroticans – C. perfringens tip C – α i β toksin – nekroza crevne mukoze

Papua Nova Gvineja – “pigbel” – abdominalni bol i krvave dijareje par dana posle konzumiranja obroka bogatog proteinima.

Predisponirajući faktor – nizak sadržaj crevnih proteaza

(kod ishrane siromašne proteinima – krompir sadrži inhibitore proteaza)

Trovanje hranom - C. perfringens tip A – α toksin

- drugi po broju slučajeva, posle trovanja Salmonelom u Velikoj Britaniji (1/10)



25.3.2020.

6

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS - KARAKTERISITKE

Gram pozitivan štapić, 1Χ 3-9 µm

Anaerobi, ali mogu da prežive pa čak i da rastu u prisustvu kiseonika

Spore ovalne subterminalne

Nepokretni

Rastu pri 12 – 50 oC, optimum 43-47 oC

pH: mininum 5, optimum 6,0 – 7,5

aw: minimum 0,95-0,97

Ne raste u prisustvu 6 % soli

Rasprostranjenost – tip A – široko rasprostranjen, u zemljištu 103-104/g, vodi,

prašini, sirovoj i prerađenoj hrani i u crevima čoveka

- tipovi B, C, D i E – obligatni animalni paraziti



PATOGENEZA I KLINIČKA SLIKA

Trovanje hranom izazvano C. Perfringens – mučnina, abdominalni bol, dijarea i ređe povraćanje

Inkubacija: 8 – 24 h posle konzumiranja hrane koja sadrži veliki broj (106 – 108 cfu) vegetativnih bakterija C. Perfringens

Vegetativne ćelije unete putem hrane umnožavaju se

u tankom crevu, sporuliraju i stvaraju enterotoksin.

Enterotoksin se oslobađa prilikom lize sporangija

Kod inače zdravih osoba terapija nije neophodna, oporavak za 1-2 dana

Oboljenje je uglavnom blagog toka (meta su ćelije resica koje su najstarije i brzo se zamenjuju mlađim ćelijama)

Letalan ishod - kod veoma starih osoba ili kod obolelih od neke druge primarne bolesti



Enterotoksin C. Perfringens - proteinske prirode, inaktiviše ga 60oC u toku 10 min

Deluje slično kolera-toksinu – preusmerava tok Na+, Cl- i H2O u pravcu sekrecije

- toksin se vezuje za proteinske receptore enterocita

- ugrađuje se u ćelijsku membranu

- stvara morfološke promene membrane u roku od nekoliko minuta

- menja se permeabilnost, inhibira sintezu makromolekula, stvaraju se pore i ćelija uginjava

Dijagnoza: - istorija i klinička slika

- veliki broj spora u fecesu pacijenta (>106/g)

- veliki broj vegetativnih ćelija istog serotipa u konzumiranoj hrani (>106/g)

- prisustvo enterotoksina u fecesu



25.3.2020.

7

Tipičan scenario trovanja C. perfringens:

I hrana sa mesom koje sadrži spore se kuva

II spore preživljavaju kuvanje, konkurentska mikroflora je uništena

III posle kuvanja hrana je ili nedovoljno brzo ohlađena ili je dugo čuvana na

sobnoj temperaturi - germinacija spora i brzo umnožavanje

- velika populacija vegetativnih bakterija

IV hrana se servira hladna ili zagrejana

(nedovoljno da uništi vegetativne ćelije).

Jedan broj vegetativnih ćelija unetih putem hrane

uspeva da preživi pasažu kroz želudac i dospeva

u tanko crevo gde sporulira i stvara enterotoksin.



C. Perfringens – trovanje hranom

- javlja se u slučajevima pripreme hrane unapred, koja se kasnije konzumira

(menze, bolnice, starački domovi)

prevencija – adekvatno hlađenje ovakve hrane

Većina slučajeva uključuje proizvode od mesa kao što su:

- paprikaš

- sos od mesa

- mesne pite

- pečenje

Meso - relativno često može da sadrži spore C. perfringens

- poseduje nizak redoks potencijal

- način pripreme i konzumiranja (postoji mogućnost da se C. Perfringens umnoži)



IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA C. PERFRINGENS

-Obogaćenje nije neophodno – C. Perfringens prisutan u velikom broju u namirnici koja je izvor trovanja

- u namirnici se ispituje ukupan broj vegetatvnih ćelija i spora

- broj spora - suspenzija se najpre zagreva na 80oC 10 min

Selektivno diferencijalne podloge: TSC agar

OPSP agar



25.3.2020.

8

TSC – triptoza / sulfit / cikloserin



OPSP – oleandomicin / polimiksin / sulfadiazin / perfringens

Crne kolonije – redukcija sulfita

- inkubacija 24 h pri 37 oC

- anaerobna sredina

odsustvo pokretljivosti redukcija nitrata do nitrita

fermentacija laktoze otapanje želatina

- Serotipizacija – na osnovu kapsularnih antigena – u epidemiološke svrhe



negativna pozitivna

negativna pozitivna

pozitivna negativna

Potvrda sumnjivih kolonija C. prefringens – biohemijski niz

Detekcija enterotoksina C. Perfringens

Reverzna pasivna lateks aglutinacija

- rastvoreni antigen reaguje sa antitelima koja su vezana za lateks čestice

- čestice lateksa ne učestvuju u reakciji (pasivne su) – reakciju čine vidljivom kad se povezuju usled reakcije antigen-antitelo



25.3.2020.

9

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Botulizam – trovanje hranom o kome postoji najraniji

zapisi zbog izraženih simptoma i ozbiljnosti oboljenja

1793 – u Wildbadu, Württemberg – izvor trovanja krvavice punjene u svinjski želudac

Kerner Justinius – ispitivao trovanja kobasicama (Latinski: botulus = kobasica) koje su sadržale iznutrice i izveo zaključak:

- kobasice su bile podrvgnute toplotnoj obradi

- kobasice manjeg dijametra i koje su sadržale vazdušne džepove ređe su bile izvor trovanja

1896 – Emile Van Ermengem – izolovao uzročnika trovanja čiji izvor je bila suva šunka (Flandrija; oblast u Belgiji). Ustanovio je da:

- botulizam rezultat konzumiranja hrane koja sadrži termolabilni toksin

- toksin stvara obligatno anaerobni sporogeni bacil “Bacillus botulinus”



CLOSTRIDIUM BOTULINUM – KARAKTERISTIKE

1923 – uzročnik botulizma reklasifikovan – Clostridium botulinum

- Gram +

- Pokretan, peritrihne flagele

- Obligatan anaerob

- Pravi ili blago povijeni štapići, 2-10 µm

- Spore ovalne, centralne ili subterminalne



Osam serološki različitih tipova toksina: A, B, C1, C2, D, E, F, i G

Četiri grupe na osnovu fizioloških karakteristika:

Grupa I – A,B,F - proteoliti, termorezistentne spore, problem kod sterilizovanih konzervi kao posledica grešaka u procesu toplotne obrade

Grupa II – B,E,F - neproteoliti, spore manje otporne na toplotu, stvaraju toksin pri >3oC, problem kod ohlađenih namirnica (pri 3,3oC za 1-3 meseca, pri 5oC za 5 dana).

Grupa III – stvaraju toksine C i D – oboljenje životinja i ptica

Grupa IV – toksin tipa G – reimenovan u vrstu Clostridium argentinense

Oboljenje ljudi – toksin tipa A, B, E, F i tip C(?)

Neki sojevi C. baratii i C. butyricum - mogu da stvaraju neurotoksine



C. BOTULINUM – TIPOVI I GRUPE

25.3.2020.

10

Karakteristike proteolitičkih i neproteolitičkih tipova C. botulinum

Proteolitički Neproteolitički

Termorezistentnost DA(D121 0,1-0,25 min)

NE(D80 0,6-3,3 min)

Temperatura rasta optimalna

minimalna

35 oC10 oC

30 oC3,3 oC

Vrednost pH optimalna

minimalna

6,8-7,04,5

6,8-7,05,0

Vrednost Eh optimalna

maksimalna

-350 mV+150 mV

-350 mV+150 mV

Minimalna aw pri kojoj je moguć rast tip A 0,95tip B 0,94

0,97

Maksimalna koncentracija NaCl pri

kojoj je moguć rast

10 % 5 %



Uticaj pH na C. botulinum

Minimalan pH – zavisi od temperature, aw i vrste kiseline

pH 4,5 - apsolutni minimum

Međutim u eksperimentalnim uslovima rast utvrđen pri pH 4,0 u medijumu koji sadrži veliku količinu proteina

Maksimalan pH pri kome C. Botulinum raste 8,5-8,9

Toksin takođe nestabilan pri visokom pH



U slučajevima botulizma čiji izvor je konzerviranovoće, gde je kiselost važan zaštitni faktor,objašenjenje leži u aktivnosti kvasaca i plesni koje surasle u ovim proizvodima i time povećale pH

U priobalnom muljevitom zemljištu postoje boji uslovi za razmnožavanje C. botulinum - vlaga, anaerobni uslovi, hranljive materije

Psihrotrofni tip E – priobalni delovi zapadne Amerike, Japana i Baltičkog mora –glavni izvor trovanja - meso ribe



proteolitički tipovi A i B

Rasprostranjen u zemljištu, povremeno i u digestivnom traktu zdravih sisara i ptica

Geografski široko rasprostranjen:

U Evropi dominira tip B

Clostridium botulinum – rasprostranjenost

U severnoj Americi na zapadnoj obali tip A (85 %), na istočnoj tip B (63 %)

neproteolitički tip B

25.3.2020.

11



Važnije osobine botulinusnih toksina:

veoma toksični - 30 ng botulinusnog toksina, odnosno 0,1 g namirnice koja sadrži toksine izaziva botulizam sa fatalnim ishodom

Toksin se sintetiše za vreme logaritamske faze rasta i oslobađa u medijum lizom ćelije

stabilni u kiseloj sredini (želudac)

termolabilni - inaktivišu se pri 80 o C /10 min

ne podnose pH vrednosti veće od 7,0

mesto delovanja - presinaptički holinergički nervni završeci paraliza

Toksin se sintetiše kao jednolančani protoksin koji se sastoji od lakog (50 kDa) i teškog lanca (100 kDa) koji su povezani disulfidnim mostovima

Aktiviranje toksina – razlaganje toksina na laki iteški polipeptidni lanac:

toksine proteolitičkih sojeva razlažu proteaze kojestvara sama bakterija

toksine neproteolitičkih sojeva u digestivnomtraktu razlaže tripsin

laki lanac

teški lanac

mesto razlaganja



Teški lanac – odgovoran za specifično vezivanje za neuron

Laki lanac – ulazi u neuron (laki lanac je Zn-endopeptidaza koja se aktivira redukcijom disulfidne veze koja povezuje laki i teški lanac)



Mehanizam delovanja botulinusnih toksina

Tri faze:1. toksin se vezuje za površinu neurona

2. laki polipeptidni lanac se ubacuje uunutrašnjost neurona

3. toksin blokira oslobađanje acetilholina štoima kao posledicu paralizu mišića

Endopeptidaza cepa komponente kompleksa koji služi za vezivanje vezikula koje sadrže neurotransmiter acetilholin

25.3.2020.

12

Alimentarni botulizam – intoksikacija koja se javlja posle konzumiranja hrane u kojoj je stvoren toksin

Postoje još:• Infantni botulizam• Botulizam iz rana• Infektivni botulizam • Inhalacioni botulizam • Jatrogeni botulizam



PAZOGENEZA I KLINIČKA SLIKA

ALIMENTARNI BOTULIZAM

Inkubacija : 8h – 8 dana, obično 12-48 h posle konzumiranja hrane koja sadrži toksin

Inicijalni simptomi:

-Povraćanje

-Zatvor

-Retencija urina

-Dvostruki vid

-Otežano gutanje

-Suvoća usta

-Otežan govor

1-7 dana po pojavi simptoma nastupa paraliza mišića za disanje

Oporavak – do 8 meseci



TERAPIJA

Veoma važno što ranije postavljanje dijagnoze

-Ispiranje digestivnog trakta u clju otklanjanja ostataka hrane koja sadrži toksin

-Intravenska aplikacija antitoksina (specifičnog ili polivalentnog) u cilju neutralizacije toksina prisutnog u cirkulaciji

-Toksin se već vezao za nervne završetke – prolazno poboljšanje pomoću antagonista neuromuskularnih blokatora (4-aminopiridin)

-Priključenje na respirator ukoliko je potrebno

Mortalitet visok – 20-50%

Zavisi od:

-tipa toksina (tip A daje veći mortalitet nego tipovi B i E)

-količine unetog toksina

-brzine primene terapije



25.3.2020.

13

INFANTNI BOTULIZAM

Retzultat kolonizacije tankog creva sa C. botulinum i produkcije toksina in situ

Prvi put opisan 1976

Najčešće tip B C. botulinum

Kod odojčadi 2-6 meseci- u periodu uvođenja nemlečne hrane

Crevna mikroflora nedovoljno razvijena

Med – 10 % ispitanih uzoraka sadrži spore C. botulinum (USA)

-Preporuka - ne davati med deci mlađoj od godinu dana

BOTULIZAM IZ RANA

Uzrokovan supkutanom infekcijom sporama C. botulinum

- povrede, intravensko uzimanje droga nesterilnim iglama

JATROGENI BOTULIZAM

-predoziranje kod kozmetičkog tretmana uklanjanja bora (botox)



C. BOTULINUM U NAMIRNICAMA

Kriterijumi:

1. Namirnica se kontaminira sporama ili vegetativnim oblicima C. botulinum putem sirovina ili u toku proizvodnje

2. Namirnica se obrađuje tolotom koja inhibira kompetitivnu mikrofloru i koja u normalnim okolnostima treba da inhibira i C. botulinum

3. Uslovi u namirnici (tempratura, pH, Eh, aw) pogodni za rast C. botulinum

4. Namirnica se konzumira hladna ili blago zgrejana temperaturama koje ne mogu da unošte toksin

Ove kriterijume ispunjavaju slabokisele namirnice – kontrola procesa toplotne obrade

Problem - priprema konzervirane hrane u domaćinstvima

1899 – 1981: ukupno 522 slučaja botulizma



Meso ribe – C. botulinum tip E

Dimljena riba – konzumirana bez prethodne toplotne obrade

Severna Amerika 1960-tih

Nemačka 1970-tih

Problem – nedovoljna toplotna obrada i sadržaj soli, neadekvatno skladištenje, pakovanje u vakuumu

Sadržaj soli – najmanje 3 % u vodenoj fazi

Toplotna obrada – u centru proizvoda 63 oC za vreme dimljenja

Skladištenje – pri temperaturama manjim od 4 oC



Prevencija:

25.3.2020.

14



Jogurt sa lešnikom (Velika britanija 1989)

27 obolelih, jedan sa smtnim ishodom

- pH jogurta dovoljan da spreči stvaranje toksina

- toksin prisutan u pireu od lešnika koji nije adekvatno obrađen toplotom

Tabela 1. Pojavljivanje botulizma u svetu čiji su izvor proizvodi od mesa i ribe (Peck, 2005)

Godina i zemlja Vrsta hraneBroj slučajeva: ukupno/(fatalno)

Vrsta toksina: uzročnik

1991, EgipatNeeviscerirana usoljena riba > 91 (18)

Tip E: Neproteolitički C.

botulinum

1993/4, ŠvajcarskaSuva šunka 12 /0 Tip B: C. botulinum

1997, Nemačka Vakuum pakovana dimljena riba 2 (0)Tip E: Neproteolitički C.

botulinum

1997, Argentina Šunka pripremeljena u domaćinstvu 6 (0)Tip E: Neproteolitički C.

botulinum

1997, Nemačka Dimljena riba u vakuum pakovanju, pripremljena u domaćinstvu

4 (0)Tip E: Neproteolitički C.

botulinum

1998, Hrvatska Šunka 20 (0) Tip toksina nije identifikovan

1999, Maroko Mortadela 78 (20) Tip B: C. botulinuma

2001, KanadaFermentisana lososova ikra 4 (0)

Tip E: Neproteolitički C.

botulinum

2002, Južna Afrika Konzervirana sardina 2 (2)Tip A: Proteolitički C. botulinum

2003, Francuska Kobasica proizvedena u skladu sa halal zahetvima

4 (0) Tip B: C. botulinum

2003, Južna Korea Kobasica u limenci 3 (0) Tip toksina nije identifikovan

2003, NemačkaSuva riba pripremljena u domaćinstvu

3 (0)Tip E: Neproteolitički C.

botulinum



Tabela 2. Proizvodi od mesa i ribe izvori botulizma u Srbiji (1994 - 2002.) (Vuković, 2005)

Proizvod Broj slučajeva

Suve šunke iz domaćinstva 116

Fermentisane suve kobasice iz domaćinstva 4

Suvo svinjsko meso iz domaćinstva/ 2

Kulen – fermentisana suva kobasica iz Mađarske 2

Pig meat – konzerva iz humanitarne pomoći (proizvedena uDanskoj)

4

Jetrena pašteta u crevu 3

Jetrena pašteta u konzervi (aluminijumska posuda) 2

Riblje konzerve 6

Nepoznat izvor 1

Ukupno 140



25.3.2020.

15

IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA C. Botulinum

-Zbog velike metaboličke raznovrsnosti selektivne podloge imaju limitiranu ulogu

-Identifikacija se bazira na sposobnosti tipičnih kolonija da stvaraju toksin

- neophodno obogaćenje -

- zagrevanje 80oC 10 min u cilju eliminacije nesporogenih mikroorganizama

(problem – uništavanje slabije termorezistentnih sojeva – Grupa II)

- obogaćenje - bujon od mesa na 30oC 7 dana

- samoobogaćenje - vakuum pakovanje 5 dana na 25-30oC



čvrste podloge – krvni agar (krv konja) ili “egg yolk” agar – anaerobno 3 dana

Izgled kolonija – glatke kolonije neravnih ivica, 2-3 mm, lipoliza na egg yolk agaru (izuzetak tip G)



IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA C. Botulinum

Presejavanje na bujon – provera stvaranja toksina

Inokulacija antitoksina u agar – kolonije koje stvaraju toksin okružene zonom precipitacije (toksin-antitoksin precipitat)

krvni agar “egg yolk” agar

Biološki ogled na miševima

- najosetljivija metoda – letalna doza za miša je nekoliko pikograma

Ispitivani ekstrakt se deli na tri jednaka dela:

1. Kontrola – zagreva se na 100 oC 10 min. kako bi se unistio eventualno prisutan toksin

2. Tretira se tripsinom kako bi se aktivirao eventualno prisutan protoksin

3. Ne tretira se

Svaki od ova tri ekstrakta aplikuje se intraperitonealno kod dva miša

Posmatranje 4 dana

- Prati se pojava simptoma – otežano disanje i pojava karakterističnog “struka ose”

- Toksin se potvrđuje aplikacijom polivalentnog antitoksina

- Tip toksina se određuje primenom monovalentnih seruma



25.3.2020.

16



Botulizam – biološki ogled na miševima

Uzorak hrane

Obogaćenje ili samoobogaćenje (vakuum pakovanje 5 dana na 25-30oC

obogaćenje

Izolovanje i prečišćavanje sumnjivih kolonija

Test na miševima

Netretirani ekstrakt Tretirani tripsinom Kontrola

Tretirani toplotom 100 oC/5min

U slučaju pojave simptoma

potvrda antiserumom Nema simptoma botulizma



IZVORI KONTAMINACIJE MESA- Spore C. botulinum su vrlo rasprostranjene – zemljište, mulj, digestivni trakt

sisara i ptica, škrge i utroba riba

Svinjsko meso je češće kontaminirano sporama klostridija u odnosu na meso goveda i ovaca

Svinje u slobodnom uzgoju riju i konzumiraju zemlju u crevima veliki broj klostridija



25.3.2020.

17

IZVORI KONTAMINACIJE MESA

Klanje životinja na nehigijenski način

Klanje prljavih životinja

Šurenje u bazenima




Endogena kontaminacija:

- Klanje životinja u stanju stresa- Nije ukinuta hrana 12h pre klanja



Crevne bakterijeKrvotok

Meso


- 1 kg mesa – 0 do 20 spora klostridija

- U mesu se spore C. botulinum nalaze u vrlo malom broju < 0,1 do 7 spora/kg

- Jetra, meso svinjskih glava, kožice – 100 spora/kg

- Krv, krvna plazma – 10.000 spora/kg

- MOM – 50.000 spora/kg

- Začini – 100.000 spora/kg



25.3.2020.

18

Sprečavanje botulizma čiji su izvor proizvodi od mesa- Inaktivacija spora C. botulinum

- Delimična inaktivacija i inhibicija spora C. botulinum

- Inhibicija spora C. botulinum

Moguće samo u objektima koji ispunjavaju sve propisane higijenske i tehnološke zahteve i koji se nalaze pod kontrolom



Inaktivacija spora C. botulinum proteolitičkih tipova A i B

- Sterilizacija konzervi slabokiselih namirnica (pH > 4,5)

Fo vrednost najmanje 3, a najviše 5

Letalnost takva da smanji broj spora C.botulinum za 12 decimalnih redukcija(12D-koncept)

Vreme decimalne redukcije spora C. Botulinum pri 121,1 oC iznosi 0,21 min

Fo=Dr(log No+logN)= 0,21(log1+log10-12)=0,21x12=2,52

Prema zakonu verovatnoće jedna spora bi preživela u jednoj od bilion (1/1012) konzervi



Inaktivacija zračenjem – γ-zraci (60Co, 137 Cs)

- Vegetativni oblici C. botulinum inaktivišu se zračenjem u dozama od 3 do 5 KGy

- Spore se inaktivišu primenom visokih doza (25 – 60 KGy) koje izazivaju senzorne promene hrane



25.3.2020.

19

Delimična inaktivacuja i inhibicija

Blaži postupci sterilizacije (F<2,5) + Nitriti, NaCl, pH, Eh

Primeri za Luncheon meat i Chopped meat (konzerve od salamurenog mesa):

- Fo 1,0 do 1,5 i koncentracija NaCl u vodi 3,0 do 4,0 %- Fo najmanje 1,0 i koncentracija NaCl u vodi 4,0 do 4,5 %- Fo 0,5 do 1,0 i koncentracija NaCl u vodi 4,5 do 5,0 %- Fo najmanje 0,5 i koncentracija NaCl u vodi 5,0 do 5,5 %



MOGUĆNOSTI SPREČAVANJA BOTULIZMA

Sprečavanje kontaminacije mesa

Stres kod životinja za klanje mora da se svede na minimum

Obustava ishrane 12h pre klanja

Radnici u klanicama moraju biti stručni i svesni značaja primene higijenskih mera




U klanicama redovno sporovođenje čišćenja i dezinfekcije

Kod svinja se preporučuje pranje životinja pre klanja

Prednost ima šurenje svinja u vertikalnom položaju (kabinetisa vrelom vodom ili vodenom parom), u odnosu na šurenje ubazenima

Prilikom šurenja svinja u bazenima neophodno je menjati zaprljanu vodu čistom

Pre ubacivanja trupa u bazen za šurenje životinja treba dabude klinički mrtva



25.3.2020.

20


Hlađenje mesa mora biti efikasno

Redovno mora da se sprovodi čišćenje i dezinfekcija komora za skladištenje i transport mesa obavlja pri niskojtempreaturi

Podvezivanje jednjaka i rektuma i evisceracija bez oštećenja želudačno-crevnog trakta

Ukoliko dođe do vidljivog zagađenja trupa, takve delove treba odstraniti isecanjem, a nikako pranjem, pri čemu se kontaminiraju čiste površine



Suva šunka

U našoj zemlji je suva šunka iz domaćinstava najčešći izvor botulizma:- klanje svinja u nehigijenskim uslovima – kontminacija sporama- nepostojanje minimalnih higijenskih i tehnoloških uslova za obradu mesa iproizvodnju šunke - stvaranje toksina u šunki

Mere za sprečavanja botulizma:

klanje svinja u higijenskim uslovimatrupovi moraju biti ohlađeni, temperatura u dubini butova 0-4 oCne koristiti meso čiji pH > 6,0 (usporena difuzija soli)usoljavanje na temperaturi ispod +5 oC, sve dok kuhinjska so nedifunduje u meso i aw ne opadne ispod 0,96 (inhibicija C. botulinum)usoljavanja treba da traje dovoljno dugo da bi kuhinjska so difuzijomdospela u dubinu mesatemperatura vazduha na početku sušenja mora biti manja od 15 oC



-Toplotnu obradu na temperaturama pasterizacije preživljavaju sporesvih tipova C. botulinum, a toplotnu obradu na temperaturama kuvanjapreživljavaju spore proteolitičkih tipova C. botulinum

- Jetrene kobasice i krvavice sadrže veću količinu gvožđa iz krvi i jetre- Imaju pH veći od 6, što umanjuje zaštitni efekat nitrita- Imaju nizak redoks-potencijal

Pasterizovane kobasice (80 oC) skladištiti ispod +4 oCKobasice konzervisane kuvanjem (96-98 oC) čuvati ispod +7 oC

Izrađuju se pretežno od iznutrica - jetra, pluća isrce, zatim od kožica, masnog tkiva, mesasvinjskih glava i krvi – koji su u većoj merikontaminirane klostridijama nego meso

Jetrena kobasica (pašteta)



25.3.2020.

21

Sterilisane konzerve od mesa

U cilju prevencije botulizma važnu ulogu imaju: hermetičnost posuda za konzerve - pre početka i na krajuproizvodnje mora se ispitati kvalitet dvostrukog šava, odnosnohermetičnost praznih posuda

adekvatna toplotna obrada - toplotna obrada mora biti pravilnoizvedena, a letalnost postupka sterilizacije mora biti takva da može daizvrši 12 decimalnih redukcija najotpornijih spora mezofilnih tipova A i BC. botulinum, što iznosi najmanje Fo=3. Svaki postupak sterilizacijemora biti kontrolisan i dokumentovan

hlađenje konzervi na kraju sterilizacije mora biti takvo da ne oštetilimenke i ne omogući naknadnu kontaminaciju sadržaja sporama

- Sterilisane konzerve se skladište na temperaturi do 25 oC i mogu bitiodržive do 4 godine



„Shelf-stable“ proizvodi

Ovi proizvodi se pune u hermetički zatvorene posude ili omotače iobrađuju termičkim procesima čija je letalnost manja od F=2,5, pričemu se uništavaju vegetativni oblici bakterija i delimično inaktivušuspore klostridija i bacila

Bezbednost ovih proizvoda zasniva se na:

kombinovanim efektima toplotne obrade i

inhibiciji preživelih spora nekim od antimikrobnih parametara, kaošto su aw, pH, količina kuhinjske soli i nitrita

Održivi na sobnim temperaturama



aw-SSP – aw < 0,95, termički tretman od 75 oC u centruproizvoda i dodatak svega 40-50 mg/kg nitrita, održivost jedo 12 meseci pri 20 oC - Italijanska mortadela

pH-SSP - pH 5,4-5,6, uz termički tretman od najmanje 72 oCu centru proizvoda, a održivost proizvoda je više meseci na20 oC - Gelderse rookworst

F-SSP - inaktivacija spora neproteolitičkih tipova C.

botulinum blagom sterilizacijom (Fo>0,4), a preživele sporeproteolitičkih tipova C. botulinum inhibiraju se delovanjempH<6,5, aw<0,97 i dodavanjem najmanje 100 mg/kg nitrita.Mogu biti održivi više sedmica bez primene hladnoće

- Barene i jetrene kobasice, krvavice

„Shelf-stable“ proizvodi



25.3.2020.

22

Pasterizovane upakovane ohlađene namirnice

- dimljena riba, plodovi mora, naresci kuvanog mesa, neke vrste gotovihjela, mesne salate itd.

- stavljaju se u promet upakovani, u vakuum-pakovanju ili u upakovani uatmosferi zaštitnih gasova

- obrađuju se toplotom pri 70 do 95 oC, posle čega se brzo hlade

- preživljavaju spore proteolitičkih i neproteolitičkih tipova C. botulinum

- skladište se pri 1 - 8 oC - održivost proizvoda iznosi do 42 dana

- Rizici: povećanje temperature proizvoda na putu od mesta kupovine dodomaćinstva iznosi i do 20 oC, a temperatura u kućnim frižiderimavarira od -1 do +11 oC



Pasterizovane upakovane ohlađene namirnice

Preporuke (Peck, 2008):

toplotna obrada pri 72oC - čuvanje pri temperaturi do +3 oC toplotna obrada pri 72oC i čuvanje pri temperaturi do +5 oC - održivost

do 10 dana toplotna obrada pri 72oC i čuvanje pri 5 do 10 oC - održivost do 5 dana toplotna obrada 10 min pri 90 oC ili 36 min pri 85 oC ili 129 min 80 oC čuvanje pri temperaturi do 8 oC

čuvanje pri temperaturama do 8 oC u kombinaciji sa drugim antimikrobnim činiocima:

- pH vrednost manja od 5,0- koncentracija soli veća od 3,5 %- aw vrednost manja od 0,97 - upotreba konzervanasa (nitriti) koji inhibiraju rast C. botulinum



trovanja gram + bakterijamanamirnice.vet.bg.ac.rs/001 studentski folder/newsas_bhap... · 2020. 4....

Documents