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TRASPORTO DI MEMBRANA

movimento di molecole e ioni tra i diversi scomparti presenti nei sistemi biologici è noto come TRASPORTO, esso può essere

considerato fra singole membrane cellulari, fra una pianta e il suo ambiente circostante o fra una

parte e l’altra della pianta

Il movimento di molecole per diffusione è definito TRASPORTO PASSIVO

Il movimento di sostanze contro un gradiente

di concentrazione, o chimico, è definito TRASPORTO ATTIVO, non è spontaneo e necessita che venga compiuto del lavoro sul

sistema tramite l’applicazione di energia cellulare.

Un modo per ottenere questo risultato è di accoppiare il trasporto con l’idrolisi di ATP

membrana cellulare

Permette o impedisce il movimento di una sostanza (permeabilità di membrana)

garantisce un ambiente fisico-chimico

altamente stabile condizioni indispensabile al regolare svolgimento di attività metaboliche,

riproduttive e dello sviluppo

eucarioti evoluzione dello sviluppo endomembrane

concentrazione reagenti

separazione processi incompatibili

accumulo cataboliti

necessità di controllare la composizione dell’ambiente interno in funzione a diverse condizioni ambientali (mantenimento dell’omeostasi cellulare)

PIANTE

il trasporto di membrana è alla base di numerosi processi biologici essenziali

La genesi del turgore cellulare

L’acquisizione di nutrienti

La secrezione di prodotti di rifiuto del metabolismo

Distribuzione di metaboliti

La compartimentalizzazione dei metaboliti

La trasduzione dell’energia

La trasduzione del segnale

generazione del turgore. La presenza della parete cellulare permette alle cellule di generare turgore (pressione positiva)

accumulo K+ nel citoplasma e nel vacuolo

In base al principio dell’elettroneutralità delle soluzioni i cationi devono essere controbilanciati da una corrispondente concentrazioni di anioni; gli anioni principali che si accumulano nel vacuolo sono il Cl- ( in funzione alla sua disponibilità ) o il malato

ACQUISIZIONE NUTRIENTI

Le piante, a differenza degli animali, sintetizzano biomolecole organiche a partire da nutrienti inorganici. Molti di questi elementi essenziali, per essere assimilati negli amminoacidi o altri metaboliti, sono assorbiti dal suolo grazie a specifici sistemi di trasporto attraverso le radici

ESCREZIONE PRODOTTI DI SCARTO

Il metabolismo genera inevitabilmente molecole di scarto inutilizzabili che devono

essere rimosse dal citosol.

L’H+ è il principale prodotto generato dal metabolismo

Per espellere i protoni dal citosol sulla

membrana plasmatica e su quella vacuolare delle cellule vegetali si sono evolute le

cosiddette pompe protoniche

DISTRIBUZIONE METABOLITI

Ripartizione prodotti della fotosintesi dai siti di sintesi a quelli di utilizzo e di accumulo

COMPARTIMENTALIZZAZIONE DEI METABOLITI

Alcuni processi biochimici sono incompatibili tra loro

→ necessità di evitare cicli futili

(ex. sintesi amido e glicolisi)

TRASFORMAZIONE ENERGIA

Il trasporto di membrana è al centro dei processi che realizzano la conversione dell’energia libera in forme

biologicamente utili

fotosintesi e respirazione

TRASDUZIONE DEL SEGNALE

Molti segnali biotici o abiotici implicati nello sviluppo e nella crescita inducono nelle piante

risposte cellulari innescate da aumenti transienti della concentrazione citosolica del Ca2

2+ libero

stimolo ambientale → ≠ [Ca22+] → risposta

fisiologica

DIFFUSIONE spostamento delle molecole secondo un gradiente di concentrazione dovuto ad

agitazione termica casuale

Il verso del movimento netto di un soluto attraverso una membrana è stabilito dal verso della forza motrice che agisce sul sistema di trasporto. Le forze motrici possono essere quantificate in termini di relazioni di energia libera connessa ai potenziali chimici del soluto

µj = µ*j + RTln Cj + zjFE + VjP

Il potenziale chimico di un soluto non carico, j, presente in un mezzo può essere definito dall’equazione:


potenziale chimico di j in condizioni

standard


componente della concentrazione


componente della carica elettrostatica


componente della pressione

idrostatica


costante universale dei

gas


temperatura assoluta


concentrazione di j


carica elettrostatica di j


costante di Faraday


potenziale elettrico generale

della soluzione


volume parziale molale j


pressione

µj = µ*j + RTln Cj + zjFE + VjP X

significativo esclusivamente nei movimenti osmotici

dell’acqua

“L’importanza del concetto del potenziale chimico è che somma tutte le forze che possono agire su una molecola e che portano al trasporto netto” In generale, la diffusione ( o trasporto passivo) muove sempre le molecole da zone a potenziale chimico superiore verso aree con potenziale chimico minore. Il movimento contro gradiente di potenziale chimico indica un trasporto attivo

µis = µ*

s + RTln Cis

µos = µ*

s + RTln Cos

saccarosio

i = interno O = esterno

Possiamo calcolare la differenza del potenziale chimico del saccarosio fra le soluzioni all’interno e all’esterno della c e l l u l a i n d i p e n d e n t e m e n t e d a l meccanismo di trasporto

Cos

Cis

= RT ln

Forza motrice Δµs = µos - µi

s =

= (µ*s + RTln Co

s) - (µ*s + RTln Ci

s) =

= RT(ln Cos- ln Ci

s) =

Δµs è proporzionale al gradiente di concentrazione

Cos

Cis

Δµs = RT ln

relazione tra il potenziale chimico µ e il trasporto di molecole attraverso una membrana

ione K+

(Bisogna considerare la componente elettrica del potenziale chimico)

CoK

CiK

ΔµK = RT ln + zF(Eo-Ei)

dato che la carica elettrostatica del K+ z=+1

CoK

CiK

ΔµK = RT ln + F(Eo-Ei)

Potenziale elettrico

gli ioni diffondono sia in risposta ai loro gradienti di concentrazione

che a qualsiasi differenza di potenziale elettrico, se viene

applicato un voltaggio (un campo elettrico) fra i due scomparti gli

ioni possono essere condotti contro un gradiente di

concentrazione

cosa succede se una membrana ha una permeabilità maggiore per il K+ che per il Cl-?

I due i on i d i f f onde ranno attraverso la membrana a velocità diversa. Il risultato sarà una debole separazione di c a r i che che gene re rà un potenziale elettrico attraverso la membrana. Il potenziale di membrana che si forma è detto potenziale di diffusione

il potenziale di diffusione ritarda l’ingresso di K+ e accelera quello di Cl-

la presenza di un potenziale di membrana indica una distribuzione disuguale degli ioni attraverso la

membrana

trascurabile in termini chimici

-100 mV → un anione in più su 100.000

PRINCIPIO DELL’ELETTRONEUTRALITÀ

una soluzione contiene sempre un numero uguale di anioni e cationi

cosa succede se la membrana è permeabile solo al K+?

all’equilibrio [K+]B > [Cl-]B

all’equilibrio si genera un:

POTENZIALE DI MEMBRANA che bilancia il

GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE

quando la distribuzione di un soluto attraverso la membrana raggiunge l’equilibrio, il flusso

passivo (J) (cioè la quantità di soluto che attraversa un’unità di area di membrana

nell’unità di tempo) è lo stesso in entrambe le direzioni

Jo→i = Ji→o

Jo→i = Ji→o

Ei-Eo = RT zjF

ln Cj

o

Cji

equazione di Nerst

quindi per ogni ione

µ*j + RTln Cj

o + zjFEo = µ*j + RTln Cj

i + zjFEi risolvendo l’equazione si ottiene la differenza del potenziale elettrico fra i due scomparti

i potenziali elettrochimici saranno uguali µjo = µj

i

ΔEn = Ei-Eo

potenziale di Nerst

ΔEn = 2.3RT zjF

log Cj

o

Cji

per uno ione univalente a 25°C

ΔEn = 59 log Cj

o

Cji

La differenza di potenziale elettrico è conosciuta come il

all’equilibrio, la differenza di concentrazione di uno ione tra due scomparti è bilanciata dalla

differenza di voltaggio tra gli scomparti

ΔEn=59 log Cj

o

Cji

stabilendo un ΔE di 59 mV mantiene una differenza di

concentrazione di 10 volte per uno ione che viene trasportato

tramite diffusione passiva Co/Ci=10/1

log 10=1

tutte le cellule possiedono un potenziale di membrana, dovuto alla distribuzione asimmetrica tra l’interno e l’esterno della cellula. Questi potenziali di membrana possono essere facilmente determinati inserendo un

microelettrodo in una cellula e misurando la differenza di voltaggio fra l’interno della cellula e il mezzo esterno

in cui la cellula è immersa

-240 mV < ΔEn > -60 mV

Trasporto passivo = frecce tratteggiate Trasporto attivo = frecce intere

EQUAZIONE DI GOLDMAN

Numerosi ioni permeano simultaneamente le membrane cellulari; quindi il potenziale di Nerst per ogni singola specie ionica descrive raramente il potenziale di diffusione della membrana. Invece tutti i potenziali di diffusione attraverso la membrana sono descritti dall’equazione di Goldman

ΔE con equazione di Goldman = -50/-40 mV

misura sperimentale ΔE = -240/-60 mV

Nelle piante i potenziali di membrana misurati sperimentalmente sono spesso molto più negativi di quelli calcolati dall’equazione di Goldman

Oltre al potenziale di diffusione, esiste una seconda componente del potenziale di membrana. L’eccesso di voltaggio è dato dalla H+-ATPasi elettrogenica della membrana plasmatica. Si genera un voltaggio attraverso la membrana ogni qualvolta uno ione si sposta dentro o fuori dalla cellula senza essere controbilanciato da uno ione di carica opposta. Tale meccanismo di trasporto attivo, definito POMPA ELETTROGENICA, che tenderà a spostare il potenziale di membrana lontano rispetto al valore previsto dall’equazione di Goldman

L’energia richiesta per il trasporto attivo è spesso fornita dall’idrolisi dell’ATP. La dipendenza del potenziale di membrana dall’ATP può essere dimostrata osservando l’effetto del cianuro sul potenziale di membrana

Due tipi di trasportatori aumentano il movimento di soluti attraverso la membrana: Canali sono delle proteine transmembrana che fungono da pori selettivi nella membrana Carrier la sostanza che viene trasportata è inizialmente legata da un sito attivo posto sul carrier proteico. Il legame porta a un cambiamento conformazionale della proteina, che espone la sostanza alla soluzione dalla parte opposta della membrana.

CANALI può non richiedere il legame del soluto

due conformazioni: aperti/chiusi, è un trasporto passivo

Tipo –R attivati rapidamente si aprono e si chiudono molto rapidamente in risposta ad un voltaggio fornito come stimolo Tipo-S attivati lentamente, rimanendo aperti per tutta la durata dello stimolo

Modello del canale per il potassio nelle piante

Patch clamp permette di r i levare del le p iccole c o r r e n t i e l e t t r i c h e costituite dal flusso di ioni attraverso i canali. La caratterist ica è la possibilità di analizzare una s ingola molecola proteica durante la sua attività di catalisi del movimento ionico

voltage-clamp misura la corrente elettrica e i potenziali di membrana che vengono applicati dall’esterno ad una membrana e quindi all’apertura di un numero crescente di canali in risposta ai potenziali applicati

CARRIER

trasporto passivo (diffusione facilitata) trasporto vettoriale ioni e soluti attraverso

le membrane

la velocità di trasporto è più lenta rispetto ai canali (Vcanale = 106 Vcarrier)

Il meccanismo proposto non prevede un movimento dei siti di legame del soluto da un lato all’altro della membrana, ma piuttosto che la reazione di trasporto sia conseguente a variazioni conformazionali del carrier

le cinetiche di attività dei carrier sono descrivibili con l’equazione di

Michaelis-Menten

La concentrazione di substrato che determina una velocità di trasporto corrisponde alla metà della velocità massima rappresenta la costante di Michaelis-Menten

PRINCIPALI IONI E SOLUTI TRASPORTATI DA CARRIER NH4

+, NO3-, Pi, SO4

2-, zuccheri, amminoacidi, basi azotate

alta selettività per la molecola da trasportare

TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO il trasporto è accoppiato a una fonte di energia metabolica idrolisi di ATP una reazione di ossido-riduzione

POMPE elettrogeniche → H+-ATPasi è riferito al trasporto di ioni che coinvolge il movimento netto di carica attraverso la membrana elettroneutre → H+/K+-ATPasi (animali)

→ Na+/K+-ATPasi (animali)

non coinvolge il movimento netto di carica

Le proteine di membrana responsabili del trasporto attivo primario sono definite pompe

principali pompe elettrogeniche H+-ATPasi di plasmalemma H+-ATPasi vacuolare H+-pirofosfatasi (vacuolo e golgi)

H+-ATPasi di plasmalemma

Il domino C-Terminale è autoinibitorio

Regione idrofilica Acido aspartico

che subisce fosforilazione

H+-ATPasi vacuolare

Questa proteina può essere separata in una porzione solubile definita V1, che comprende i siti di legame dei nucleotidi adenilici, e una porzione integrale di membrana definita V0, che costituisce la struttura attraverso la quale gli ioni H+ permeano la membrana. Nella porzione V1 tre copie della subunità 1 e della subunità 2 si dispongono a formare una struttura esamerica; più o meno altre 8 subunità contribuiscono alla costituzione di V1. La porzione V0 contiene copie multiple della subunità 3 e quattro altre subunità.

estrusione attiva di H+

gradiente elettrochimico di protoni (forza motrice protonica)

ENERGIA LIBERA

il movimento di protoni secondo il loro gradiente elettrochimico può essere accoppiato al lavoro cellulare

ΔµH+ = FΔE + 2.3RT log [H+]i

[H+]o

Δp = = ΔE + 2.3RT log [H+]i

[H+]o

ΔµH+

F F

poiché pH = -log[H+]

log [H+]i

[H+]o =- (pHi-pHo)= ΔpH

Δp = ΔE - 2.3RT F

ΔpH

Δp = ΔE -59 ΔpH Forza proton motrice è l ’energia l ibera accumulata sotto forma di gradiente di H+

L’energia accumulata nei mitocondri e nei cloroplasti sotto forma di gradiente protonico è utilizzata per sintetizzare ATP. L’attività di particolari pompe che idrolizzano ATP genera gradienti protonici attraverso la membrana plasmatica o il tonoplasto. I potenziali elettrochimici stabiliti dall’attività di queste pompe sono utilizzati per muovere ioni o metaboliti.

L’insieme dei processi chemiosmotici che si realizzano nell’ambito di una cellula vegetale

TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO

la forza proton motrice può guidare il trasporto di altre sostanze contro il gradiente elettrochimico

SIMPORTO protone e molecola si muovono nella stessa direzione ANTIPORTO protone e molecola si muovono in direzioni opposte

L’energia che garantisce lo svolgimento del processo è accumulata tramite il gradiente di protoni viene utilizzata per assorbire il substrato contro il suo gradiente di concentrazione

simporto glucosio-H+

L’aumento osservabile di pH indica che i protoni sono scomparsi dal liquido e che allo stesso tempo diminuisce il potenziale di membrana della cellula

Le proprietà di trasporto di un soluto possono cambiare a diverse concentrazioni del soluto A b a s s e c o n c e n t r a z i o n i d i s a c c a r o s i o l a v e l o c i t à d i assorbimento del saccarosio mostra cinetiche di saturazione t i p i c h e d i u n a m o l e c o l a trasportatrice simporto H+-saccarosio

alte concentrazioni saccarosio, la velocità di assorbimento aumenta linearmente trasporto passivo

Studi molecolari e biochimici hanno confermato la presenza di canali dell’acqua nelle membrane delle cellule vegetali. Questi canali, sono definiti acquaporine

Le acquaporine

Sono membri della famiglia dei canali transmembrana conosciuta come major intrinsic protein (MIP) hanno dimensioni piuttosto limitate (25-30 kDa), presentano 6 regioni transmembrana e possiedono una sequenza interna ripetuta indicativa della loro origine da un gene che ha subito fenomeni di duplicazione e

fusione. Le acquaporine sono caratterizzate anche da residui NPA (Asn-Pro-

Ala) altamente conservati sia nella metà N- sia in quella C-terminale della proteina. Nelle piante sono state identificate

acquaporine sulle membrane vacuolari e su quelle plasmatiche ed è quindi possibile definire due subfamiglie:quella delle proteine

integrali del tonoplasto (TIP) e quella delle proteine integrali della membrana plasmatica (PIP)

CF1 porzione estrinseca che contiene il sito catalitico coinvolto nella sintesi di ATP α3, β3, γ, δ, ε CF0 porzione proteica integrata alla membrana che funziona da canale per i protoni a, b, b’, c12

ATP sintasi

Altamente idrofobica

F-ATPasi dei mitocondri e dei cloroplasti. V-ATPasi, presente nel tonoplasto. Pompa i protoni all’interno del vacuolo, generando la forza motrice per diversi sistemi di trasporto P-ATPasi, presente sulla membrana plasmatica

H+-ATPasi

RUOLO FISIOLOGICO DELL’H+-ATPasi DI PLASMALEMMA

mantenimento del pH del citoplasma

↑ pH interruzione

della dormienza dei semi

↑ pH sintesi DNA e

divisione cellulare

≠  pH risposte di difesa

a patogeni


forza guida per sistemi di trasporto di ioni e nutrienti


apertura e chiusura degli stomi


crescita per distensione

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

possibili meccanismi che determinano un aumento di attività dell’H+-ATPasi

fattori che influenzano l’attività dell’H+-ATPasi stress salino luce auxina patogeni

il dominio C-terminale regola l’attività dell’enzima

prove sperimentali espressione H+-ATPasi senza C terminale proteolisi incontrollata

LA FUSICOCCINA

metabolita fitotossico prodotto dal fungo Fusicoccum amygdali

l’infezione provoca una stimolazione

incontrollata dell’H+-ATPasi Il dominio C-terminale non è più in grado di controllare l’attività dell’H+

ATPasi

apertura incontrollata degli stomi

morte per avvizzimento

la fusicoccina promuove il legame di una proteina 14-3-3 sul dominio C-terminale dell’H+-ATPasi

Proteine 14-3-3 Classe di proteine regolatrici diffuse in tutti gli eucarioti Proteine dimeriche. Ogni monomero ha un PM di circa 30 kDa Interagiscono con numerose proteine bersaglio, tramite il riconoscimento di particolari sequenze fosforilate su residui di serina

Ruolo delle 14.3.3

- Regolazione dell’H+ ATPasi - Regolazione della trascrizione genica -  Regolazione dell’H+ sintasi -  Processo apoptotico?

la fusicoccina promuove il legame delle proteine 14-3-3 sul dominio C-terminale dell’H+-ATPasi

meccanismo di azione della fusicoccina

bassa attività

alta attività

l’interazione tra H+-ATPasi e proteine 14-3-3 è mediata dalla fosforilazione di un residuo di treonina nel dominio C-terminale della pompa protonica

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