transformation of medicago truncatula with the arginine ... o profeta, khalil gibran . vi . vii...

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  • Transformation of Medicago truncatula with the Arginine

    Decarboxylase Gene to Modify Polyamine Metabolism toward

    Water Deficit Resistance

    Ana Sofia Roldão Lopes Amaral Duque

    Dissertation submitted to obtain a Ph.D. (Doutoramento) degree in Biology at the

    Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de Lisboa

    Oeiras, November 2010

  • ii

  • iii

    Agradecemos o apoio financeiro da FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) e

    do FSE (Fundo Social Europeu) no âmbito do III Quadro Comunitário de Apoio

    Bolsa nº BD/1164/2000

  • iv

  • v

    “E eu digo que sem movimento a vida é, com efeito, trevas

    e que todo o movimento é cego sem o saber,

    e que sem trabalho todo o saber é vão,

    e que sem amor todo o trabalho é vazio...”

    “And I say that life is indeed darkness save when there is urge,

    and all urge is blind save when there is knowledge,

    and all knowledge is vain save when there is work,

    and all work is empty save when there is love…”

    O Profeta, KHALIL GIBRAN

  • vi

  • vii

    Agradecimentos:

    O trabalho apresentado nesta dissertação de Doutoramento foi desenvolvido no

    Laboratório de Biotecnologia de Células Vegetais, do Instituto de Tecnologia Química e

    Biológica da Universidade Nova de Lisboa, sob a supervisão do Professor Pedro Fevereiro e

    co-supervisão da Doutora Dulce Santos.

    Ao Professor Pedro Fevereiro agradeço o facto de me ter acolhido no Laboratório de

    Biotecnologia de Células Vegetais e de ter aceite a supervisão deste trabalho de investigação.

    Agradeço a disponibilização de todo o equipamento e material necessário ao bom

    desenvolvimento dos trabalhos. Reconheço a ética, o rigor científico e empenho no

    acompanhamento do trabalho e também as relevantes discussões científicas sobre este e

    outros assuntos. Agradeço a amizade, desde os tempos longínquos de “l'apprentie sorcière”

    até aos dias de hoje, bem como a disponibilidade sempre demonstrada para me receber no

    laboratório apesar dos meus "out of science" interregnos. Para o futuro fica a mítica frase “No

    pain, no gain” e a não menos famosa “'Alea jacta est”, aquando da submissão de algum artigo

    ou projecto. Obrigada, Pedro.

    À Doutora Dulce Santos agradeço ter aceite a co-supervisão deste trabalho de

    investigação. Agradeço a partilha de conhecimentos e o acompanhamento “na bancada” do

    trabalho laboratorial. Pela sempre presença e disponibilidade no esclarecimento de dúvidas,

    laboratoriais e “existenciais”, pelo espírito brilhante e assertivo nas discussões científicas: “E

    porque razão não ...?”, e pelo inigualável sentido de humor. Agradeço a amizade sempre

    demonstrada em todas as ocasiões, melhores ou piores, da vida. Para sempre ficou a máxima

    “work smarter not harder” que espero nunca esquecer. Obrigada, Dulce.

    Agradeço o apoio financeiro da FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) e do

    FSE (Fundo Social Europeu) no âmbito do Quadro Comunitário de Apoio (Bolsa nº

    BD/1164/2000).

  • viii

    Agradeço à Professora Anabela Bernardes da Silva e ao Professor Jorge Marques da

    Silva todo o apoio nos esclarecimentos de fisiologia vegetal, a disponibilização de

    equipamentos e as significativas sugestões para a avaliação fisiológica das plantas.

    À Engenheira Cristina Leitão agradeço todo o apoio e ajuda nos “insondáveis”

    procedimentos cromatográficos que levaram à determinação das aminas biogénicas nas

    plantas estudadas. Agradeço à Doutora Vitória San Romão pela disponibilização do aparelho

    de RT-HPLC e à Engenheira Paula Chicau pelo uso da “Waters Pico-Tag Workstation” e pela

    ajuda com os problemas laboratoriais.

    Pelos materiais utilizados neste trabalho agradeço:

    Ao Doutor Phillip Mullineaux (John Innes Center, Norwich, England) por

    disponibilizar os plasmideos pSoup e pGreen0000, à Doutora Teresa Capell (na altura no

    John Innes Centre, Norwich, England) pelo plasmideo pAMC2 contendo o gene Adc de aveia

    e ao Doutor Herman Spaink (Institute of Molecular Plant Sciences, Leiden) por disponibilizar

    o plasmideo pMP2482.

    Agradeço a todos os meus colegas do Laboratório de Biotecnologia de Células Vegetais,

    nomeadamente:

    À minha colega e amiga Susana Araújo, companheira de “viagem” e de muitos

    momentos passados na bancada, dos sucessos e insucessos do trabalho laboratorial e das

    muitas discussões sobre experiências laboratoriais e artigos. Pela escrita a quatro mãos, entre

    biberões e mudas de fralda da Marianinha, de que resultou a publicação dos nossos dois

    artigos. Agradeço a tua boa disposição e o sempre presente bom senso, a companhia

    inesquecível na atribulada ida aos EUA e todas as experiências que temos partilhado.

    Obrigada, Su.

    À Vitória Gemas, pela amizade e partilha de muitos momentos no nosso projecto

    conjunto, pela partilha de muitas dificuldades mas também de muitas vitórias. Obrigada por

  • ix

    teres compreendido a minha necessidade de mudar. Espero que sigas o teu caminho com

    muito sucesso e alegria. Obrigada!

    Ao Jorge Paiva, a inesgotável energia e disponibilidade. Os conselhos laboratoriais e

    a ajuda nos mistérios do RNA e a camaradagem na hora de almoço e nos “coffee brakes”.

    Obrigada também pelo encorajamento nas fases mais difíceis de submissão de artigos e

    escrita da tese. Thanks!

    Ao André Almeida, pela sempre boa disposição e entusiasmo com que vê a vida e o

    trabalho, pelo carácter e companheirismo, pelas divertidas conversas de almoço e pelo

    conhecimento enciclopédico que por vezes dá tanto jeito. Obrigada.

    À Carlota Vaz Patto, à Helena Garcês e à Rita Carré, pela simpatia, boa disposição e

    encorajamento nesta difícil fase final do trabalho.

    À Leonor Tomaz agradeço a manutenção das plantas in vitro e a organização geral do

    laboratório e à Susana Neves agradeço o interesse e a ajuda nas questões relacionadas com a

    classificação das leguminosas.

    À Matilde Cordeiro agradeço a ajuda preciosa na manutenção das plantas in vitro na

    fase mais louca do trabalho de subcultura, a ajuda na edição final do artigo GfpGus e a boa

    disposição e entusiasmo. Muito fixe!

    À Sofia Pires agradeço a ajuda com a manutenção das células em suspensão de

    Medicago, bem como as conversas partilhadas sobre a difícil mas por vezes hilariante tarefa

    de ser mãe.

    A toda a “malta nova” do laboratório, por continuarem um trabalho que gostam e em

    que acreditam.

  • x

    À minha família, ao meu marido Nuno e às minhas filhas Filipa, Rita e Mariana,

    agradeço toda a paciência com que têm suportado certas ausências e o apoio e amor sempre

    demonstrados.

    A todos os tios e tias, verdadeiros ou emprestados, pela ajuda em ir buscar, levar e

    servir de “babysitter” às três princesas lá de casa. À avó Mané pela ajuda preciosa.

    Ao meu pai por me ter incutido o espírito de observação e o interesse pelos mistérios

    da Natureza. Ao meu sogro Victor pelo exemplo de honestidade e coragem que foi a sua vida.

    À minha mãe por ter sido MÃE.

    A todos, muito obrigada!

  • xi

    Resumo:

    O principal objectivo desta tese consistiu na transformação da leguminosa modelo

    Medicago truncatula e expressão de uma sequência codificadora do gene da arginina

    decarboxilase (Adc) de aveia (Avena sativa), que codifica uma enzima chave da via das

    poliaminas. Com esta manipulação genética pretendia-se alterar os níveis de poliaminas com

    intuito de produzir linhagens que apresentassem respostas melhoradas na resistência ao

    deficit hídrico.

    Dentro dos stresses abióticos, o deficit hídrico conduz a uma limitação da

    produtividade vegetal e condiciona a área de distribuição das formações vegetais na

    superfície do globo terrestre. As leguminosas têm um papel importante nos ecossistemas,

    devido a sua capacidade de fixarem o azoto atmosférico em simbiose com bactérias do

    género rhizobium. O cultivo de Leguminosas pode contribuir para o melhoramento do

    conteúdo em azoto do solo, melhorando a sua fertilidade e favorecendo a introdução de novas

    culturas em áreas previamente desertificadas.

    O facto dos mecanismos fisiológicos envolvidos na resistência ao deficit hídrico

    serem complexos e ainda pouco compreendidos bem como a dificuldade em obter

    marcadores moleculares associados a esta característica tem limitado as abordagens de

    melhoramento convencional nesta família de plantas.

    O melhoramento através da obtenção de cultivares geneticamente modificados requer

    uma optimização prévia de sistemas de transformação e selecção d

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