transformasi plasmid

7/22/2019 Transformasi plasmid

1/24

TRANSFORMASI PLASMID

I. TUJUAN1.1Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel

E.coli.

II. PRINSIP2.1 Pembuatan sel kompeten yang dapat disisipi vektor DNA

rekombinan.E.Colidibiakkan dalam suspensi media,pada saat mid-

log phase diambil dengan cara sentrifugasi dan inkubasi dalam es

dengan penambahan larutan CaCl2dingin.

2.2 Transformasi E.Coli dengan plasmid rekombinan ditambahkan kedalam sel kompeten disertai dengan kontrol.Campuran sel kompeten

dan DNA plasmid diinkubasi dalam es kemudian diberi kejut panas

(heat-shock) pada suhu 42C dam selanjutnya diinkubasi pada suhu

37C.

2.3Seleksi koloni E.Coliyang telah disisipi DNA plasmid rekombinandengan menggunakan cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG.

III. TEORIDalam perkembangannya, istilah transformasi telah

didefinisikan secara lebih luas lagi yaitu pengambilan molekul DNA

oleh setiap jenis sel tanpa memandang apakah pengambilan molekul

DNA tersebut menyebabkan adanya perubahan dalam sel yangdapat

dideteksi atau tidak dan objek dari transformasi ini tidak terbatas padabakteri saja,tetapi termasuk juga fungi, hewan, dan tumbuhan.

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel

inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil


2/24

transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru

yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya

dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Pemasukkan molekul

DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila

vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut

transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang.

Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya

dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid

tersebut(Brown, 1991).

Transformasi memiliki arti penting dan sangat berguna dalam

penelitian penelitian genetik bakteri di laboratorium terutama bagi

pemetaan kromosom bakteri. Hal ini terjadi karena frekuensi terjadinya

transformasi antara dua gen pada waktu yang samamerupakan petunjuk

jarak antara gen gen ini pada kromosom. Plasmid adalah molekul

DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di

dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam

plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan

kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi

sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa

genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-

gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut

selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti

insulin, interferon, dan berbagai enzim(Pelczar dan Chan, 1986).

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam

sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil

transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru

yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya


3/24

dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Proses transformasi

merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat

kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat

rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel

transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang

berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah

sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya

berdasarkan adanya marka seleksi 18 yang disisipkan pada plasmid.

Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel

transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang

yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium

padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan

sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni

yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal

dari bakteri transforman saja ( Wibowo, 2002).

Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah

molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan

molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel

inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli.

Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap

DNA asing. Setiap sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap

molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat menyerap DNA secara

efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak

efisien dalam menyerap DNA adalahEscherichia coli. Sel ini memiliki

kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. SelE. colisecara

alami memiliki kemampuan transformasi yang rendah. Peningkatan

kemampuan transformasi secara alami dilakukan dengan memanen sel


4/24

pada fase stasioner dan penumbuhan kembali pada media. Sel yang

kompeten diperoleh pada fase lag dan menghilang pada fase log

(eksponensial). Laju transformasi meningkat seiring dengan jumlah

plasmid hingga mencapai fase plateau. SelE.coliyang kompeten diberi

perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri.

Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke

dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas

berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah

mengalami perlakuan yang ekstrem(Tsen,2002).

Salah satu cara untuk menyeleksi klon yang benar adalah dengan

menggunakan media tumbuh yang mengandung antibiotik.Cairan

suspensi dalam pekerjaan transformasi (campuran antara

bakteri,plasmid,dan DNA asing yang telah di perlukan dalam rangka

trasformasi) di sedarkan pada media yang mengandung tetasiklin.

Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni sel 1 dan koloni sel 2 (koloni

adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel

bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-

masing koloni yang tumbuh pada media + tetrasklin kemudian di

pindahkan pada media + ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada

media + ampisilin adalah koloni yang di inginkan (sel-sel bakterinya

mengandung plasmid rekombinasi). Bakteri ditumbuhkan pada medium

yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka selE. coli

yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah

memasukkan plasmid(Wibowo, 2002).

DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang

dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan

biasanya terjadi bersama-sama.Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah


5/24

diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA

organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau

mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi

antibiotik.Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak

terjadi melalui proses alam dalam sel, tetapi direkayasa.Sebuah protein

rekombinan adalah protein yang berasal dari DNA rekombina(Pelcza,

1986).

Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat

bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia

sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan

pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi

DNA Rekombinan.Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung

maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan

hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah

digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada

manusia diobati dengan insulin manusia.Saat ini insulin manusia telah

berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri.

Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah

karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen

yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri(Wibowo,

2002).

pCAMBIA vektor backbone berasal dari vektor pPZP (dibangun

oleh Hajdukiewicz, Svab& Maliga, lihat References21). Sementara

keterbatasan teknis dan IP tidak sempurna dan memiliki (lihat BioForge

GUSPlus Project 22, di mana kita meningkatkan gen reporter dan

metode seleksi untuk lebih lengkap kebebasan untuk beroperasi), vektor

pCAMBIA menawarkan:


6/24

jumlah salinan tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalam Agrobacterium ukuran kecil, 7-12kb tergantung pada plasmid situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan

kecil tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA

Anda minati

Pilihan bakteri dengan kloramfenikol atau kanamisin Pilihan tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi

fosfinotrisin dihentikan di permintaan pemilik IP, Bayer, setelah

distribusi awal tahun 1997)

cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reportergusA.

Gambar 1: pCAMBIA

Nomenklatur vektor pCAMBIA:

Digit pertama - mengindikasikan pemilihan tanaman: 0 untuk

ketidakhadiran, 1 untuk resistensi higromisin, 2 untuk kanamisin, dan 3

untuk fosfinotrisin (vektor yang mengandung gen resistensi fosfinotrisin

tidak lagi tersedia dari Cambia atas permintaan Bayer, yang memiliki

paten membatasi penggunaannya dalam beberapa negara).


7/24

Digit kedua - menunjukkan seleksi bakteri: 1 untuk spektinomisin /

streptomisin resistensi, 2 untuk kloramfenikol, 3 untuk kanamisin, 4

untuk spek / radang dan kanamisin.

Ketiga digit - menunjukkan polylinker digunakan: 0 untuk pUC18

polylinker, 8 untuk pUC8 polylinker, 9 untuk pUC9 polylinker.

Keempat digit - menunjukkan gen pelapor (s) hadir: 0 untuk tidak ada

gen pelapor, 1 untuk E.coli gusA, 2 untuk mgfp5; 3 untuk gusA: mgfp5

fusi, 4 untuk mgfp5: gusA fusi, 5 untuk Staphylococcus sp. gusA

(GUSPlus).

Kelima digit - mencatat beberapa fitur khusus lainnya. Sejauh ini telah

digunakan hanya dengan: pCAMBIA1305.1 dan plasmid berasal

darinya, di mana 0,1 menunjukkan tidak adanya peptida sinyal dari

GUSPlus tersebut protein, dan pCAMBIA1305.2 mana 0,2

menunjukkan adanya sinyal peptida GRP dalam planta sekresi protein

GUSPlus.

Lagging surat - X menunjukkan bahwa gen pelapor kekurangan nya

kodon start sendiri dan vektor adalah untuk menciptakan fusi kepada

reporter, Z menunjukkan adanya lacZa fungsional untuk skrining biru-

putih, a / b / c menunjukkan bingkai membaca untuk fusi dengan Fuse

dan Penggunaan vektor. (Tsen et al. 2002).

Gus vektor Seleksi Intron (pCAMBIA1201; pCAMBIA1301,

pCAMBIA2201; pCAMBIA2301)

Peneliti ingin versi terbaru harus melihat pCAMBIA 1.305,1,

pCAMBIA1105.1 atau Pcambia 1305.2103, yang dapat diminta melalui

BioForge GUSPlus Project104. Informasi tentang tua vektor pCAMBIA

di sini untuk kenyamanan.Vektor ini mengandung berfungsi penuh

gusA reporter membangun untuk analisis sederhana dan sensitif gen


8/24

fungsi atau kehadiran di tanaman diregenerasi dengan GUS assay.

Konstruk menggunakan E.coli gusA (N358Q untuk menghindari

glikosilasi N-linked) dengan intron (dari biji jarak gen katalase) dalam

pengkodean urutan untuk memastikan bahwa ekspresi aktivitas

glukuronidase berasal dari sel-sel eukariotik, bukan dari ekspresi oleh

sel A. tumefaciens sisa. Gen reporter gusA adalah kloning dalam format

modular baru. Ini plasmid cocok untuk penyisipan gen lain yang

menarik yang mengandung promotor mereka sendiri dan terminator.

Peneliti dapat cukai gen gusA dan masukkan gen mereka sendiri bunga

di tempatnya atau menggunakan vektor ini untuk membuat fusi dari

gusA dengan gen minat mereka (jika Anda telah membuat sebuah

pCAMBIA derivatif vektor bahwa peneliti lain akan menemukan

berguna dan ingin berbagi, silahkan beritahu kami tahu). Vektor ini

berisi pUC18 polylinker-lacZa dan seleksi bakteri dan tanaman yang

sama gen sebagai sesuai Minimal Vektor Pemilihan mereka(Tsen,2002).

IV. PROSEDURDalam percobaan ini strain E.coliTop 10 yang dikulturkan semalaman

ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain

E.coliTop 10 ke media LB cair. Kemudian diinkubasi di dalam shaker-

incubator dengan kecepatan rotasi 125rpm pada suhu 37C selama 16

jam(semalaman).Setelah itu Hasil inkubasi semalaman dipindahkan ke

media LB cair 25ml, dilakukan dengan cara mengambil 250l kultur

E.coli Top 10 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dikatakan

perbandingan anatara volume media dan volume kultur 10:1.Kemudian

kultur tersebut diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan

rotasi 125 rpm selama 120 menit yaitu selama 2 jam pada suhu 37C.


9/24

Setelah sebanyak 1,5 ml kultur diinkubasi selama 2 jam, kultur tersebut

diambil dan dimasukkan ke dalam tadung sentrifuga dan dengan

kecepatan 5.700 x g dilakukan sentrigfigasi selama 5 menit. Setelah

disentrifugasi supernatan yang terhasil dibuang dan ditambahkan 500l

CaCl2yang dingin,diresuspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan

5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali dan

ditambahkan kembali 200 l CaCl2dingin ke dalam tabung, diresuspensi

dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung

mikrosentrifuga, dua diantaranya diinkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk

diinkubasi 16 jam. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang

masing-masing berisi 200 l selkompeten, salah satunya atau tabung

nomor 1 ditambah dengan 10 l palsmid pUC19sirkuler, sedangkan

tabung nomor 2 tidak ditambah dengan plasmid. Kedua tabung

diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut

panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42C dan segera

dipindahkan ke dalam es dan diinkubasi kembali selama 10 menit.

Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah

diinkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-

incubator pada suhu 37C dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5

jam. Sebanyak 100 l hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating

ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50

l hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media

LB tanpa ampisilin. Diinkubasiksn selama 16 jam pada suhu 37C.

Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam

yang masing-masing berisi 200 l sel kompeten, ditambahkan 10 l

vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung

nomor 3), 2 l vektor pUC19 rekombinan(tabung nomor 4) dan tidak


10/24

ditambahkan apapun (tabung nomor 5). Ketiga tabung mikrosentrifuga

diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas

(heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42C dan segera dipindahkan ke

es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga

selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,dilanjutkan

dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu

37C. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara

menambahkan 50 l X-Gal dan 100 l IPTG ke media cawan LB/Amp,

lalu diinkubasi pada suhu 37Cselama lebih kurang 30 menit. Hasil

inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media

cawanLB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 l. Tabung nomor 4

disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.Supernatan

dibuang hingga tersisa 100 l, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara

plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.Hasil inkubasi pada tabung no.5

ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawanLB/Amp sebanyak

100 l dan ke media cawan LB sebanyak 50 l, dilanjutkan dengan

inkubasi selama 16 jam pada suhu 37C. Dilakukan penjumlahan untuk

cawan yang berisiE. colidengan pUC19 sirkuler koloni untuk diketahui

efisiensi transformasinya.Efisiensi transformasi dihitung dengan cara

sebagai berikut, Dimana,koloni= jumlah koloni putih (dalam

cfu)[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng).


11/24


12/24

5.4Lemari es

5.5Mikro pipet

5.6Mikrosentrifuga


13/24

5.7Pengocok orbital

5.8Sarung tangan

5.9Tabung Eppendrof

Bahan

5.1Aquabides5.2Etanol 95%5.3GeneJET plasmid minprep kit (fermentas life sciences):

Resuspension solution, Lysis solution, Neutralization solutiom,

Wash solution, RNase A, Elution Buffer (10mM Tris-HCL, pH

8.5), GeneJET Spin Colums dan tabung kolektor 2mL


14/24

5.4Kloramfenikol/ kanamisin 100 g/mL dalam medium LB cair5.5Medium lurea bertani (LB) cair (Biogen)5.6Plat biakan bakteriE.coliTop 10 berumur 18-24jam5.7pCambia 1201

VI. DATA PENGAMATAN

No.Cawan

Petri

Hasil Pertumbuhan

Hasil Pengamatan

Ada Pertumbuhan Tiada pertumbuhan

1.Kontrol

(+)

2.Kontrol (-

)

3.

A

(Ada

pChambia

1201)

4.

B

(Tanpa

pChambia

1201)


15/24

VII. PEMBAHASAN

Praktikum bioteknologi ada beberapa tahap yang harus dikerjakan

sebelum kitamendapatkan hasil murni dari isolasi DNA dan isolasi Kromosom.

Pada awal praktikum kita melakukan Transformasi, transformasi disini

bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Coli. Transformasi disini

memiliki prinsip diantaranya pembuatan sel kompenten yang dapat disisipi

vektor DNA rekombinan, transformasiE. Colidengan plasmid rekombinan dan

menyeleksi koloni E.coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan

menggunakan cawan LB/kloramfenikol/X-Gal/IPTG. Pada praktikum

transformasi genetic ini dilakukan pembuatan sel kompeten E.coliTop 10 dan

transformasi plasmid DNA. Transformasi genetic adalah proses introduksigen

dari satu organism ke organisme lain yang memungkinkan untuk memunculkan

sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Transformasi genetic merupakan salah

satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari regulasi gen,

identifikasi fungsi gen, pengujian metabolisme, mempelajari fisiologi serta

perkembangan tanaman.

Sebelumnya telah dilakukan pembuatan sel kompeten oleh asisten

sehingga pada praktikum kali ini praktikan tinggal melakukan transformasi

DNA plasmid. Sel Kompeten(Competent Cells, CC, C-Cells) adalah sel

(bakteri atau yeast) yang telah mengalami perubahan dalam hal tingkat

permeabilitasnya. Artinya membrane sel dari bakteri atau yeast tersebut mampu

dilewati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah masuk tersebut akanbertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba tersebut. Pembuatan

sel kompeten dimulai dengan mengkultur semalaman strain E.coli Top 10 ke

media LB cair 10 ml dengan cara memindahkan satu koloni stran E.coliTop 10


16/24

ke media LB cair. Setelah itu diinkubasi dalam shaker-inductor dengan

kecepatan rotasi 125 rpm dengan suhu 37C selama 16 jam hingga 18

jam.Kultur sel sendiri merupakan metode dimana suatu sel dari suatu jaringan

diambil danditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol dan aseptik. Sel yang

digunakan untuk dikultur biasanya diambil dari jaringan eukariot. Sel tersebut

akan tumbuh dan bertambah banyak dalam kondisi in vitro.Setelah dikultur dan

diinkubasi selama 16 jam, kultur dipindahkan ke media LB cair 10 mL dengan

cara mengambil 250 mikro liter E.coliTop 10 ke dalam media LB cair steril 5

mL,lalu diinkubasi kembali dengan shaker incubator dengan kecepatan 125

rpm selama 2 jam pada suhu yang sama. Tahap ini dilakukan agar sel semakin

memperbanyak diri sehingga jumlahnya dibanyak sehingga untuk

mendapatkan sel transforman cukup mudah melalui media tersebut. Kemudian

1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam dimasukkan dalam tabung eppendorf, Kultur

hasil inkubasi 2 jam ini diperkirakan telah mengalami fase log. Fase log

diperlukan agar jumlah bakteri yang terisolasi untuk pembuatan sel kompeten

optimal. Setelah itu kultur diambil kembali dan untuk selanjutnya dimasukkan

tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5700 x gselama 5 menit hal ini dilakukan untuk memisahkan bakteri dengan medium

pertumbuhannya.Supernatan yang dihasilkan dibuang dan kedalam tabung

ditambahkan 100 mikro liter CaCl2 dingin. DNA plasmid merupakan wadah

yang digunakan untuk mengcloning gen.

Proses transformasi bakteri diawali denga pembuatan sel kompeten.

Pencampuran sel kompeten dan DNA insert diinkubasi bersama dengan larutan

kalsium klorida (CaCl2) yang terdapat pada TFB, fungsi larutan ini adalahmegganggu keseimbangan kalsium dalam membran sehingga membran berhasil

terbuka dan DNA insert dapat masuk. Cara kerja larutan ini adalah membantu

terbukanya protein integral sebagai kanal ion. Proses selanjutnya yaitu


17/24

dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42C selama 45 detik dengan maksud

membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang

mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Proses pengerjaan transformasi

dapat dilakukan di dalam laminar ataupun di luar laminar. Perbedaannya hanya

pada kesterilan kerja dan resiko kontaminasi pada pekerjaan di luar laminar.

Supernatan tersebut mengandung DNA plasmid sehingga harus

dipisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh

lebih kecil daripada DNA kromosom sedangkan fungsi penambahan CaCl2

sendiri akan mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam

pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa

penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut

panas(Utomo,2005).Setelah dilakukan penambahan CaCl2 dingin, kemudian

diresuspensi dandisentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama dan waktu

yang sama seperti sebelumnyaSupernatan dibuang kembali ditambahkan lagi

CaCl2 dingin di resuspensi lagi danselanjutnya diinkubasi dalam es.

Sentrifugasi dilakukan berulangulang bermaksud agar DNA plasmid benar

benar sudah tidak bercampur lagi dengan DNA kromosom. Sedangkan

penginkubasian dalam es bertujuan untuk membuat suhu di dalam media

menjadi ekstrem halini akan berpengaruh dengan tahap selanjutnya ya itu heat

shock. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk

membuka pori pada dinding sel bakteri.Inkubasi dengan plasmid akan

menyebabkan masuknya plasmid kedalam sel. Penambahan media LB setelah

perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri

setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.Untuk mengetahui sel yang telahmengalami transformasi maka dilakukan seleksi transforman dengan

memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai markaseleksi. Bakteri ditumbuhkan

pada medium yang mengandung kloramfenikol.


18/24

Dengan adanya kloramfenikol,maka sel E. coli yang dapat tumbuh

hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi

selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal.

Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang

sama sebagai bakteri transforman.Tabung mikro sentrifuga hasil inkubasi 2jam

yang masing-masing berisi 50l sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor

A ditambah dengan 5l plasmid p CAMBIA 1201, sedangkan tabung nomor B

tidak ditambah dengan p CAMBIA. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam

es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock)selama 90 detik

dengan suhu 42 c dan segera dipindah kan kedalam es untuk diinkubasi kembali

selama 20 menit. Tabung mikro sentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml

setelah inkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi 10 menit, dilanjutkan

dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oc dengan kecepatan

rotasi 150 rpm selama 1,5 jam. Sebanyak 100 l hasil diinkubasi ditumbuhkan

dengan cara plating ke media cawan LB/Kloramfenikol untuk kedua tabung.

Selain itu, sebanyak 50 l hasil inkubasi pada tabung nomor B ditumbuhkan

juga pada media LB kloramfenikol . Selain itu dilakukan kontrol positif dan

kontrol negative. Kontrol positif digores dengan E.Coli manakala kontrol

negative hanya mengandungi LB agar Inkubasi dilakukan selama 18jam /over

night pada 37oC.

pCAMBIA adalah sesuatu vektor yang digunakan dalam bidang

bioteknologi. pCAMBIA yang digunakan adalah pCAMBIA 1201. Ciri ciri

pCAMBIA adalah : asal copy rendah-replikasi menghasilkan rendah preps DNA hasil; replikan tidak stabil, menyebabkan hilangnya variabel plasmid selama

propagasi;


19/24

saiz gedik kurangnya situs restriksi nyaman untuk manipulasi terbatas pilihan untuk kedua bakteri dan tanaman kurangnya cara sederhana untuk membangun fusi gen pelapor

pCAMBIA digunakan dalam praktikum ini karena pCAMBIA mempunyai

kemampuan memproduksi nomor tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi.

Ciri lain vektor ini adalah

pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalamAgrobacterium size kecil, 7-12kb plasmid yang sesuai situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan kecil

tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA Anda minati

pemilihan bakteri untuk chloramphenicol or kanamycin seleksi tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi

fosfinotrisin dihentikan atas permintaan pemilik IP, Bayer, setelah

distribusi awal tahun 1997)

cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reporter gusAPerbedaan pCAMBIA 1201 dan pCAMBIA 2201 adalah:

pCAMBIA R-

gene

plants

R-gene

bacteria

Polylinker Reporter

gene

T-DNA

size(BP)

Lac-

Z

Vector

family

2201 nptII cmr pUC18 gusA 5391 - GIS

1201 hptII cmr pUC18 gusA 5606 - GIS

Perbedaan antara kedua vector tersebut adalah size. Gus A merupakan reporter

gene untuk kedua-dua vektor tersebut. Fungsi kedua vektor adalah untuk


20/24

meningkatkan produksi E.coli . Basa pasang kedua vektor berbeda. pCAMBIA

2201 dan pCAMBIA 1201 terdiri dari Gus intro selection vectors pCAMBIA.

Gambar 2: Struktur pCAMBIA


21/24

Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa cawan petri yang dibuat

kontrol positif yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan

manakala kontrol negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat

pertumbuhan mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi

pCAMBIA dan diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada

pertumbuhan.Cawan petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi

kloramfenikol juga tidak mengandungi pertumbuhan mikroorganisme.

Dari hasil yang didapati , sepatutnya cawan petri A akan terdapat

pertumbuhan koloni ini kerana hal ini dikarenakan bahwa E.coli tersebut


22/24

mengandung gen resisten kloramfenikol yang di transformasi dari pCAMBIA

yang mengandung gen resisten kloramfenikol. Kesalahan yang mungkin

dilakukan oleh kami yang memungkinkan mempengaruhi result adalah,

dimungkinkan kloramfenikol telah rusak karena kepanasan, atau mungkin

disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril.

Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung kloramfenikol.

Dengan adanya kloramfenikol, maka sel E. coliyang dapat tumbuh hanya sel

transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam

akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri

yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai

bakteri transforman.

VIII. KESIMPULAN

Dari hasil percobaan kali ini cawan petri yang dibuat kontrol positif

yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan manakala kontrol

negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat pertumbuhan

mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi pCAMBIA dan

diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada pertumbuhan. Cawan

petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi kloramfenikol juga tidak

mengandungi pertumbuhan mikroorganisme. Daripada percobaan ini

sepatutnya cawan petri A akan terdapat pertumbuhan koloni ini kerana hal ini

dikarenakan bahwa E.coli tersebut mengandung gen resisten kloramfenikol

yang di transformasi dari pCAMBIA yang mengandung gen resisten

kloramfenikol. Kesalahan yang mungkin dilakukan oleh kami yangmemungkinkan mempengaruhi result dimungkinkan kloramfenikol telah rusak

karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang

aseptis atau kurang steril.


23/24

IX. LAMPIRAN


24/24

DAFTAR PUSTAKA

Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica.

Yogyakarta.

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, 1986. Dasar _ Dasar Mikrobiologi Jilid I.

Universitas Indonesia. Jakarta.

Tsen et al. 2002.Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of

Biomedical Science 9:246-252.

Wibowo.2002. Tranformasi Fragmen Dna Kromosom Xanthomonas

Campestris Ke Dalam Escherichia Coli. MAKARA, SAINS, VOL. 6,

NO. 1

transformasi plasmid

Documents