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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL 1 TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN Objetivos Conocer el fundamento para transformar células bacterianas. Realizar la técnica de transformación bacteriana. Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo. Conocer la definición de organismo transgénico. Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos. Introducción Desde épocas antiguas, el ser humano ha seleccionado animales y plantas con características fenotípicas deseables. La domesticación ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la producción de insumos para consumo humano. Por ejemplo, hace 100 años una vaca producía en promedio 2000 a 3000 litros de leche al año; actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al año, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 años producía en promedio 70 huevos al año, mientras que en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al año. Las técnicas convencionales de reproducción han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinación cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro produce la mula, que es estéril. Así, el número de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse sólo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados. Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de técnicas de manipulación y de selección del material genético, es decir, con la ingeniería genética. Debido a que el DNA contiene un código genético esencialmente igual para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos no relacionados y producir organismos con características útiles y particulares, que de otra manera sería imposible obtener: los denominados organismos transgénicos. Actualmente se ha identificado y caracterizado un gran número de genes. Este conocimiento abre la posibilidad de buscar métodos para introducir o modificar un gene que proporcione una característica deseable, como por ejemplo, curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes ajenos al huésped se pueden ocasionar efectos indeseados, por ejemplo, que la característica introducida lleve a una alteración en el metabolismo, en la señalización y, por tanto, modifique la fisiología y sobrevivencia del individuo, o bien que se “escape” la nueva información de manera indiscriminada a otros organismos. Requisitos para construir un vector de clonación Aún cuando el código genético es básicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control genético difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una célula eucarionte. Para la producción de un organismo genéticamente modificado se debe producir o construir un transgene, que consiste en el gene de interés más una parte extra de DNA que controle correctamente la

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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN

Objetivos Conocer el fundamento para transformar células bacterianas. Realizar la técnica de transformación bacteriana. Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo. Conocer la definición de organismo transgénico. Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.

IntroducciónDesde épocas antiguas, el ser humano ha seleccionado animales y plantas con características fenotípicas deseables. La domesticación ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la producción de insumos para consumo humano.Por ejemplo, hace 100 años una vaca producía en promedio 2000 a 3000 litros de leche al año; actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al año, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 años producía en promedio 70 huevos al año, mientras que en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al año.

Las técnicas convencionales de reproducción han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinación cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro produce la mula, que es estéril. Así, el número de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse sólo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados.

Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de técnicas de manipulación y de selección del material genético, es decir, con la ingeniería genética. Debido a que el DNA contiene un código genético esencialmente igualpara todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos no relacionados y producir organismos con características útiles y particulares, que de otra manera sería imposible obtener: los denominados organismos transgénicos.

Actualmente se ha identificado y caracterizado un gran número de genes. Este conocimiento abre la posibilidad de buscar métodos para introducir o modificar un gene que proporcioneuna característica deseable, como por ejemplo, curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes ajenos al huésped se pueden ocasionar efectos indeseados, por ejemplo, que la característica introducida lleve a una alteración en el metabolismo, en la señalización y, por tanto, modifique la fisiología y sobrevivencia del individuo, o bien que se “escape” la nueva información de manera indiscriminada a otros organismos.

Requisitos para construir un vector de clonación

Aún cuando el código genético es básicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control genético difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una célula eucarionte. Para la producción de un organismo genéticamente modificado se debe producir o construir un transgene, que consiste en el gene de interés más una parte extra de DNA que controle correctamente la

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función del gene en el nuevo huésped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una región promotora en el extremo 5’ del gen para que sea reconocido por el aparato transcripcional del organismo receptor.Recuerda que la región promotora es un segmento de DNA localizado río arriba de la región 5’ del gen y que actúa como un elemento que controla la expresión del gen. Asimismo, se debe añadir una secuencia de poli A en la porción 3’ del gen para que el RNAm pueda ser traducido.

Los plásmidos poseen un interés singular en la Ingeniería Genética por ser uno de los vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener múltiples copias); en esta célula hospedera el vector se replica y se expresa. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (inserto) se denominavector recombinante.

Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido debe poseer al menos tres características (Figura 4.3):

1) Tener su propio origen de replicación y, por tanto, la capacidad de replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero.

2) Tener un sitio de clonación múltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restricción (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera específica) y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación deseada.

3) Poseer marcadores genéticos seleccionables que permitan aislar a las células hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibiótico. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibiótico.

Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan sólo bajo ciertas circunstancias metabólicas y/o en tejidos específicos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresión, denominados promotores fuertes, que también pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento.

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Figura 4.3. Vector de clonación pET-24. Se muestran algunas características del vector, como el sitio origen de la transcripción (ori), el sitio de clonación múltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; f1 ori, origen de replicación f1 y el sitio que servirá para controlar la expresión del transgene una vez que sea insertado en el sitio de clonación múltiple, el sitio de unión al represor lac I. Los vectores usualmente presentan más de un origen de replicación, Ori que es el que es usado para que la bacteria se replique, mientras que f1 ori es el origen de replicación usado por el fago F1 y es usado para producir DNA de cadena sencilla.

TransformaciónExisten varias técnicas para la introducción del transgene en la célula u organismo, como son la microinyección, la infección de una célula huésped con virus que contenga al vector, o mediante el uso de bacterias (principalmente para la transformación de plantas). En el caso de la transformación de bacterias, generalmente se introduce el DNA ajeno por microelectroporación o por choque térmico.

Durante el choque térmico, las bacterias que serán las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre éstos se encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga eléctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lípidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del plásmido al interior celular. Las células que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción de material genético se denominan células competentes.

Una vez que se introduce el material genético a las células competentes, se disminuye la temperatura y se diluye el calcio, con lo que se restaura la permeabilidad membranal. Al colocar a las células en condiciones óptimas de crecimiento se obtienen las células transformantes.

En la práctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 4.4, que contiene el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizará la transformación mediante la técnica de choque térmico y la resistencia a kanamicina se utilizará como indicador de que las células son transformantes.

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Figura 4.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa. El vector pET24 (Figura 4.3) fue utilizado para la construcción del vector pET-TEM-1. Se insertó el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonación múltiple del vector pET24. El transgene, ompA-lac, contiene la secuencia completa de la proteína TEM-1 -lactamasa. Para insertarlo se adicionó el sitio de restricción BamHI y adicionalmente se colocó hacia la región 5’ del gen la secuencia que codifica para la secuencia señal o de tránsito de una proteína que se encuentra en la membrana externa de bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la proteína OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia señal permitirá que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las células con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las células es a kanamicina ya que el plásmido contiene un gene que confiere la resistencia a ese antibiótico.

Material biológico 1 tubo de microcentrífuga con 100 L células competentes de E. coli por grupo,

mantenerlas congeladas hasta su uso. 1 tubo de microcentrifuga con 100 L células competentes de E. coli por equipo,

mantenerlas congeladas hasta su uso. Plásmido PET-TEM-1.

Materiales y equipo2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL) Tubos de microfuga de 1.5 mL Varilla de vidrio en forma de L Recipiente para hieloMechero Bunsen Micropipeta de 100-1000 L Micropipeta de 10-100 LCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 μL estérilesCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 μL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 μL estériles

Material por grupoBaño de incubación a 42C Incubadora con agitación a 37C

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Reactivos Medio SOC (“Super Optimal broth with Catabolite repression”). Medio que se prepara

utilizando el medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. (5 mL por grupo).

Desarrollo experimentalLas células competentes se proporcionarán congeladas. En el apéndice se encuentra el protocolo de preparación de las células competentes.

Preparativos1. Revisar y/o equilibrar el baño de incubación a 42C.2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente.3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37C por 30

min. antes del plaqueo.

Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico.

1. Tomar un tubo de células competentes del congelador y colocarlas directamente en el hielo. Descongelar las células competentes en el hielo (las células competentes son muy sensibles a los cambios de temperatura).

2. Añadir 1 a 5 L (1 a 50 g) del plásmido a un microtubo que contiene 100 L de células competentes. NOTA. Los profesores te indicarán el volumen de DNA a usar y su concentración.

3. Mezclar invirtiendo el tubo.4. Dejar en hielo por 30 minutos.5. Dar choque térmico a 42C durante 45 segundos. NO AGITAR.6. Agregar 450 μL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37C con agitación (225 a

250 rpm).7. Si la turbidez del medio es escasa, concentrar las células por centrifugación a 14,000

rpm por 1 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 μL de medio SOC.

8. Esparcir los 100 μL de las bacterias transformadas en las cajas con el medio de selección (Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio.

9. Incubar a 37C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4C.10.Como control negativo incubar 100 μL de células competentes en una caja con LB-

kanamicina por 24 h a 37C. 11.Calcular la eficiencia de la transformación, para lo cual se necesita conocer la

concentración del DNA usado para la transformación, el volumen añadido a la mezcla de transformación, el volumen usado para el plaqueo y el número de colonias obtenidas.

Cuestionario1. ¿Qué es un organismo transgénico?2. ¿Cuáles son las principales diferencias entre los métodos de reproducción asistida y la

de producción de organismos transgénicos para la producción de organismos mejorados?

3. ¿Cuáles son las consideraciones éticas que deben tomarse en cuenta para producir organismos transgénicos?

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4. ¿Qué es un vector de clonación?5. ¿Cuáles son los requisitos que debe cumplir un vector de clonación para ser utilizado

para transformar a un organismo?6. Da dos ejemplos de tipos de vectores que son usados para la clonación de fragmentos

de DNA de alto peso molecular7. ¿Qué tipo de vector de clonación es el pET24?8. ¿Cuál es el método de transformación que se utilizará en la práctica?9. Describe al menos otros dos métodos para transformar células, ya sea de animales,

hongos o plantas.10.Para realizar la transformación de células, además del vector de clonación se

necesitan las células receptoras, ¿qué tipo de células receptoras son las E. coli DH5α y las células E.coli BL21?

11.¿Cuál es el marcador de selección de las cepas transformantes y dónde se encuentra codificado?

12.Después de obtener un organismo transgénico, ¿cuáles son los cuidados que se deben tener para su manipulación o almacenamiento?

Referencias Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localización

QP514.2 Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd

edition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442.

Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317. QH345 L43

Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein science. A.4D.1-A.4D.2.

Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.

Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Reverté, pp.745-773.

http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/ http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm (determinación de

eficiencia de la transformación)

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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS

Objetivos Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del

DNA genómico. Realizar el aislamiento del DNA plasmídico.

IntroducciónDesde finales de la década de los años 70 del siglo pasado, se desarrolló un gran número de métodos de aislamiento de plásmidos. La mayoría toma en cuenta las diferencias topológicas (es decir, de acomodo en el espacio) entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, así como el tamaño de ambos. Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA del plásmido circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento entre las dos cadenas no se perturba grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente, ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas macromoléculas. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas, mientras que las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.

Material biológicoCélulas de E. coli transformante obtenidas en la práctica anterior.

Materiales y equipoTubos para microfugaRecipiente para hieloMicrocentrífugaMicropipeta de 100-1000 μLMicropipeta de 20-200 μLMicropipeta de 0.5-10 μLCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 μLCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 μL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 μL

Reactivos Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 μg/mL) Solución GTE: 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0. 3 M Acetato de potasio pH 4.8 70% Etanol Isopropanol 10 N NaOH

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10% SDS Para preparar 500 μL de solución de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 L de

10 N NaOH y 50 L 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo deberá prepararla justo antes de usarla.

Desarrollo experimental (Figura 4.5)Trabajo previo

1. Inocular una colonia de las células transformadas en 5 mL de medio Luria que contenga kanamicina a una concentración de 30 g/mL, e incubar a 37C por 12 h con agitación horizontal constante. Colocar los tubos de preferencia en forma diagonal para que se agiten bien las células y haya buen crecimiento.

Obtención de plásmido por el método de lisis alcalina 2. Tomar 1.5 mL del cultivo, colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a

10,000 rpm por 1 min a 4C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el medio Luria. Repetir este paso en el mismo tubo tres veces más o hasta que el cultivo se acabe el cultivo. De tal manera que el paquete celular de los 5 mL quede en un solo microtubo.

3. Resuspender el paquete celular en 300 L de solución GTE fría, agitando en el vórtex. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. Preparar la solución de lisis durante este tiempo de incubación.

4. Adicionar 300 L de la solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión del tubo. IMPORTANTE: no agitar en el vórtex. Incubar en hielo por 5 min.

5. Agregar 300 L de la solución fría de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar suavemente por inversión del tubo. Incubar en hielo por 5 min.

6. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. a 4C.7. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de

isopropanol frío.8. Incubar por 20 min a -20C.9. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4C.10.Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA añadir 1 mL de etanol al 70% y

centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. 11.Remover el sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por

evaporación a temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min).12.Resuspender el DNA en 30 L de agua estéril, guardar a –20C.

Nota. Se recomienda cuantificar el DNA por su absorbancia a 260 nm. Obtener los g/mL considerando que una unidad de A260 nm de DNA de doble cadena es igual a 50 g/mL.

Investiga:El fundamento de la determinación espectroscópica a 260 nm de la concentración de ácidos nucleicos.

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Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo

Células transformantes

Inocular 5mLMedio LB + Kanamicina

Incubar a 37 0C / agitación durante 12- 16 h

a. Tomar 1.5 mL del cultivo y centrifugar

b. Eliminar el sobrenadante

Resuspender el paquete celular con sol. GTE fría.

Adicionar sol. de lisis

Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb

Mezclar por inversión (no agitar). Incubar en hielo máximo 5 min.

Adicionar sol. de acetato de potasio fría

Mezclar por inversión (no agitar). Incubar en hielo máximo 5 min.

Centrifugar y tomar el sobrenadante

Adicionar isopropanol frío (v/v)

Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.

Añadir etanol al 70%, agitar en vórtexCentrifugar

Resuspender el DNA en 30 L de agua estéril.

Eliminar sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por evaporación

Eliminar el sobrenadante

Figura 4.5. Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior.

5 a 10 uL para la cuantificación Cuantificar ácidos nucleicos (relación Abs260 nm / Abs 280 nm).

Eliminar el sobrenadante

Eliminar el sobrenadante

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Cuestionario1. ¿Cuáles son las propiedades del DNA plasmídico que nos permiten separarlo del DNA

cromosomal o genómico?2. Explica por qué se usa NaOH, SDS, acetato de potasio y etanol en la purificación de

plásmidos.3. ¿Cuáles son los principales contaminantes de una preparación de plásmidos?4. ¿Cómo los eliminas? 5. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos una vez purificados?6. ¿Cuáles son los métodos utilizados para cuantificar los ácidos nucleicos?7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si el plásmido que obtuviste se

encuentra puro?8. ¿Porqué a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmídico?9. Busca el factor de conversión de pares de bases a número de aminoácidos y de

número de aminoácidos a peso molecular de proteína en kDa.

Referencias Tümmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences &

2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.745-773. Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edición,

WH Freeman.

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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:

ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDO.

Objetivos Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de

agarosa. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de

agarosa. Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la

biotecnología.

IntroducciónLas endonucleasas de restricción o tipo II se caracterizan por su habilidad para reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla específicamente en ambas cadenas de la molécula de DNA. Si bien existen tres tipos de endonucleasas con características de reconocimiento y de corte del DNA distintas, son las del tipo II son las que se utilizan en biología molecular, debido a que son capaces de cortar directamente la secuencia que reconocen y a que no modifican la secuencia blanco. Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por bacteriófagos, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Las enzimas de restricción generalmente reconocen secuencias palindrómicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restricción (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simétricas del centro del palíndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetría, produciendo extremos romos (Figura 4.6).

EcoRI HindIII HaeIII

Figura 4.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restricción en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el último ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del género y especie de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

Las enzimas de restricción son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las técnicas para el análisis y la manipulación de los ácidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminación de secuencias genómicas que van desde un nucleótido hasta

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cientos de bases, así como en la introducción de secuencias ajenas a un genoma, lo que ha permitido la producción de proteínas recombinantes.

Existen diferentes factores que afectan la reacción de restricción por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta concentración de sales. Los efectos de la contaminación pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima añadida a la reacción, arriba de 10 a 20 U /g DNA, incrementando el volumen de reacción, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duración de la incubación. La digestión del DNA genómico por estas enzimas puede facilitarse por la adición de policationes como espermidina, que actúa uniendo contaminantes cargados negativamente. Cuando un plásmido está superenrollado es necesario añadir más enzima o bien, desnaturalizarlo.

El tratamiento de una molécula de DNA con enzimas de restricción permite producir fragmentos definidos que pueden separarse mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los grupos fosfato de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo. Cuando la migración ocurre en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, porque las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes.

Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción. Si el fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restricción, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molécula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restricción se denomina mapa de restricción. El análisis de los mapas de restricción constituye una importante herramienta para localizar secuencias de bases específicas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados.

Existen varias aplicaciones de los mapas de restricción, como la obtención de los patrones de RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) utilizados en las pruebas de paternidad, así como también en la identificación de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen, cabello, etc.

En la práctica se utilizarán dos enzimas de restricción en una mezcla. Esto se debe a que el vector utilizado en la transformación (Figuras 4.3 y 4.4) tiene dos sitios de restricción para enzimas diferentes, de manera que sólo se podrá liberar el fragmento de DNA de interés al cortar por los extremos con las dos enzimas que reconocen dichos sitios.

Material biológicoDNA plasmídico purificado de la práctica anterior.

Materiales y equipoRecipiente para hieloTubos para microfugaGradilla para tubos de microfugaRecipientes para teñir el gel.Micropipeta de 100-1000 μL

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Micropipeta de 20-200 μLMicropipeta de 0.5-10 μLCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 μL estérilesCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 μL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 μL estérilesCámara de electroforesis horizontalFuente de poderVórtex Horno de microondasMicrofugaBaño de incubación a 37CBaño de incubación o bloque de calentamiento a 100CTransiluminadorPantalla de acrílico Cámara fotográfica

Reactivos NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20C. BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20C.NOTA; Las enzimas de restricción son muy sensibles a la temperatura, mantenerlas en frío durante su manipulación. Amortiguador TANGO de restricción. Reactivo que es proporcionado por el proveedor

junto con la enzima NdeI. TAE 1X. Ver preparación en el apéndice. Agarosa Amortiguador de muestra Estándar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizará de acuerdo

a las instrucciones del proveedor. Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)

Desarrollo experimental

Ensayo de restricción1. Etiquetar dos tubos de microfuga.2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de plásmido y 1 L de

Amortiguador Tango10X3. Incubar a 100C por 5 min.4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.5. Pasado el tiempo de incubación, añadir al tubo 1 únicamente una de las dos enzimas

de restricción que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 L BamHI y otro par de equipos 1 L NdeI. Mezclar suavemente después de añadir la enzima.

6. Al tubo 2 añadir 1 L de BamHI y 1L de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al tubo de microfuga.

7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el líquido se deposite en el fondo.

8. Incubar a 37C por 1.5 h.

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9. Se sugiere añadir 0.5 l de una solución de RNasa (1 g/mL) e incubar 30 min a 37C. Este procedimiento eliminará el RNA y facilitará la visualización de los productos de la restricción en el gel. Otra opción para la eliminación del RNA es añadir 2 L de la solución de RNasa a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cámara de electroforesis, cuando esté tibio.

10.Al término de la incubación colocar los tubos en hielo.11.Se recomienda que para visualizar más nítidamente los fragmentos de la restricción,

tomar todo el volumen usado en el ensayo de restricción de cada tubo para correr en un gel de agarosa.

Preparación del gel Se sugiere utilizar un gel por cada dos equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o

carriles en el gel. Colocar la bandeja de acrílico para hacer el gel dentro de la cámara y colocar el peine. Preparar un gel de agarosa al 1%. Pesar 0.35 g agarosa en un matraz Erlenmeyer,

añadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodón o una servitoalla. Se calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min. o hasta que la agarosa se disuelva bien.

Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60C, añadir entonces 2 L bromuro de etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGÉNICO) para obtener una concentración final de 0.5 g/mL, agitar el matraz para mezclar. O bien añadir el reactivo SYBR Green (se recomienda usar 1 L de 10,000 SYBR Green I por cada 10 mL de gel)..

Depositar el gel en la bandeja de la cámara (Figura 4.7), evitando la formación de burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min).

Quitar los acrílicos que hacen la bandeja y colocar el gel en la cámara de electroforesis.

Añadir el amortiguador TAE en la cámara. La cámara de electroforesis se llena con aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.

Figura 4.7. Preparación de un gel de agarosa. Adición de la agarosa disuelta en TBE.

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Preparación y cargado de las muestras.1. Tomar los tubos de microfuga que fueron usados en la restricción y etiquetarlos R1,

R2. Además marcar dos tubos más uno como E de estándar y otro como P de plásmido sin digerir.

2. Añadir los reactivos como se indica en la tabla 4.1. Usar una punta de micropipeta distinta para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación cruzada.

Tabla 4.1. Preparación de muestras para aplicar en el gel de agarosa.Reactivos Estándar*

(E)Plásmido sin

digerir (P)

Plásmido digerido con una enzima

(R1)

Plásmido digerido con dos enzimas

(R2)Muestra 1 μL DNA-HindIII 10 μL 12 μL** 13 μL**H2O 9 μL Amortiguador de muestra

2 μL (Stop Mix) 3 μL 3 μL 3 μL

*El estándar que se usa en el laboratorio (lambda DNA digerido con HindIII) puede calentarse a 65°C por 10 min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el carril del estándar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb.** Volumen que quedó después de realizar el ensayo de restricción.

3. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el líquido en el fondo.

4. Retirar el peine de la bandeja. Muy importante: los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el cátodo, generalmente el electrodo es de color negro.

5. Tomar el volumen total de cada uno de los tubos de microfuga preparados según la tabla 4.1 y colocar en los pozos como se muestra en la Figura 4.8.

Figura 4.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.

6. Una vez depositadas las muestras, colocar la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro con negro) y conectar a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cámara.

7. Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la observación de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiación ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrílico entre el observador y la fuente de luz UV.

8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese propósito, los geles serán incinerados, junto con los guantes y puntas si es que estuvieron en contacto con el bromuro de etidio.

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Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas. Construir la curva de estándares de peso molecular y Estimar el tamaño aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA así como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estándar de peso molecular que se encuentran en la parte inferior de la tabla 4.1.

9. Analizar los resultados.

Cuestionario

1. ¿Qué parte de la molécula de DNA le confiere la carga negativa? 2. ¿Cuál es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los

dos colorantes que contiene? 3. ¿Por qué el bromuro de etidio es un reactivo mutagénico?4. ¿A que se le denomina topoisómeros?5. ¿En la práctica se pudieron observar topoisómeros?6. ¿Qué peso molecular tienen los topoisómeros? 7. ¿Qué tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la práctica, romos o

cohesivos?8. ¿Cuántos fragmentos de DNA o restricción se obtuvieron al utilizar las dos enzimas

NdeI y BamH1?9. ¿Cuántos fragmentos se obtuvieron al utilizar sólo una de las enzimas de restricción?

¿Por qué?10.¿Cuál fue el peso molecular del DNA liberado y del plásmido o vector?11.¿Cuáles son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restricción?

Referencias

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Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences © 2001, John Wiley & Sons, Ltd.

www.els.net. Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition.

Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.

279-317. Localización QH345 L43 Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual.

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specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.

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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.

Objetivos Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli Realizar la inducción de una proteína recombinante (-lactamasa) Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes

Introducción La necesidad de producir proteínas heterólogas o recombinantes para varias aplicaciones científicas y comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular proteínas. Los sistemas bacterianos han sido los más utilizados para este fin, debido a que son fácilmente manipulables genéticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son económicos y se requiere sólo un entrenamiento mínimo para su manejo. Además, muchas de las características inherentes a los sistemas bacterianos permiten la automatización en proyectos de producción a gran escala, donde se requiere la producción y muestreo de cientos de clonas.

A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes: las proteínas de eucariontes o las proteínas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carácter químico del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas (proteínas que se unen a las proteínas recién sintetizadas), así como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-traduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariontes. Por ejemplo, los sistemas de expresión de bacterias no glicosilan a las proteínas. Otros sistemas de expresión, como los sistemas de células de mamífero,de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las proteínas eucariontes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las proteínas es crítica, aunque el costo de estos sistemas es considerablemente más alto y la tecnología que se necesita es más complicada. Adicionalmente, la producción de grandes cantidades de proteínas, como algunos productos terapéuticos, se puede lograr tanto en plantas como en sistemas animales.

Muchas compañías ofrecen una serie de vectores con capacidades de expresión muy variadas, con o sin proteínas de fusión que funcionan como etiquetas para la detección y/o purificación de la proteína deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y promotores distintos.

Los vectores de expresión como el pET son usados comúnmente para la expresión de proteínas heterólogas en E. coli. En los sistemas pET, los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del promotor del bacteriofago T7, que controla la alta expresión de la RNA polimerasa T7. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiará con más detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresión de la proteína de interés, se tiene que introducir lactosa o un análogo de ésta, el más utilizado es el isopropil-D tiogalactosido(IPTG), análogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial del operón de la lactosa (Fig. 4.9). El IPTG se une a la proteína represora, ocasionándole a la proteína un cambio conformacional que le impide su función biológica de unirse al DNA. La actividad biológica de la proteína represora es unirse a una secuencia de DNA denominada operador impidiendo, en el caso del vector pET, la transcripción del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripción del transgene. El efecto del IPTG de liberar de la represión del gen es denominado inducción, por lo que el IPTG es llamado inductor. El gen que codifica a la proteína represora se encuentra incluido en el vector, LacI, y su transcripción ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector (Fig. 4.9).

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Así, a pocas horas de inducción, la formación de la proteína deseada puede llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula.

Figura 4.9. Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de proteína mediada por el vector pET.

Como se mencionó anteriormente, la producción de la proteína recombinante en un organismo no relacionado puede llevar a que la proteína no sea funcional, ya sea porque no presenta las modificaciones post-traduccionales necesarias o bien porque no se plegó adecuadamente, provocando su aglomeración. Cuando las proteínas se aglomeran formando agregados que sólo pueden solubilizarse a través del uso de soluciones de detergentes, se dice que forman cuerpos de inclusión. En este caso, aumentan los costos de producción y/o recuperación de la proteína.

En la práctica se llevará a cabo el monitoreo de la inducción de la -lactamasa en células completas de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 4.4), vector que fue producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostró en la Figura 4.3.

Material biológico por grupo1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo líquido saturado de células transformadas de E. coli (crecidas por 12 a 16 horas con agitación vigorosa).

Material y equipo1 mechero1 recipiente para hielo Tubos para microfuga de 0.5 mL 2 vasos de precipitados 25 mL1 pipeta Pasteur con bulboRecipiente de plástico para la tinción. Micropipeta de 2 a 10 LMicropipeta de 20 a 200 LMicropipeta de 200 a 1000 L1 caja de puntas de 10 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta1 caja de puntas de 1000 L para micropipetaPlacas de vidrioPeine

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Separadores Pinzas para sujetar las placasCámara para electroforesisFuente de poderVórtexIncubadora a 37C con agitación Cámara fotográfica

Reactivos 1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL) 100 mM IPTG Estándar de peso molecular de proteínas 8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotómetro.

Desarrollo experimentalInducción de proteína recombinante, -lactamasa (Figura 4.8).

1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de células de E. coli transformadas con el vector PET-TEM-1-ompA-lactamasa, y añadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina. Tomar una alícuota de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 m contra un blanco de medio Luria (la absorbancia debe ser menor a 0.3). Incubar los tubos con agitación vigorosa a 37C (colocarlos en posición diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8.

2. Para verificar que se llegó a la absorbancia indicada, tomar una alícuota de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 m contra un blanco de medio Luria. Si aún no llega, volver a incubar el matraz con agitación vigorosa.

3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alícuota a la que llamaremos tiempo 0(mantener en hielo el tubo de microfuga).

4. Agregar el IPTG para tener una concentración final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del medio con células puede variar, dependiendo del número de alícuotas que se hayan tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el cálculo tomando en cuenta el volumen final de medio con células.

5. Incubar nuevamente a 37C con agitación horizontal y tomar alícuotas de 1 mL cada 30 min por 1.5 o 2 h.

6. Guardar todas las alícuotas en tubos de microfuga a 4C.

Preparación de un gel de poliacrilamida-SDSDurante el tiempo de incubación e inducción de la proteína recombinante, preparar un gel de poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las instrucciones de elaboración se encuentran en la sección II, parte III del manual. O bien realizar los geles y la corrida de las muestras en otra sesión de laboratorio.

Preparación de las muestras y separación en un gel de poliacrilamida-SDS1. Tomar 15 L de cada una de las alícuotas que fueron recolectadas y mezclarlos con 10 L de

amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. Hacer una mezcla apropiada de estándares de peso molecular (se sugiere 7 L de los estándares de peso molecular más 18L de amortiguador de muestra).

2. Ensamblar el gel en la cámara de electroforesis.3. Aplicar las muestras en el gel.4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del

colorante haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel.

5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel.

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6. Enseguida desprender el gel de las placas y realizar la tinción depositando el gel en una charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante.

7. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución desteñidora. Poner a agitar suavemente.

8. Tomar la foto del gel.9. Analizar los resultados. La proteína tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el

péptido señal de la proteína ompA y de 29 kDa sin péptido señal.

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Células del cultivo saturadoIncubar a 370C / agitación vigorosa

durante 2 h

Incubar a 37 0C / agitación.Tomar una alícuota cada 30 min

1 mLt = 30 min

Medio LB-kanamicina

1.5 ml

Leer a 600 m hasta obtener 0.6-0.8 Abs.

Agregar__________L 100mM IPTG (concentración final 0.5 mM)

1 mLt = 60 min

1 mLt = 90 min

Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS.

t = 0

Figura 4.10. Proceso de inducción de proteína recombinante en E. coli.

1 mL t = 0

1 mL t = 120 min

Elegir entre incubar hasta 90 o 120 min, ya que sólo hay 5

pozos disponibles por equipo. Recordar que

uno de los pozos contendrá el estándar

de peso molecular.

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Cuestionario

1. Menciona las diferencias entre las células de E. coli DH5 y las células E. coli BL21 2. ¿Qué es una proteína recombinante?3. ¿Por qué el cultivo de células debe de llegar a una densidad óptica de 0.6 a 0.8 antes de

comenzar el proceso de inducción de la proteína recombinante?4. ¿Cuál fue el tiempo en el que se produjo la máxima cantidad de proteína recombinante?5. ¿Qué otros parámetros se podrían modificar para obtener un mayor rendimiento de la

proteína?6. ¿Qué son los cuerpos de inclusión?7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si la proteína se encuentra en forma soluble o

en forma agregada?8. ¿Qué método propondrías para purificar a la proteína recombinante obtenida?9. Describe tres ejemplos de proteínas recombinantes que se producen actualmente de manera

comercial, explicando sus usos.

Referencias Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning

vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442. Hammlev D, Madden D, Nørby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for

biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE. LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in

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