TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENETICO: ENSAYOS DE RESTRICCION DE PLASMIDO

Espinosa Muñiz José Carlos2011-2

Endonucleasas de restricciónEs una enzima que se caracteriza

por reconocer una secuencia de 4 a 6 pb y cortarlas específicamente en ambas cadenas de la molécula del ADN.

Tipos de endonucleasasTipo ITipo II. Son las

usados en biología molecular

Tipo III

Tipo IIEs la mas utilizada en biología

molecular.Cortan sobre la secuencia que

reconocen. Han perdido su capacidad de ser metilasas del DNA

Cofactor MgNo ATP

¿porqué enzimas de restricción?Las endonucleasas son también

llamadas enzimas de restricción debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por bacteriófagos. RESTRINGEN EL PASO DEL BACTERIÓFAGO.

Son utilizadas para la eliminación de secuencias genómicas o para su introducción a un genoma (proteínas recombinantes)

Generalmente reconocen secuencias palindromicas, es decir, segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda y viceversa.

Extremos cohesivosEs cuando la enzima de

restricción rompe la cadena del ADN en posiciones no simétricas y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena.

Extremos romosEs cuando la enzima de

restricción corta exactamente sobre los dos ejes de simetría.

NomenclaturaEl nombre de estas enzimas esta

asignado dependiendo su origen bacteriano.

La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.

Eco RI E = género Escherichiaco = especie coliR = cepa RV 13I = primera

endonucleasa identificada de esta cepa

Factores que afectan la reacción de restricciónSe inhiben con los contaminantes

que podemos encontrar en preparaciones de ADN (proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, sales)

SolucionesSi se aumenta la cantidad de

enzima (10 a 20 U/µg DNA) incrementa el volumen de reacción, lo que diluye los inhibidores.

Se puede aumentar la duración de la incubación.

Adición de policationes (espermidina) uniéndose a contaminantes cargados -

¿Para que utilizamos enzimas de restricción en el DNA?Permite producir fragmentos

definidos que se pueden separar mediante una electroforesis horizontal.

Un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción.

Si el fragmento a analizar es extenso, se pueden utilizar una o mas enzimas de restricción (individual o mezcla)

Mapa de restricciónEs un diagrama de la molécula

de DNA en donde se muestra los sitios de corte de las enzimas de restricción.

Se puede localizar secuencias de bases especificas en un cromosoma para estimar el grado de diferencia entre los cromosomas

En la práctica se utilizaran una mezcla de dos enzimas de restricción ya que el vector utilizado en la transformación no presenta dos sitios de restricción para la misma enzima.

SESIÓN EXPERIMENTAL

ObjetivosConocer el principio de separación y

detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa.

Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos.

Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Conocer la utilidad de enzimas de restricción en la transformación genética y biotecnológica.

Materiales y reactivosDNA plasmidico purificado.Kit para electoforesisNdel enzima de restricción que

genera extremos cohesivos (ALMACENAR -20°C)◦Neisseria denitrificans◦37°C

BamHI enzima de restricción que genera extremos cohesivos (ALMACENAR -20°C)◦Curtobacterium albidum◦37°C

Materiales y reactivosAmortiguador TANGO de

restricciónTAE 1XAgarosaBuffer de muestraEstándar de peso molecularBromuro de etidio

Desarrollo experimental1. Colocar en un tubo de microfuga los siguientes

reactivos: 10 µL de plasmido y 1 µL de amortiguador Tango 10x. Realizarlo por duplicado.

2. Incubar 100°C por 5 min.3. Incubar en hielo por 5 min.4. Al tubo 1 agregar 1 µL de una de las enzimas

de restricción (la indicada por el profesor). Mezclar.

5. Al tubo 2 añadir 1 µL de BamHI y 1 µL de Ndel. Mezclar.

6. Centrifugar por 5 segundos.7. Incubar a 37°C por 90 minutos.8. Al terminar la incubación, colocarlos en hielo.9. Tomar alícuota de 10 µL para correr el gel de

agarosa.

Preparación del gel de agarosaPreparar el gel de agarosa al

1.2% (0.42 g agarosa + 35 mL de TAE 1X).

Calentar hasta que se disuelva bien.

Esperar a que la temperatura disminuya y agregar 2 µL de Bromuro de etidio (AGENTE MUTAGENICO)

Verter el gel sin formar burbujas. Dejar enfriar.

Añadir amortiguador TAE a la cámara hasta que se cubran los pozos hechos por los peines.

Preparación de muestrasREACTIVOS E P R1 R2

MUESTRA 1 µL DNA 10 µL 10 µL 10 µL

H2O 9 µL ----- ----- -----

BUFFER 2 µL Stop Mix

3 µL 3 µL 3 µL

E: estándarP: plásmido sin digerirR1: plásmido digerido con una enzimaR2: plásmido digerido con dos enzimas

DNA, Moléculas cargadas negativamente

Tomar 13 µL y colocarlos en los pozos.

Conectar a la fuente de poder a 80 V por 40 minutos.

Observar el gel en una cámara de luz UV para visualizar las bandas de DNA