312

が ん セ ン ター に お け るtoxin A陰 性toxin B陽 性

Clostridium difficileに よ る 下 痢 症 の 院 内 集 団 発 生

1)千葉県がんセ ンター臨床検査部(現 千葉県木更津保健所),2)国 立感染症研究所細菌 第二部,

3)千葉県衛生研 究所細菌研究室(現 千葉県野田保健所),4)千 葉 県が んセ ンター腫瘍 ・血液内科

佐 藤 洋 子1)加 藤 は る2)小 岩 井 健 司3)酒 井 力4)

(平 成16年1月16日 受 付)

(平 成16年1月23日 受 理)

Key words: Clostridium difficile, diarrhea, nosocomial infection

要 旨

2001年2月 か ら7月 まで に千 葉県 が ん セ ン ターの 東4(造 血 器/呼 吸器 腫 瘍)病 棟 でClostridium diffi-

cile関 連 下痢 症 が15症 例 と頻繁 に認 め られ た.15症 例 中10症 例 が悪性 リンパ種症 例 で あ り,12例 に抗

菌 薬,11例 に抗癌 剤 の使 用 が認 め られ た.15症 例 中5症 例 か らtoxin A陽 性toxin B陽 性(A+B+)C.

difficile株が,残 る10症 例 か らtoxin A陰 性toxin B陽 性(A-B+)C.difficile株 が 分 離 され た.Toxin

A-B+10株 は,PCR ribotypingに よ り10株 とも同一 のバ ン ドパ ター ンを示 し,パ ル ス フ ィー ル ドゲ ル

電気 泳 動 に よる タイ ピ ングに よっ て同 じmajor type(2サ ブ タイプ)に タイ プ され,本 病棟 に おい てtoxin

A-B+C.difficileに よる下 痢症 の 院 内集 団発 生 が起 きた と考 え られ た.糞 便 検体 中のtoxin Aは15症 例

中14症 例 に おい て検 討 され たが,toxin A+B+株 が 分 離 され た2症 例 でtoxin A陽 性 で あ り,toxin A-

B+株 が 分離 され た10症 例 を含 む12症 例 でtoxin A陰 性 で あ った.糞 便 中のtoxin A検 出 だ けで な く,

菌 の培 養 を行 っ た こ とに よ り,院 内集 団発 生 を認 識す るこ とが可 能 であ っ た.

〔感染症誌78:312～319,2004〕

序 文

Clostridium difficileは抗菌薬や抗癌薬が誘因 と

なって引 き起 こされる下痢症/腸 炎の主要な原因

菌である.ま た,芽 胞を有する菌であるため病院

環境に長期にわたって存在 し,院 内伝播すること

が知 られている.特 に欧米では多 くの院内集団発

生が報告されている1).

C.difficileによる 腸 炎 の 発 症 に はtoxin Aと

toxin Bが 関与 している.従 来,毒 素産生株はtoxin

Aとtoxin Bの 両毒素を産生 し,毒 素非産生株 は

両方 とも産生 しないとされて きたために,C.diffi-

cile関 連 下 痢 症(CDAD)の 細 菌 学 的 検 査 に は糞 便

中 のtoxin A検 出 あ る い はtoxin B検 出 の ど ち ら

か,お よ びC.difficileの 分 離 培 養 が 行 わ れ て き た.

近 年,toxin Bを 産 生 す るがtoxin Aを 産 生 しな い

toxin A-B+C.difficile株 が ヒ トの 消 化 管 に 対 し

て病 原 性 が あ る こ とが 報 告 され は じめ 注 目 され て

い る2)～4).欧 米 で はtoxin Aとtoxin Bが 同 時 に

検 出 で きる キ ッ トも利 用 され て い るが,日 本 で は

毒 素 検 出 キ ッ トと し て利 用 で きる の は酵 素 免 疫 法

に よ るtoxin A検 出 キ ッ トで あ り,toxin A-B+

C.difficileに よ る 感 染 症 は 見 逃 さ れ る恐 れ が あ る.

今 回 対 象 と な っ た 病 棟 で は1992年 か ら1997年

に か け てCDAD症 例 が 多 発 した 経 緯 が あ り5)6),

そ の 際 に は 菌 株 の 解 析 は 行 わ れ な か っ た た め に 院

別刷請求先:(〒292-0832)千 葉県木更津市新田3-

4-34

千葉県木更津保健所 佐藤 洋子

感染症学雑誌 第78巻 第4号

Toxin A-B+Clostridium difficileに よ る下 痢 症 の 院 内 集 団 発生 313

内 感 染 で あ る か ど うか 証 明 され な か っ た.今 回,

2001年2月 か ら7月 ま で の6カ 月 間 に 再 び

CDAD症 例 数 の増 加 が 認 め ら れ,分 離 さ れ た 菌 株

の 毒 素 産 生 性 を検 討 し た と こ ろ,多 数 がtoxin A

陰性 株 で あ っ た た め,さ らに 患 者 背 景 と と も に解

析 し た.

対 象 と方 法

2001年2月 か ら7月 ま で に 千 葉 県 が ん セ ン

ター の 東4(造 血 器/呼 吸 器 腫 瘍)病 棟(18室48

床)に お い て,CDADを 疑 わ れ た46症 例 よ り提 出

さ れ た 糞 便138検 体 の う ち 培 養 に て28検 体(19

症 例)か らC.difficileが 分 離 され た.そ の う ち15

症 例 の 臨 床 背 景 と,分 離 され たC.difficile菌 株 の

解 析 を 行 っ た.

C.difficileは サ イ ク ロ セ リ ン ・セ フ ォ キ シ チ

ン ・マ ン ニ トー ル培 地(CCMA日 水 製 薬)で 分 離

培 養 後,C.Dチ ェ ックD-1(シ オ ノ ギ)ま た はRap

ID ANA II(ア ム コ)に て 同 定 した.

糞 便 検 体 中 のtoxin Aは ユ ニ ク イ ッ ク(関 東 化

学)を 用 い て 検 出 した.菌 株 の 毒 素 産 生 性 は,ブ

レ イ ンハ ー トイ ンフ ュ ー ジ ョ ン液 体 培 地(栄 研 化

学)で5日 間嫌 気 培 養 した 培 養 液 を用 い た.Toxin

A検 出 に はユ ニ ク イ ッ ク を 使 用 し,Toxin B検 出

に は フ ィル ター 濾 過 した培 養 液 を 用 い て ベ ロ細 胞

に よ る細 胞 培 養 に よ り行 っ た.細 胞 変 性 陽 性 の も

の は抗C.difficile toxin B抗 体(TechLab)に よ る

中 和 反 応 で 確 認 した.

菌 株 の 毒 素 遺 伝 子 の 検 討 は,toxin A遺 伝 子 の

非 反 復 塩 基 配 列 お よ び 反 復 塩 基 配 列(プ ラ イマ ー

NK3-NK2お よ びNK11-NK9)7)8)お よ びtoxin B

遺 伝 子 の 非 反 復 塩 基 配 列(プ ラ イ マ ー セ ッ トNK

104-NK105)7)をPCRで 増 幅 す る こ と に よ り行 っ

た.

菌 株 は,PCR ribotyping9)10)お よ び パ ル ス フ ィー

ル ドゲ ル電 気 泳 動(PFGE)10)11)に よ り タ イ ピ ン グ

した.両 者 と も既 に報 告 され た 方 法 に 従 い 行 っ た.

PFGEに は制 限 酵 素Sma Iを 使 用 した.PFGEバ

ン ドパ ター ンの 解 析 に はTenoverら の ク ラ イ テ

リ ア を 用 い12),3バ ン ド以 下 の 差 異 の タ イ プ を

subtype,4バ ン ド以 上 の バ ン ド差 が 認 め られ た

タ イ プ をmajor typeと した.

結 果

15症 例の患者背景をTable 1に 示す.15症 例の

うち男性9例 で,女 性6例 であった.50歳 以上が

9例(60%)で,基 礎疾患は悪性 リンパ腫(ML)が

10例(65%)を 占めてお り,肺 がんが2例(13%),

急性骨髄性白血病,肺 腫瘍,馬 尾神経腫瘍が1例

(7%)ず つであった.C.difficile関 連腸炎の症状 と

しては15症 例全例で下痢が認められ,発 熱,腹 痛

が多 くの症例で認め られた.内 視鏡検査を行 った

症例 はなかった.15症 例のCDAD発 症前の抗菌

薬使用状況,抗 癌剤使用状況,そ のほかの治療,

CDAD発 症 日と病室,CDADの バ ンコマ イシン

(VCM)治 療等の臨床経過 をTable 1お よびFig.

1で 示す.抗 菌薬 は15例 中12例(80%),抗 癌剤

は11例(73%)に 投与 されていた.使 用抗菌薬で

多 く使用 されていたものは,カ ルバペネム系 とセ

フェム系であった.CDAD発 症前1カ 月間に抗菌

薬の使用歴のない3例 の うち2例 は抗癌薬を投与

されてお り,1例 は放射線治療 を うけていた.

CDAD診 断後,14例 はVCMに よる治療が行われ

回復 した.1例 はVCMの 投与は行われずに下痢

は3日 間で回復 した.

東4病 棟 は,18室48床 のうち2床 以上の病室

が10室 あるが,そ の うち8室(80%)にCDAD

症例が認められ,特 定の病室に集積する傾向は認

められなかった.

15症 例 より分離されたC.difficile 15株 の毒素産

生性,毒 素遺伝子型のPCR,PCRリ ボタイピング,

PFGEタ イピングの結果をTable 2に 示す.15株

すべての培養上清においてベロ細胞で細胞毒性が

認め られ,抗toxin B抗 体によって中和 され,toxin

B産 生性が認め られた.Toxin A産 生性は15株 中

5株 で認め られたが(toxin A+B+),残 る10株 で

陰性であった(toxin A-B+).PCRに よる毒素遺

伝 子の検討で は,15株 すべ て にお いてtoxin A

遺伝子 とtoxin B遺 伝子の非繰 り返 し部分の遺伝

子が検出された(Fig.2-A).Toxin A遺 伝子の繰

り返 し配列 部 分 を検 出す るPCRで は,5株 の

toxin A+B+株 で は 約1,200bp,残 る10株 の

toxin A-B+株 は約700bpのPCR産 物の増 幅が

認められ(Fig.2-B),毒 素産生性 とPCRに よる毒

平成16年4月20日

314 佐藤 洋子 他

素 遺 伝 子 型 が 一 致 して い た.糞 便 中 のtoxin Aは

15症 例 中14症 例 に お い て検 討 し,2例 に お い て 陽

性 で あ っ た.こ の2例 か らはtoxin A+B+株 が 分

離 さ れ た.

15株 はPCRリ ボ タ イ ピ ン グ に よ り異 な る4タ

イ プ(trf,smz,hr,yok)に 分 け ら れ た.Toxin

A+B+株5株 で は3タ イ プ(smz,hr,yok)が 認

め られ,そ の う ち3株 は 同 一 の バ ン ドパ ター ン を

示 し タ イ プhrに 属 して い た.ま た,toxin A-B+

株10株 は す べ て 同 じ タ イ プtrfで あ っ た(Fig.3-

A).

PFGEタ イ ピ ン グで は15株 中14株 に 異 な る3

major typeお よ び5subtypeが 認 め られ,1株 は

DNA degradationの た め に タ イ プ 別 不 能 で あ っ

た.Toxin A+B+株5株 の う ち,同 じPCR ribo-

type hrで あ っ た3株 で2種 類 の バ ン ドパ タ ー ン

が 認 め られ た が,2バ ン ドの 差 異 で あ る こ と か ら

3株 は 同 じmajor typeに タ イ プ さ れ た(Y11-aお

よびY11-c).残 りの2株 は,1株 は異 な るPFGE

タ イ プ(CB11)で あ り,1株 はPFGEで タ イ プ 別

不 能 で あ っ た.Toxin A-B+株10株 で は2種 類

のバ ン ドパ タ ー ンが 認 め られ,2バ ン ド差 で 同 一

のmajor typeに 分 類 され た.PFGEタ イプTRM-

dが6株,TRM-eが4株 認 め られ た(Fig.3-B).

タ イ ピ ン グ結 果 と症 例 が 入 室 して い た病 室 に は特

に 関 連 は 認 め ら れ な か っ た が,toxin A-B+の

TRM-d株 は3月 か ら4月 に か け て,TRM-e株 は

5月 か ら7月 に か け て 分 離 され た.

考 察

Toxin A-B+株 は1993年 に無 症 候 小 児 か ら分

離 の 報 告13)があ っ た も の の,消 化 管 感 染 症 に お け

る 臨 床 的 意 義 につ い て は 明 らか で は な か っ た.し

か し,2000年 にLimayeら に よ るtoxin A-B+株

に よ る 偽 膜 性 腸 炎 症 例 が 報 告 さ れ2),カ ナ ダ お よ

び オ ラ ン ダ に お け るtoxin A-B+株 に よ る 院 内

集 団発 生 事 例 が 報 告 され る に お よ び3)4),そ の 臨 床

的 意 義 が 注 目 され る よ う に な っ た.今 回 の 検 討 で,

造 血 器/呼 吸 器 腫 瘍 病 棟 で 多 発 したCDAD15例 中

10例 にtoxin A-B+株 が 分 離 さ れ,分 離 され た

10株 のtoxin A-B+株 はPCR ribotypingと

PFGEタ イ ピ ン グ の 結 果 か ら,toxin A-B+C.dif-

感染症学雑誌 第78巻 第4号

Toxin A-B+Clostridium difficileに よる 下痢 症 の 院 内集 団 発 生 315

Table 2 Enzyme immunoassay test results for toxin A in stool and toxigenicity and typing results of C. difficile

isolates from 15 patients

ficileによる下痢症 の院内集団発生があった と考

えられた.病 棟内の特定の病室に限局せず広 く病

棟全域か ら発生 していることより,医 療従事者や

患者,便 器等 を介 して菌が病棟中に伝播,拡 散 し

たと考えられた.

CDADの リスクフ ァクターとして抗菌薬投与

が重要であ り,特 にセフェム系抗菌薬,ア ンピシ

リン,ク リンダマイシンの関与が多 く報告されて

いる14).今 回検討 した15例 において もセフェム

系,カ ルバペメム系が多 く使用 されてお り,投 与

後早いもので3日,遅 いもので3～4週 間後に発症

が認め られた.抗 菌薬以外の リスクファクターと

しては抗癌剤投与5),H2ブ ロッカー投与等が報告

されている15).本事例では抗菌薬が投与 されてい

ない例が3例 あるが,そ のうち2例 に腸の運動を

障害する抗癌剤であるvincristin(VCR)が 投与さ

れていた.本 剤は消化管蠕動を阻害す る作用があ

り便の停滞を起 こすが,こ のことがCDADの 誘因

になると考 えられる6)16).がんセ ンターのなかで

も腫瘍 ・血液内科では,抗 菌薬の使用に加え抗癌

剤による治療が多いため,他 科 よりもCDADが 多

発 したと考えられた.

最近,日 本の病院におけるtoxin A-B+株 によ

る院内集団発生事例が報告された17).こ の論文で

は,toxin A+B+株 に よ るCDAD症 例 とtoxin

A-B+株 によるCDAD症 例が比較 されてお り,

toxin A-B+株 が分離 された症 例で は優位 に頻

繁に抗癌剤が使用 されていると報告 されている.

Toxin A-B+株 によるCDADと 抗癌剤の関連に

ついてはさらなる検討が必要であるが,今 回の事

例 を含めたtoxin A-B+株 に よる集団発 生2事

例において抗癌剤使用が多 くの症例で誘因となっ

ている点は興味深い と考えられた.

東4病 棟で は造血器腫瘍 という患者背景があ

り,CDADが 重症化 しやすい傾向があるため6),

検査の結果CDADと 診断された場合は誘 因とな

る抗 菌薬等 を中止 あ るい は変更 す る とと もに

VCMに よる治療 を積極 的に行 っている.今 回検

討 した15症 例中自然治癒 した1例 を除いた14症

例 においてVCMに よる治療がなされ,全 例回復

した.

C.difficileは芽胞のかたちで病院の環境に長期

平成16年4月20日

316 佐藤 洋子 他

Fig. 1 Clinical courses of 15 patients.

間生存 し続け,汚 染 された病院環境が院内感染の

感染源や感染経路 となりうる18).東4病 棟では,

今 回のCDADの 集団発生が特定の病室に限局せ

ず広 く病棟全域で発生 した事実から,特 に トイレ

と便処理 を主体 に伝播予防対策を講 じた.そ して

環境の湿性清掃,CDAD患 者専用ポー タブル トイ

レの使用,担 当看護師の専任化,便 処理時のディ

スポーザブル手袋の使用などを徹底 した.そ の結

果 そ れ 以 後CDADの 集 中 発 生 は 見 られ て い な い.

CDADの 院 内拡 散 を 防 止 す る た め に は,(1)医 療 従

事 者 がC.difficile感 染 は 決 して 稀 な 疾 患 で は な く

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus等 と 同

様 に 院 内 感 染 を 引 き起 こ す こ とを 十 分 に 認 識 し,

ス タ ン ダ ー ドプ リ コー シ ョ ン と接 触 感 染 予 防 対 策

を徹 底 す る こ と,(2)CDADを 疑 う場 合 に は 便 の 細

菌 学 的 検 査 をす る こ と,(3)抗 菌 薬 投 与 が 最 大 の リ

感染症学雑誌 第78巻 第4号

Toxin A-B+Clostridium difficileに よ る 下痢 症 の 院 内 集 団 発 生 317

Fig. 2 Polyacrylamide gel electrophoresis of PCR

product of six isolates.

Multiplex PCR with the primer sets, NK3-NK2 detect-

ing for the non-repeating sequences of the toxin A

gene and NK 104-NK 105 detecting tor the non-

repeating sequences of the toxin B gene (A), and PCR

with the primer set, NKV011-NK11-NK9 detecting for

the repeating sequences of the toxin A gene (B).

Lanes 1 to 3, A-B+isolates from three patients;

lanes 4 to 6, A+B+isolates from three patients; lane

7. VPI 10463 strain as a positive control for A+B+;

lane 8, GAI 95601 strain for a positive control for A-

B+; lane 9, negative control; and lane M, 100-bp lad-

der as a size marker.

A

B

Fig. 3 PCR ribotype patterns (A) and PFGE patterns

of Sma I-digested DNA (B).

Lanes 1 to 3. PCR ribotype trf/PFGE type TRM-d;

lanes 4 and 5, trf/TRM-e; lanes 6 and 7, hr/Y11-c;

lane 8. yok/CBl 1; lane 9. smz/PFGE nontypeable

(not included in PFGE profile), lane 10 . negative con-

trol (A); and lanes M, size markers, 100-bp ladder

(A) and chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae

(B) were used as molecular markers.

A

B

ス ク フ ァ ク ター な の で 不 必 要 な 抗 菌薬 の 投 与 は極

力控 え る こ とが 重 要で あ る.

また,今 回 糞 便 中 のtoxin A検 査 につ い て は,

toxin A+B+株 の 分 離 例5例 中3例 に お い て 陰 性

だ っ た.こ の こ と は,toxin Aキ ッ トの 感 度 が

toxin A産 生 性C.difficileの 培 養 検 査 と 比 較 す る

と あ ま り高 くな い こ とを 示 して い る.さ らに,今

回 の 事例 の よ う にtoxin A-B+株 に よ るCDAD

は,糞 便 中 のtoxin A検 査 の み 施 行 し て い る と 見

逃 され て し ま う危 険 性 が あ る.

CDADの 診 断 検 査 の"gold standard"と い わ れ て

い る細 胞 培 養 法 に よ る 糞 便 中 の 毒 素検 出 を 基 準 に

す る と,Oxoid Toxin Aキ ッ トに よ るtoxin A検

出 の 感 度 ・特 異性 は50%・98%で あ る が,海 外 で

使 用 され て い るtoxin Aとtoxin Bの 両 者 が 検 出

可 能 な キ ッ トに よ る 方法 で は80～82%・99%と

報 告 され て い る19).

臨 床 的 にCDADが 疑 わ れ 糞 便 中toxin Aが 陰

性 で あ っ て も消 化 管 症 状 が 改 善 し な い 場 合 や 複 数

の 症 例 に消 化 管 症 状 が 認 め ら れ 院 内 感 染 が 疑 わ れ

る場 合,さ ら に,本 事 例 の よ うに 抗 菌 薬 や 抗 癌 薬

の 使 用 の 多 い ハ イ リ ス クな 患 者 の 多 い 病 棟 で は,

C.difficileの 培 養 を 行 う必 要 が あ る と 考 え られ た.

特 に 院 内 集 団 発 生 が 疑 わ れ た場 合 に は,疫 学 的 調

査 に 菌 株 が 必 要で あ り培 養 検 査 が 重要 で あ る.さ

ら に,toxin Bも 検 出 可 能 なtoxin A/toxin B検 出

キ ッ トの 一日 も 早 い 国 内へ の 導 入 が 望 まれ る.

今 回,わ れ わ れ は 最 近 観 察 され た 千葉県 が ん セ

ン タ ー 東4病 棟 のtoxin A-B+C.difficileに よ る

CDADの 集 団 発 生 を 報 告 した.多 少 で も 今 後 の わ

が 国 のCDAD対 策 に 役 立て ば 幸い で あ る.

なお,本 研究 の 一部は厚生労 働科学研 究 費補助 金(新

興 ・再興 感染症研究 事業)「薬剤 耐 性菌の 発生動 向の ネ ッ

トワー クに関す る研究(H15-新 興-10)」および,科 学研究費

補助 金,基 盤研究(C)(2)課 題番 号14572197「 遺 伝子解 析

技 術 を用 いたデ フ ィシ ル菌院 内発生時 におけ る流行 菌株

の解明 」の研究経 費に よ り実施 された.

文 献

1) Samore M, Killgore G, Johnson S, Goodman R,

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平成16年4月20日

318 佐藤 洋子 他

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感染症学雑誌 第78巻 第4号

Toxin A-B+Clostridium difficileに よる 下痢 症 の 院 内 集 団 発 生 319

A Nosocomial Outbreak of Diarrhea Caused by Toxin A-negative,Toxin B-positive Clostridium difficile in A Cancer Center Hospital

Hiroko SATO1), Haru KATO2), Kenji KOIWAI3) & Chikara SAKAI4)1)Division of Clinical Laboratory, Chiba Cancer Center Hospital

2)Department of Bacterial Pathogenesis and Infection Control, National Institute of Infectious Diseases

3)Chiba Prefectual Institute of Public Health

4)Division of Hematology and Oncology, Chiba Cancer Center Hospital

Between February and July 2001, 15 patients were diagnosed as Clostridium difficile-associateddiarrhea in a ward of hematological neoplasm and lung cancer in a cancer center hospital. Of these 15

patients, 10 had malignant lymphoma, and 12 and 11 had exposure to antimicrobial agents and cancerchemotherapy, respectively, before the onset of diarrhea. Toxin A-positive, toxin B-positive (A+B+)C. difficile was recovered from five patients and the remaining 10 patients suffered from diarrheacaused by toxin A-negative, toxin B-positive (A-B+) strains. All of the 10A-B+isolates repre-sented an identical banding pattern by PCR ribotyping and classified into one type (two subtypes) by

pulsed field gel electrophoresis typing, indicating that a nosocomial outbreak of diarrhea caused byA-B+C. difficile occurred among the patients hospitalized on this ward. Detection of toxin A in stoolspecimens by a toxin A detection kit was performed on 14 patients. Although two patients who car-ried A+B+strains were positive for toxin A assay, toxin A detection test was negative in 12 pa-tients including 10 patients with A-B+C. difficile infection. Diagnosis of C. difficile-associated diar-rhea by combination of toxin A assay in feces and culture of C. difficile could successfully lead to rec-ognition of an outbreak caused by A-B+C. difficile in a cancer center hospital.

〔J. J. A. Inf. D. 78: 312～319, 2004〕

平成16年4月20日