tox. no volátiles

7/24/2019 Tox. No Voltiles

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Laboratorio de Toxicologa

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IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNAMUESTRA PROBLEMA

OBJETIVOS ACADMICOS

Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para separar txicos no voltiles de

naturaleza cida y bsica en una muestra problema.

Que el alumno emplee reacciones coloridas y cromatografa en capa fina (CCF) para la identificacin

de txicos no voltiles en una muestra problema.

Que el alumno cuantifique un txico no voltil en una muestra problema.

PROBLEMA

Separar e identificar escopolomina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico de una

muestra problema; y cuantificar el cido barbitrico presente.

REACTIVOS

Hidrxido de amonio (NH4OH) Solucin de NaOH al 10%*Metanol (MeOH) Acetato de etilo (AcOEt)

cido actico glacial (AcOH) Escopolamina

Reactivo de Dragendorff * Diclorometano (CH2Cl2)

Reactivo de Dille-Koppanyi * cido barbitrico

Paracetamol cido 4-hidroxibenzoico

cido tartrico * Solucin acuosa de cido actico 2 M*

Solucin saturada de nitrito de sodio (NaNO2) * cido clorhdrico (HCl) concentradocido clorhidrico 1N* Sulfato de sodio anhdro

Acetato de etilo (AcOEt) Solucin de NaHCO3al 10%

*Ver APNDICE II


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EQUIPO

Rotaevaporador Bomba de aspersin

Lmpara de luz ultravioleta Espectrofotmetro

Parrilla de calentamiento

MATERIAL POR E QUIPO (Primera sesin)

Embudo de separacin de 250 mL 2 Agitador de vidrio 1

Embudo de cola corta 2 Probeta de 10 mL 2

Matraz Erlenmeyer de 125 Ml 6 Pipeta graduada de 10 mL 2

Matraz de bola de 50 Ml 2 Anillo metlico 2Vaso de precipitados de 250 Ml 5 Tubos de ensayo 8

Vaso de precipitados de 100 mL 4 Anillos de corcho 2

Vidrio de reloj de 9 cm 2 Pipeta Pasteur 4

MATERIAL PARA LA CURVA (Primera sesin)

Matraz volumtrico de 25 Ml 1 Pipeta volumtrica de 4 mL 1

Matraz volumtrico de 10 mL 4 Micropipetas de 100-1000 L 1

Pipetas volumtricas de 5 mL 2

MATERIAL POR E QUIPO (Segunda sesin)

Cromatoplacas 1 Tubos capilares 3

Vasos de precipitados de 100 mL 4 Pipeta graduada de 10 mL 2

NOTA: El profesor proporcionara las celdas para las lecturas

DESARROLLO EXPERIMENTAL

El profesor proporcionar una muestra problema de 30 mL, la cual contiene los txicos no voltiles

escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico.


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PRIMERA SESION

A) EXTRACCIN CIDA

1. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solucin acuosa de cido tartrico al 10% hasta

llegar a pH = 2. La muestra acidificada se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos

porciones de 15 mL de AcOEt; se separan las fases orgnicas y renen en un matraz. Guardar y

etiquetar la fase orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y 3

respectivamente.

2. Tratamiento de la fase orgnica:

2.1

La fase orgnica se extrae con dos porciones de 15 mL de una solucin de bicarbonato de sodio(NaHCO3) al 10%; reunir las fases acuosas en un matraz y tratarlas de acuerdo a lo indicado

en el inciso 2.3.

2.2

A la fase orgnica obtenida en el inciso 2.1 se le adiciona sulfato de sodio anhidro para

eliminar el exceso de agua en la muestra, posteriormente la fase orgnica se filtra a travs de

algodn y se concentra in vacuo;el residuo final se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar

como fraccin A1.

2.3La fase acuosa que se reuni en el inciso 2.1 se acidifica con HCl concentrado hasta llegar a un

pH = 1 y posteriormente se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt; las fases orgnicas

se renen en un matraz, se elimina el exceso de agua adicionando sulfato de sodio anhidro y

filtrando a travs de algodn, finalmente la fase orgnica se concentra in vacuo y el residuo

obtenido se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A2. Nota: La fase

acuosa se desecha de acuerdo a lo indicado en R0 (Apndice disposicin de residuos).

3. Tratamiento de la fase acuosa:

3.1

Adicionar gota a gota (aproximadamente 15 gotas), una solucin de NaOH al 10% hasta pH = 10.La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL

de CH2Cl2; las fases orgnicas se renen en un matraz, se seca sobre sulfato de sodio anhidro,

concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con 2 mL de CH2Cl2. Etiquetar como

fraccin A3.


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3.2Ala fase acuosa obtenida en el inciso 3.1, se adiciona gota a gota, HCl concentrado hasta llegar a

pH = 2. Etiquetar como fraccin A4.

4.

Tomar 2 mL de la fraccin A4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el

residuo obtenido se reconstituye con 2 mL de metanol y se conserva para su posterior anlisis con

las pruebas de identificacin.

5. El remanente de la fraccin A4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico de acuerdo

al procedimiento indicado en el apartado C(Cuantificacin).

B) EXTRACCION BSICA

1.

A 15 mL de la muestra problema se agrega gota a gota una solucin de NaOH al 10% hasta llegar a

un pH = 10 (aproximadamente 20 gotas). La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin

y se extrae con dos porciones de 15 mL de CH2Cl2; se separan las fases orgnicas y renen en un

matraz. Guardar y etiquetar la fase orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y

3 respectivamente.

2. Tratamiento de la fase orgnica: Adicionar sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de

agua, filtrar sobre algodn y concentra in vacuo. El residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de

MeOH. Etiquetar como fraccin B3.

3. Tratamiento de la fase acuosa:

3.1Adicionar gota agota, una solucin de HCl 1N hasta pH = 7. La solucin resultatnte se trasvasa

a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt

3.2A la fase orgnica obtenida se le adiciona sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn

y se concentra in vacuo, el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como

fraccin B1.

3.3

La fase acuosa neutra del inciso 3, se lleva a pH = 2 adicionando HCl 1N. Se trasvasa a unembudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt. A la fase orgnica

obtenida se le agrega sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn, concentra a presin

reducida y el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B2.

3.4

La fase acuosa remanente de la extraccin anterior, se etiqueta como fraccin B4.


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4. Tomar 2 mL de la fraccin B4y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el

residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de metanol y se conserva para su posterior anlisis.

5.

El remanente de la fraccin B4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico.

Nota:El disolvente recuperado al final de la concentracin in vacuo se depositar en el contenedor

etiquetado como R1 para A3 y B3 y en R2 para A1-2 y B1-2. Los residuos de sulfato de sodio

anhidro se depositan en el contenedor etiquetado como R3.

C) CUANTIFICACIN DE CIDO BARBITRICO

PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO BARBITRICO

La curva patrn de cido barbitrico se prepara colocando en matraces volumtricos de 10 mL los

volmenes de la solucin patrn de cido barbitrico indicados en la Tabla 1 y llevando al aforo con

agua destilada:

Tabla 1. Curva patrn de cido barbitrico

No. de tubo Alicuota de lasolucin patrn de cido barbitrico (mL)

Concentracinde cido barbitrico (mg/mL)

1 0.0 BLANCO

2 1.5 0.45

3 3 0.90

4 6 1.80

5 8 2.40


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TRATAMIENTO DE LAS FRACCIONES QUE CONTIENEN CIDO BARBITRICO:

MUESTRA PROBLEMA, CURVA PATRN Y BLANCO

1.

Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen cido barbitrico(muestra problema, patrn y blanco).

2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solucin saturada de NaNO2, 0.1 mL de la

solucin de AcOH 2My 2.4 mL de agua destilada.

3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotmetro a 530 nm, utilizando

como blanco el tubo nmero 1 de la curva (ver Tabla 1).

4. Despus de haber realizado la lectura de cada una de las muestras colocarlas en un contenedor

etiquetado como R12.

SEGUNDA SESION

D) IDENTIFICACIN

Cromatografa en capa fina

Solicitar a los profesores dos placas para cromatografa en capa fina (CCF). Los anlisis por CCF serealizan en cromatoplaca de 5 cm X 2.5 cm, que consisten en placas de aluminio recubiertas con una

capa de gel se slice (slica Kieselgel 60 F254Merck)

1. Previamente, se aplicar en el lado izquierdo de una cromatoplaca (placa 1) la referencia de

escopolamina, en la placa 2 la de cido barbitrico, en la placa 3 la referencia de paracetamol y en la

4 la de cido 4-hidroxibenzoico. Colocar la muestra de los residuos reconstituidos previamente

aplicndolas en el lado derecho de cada una de las placas de acuerdo al siguiente esquema.


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Esquema 1. CCF de las muestras en estudio.

2.

Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla deCH2Cl2-MeOH- NH4OH (9:1:0.1). Nota: Para preparar este sistema de elucin es necesario

mezclar el hidrxido de amonio y metanol y posteriormente verter la mezcla resultante en el

CH2Cl2.

3. Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una mezcla de

AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1). Agitar vigorosamente la mezcla de elucin antes de eluir

la placa.

4. Para la identificacin de paracetamol utilizar como sistema de elucin una mezcla CH2Cl

2-

MeOH (9:1).

5. Para la identificacin de cido 4-hidroxibenzoico utilizar como sistema de elucin una mezcla

CH2Cl2-MeOH (9:1) + 10 gotas de AcOH glacial, por cada 10 mL de mezcla.

6. Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las cromatoplacas.

7. Eluir hasta la lnea limite de elucin indicada en el esquema 1.

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8. Visualizar la presencia de las sustancias con una lmpara de luz U.V. a 254 nm y

posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como solucin

reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide (escopolamina), con una

cmara de yodo para el cido barbitrico, y con sulfato crico amoniacal/H2SO4 para el

paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico.

9. Calcular el factor de retencin (Rf) para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y comparar el

valor obtenido con el de la referencia correspondiente.

10. Una vez identificados las sustancias, desechar los sistemas de elucin de la siguiente forma:

depositar la mezcla CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1) en el contenedor etiquetado como R4;

depositar la mezcla AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1) en el contenedor etiquetado como R5;

depositar las mezclas que contengan CH2Cl2-MeOH-AcOH en el contenedor etiquetado como

R6. Depositar las cromatoplacas en una bolsa de plstico etiquetada como R7

Identificacin por reacciones de color

Con el excedente de las fracciones reconstituidas realizar los ensayos respectivos.

Escopolamina: reactivo de Dragendorff

1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a escopolamina en un tubo de ensayo

y agregar 2 gotas de solucin reveladora de Dragendorff.

2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con CH2Cl2para esta

reaccin.

Barbitricos: reactivo de Dille-Koppanyi

1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a barbitricos en un tubo y agregar dos

gotas del reactivo A y una gota del reactivo B (Dille-Koppanyi).

2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con MeOH para esta

reaccin.

3. Una vez identificadas TODAS las fracciones desechar de la siguiente manera: Depositar las

fracciones A4, B4 y los residuos de la reaccin de Dille-Koppanyi en el contenedor etiquetado


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como R8. Depositar las fracciones A3, B3 y los residuos de la reaccin de Dragendorff en el

contenedor etiquetado como R9.

Nota: Los residuos de paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico se depositarn en los contenedores

etiquetados como R10 y R11, respectivamente.


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CUESTIONARIO.

1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico

adems de ajustar el pH?

________________________________________________________________________________

2. Una vez desarrollado el guin qu puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que

son crticos para una eficiente extraccin de un xenobitico?

________________________________________________________________________________

3. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificacin. Marque con

una cruz si la reaccin fue positiva y un guin si fue negativa.

Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin

Referenciaescopolamina

Residuoreconstituido

deescopolamina

Referenciabarbitrico

Residuoreconstituido

de cidobarbitrico

Dragendorff Dille-Koppanyi

Rf

4. Indique si su muestra contena cido barbitrico. Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5. Indique si su muestra contena escopolamina. Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________

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6. Indique si su muestra contena cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. Explique su respuesta.

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________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.

En la extraccin en medio cido cual es la finalidad de utilizar la solucin de NaHCO3 al 10%.

________________________________________________________________________________

8. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada identificacin de los componentes en

la muestra problema? Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

9. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores de la

regresin lineal.Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn

Concentracin de cido

barbitrico [mg/mL]Absorbancia

0.0

0.45

0.9

1.8

2.4

Pendiente (m)

Ordenada al origen (b)

Coeficiente de correlacin (r)


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10. Interpole los valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de cido barbitrico en

la muestra. Indique el procedimiento.

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

Clark E.E.Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972.Bowman W.C. y Rand M.J. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Ed.

Interamericana, Mxico, 1984. pp 42.25!42.32.Blanke R.V. y Decker W.J. Analysis of Toxic substances. En Burtis C.A., Edward R.A. (Eds.)

Textbook of clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986. pp 1670!1744.Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal

of Forensic Sciences 30, 708!714,

Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs.Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Bloodand Tissues.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154!159.

Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica, Plantas Medicinales. Ed.Acribia, Zaragoza, Espaa, 2001, pp 775!792.

Aydn, A., Ercan ., Ta!co"lu S. (2005). A novel method for the spectrophotometric determination ofnitrite in water. Talanta66, 11811186.


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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS.

1. Efectos txicos de la escopolamina y del cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y

paracetamol.

2. Relacin del grado de disociacin de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra

disuelto en funcin del valor de su pKa.

3. Valores de pKa de la escopolamina y el cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y

paracetamol.

4. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.

5. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y en un disolvente orgnico.

6.

Densidad de los disolventes a emplear.7. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.

8.

Sustancias que pueden precipitar protenas.

9.

Especificar las especies qumicas que se encuentran en cada una de las fases obtenidas en los

tratamientos cido y bsico

10.

Objetivo de adicionar una solucin de NaOH 2.5Nen el proceso de extraccin cida.

11.

Objetivo de adicionar una solucin de HCl 1Nen el proceso de extraccin bsica.

12.Fundamento y esquema de la reaccin de Dragendorff.

13.Fundamento y esquema de la reaccin de Dille-Koppanyi.

14.Fundamento de cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de sustancias

qumicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como agentes reveladores.

15.Reaccin involucrada en la cuantificacin de cido barbitrico.

16.Ley de Lambert y Beer

17.Sugiera un esquema de separacin para la siguiente mezcla de sustancias no voltiles, indicando

los reactivos y disolventes utilizados, los valores de pH y la naturaleza de las sustancias durante

las diferentes etapas del proceso.

COOH

OH

OHOH

cido glico [A,pKa 3.0]

O

CH3

OH

cido propanico [B,pKa 4.36]

CH3

NH-CH3

OH

Efedrina [C,pKa9.36]


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APENDICE II: PREPARACION DE REACTIVOS

Solucin de sulfato srico amoniacal en cido sulfrico.

Pesar 12 g de sulfato srico amoniacal y adicionarlos lentamente y con agitacin constante sobre 350 g

de hielo, posteriormente, adicionar 12.5 mL de H2SO4concentrado manteniendo la agitacin. Una vez

obtenida la solucin se filtra a travs de algodn. Guardar la solucin anterior en un frasco mbar.

Reactivo de Dragendorff (Solucin reveladora)

Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 mL de cido actico glacial,

calentar por 10 minutos a 40o

C para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormentefiltrar la solucin. 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) se mezclan con 8 mL de acetato de etilo, la

solucin anterior guardarla en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses).

Reactivo A (Dille-Koppanyi)

Solubilizar 1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de metanol absoluto.

Reactivo B (Dille-Koppanyi)

Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 95 mL de metanol absoluto

Solucin de hidrxido de sodio al 10%

Disolver 10 g de NaOH en 100 mL de agua destilada.

Solucin de cido clorhdrico 1 N

Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.

Solucin de cido tartrico al 10%

Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.


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Solucin patrn de cido barbitrico 3 mg/mL

Pesar 75.0 mg de cido barbitrico y transferir la pasada cuidadosamente a un matraz volumtrico de

25 mL, llevar al aforo con agua destilada.

Solucin saturada de nitrito de sodio.(NaNO2)

Pesar 82 g de NaNO2 y disolver en 100 mL de agua destilada.

Solucin de cido actico 2 M.

Medir 1.14 mL de cido actico glacial (densidad 1.049 g/mL) y agregarlos a 5 mL de agua, vaciar en

un matraz volumtrico de 10 mL y aforar en seguida con agua destilada.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R0: Residuo acuoso extraccin cida. Desechar en la tarja.

R1: Residuos de escopolamina en diclorometano.

R2:Residuos de acetato de etilo.

R3: Sulfato de sodio anhidro.

R4: Mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 7 gotas de NH4OH

R5: Mezcla MeOH-acetato de etilo-cido actico

R6: Mezcla CH2Cl2-MeOH-cido actico

R7: Cromatoplacas

R8: Reactivo de Dille-Koppanyi, cido barbitrico (fracciones A4y B4), acetona y MeOH

R9: Reactivo de Dragendorff, escopolamina (fracciones A3y B3), CH2Cl2y MeOH

R10: Residuos de paracetamol.

R11:cido 4-hidroxibenzoico.

R12:cido barbitrico, NaNO2, AcOH, acetona y MeOH

tox. no volátiles

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