TIPIZACIJA HLA MOGUĆIH PRIMATELJA I DARIVATELJA

ORGANA KOD TRANSPLANTACIJE SOLIDNIH ORGANA

Sanja Salamunović, dipl.ing.med.lab.diag.

KLINIČKA JEDINICA ZA TIPIZACIJU TKIVAKLINIČKI ZAVOD ZA TRANSFUZIJSKU MEDICINU I TRANSPLANTACIJSKU BIOLOGIJU

KBC-ZAGREB

Zadar, 23.rujan 2011.

TRANSPLANTACIJA?

Unošenje stranog tkiva - organa davatelja u organizam primatelja u svrhu liječenja

Prema vrsti transplantata razlikujemo:

Transplantaciju nelimfatičnog tkiva (solidnih organa):

Bubreg, srce, jetra, gušterača, pluća, rožnica

Transplantaciju limfatičnog tkiva:

Koštana srž, krvotvorna matične stanice

MALO POVIJESTI...

KBC-RIJEKA

1971. Prva transplantacija bubrega sa živog darivatelja 1972. Prva transplantacija bubrega sa umrle osobe Prof.dr.Vinko Frančišković i sur. 1971. Prva tipizacija antigena HLA Prof.dr.Ksenija Vujaklija - Stipanović

KBC-ZAGREB 1988. Prva transplantacija srca Prof.dr.Josip Sokolić i sur.

KBC – ZAGREB 1990. Prva transplantacija jetre Doc.dr.sc.Vuk Borčić i sur.

....I JOŠ MALO

KB JORDANOVAC, 2002. Prva transplantacija pluća Prof.dr.sc.Zoran Slobodnjak i sur.

KBC- RIJEKA1993. Prva simultana transplantacija bubrega i gušterače Prof.dr.sc. Miomir Zelić i sur.

KB – MERKUR 2002. – Prva,simultana transplantacija jetre i bubrega Prof.dr.sc.Josip Pasini Dr.Stipe Jandrijević i sur.

TRANSPLANTACIJA ORGANA U RH

26.05.2007.

RH PUNOPRAVNA ČLANICA EUROTRANSPLANTA

EFI AKREDITIRANI LABORATORIJI U RH

UVJET ZA PRIHVAĆANJE LABORATORIJA U ET PROGRAM:

AKREDITACIJA EVROPSKE FEDERACIJE ZA IMUNOGENETIKU

(EFI AKREDITACIJA)

ZAGREB ( 22.05.2007.) KJ za tipizaciju tkiva, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu i

transplantacijsku biologiju, KBC Zagreb

Referentni centar MZSS za tipizaciju tkiva

RIJEKA ( 12.09.2008.)KJ za tipizaciju tkiva, Klinički zavod za transfuzijsku medicinu, KBC Rijeka

EFI AKREDITACIJA

EUROTRANSPLANT ?

Najveća europska organizacija za transplantaciju organa

Obuhvaća regiju u kojoj živi 120 000 000 stanovnika

7 zemalja članica

Belgija, Njemačka, Hrvatska, Luksemburg,Nizozemska, Austrija i Slovenija

EUROTRANSPLANT ?

Središte u Leidenu - Nizozemska

Povezuje transplantacijske centre, laboratorije i donorske bolnice u zemljama članicama

Povezujući donorski organ s primateljem ostvaruje se cilj - optimalno iskorištenje doniranih organa

Na središnjoj listi čekanja Eurotransplanta prijavljeno je oko 16 000 mogućih primatelja organa

Liste čekanja podijeljene su po organima (bubreg, srce, jetra, pluća)

EUROTRANSPLANT - PREDNOSTI

Postojanje jedinstvenog donorskog identifikacijskog sustava

Velik broj donorskih organa (godišnje oko 7000)

Postojanje jedinstvene liste čekanja ( za svaki organ posebno )

Velik broj prijavljenih primatelja daje mogućnost odabira najpodudarnijeg donorskog organa

Povećavanje šanse hitnog dobivanja organa živitno ugroženim pacijentima

Udruženi stručnjaci svih članica izrađuju i poboljšavaju propise za raspodjelu (ALOKACIJU) donorskih organa

-

RASPODJELA ORGANA U EUROTRANSPLANTU

Raspodjela organa se temelji na medicinskim i etičkim načelima vodeći računa o :

Krvnoj grupi HLA podudarnosti između darivatelja i primatelja Postotku senzibilizacije antitjelima HLA Vremenu provedenom na listi čekanja Dobi pacijenta, ako se radi o djeci Životnoj ugroženosti Nacionalnoj uravnoteženosti primatelja i darivatelja organa Svaki od navedenih parametara donosi određen broj bodova Najveći broj bodova donosi upravo HLA podudarnost

CILJ DOBRE PODUDARNOSTI HLA

Imunološki predtransplantacijski cilj jespriječiti odbacivanje transplantata

Bolja podudarnost u alelima HLA – duže preživljavanje transplantata

Manja nepodudarnost – duže preživljavanje transplantata

ODREĐIVANJE HLA PODUDARNOSTI PRIMATELJA I DAVATELJA

Imunogenetski test

HLA TIPIZACIJA

To je određivanje polimorfizma alela HLA

laboratorijskim testovima

SUSTAV HLA

Glavni sustav tkivne snošljivosti kod ljudi nazvan

Human Lekocitni Antigeni ( HLA )

Središnji dio svih imunoloških reakcija - sudjeluje u imunološkim zbivanjima prerade i predočavanja antigena limfocitima T

Sustav čine blisko vezani geni smješteni na kraćem kraku kromosoma 6

Obuhvaća ~ 0,1% ljudskog genoma (~4.000.000 pb)

To je najpolimorfniji genetski sustav u čovjeka

Poznato više od 3500 alela HLA razreda I i razreda II

PODJELA GENA SUSTAVA HLA

Geni sustava HLA su podijeljeni na

RAZRED I

RAZRED II

Unutar razreda geni su podijeljeni na lokuse

RAZRED I (lokus A, B,C)

RAZRED II (lokus DR,DQ,DP)

ZNAČAJ ODREĐIVANJA GENA HLA

presađivanja tkiva i organa povezanost s bolestimaantropološka istraživanjasudska medicina

TIPIZACIJA TKIVA

ODREĐIVANJE GENA HLA LABORATORIJSKIM TESTOVIMA

NA SVAKOM LOKUSU TIPIZACIJOM TKIVA ODREĐUJU SE DVA ALELA

JEDAN NASLIJEĐEN JEDAN NASLIJEĐEN OD OCA OD MAJKE

A1A1B8B8DR3DR3 B7B7 A3A3DR4DR4

REZULTAT HLA TIPIZACIJE

HLA - A1, A3

B7, B8

DR3, DR4

TIPIZACIJA HLA PRIMATELJA ORGANA

Metoda izbora – molekularna ( DNA) tipizacija Uvjet za prijavljivanje na listu čekanja Obavezno određivanje alela HLA -A, -B, -DR Preporučljivo i određivanje HLA -C, -DQ

Primatelji bubrega se tipiziraju iz dva neovisno izvađena uzorka venske krvi ( s antikoagulansom EDTA )

Prvi uzorak se tipizira metodom PCR-SSP Drugi uzorak se tipizira metodom PCR-SSO Dvije tipizacije svakog primatelja bubrega moraju biti identične

Primatelji srca, jetre, pluća se tipiziraju jednokratno metodom PCR-SSO

Nakon uspješne tipizacije primatelji se prijavljuju na ET liste čekanja

DARIVATELJI ORGANA

Svaka umrla osoba kod koje je nastupila cerebralna smrt ( trajni prestanak svih moždanih funkcija) – KADAVERIČNI DARIVATELJ

Darivatelj može biti i živa osoba ( bubreg, dio jetre itd.)

U RH je zakonom propisan protokol utvrđivanja moždane smrti

Zakon o pretpostavljenom pristanku

Pristanak obitelji

Tipizacija HLA darivatelja organa

Transplantacijski koordinatori (zemalja članica ET) prijavljuju ET-u postojanje darivatelja organa u svojoj zemlji

Transplantacijski koordinatori Ministarstva zdravstva i socijalne skrbi RH kontaktiraju pripravnog djelatnika za tipizaciju tkiva ( Zagreb, Rijeka )

Pristupa se tipizaciji darivatelja - po hitnom postupku

Molekularna tipizacija gena HLA izvodi se metodom PCR-SSP

Iz uzorka venske krvi uzete sa antiloagulansom EDTA

Koriste se dva paralelna testa ( različitih proizvođača) za lokuse HLA -A, -B, -C ,-DR i – DQ (Olerup, Innvitrogen)

Vrijeme izvođenja tipizacije gena HLA je 5 – 6 sati

Izvješće sa tipizacijom donora se šalje u dežurni centar ET

IZOLACIJA DNA

Venska krv sa EDTA kao antikoagulansom

Izolacija DNA - komercijalni set za brzu izolaciju DNA pomoću kolumni (Nucleospin@Blood)

Enzim proteinaza K, uz pomoć pufera, razara proteinske strukture staničnih membrana

DNA izlazi iz jezgre i veže se za silikonsku membranu kolumne

Metoda brza, jednostavna

PCR- SSP

PCR (engl. polymerase chein reaktion)

SSP (engl. sequence specific primers )

Enzimatsko umnažanje dijela DNA

molekule uz pomoć specifičnih primera za alel ili grupu alela

Mala količina materijala

Velika količina umnožene DNA

Kratko vrijeme izvođenja testa

PCR - SSP

Molekularna tipizacija lokusa na komercijalnim testovima

HLA-A* 24 reakcije

HLA-B* 48 reakcija

HLA-C* 24 reakcije

HLA-DRB1* 24 reakcije

HLA-DQB1* 8 reakcija

Za darivatelje organa izvodi se paralelno na dva testa različitog proizvođača ( Olerup, Innvitrogen )

Za primatelje organa ova metoda se primjenjuje za tipizaciju prvog uzorka MPB

SET ZA MOLEKULARNU TIPIZACIJU HLA – SSP( Olerup )

VIZUALIZACIJA REZULTATA

Elektroforeza

Uzorci se nanose na 1,5% agarozni gel, kroz koji protiče istosmjerna struja

Nukleinske kiseline su negativno nabijene te u električnom polju putuju

prema pozitivnom polu

Dolazi do razdvajanja fragmenata jer manji fragmenti putuju brže od većih

DNK se boji etidium bromidom koji se umeće između parova baza DNK

Razdvojeni fragmenti pobuđeni UV svjetlom narančasto fluoresciraju

DETEKCIJA REZULTATA

Test se očitava kao niz pozitivnih i negativnih reakcija

Svaki gel je fotografiran kamerom (G:Box Synergine)

Analiza uz pomoć kompjuterskog programa

Run Score (Olerup) UniMatsch 4,0 (Innvitrogen)

Pozitivna reakcija – vidljive su dvije vrpce: jedna kontrolnih početnica, a druga alel specifičnog produkta –

na nekim reakcijama uz produkt kontrolnih početnica su prisutni i alel specifični

produkti

Negativna reakcija – vidljiva je jedna vrpca koja je produkt kontrolnih početnica

prisutan je samo produkt kontrolnih početnica

KOMPJUTERSKA ANALIZA ( RUN SCORE – Olerup )

•

NALAZ HLA TIPIZACIJE

PRIJAVA TIPIZACIJE PRIMATELJA U ET

PRIJAVA TIPIZACIJE DAVATELJA - ET OBRAZAC

Alokacijska lista

Lista čekanja

HVALA NA PAŽNJI !