TUGAS MAKALAH

METODE PENELITIAN PENDIDIKAN SAINS(METODE PENELITIAN DESKRIPTIF)DOSEN PENGAMPU : - Prof. Dr. H. Andi Tanra Tellu.,M.Si Dr. H. Amiruddin Kasim.,M.Si

Oleh:Sri Wahyuni(A 202 14 002)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN SAINSPASCASARJANA UNIVERSITAS TADULAKO2015

Gangguan lipid Rakit mengganggu Interaksi Toxoplasma gondii dengan makrofag dan sel epitel

AbstrakKompartemen intraseluler parasit Toxoplasma gondii dapat menembus setiap berdarah panas sel hewan. Perhimpunan dilestarikan molekuler sel tuan rumah membran plasma harus terlibat dalam parasit-sel tuan rumah pengakuan. Lemak-rakit-dilestarikan membran microdomains yang mengandung konsentrasi tinggi kolesterol, sphingolipids, glycosylphosphatidylinositol, GPI-berjangkar protein, dan diberikan kepada ibubapa adalah juga diberikan kepada acylated protein seperti anggota Src keluarga kinase tirosin reseptor. Mengganggu lipid rakit dari mouse peritoneal makrofag dan sel epitel dalam salasila LLC-MARKUS2 dengan methyl-beta cyclodextrin (MCD) dan filipin, yang mengganggu kolesterol atau lidocaine, secara signifikan menghalang segala internalization-T. gondii di kedua jenis sel, walaupun paderi tetap tidak terpengaruh dalam makrofag dan penurunan hanya dalam LLC-MARKUS2 sel. Pemindaian dan transmisi elektron microscopy mengkonfirmasi pengamatan ini. Hasil akan dibahas dalam hal peran asli dari makrofag sebagai profesional fagosit terhadap LLC-MARKUS2 sel ginjal berasal dari keturunan sel epitel.

1. Latar BelakangToxoplasma gondii, salah satu yang paling tersebar luas patogen dan juga protozoa, adalah berkompeten di menyerang berbagai jenis sel dari hewan yang berbeda (Ulasan dalam [1, 2] ). Studi-studi yang dilakukan oleh beberapa kelompok selama dua puluh tahun terakhir telah memberikan sejumlah besar informasi pada peran protein yang parasit melepaskan sekali melekat ke permukaan sel tuan rumah. Protein ini memicu suatu siri kejadian yang berkemuncak di dalam penetrasi sel tuan rumah parasit yang khas endocytic melalui proses yang termasuk pembentukan sebuah vacuole dikenal sebagai parasitophorous vacuole (PV) [ 3- 6]. Beberapa protein di dalam micronemes dan rhoptries dan dua arus uang utama organel ditemukan dalam mangsa bagian me, telah ditunjukkan untuk memainkan peran penting dalam proses interaksi [7, 8]. Namun, relatif sedikit yang diketahui tentang peran permukaan sel tuan komponen selama parasit-host interaksi 9 -12 ]. Karena T. gondii dapat menembus semua sel tuan rumah diuji, sangat mungkin bahwa perkumpulan molekuler yang dilindungi di berbagai jenis sel yang terlibat dalam parasit-sel tuan proses interaksi. Salah satu--dilestarikan mesin adalah apa yang disebut sebagai "lipid rakit," yang membran microdomains yang mengandung konsentrasi tinggi kolesterol, sphingolipids, glycosylphosphatidylinositol, GPI-berjangkar protein, diberikan kepada ibubapa adalah juga diberikan kepada acylated protein seperti anggota Src keluarga kinase tirosin reseptor, dan seterusnya (ulasan dalam 13 -15 ] ). Kajian yang sebelumnya telah menunjukkan bahwa mengganggu sel tuan rakit lemak dengan menggunakan obat yang mengganggu kolesterol, seperti methyl-beta cyclodextrin (MCD) dan filipin, atau lidocaine, yang tidak mengganggu kolesterol, secara signifikan menghalang segala infeksi pada sel-sel oleh dan juga protozoa Leishmania donovani 16 ], Leishmania chagasi 17 ], Trypanosoma cruzi [18, 19 ], dan Plasmodium falciparum 20 ]. Dalam kasus T. gondii, Coppens dan Joiner 21 menunjukkan bahwa penipisan host membran sel kolesterol menggunakan lovastatin MCD berkurang atau parasit internalization dan meningkatkan jumlah parasit dipasang pada permukaan sel tuan rumah.Untuk menentukan peran dari membran microdomains lemak dalam interaksi antara dan juga protozoa dan sel tuan rumah, kami digunakan profesional phagocytic (sel makrofag) dan sebuah sel epitel line (LLC-MARKUS2) bersama dengan beberapa senyawa lemak yang mengganggu microdomains untuk menganalisa pengaruh-senyawa pada parasit-host interaksi. Sel-sel itu dilukiskan oleh elektron microscopy, dan hasil yang diperoleh dilaporkan di sini.

2. Bahan dan Metode2.1 Bahan KimiaMethyl--cyclodextrin (MCD), filipin III, -subunit kolera toksin (CTB), dan Lidokaina diperoleh dari Sigma-Aldrich Laboratorium Kimia, AMERIKA SERIKAT. Saham solusi dari MCD, CTB, dan Lidokaina telah larut dalam air dan filipin adalah diencerkan dalam dimethylsulfoxide (DMSO).2.2. ParasitKetegangan yang RH-Toxoplasma gondii dipertahankan oleh intraperitoneal petikan ke dalam tikus seperti yang dijelaskan di tempat lain.2.3 Sel Tuan RumahJalur sel epitel LLC-MARKUS2 (ATTC) dan mouse peritoneal makrofag telah digunakan di dalam penelitian ini. Sel-sel itu berbudaya di RPMI 1640 (Gibco) sedang ditambah dengan 10 % janin bovine serum dan dipertahankan di 37 C dalam 5 % CO2 atmosfer. Makrofag disiapkan dan dipertahankan seperti yang dijelaskan sebelumnya.2.4 Interaksi Sel Tuan Rumah-ParasitInteraksi percobaan yang dilakukan dengan sel dilapis pada 13 mm slide kaca. Salah satu sel-sel itu, atau parasit-incubated di hadapan berbagai senyawa diuji, seperti yang ditunjukkan di dalam bagian Hasil. Parasit-untuk-sel tuan rumah rasio disesuaikan untuk 50 : 1. Setelah sel-sel itu diizinkan untuk berinteraksi, sel tuan rumah dicuci untuk melepaskan praktiknya parasit, dan kemudian mereka tetap segar dalam menyediakan 4 % kandungan formaldehyde di dalam 0,1 M fosfat buffer, pH 7,2. Setelah keasyikan, sel-sel dibasuh dan penuh dengan Giemsa, dan coverslips telah mengalami dehidrasi di aseton-xylol dan dipasang pada kaca slide dengan Entellan pemasangan pengamatan media untuk selanjutnya dengan mikroskop cahaya (Carl Zeiss Microscopy GmbH, ", Jerman). Paderi dan yang telah ditentukan internalization indeks seperti yang dijelaskan sebelumnya 23 ]. Sekurang-kurangnya tiga independen di duplikat percobaan ini dilakukan, dan sedikitnya 600 sel dianalisis pada setiap coverslip. Data yang diperoleh kontrol dalam percobaan-dinormalisir ke 100. Grafik dan analisis statistik, termasuk Mahasiswa -tes dan satu cara ANOVA, dilakukan dengan'Panel Grafik perangkat lunak (Software GraphPad).2.5 Sel Viabilitas AssaySetelah pengeraman dengan salah satu obat, sel-sel itu dicuci di PBS dan incubated di hadapan 0.2 % Trypan biru selama 5 menit. Persentase berlabel sel-sel mati (hanya berlabel) telah ditentukan oleh pemeriksaan mikroskopik sekurang-kurangnya 300 sel dalam sekurang-kurangnya tiga independen percobaan.2.6 Pijar MicroscopyUntuk memeriksa lokalisasi-GM1 ganglioside, sel-sel itu dicuci di RPMI 1640 sedang (GIBCO, Kehidupan Technologies Corporation) dan incubated di hadapan 50 g/mL subunit kolera toksin ( Sigma-Aldrich , USA) selama 45 menit. Selanjutnya, sel-sel itu dicuci dengan PBS, pH 8,0, dan incubated di hadapan 5 g/mL DAPI ( Sigma-Aldrich , USA) untuk label inti sel. Setelah pengeraman, sel-sel itu dicuci, dipasang pada kaca slide dengan 0.2 M N-propyl gallate di sekitar 90 % glycerol, dan mengamati menggunakan Zeiss Axioplan mikroskop pijar (Carl Zeiss Microscopy GmbH, ", Jerman).2.7 Pemindaian Elektron MicroscopySetelah berinteraksi dengan parasit, sel tuan rumah dipasang pada coverslips itu tetap di dalam sebuah solusi berisi 2,5 % glutaraldehyde dalam 0,1 M cacodylate buffer, pH 7,2, selama 1 jam, membasuh pada buffer, dan postfixed selama 30 menit di dalam gelap di sebuah solusi berisi 1 % osmium tetroxide dan 0.8% kalium ferrocyanide dalam sama buffer. Sel-sel itu dicuci lagi pada buffer, mengalami dehidrasi di ethanol, dan diserahkan kepada titik kritis pengeringan di CO2 menggunakan CPD 30 Baltec peralatan. Sampel ini kemudian dilapisi dengan 0.2 nm tebal layer emas dan diteliti Jeol JSM 6340 emisi scanning mikroskop elektron beroperasi pada 3- 5 kV.2.8 Transmisi Elektron MikroskopSetelah berinteraksi dengan parasit, sel tuan rumah itu tetap selama 1 jam di 4 C di sebuah solusi berisi 2,5 % glutaraldehyde dan 1.4% segar menyediakan kandungan formaldehyde di dalam 0,1 M cacodylate buffer, pH 7,2. Kemudian, sel-sel itu dicuci di dalam buffer dan postfixed selama 40 menit di dalam gelap di sebuah solusi berisi 1 % osmium tetroxide dan 0.8% kalium ferrocyanide dalam 0,1 M cacodylate buffer, pH 7,2. Sel-sel itu kemudian dibasuh dengan buffer, mengalami dehidrasi di aseton, dan tertanam dalam polyurethane intermediates dan additives resin. Bagian Tipis diperoleh dengan menggunakan ultramicrotome. Bagian yang telah dilumuri uranyl asetat dan memimpin sitrat dan diteliti dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi (Zeiss 900 atau Jeol tahun 1200 ) beroperasi pada 80 kV.

3. Hasil3.1 MCD Pengobatan dari Sel Tuan Rumah mengganggu proses InteraksiKita digunakan MCD, cyclodextrin yang oligomer glukosa yang berinteraksi dengan membran dan sequesters lipophilic molekul di dalam inti hydrophobic 13 ]. Pengobatan LLC-MARKUS2 sel dengan MCD diikuti oleh pengeraman dengan T. gondii secara signifikan penurunan () kedua paderi dan internalization indeks (Gambar 1 (a). Inhibisi itu jelas terlihat di konsentrasi 5 mM MCD, mencapai nilai tinggi seperti 70 %. Inhibisi tidak meningkatkan ketika lebih tinggi konsentrasi MCD telah digunakan. Dalam makrofag, hanya dengan sedikit inhibisi-paderi index telah dipelihara. Namun, internalization telah berkurang drastis hingga 95 % dari pengobatan dengan 5 mM MCD (Gambar 1 (b). Khususnya, pengobatan dari kedua jenis sel dengan MCD pada konsentrasi digunakan tidak signifikan terhadap kelangsungan mengganggu sel, seperti yang ditentukan dengan menggunakan Trypan biru (data tidak ditunjukkan). Pemindaian microscopy elektron dari MCD-diperlakukan makrofag mengungkapkan bahwa sel-sel menjadi lebih ditarik dan bulat. Beberapa sel dilepaskan dari permukaan kaca seperti yang jumlah sel persegi per mikrometer adalah secara signifikan menurun, seperti yang diperlihatkan pada gambar 2. Namun, yang dilepaskan sel masih layak (data tidak ditunjukkan). Parasit dipasang untuk tidak terkena sinar makrofag dipicu endocytic proses, dan membran proyeksi dipelihara di sekitar parasit selama proses internalization (Gambar 3 (a). Sebaliknya, tidak ada permukaan membran proyeksi dipelihara di sekitar parasit pada permukaan MCD-ditangani makrofag (Gambar 3 (b). Elektron Transmisi microscopy pengamatan mengkonfirmasi bahwa parasit itu tidak terkena sinar internalized oleh sel tuan rumah (Gambar 4 (satu) namun mereka tetap terpasang pada permukaan MCD-diperlakukan sel (Gambar 4 (b).

Gambar 1:T. gondii paderi dan internalization peratusan denganLLC-MARKUS2 sel (a) dan murine makrofag (b) yang diperlakukan dengan M (5, 10, dan 20 mm) selama 30 menit sebelum penambahan T. gondii tachyzoites. Angkatan syurgawi sel pretreated dan membasuh sebelumberinteraksi selama 10 menit dengan parasit (50 : 1). Data yang ditunjukkan adalah alat SE-disalin semula poin dari tiga independen percobaan. Nilai kontrol yang telah ditetapkan pada 100. Dalam LLC-MARKUS2 sel, kedua paderi dan internalization telah menghalang segala. Namun, hanya internalization dipengaruhi di makrofag.Pemindaian microscopy elektron dari MCD-gesit dan bulat. Beberapa sel dilepaskan dari permukaan kaca seperti yang jumlah sel persegi per mikrometer adalah secara signifikan menurun, seperti yang diperlihatkan pada gambar 2. Namun, yang dilepaskan sel masih layak (data tidak ditunjukkan). Parasit dipasang untuk tidak terkena sinar makrofag dipicu endocytic proses, dan membran proyeksi dipelihara di sekitar parasit selama proses internalization (gambar 3(a)). Sebaliknya, tidak ada permukaan membran proyeksi dipelihara di sekitar parasit pada permukaan MCD-diperlakukan makrofag (Gambar 3(b)). Elektron Transmisi microscopy pengamatan mengkonfirmasi bahwa parasit itu tidak terkena sinar internalized oleh sel tuan rumah. (Gambar 4 (satu) namun mereka tetap terpasang pada permukaan MCD-diperlakukan sel (Gambar 4 (b).Kita juga menganalisa variabilitas penyakit dari MCD pengobatan. Untuk percobaan ini, sel-sel awalnya diperlakukan dengan MCD selama 30 menit. Selanjutnya, beberapa budaya dibasuh dan incubated menengah di segar selama 2 jam sebelum interaksi dengan parasit. Tidak Ada variabilitas penyakit telah dipelihara dengan LLC-MARKUS2 sel (Gambar 5 (a). Namun, yang signifikan pada efek bolak-internalization parasit oleh makrofag telah dicapai (Gambar 5 (b), tetapi efek ini adalah kurang jelas untuk paderi index. Elektron Pemindaian microscopy menunjukkan bahwa pulih makrofag memiliki permukaan yang meliputi proyeksi terpasang parasit, serupa dengan apa yang dipelihara dalam kontrol (tidak diperlihatkan).

3.2 Filipin pengobatan sel tuan rumah mengganggu interaksi mereka dengan T. gondii. Filipin adalah polyenic antibiotik yang mengikat untuk kolesterol dan dengan itu mengganggu fluiditas menembus membran sel. Oleh karena itu, kami memutuskan untuk menganalisa efeknya pada T. Gondii-host interaksi sel. Pengeraman-LLLC-MARKUS2 sel di hadapan 1 atau 3 nm tetapi tidak ada 6 nm Filipin mengambil sedikit menurunkan paderi-parasit pada sel (Gambar 6 (satu) tetapi tidak mengganggu internalization. Dalam makrofag (gambar 6 (b), filipin menghalang segala kedua paderi dan internalization. Di sebuah filipin konsentrasi 6 nm, internalization adalah ditekan oleh 85 %. Dalam diuji condotions, diperlakukan sel tetap giat (data tidak ditunjukkan). Pemindaian dan transmisi elektron microscopy mengkonfirmasi pengamatan ini (data tidak ditunjukkan).

3.3 Pengobatan Sel Tuan Rumah dengan B Subunit dari kolera Toksin Menghambat Parasite-Host Interaksi Sel. Kita juga menganalisa pengaruh GM1 ganglioside pada interaksi proses. Untuk percobaan ini, sel-sel ini diperlakukan selama 30 menit di 4 C dengan subunit kolera toksin (CTB) dan kemudian diizinkan untuk berinteraksi dengan parasit pada 37 C. Pengobatan dengan CTB sangat menghalang segala paderi dan serangan LLC-MARKUS2 sel dan mencapai nilai inhibisi 80 % (Gambar 7 (a). Makrofag diperlakukan dengan CTB juga menunjukkan diubah paderi dan internalization indeks (Gambar 7 (b). Pengobatan dalam sel dengan CTB tidak mempengaruhi kelangsungan mereka (data tidak ditunjukkan).

3.4 Pengobatan dengan Lidokaina mengganggu T. Gondii-Host Interaksi Sel. Kita digunakan Lidokaina dalam percobaan kami karena ia dapat menembus membran bilayer lemak dan dapat mengganggu lemak rakit (24 ). Kita dipilih konsentrasi Lidokaina mulai dari 57,5 untuk 230 M dan incubated sel dengan Lidokaina selama 20 menit di 37 C. Setelah pengeraman, sel-sel itu dicuci di media dan diizinkan untuk berinteraksi dengan parasit. Kita onserved Lidokaina pengobatan yang lampau menghalang segala paderi dan internalization dari parasit incubated dengan LLC-MARKUS2 celss oleh hingga 90 % (Gambar 8 (a). Perlakuan yang sama campur tangan dengan jumlah yang lebih kecil dengan parasit paderi dengan makrofag, tetapi secara signifikan menghalang segala internalization (Gambar 8 (b). Sel tes kelangsungan ditunjukkan bahwa sel-sel tetap giat setelah pengeraman dengan Lidokaina (data tidak ditunjukkan).

Gambar 2: Scanning elektron dari kontrol microscopy gambar makrofag (a) secara merata di atas permukaan kaca. (B) Pengobatan dengan 20 mM MCD disebabkan makrofag untuk melepaskan diri dari kaca, meninggalkan sebuah cetak dalam coverslip (anak panah). Makrofag yang menentang perawatan lebih bulat, menyarankan penarik filopodia dan paderi-poin. Bar: 50 m.

Gambar 3: Scanning elektron microscopy gambar tidak terkena sinar makrofag (a) dan dua sebagian parasit ditanggung oleh membran proyeksi, menunjukkan bahwa mereka sedang mengalami internalization (panah). (B) Delapan parasit (panah) dapat dilihat menempel pada ini makrofag yang sebelumnya telah diperlakukan dengan 20 mM MCD.3.5. Efek Pretreating T. gondii dengan MCD, Filipin, CTB,atau Lidokaina pada Interaksi dengan sel tuan rumah. Percobaan ini dilakukan untuk menentukan apakah sama senyawa diuji di dalam angkatan surgawi membran sel juga terkena dampak domain pada permukaan T. gondii. Tabel 1 merangkum pengamatan yang dibuat dari percobaan ini. Ianya penting untuk memperhatikan bahawa efek diamati dari memperlakukan parasit tidak jelas sebagai pengobatan berikut yang diperoleh dari sel tuan rumah . Di sebagian besar dari percobaan, kami mengamati penurunan indeks internalization dengan banyak slighter efek pada indeks paderi.

PembahasanKonsep bahawa membran sel adalah lebih mosaik dari cairan dengan nonrandom distribusi lemak adalah sebuah langkah besar dalam memahami perilaku sel-sel, khususnya interaksi dengan patogen (peninjauan di 25 ] ). Dalam kondisi basal, lemak rakit di wilayah kecil dari membran. Namun, mereka dapat membentuk gugusan lebih besar dalam menanggapi rangsangan tertentu [26, 27 ]. Data diperoleh oleh beberapa kelompok dalam satu dekade terakhir telah menetapkan bahwa interaksi intraseluler patogen dan juga protozoa dengan sel tuan rumah juga membabitkan dua langkah yang ditentukan oleh: paderi dan internalization (ulasan dalam [24, 28 -30 ] ). Paderi dapat terjadi bahkan pada suhu rendah atau ketika sel tuan rumah atau sitoskeleton diblokir oleh penggunaan obat, dan partisipasi molekul yang terkena pada permukaan sel kedua berinteraksi sangat penting untuk proses ini 31 ]. Proses yang melibatkan sel internalization signaling acara diikuti oleh endositosis prokariotis [29 ], dan komposisi membran plasma dan mobilitas membran-dikaitkan molekul, yang tergantung pada fluiditas lemak bilayer dan asosiasi dengan cytoskeletal komponen, memainkan sebuah peran yang penting.

Gambar 4: Transmisi elektron microscopy gambar dari kontrol (tidak terkena sinar) makrofag (a) yang berisi dua parasit. (B) satu parasit ini dilihat menempel pada permukaan sel yang telah pretreated dengan 20 mM MCD. Membran plasma menunjukkan pola bertitik (kepala panah).

Ini adalah rakit lemak yang didirikan pada membran sel tuan rumah yang terlibat dalam internalization dari patogen dan juga protozoa seperti Leishmania 16 ], Trypanosoma cruzi [18, 19 ], Plasmodium falciparum 20 ], dan Toxoplasma gondii 21 ]. Pergerakan junction, khusus area kontak didirikan oleh Plasmodium selama invasi ke sebuah erythrocyte [ 32] dan antara Toxoplasma dan sel tuan rumah itu menyerbu ke [ 33], memilih sel tuan rakit dan protein yang akan menjadi bagian dari parasitophorous vacuole membran [ 34]. Namun, caveolin AKU, umumnya rakit-dikaitkan protein, yang dikecualikan dari parasitophorous vacuole dari T. gondii [ 33], serta flotillin-2 [35 ]. Dalam penelitian ini dengan T. gondii, kita akan terus menganalisa peran membran lipid domain, termasuk lipid rakit, dalam proses interaksi dengan menggunakan LLC-MARKUS dan murine2 sel makrofag dan pengobatan dengan beberapa inhibitors. Kita adalah hasil dilukiskan oleh elektron microscopy untuk mendapatkan informasi lebih rinci tentang pandangan parasit-host interface sel.Kita digunakan MCD, filipin, subunit kolera racun, dan Lidokaina untuk campur tangan dengan membran sel-sel tuan rumah. Berbagai pengobatan ini mempengaruhi kedua bentuk sel dan kemampuan mereka untuk taat kepada coverslips kaca. Namun, sel tidak secara signifikan terhadap kelangsungan diubah, sebagai dinilai menggunakan Trypan tes biru.

Gambar 5: variabilitas penyakit dari efek MCD. Estimasi paderi dan internalization persentase T. gondii dengan LLC-MARKUS2 sel (a) dan murine makrofag (b) diperlakukan dengan MCD (5, 10, dan 20 mM) untuk 30 min dan kemudian incubated selama 2 jam dengan 20 % octet FCS di RPMI menengah sebelum T. gondii tachyzoites ditambahkan untuk 10 menit (50 : 1). Data yang ditunjukkan adalah alat SE-disalin semula poin dari tiga independen percobaan. . Hasil ini dapat melebarkan. Variabilitas Penyakit adalah hanya memelihara dalam makrofag.

Gambar 6: Paderi dan internalization dengan peratusan (a) LLC-MARKUS2 sel dan (b) murine makrofag setelah filipin pengobatan (1, 3, dan 6 nm) untuk 30 min sebelum penambahan parasit (50 : 1) selama 10 menit. Pada 6 nm filipin, paderi-parasit ke LLC-MARKUS2 sel sedikit menurun, dan menghalang segala internalization adalah secara signifikan. Dalam makrofag, internalization adalah ditekan oleh 85 %. Data yang ditunjukkan adalah alat SE-disalin semula poin dari tiga independen percobaan. . Hasil ini dapat melebarkan.Gambar 7: Paderi dan internalization indeks dari T. gondii di LLC-MARKUS2 sel (a) dan murine makrofag (b) setelah pengobatan dengan kolera toksin-B (CTB) (0,1, 1, dan 2 g/mL) selama 20 menit di 4 C sebelum penambahan parasit (50 : 1) di 37 C selama 10 menit. Sel-sel ini kemudiannya telah cemar dan tetap. Dalam LLC-MARKUS2 sel, paderi dan internalization diturunkan di semua konsentrasi diuji, dan dalam makrofag, pengurangan secara signifikan internalization dipelihara pada konsentrasi tinggi. Parasit beban dapat dianggarkan tak kasat mata, dan data yang ditunjukkan adalah alat SE-disalin semula poin dari tiga independen percobaan. . Hasil ini dapat melebarkan.Gambar 8: Estimasi-paderi dan internalization indeks dari T. gondii di LLC-MARKUS2 sel (a) dan murine makrofag (b) pretreated dengan Lidokaina (57.5 M, 115 M, dan kecepatan 230 M) selama 20 menit sebelum tambahan dari parasit pada 37 C selama 10 menit. Dalam LLC-MARKUS2 sel, kedua paderi dan internalization diturunkan di semua konsentrasi. Dalam makrofag, secara signifikan telah dipelihara hanya untuk internalization. Parasit beban dapat dianggarkan tak kasat mata. Data yang ditunjukkan adalah alat SE-disalin semula poin dari tiga independen percobaan. . Hasil ini dapat melebarkan.MCD adalah glukosa oligomer yang sequesters lipophilic molekul dalam hydrophobic membran nuklir 13 ], dan telah digunakan secara luas untuk menipiskan kolesterol dari membran dan mencegah endocytic proses. Pengobatan sel tuan rumah dengan MCD telah ditunjukkan untuk mengurangi internalization-Leishmania 16 ], T. cruzi [18, 19 ], dan T. gondii 21 ]. Dalam plasmodium, deplesi kolesterol dari membran terinfeksi eritrosit disebabkan precocious pembebasan dari parasit, yang noninfective [ 34]. Sel darah merah habis dari kolesterol juga mencegah serangan oleh Plasmodium falciparum [ 36]. Pengamatan Kami konfirmasi hasil sebelumnya dijelaskan untuk ini dan juga protozoa, tetapi kita juga dapat menunjukkan bahwa efek-efek pengobatan bervariasi menurut sel tuan rumah digunakan. Memang, MCD pengobatan hanya sedikit campur tangan dengan paderi-T. gondii untuk makrofag; namun, ia menghalang segala paderi untuk LLC-MARKUS2 sel oleh 75 %. Efek yang sama telah dilaporkan untuk fibroblasts dan CHO sel 21 ]. Khususnya, dalam kasus T. gondii, MCD campur tangan dengan parasit citakan internalization pada konsentrasi sebagai rendah sebagai 5 mM, sementara mirip dengan efek pada T. cruzi diperoleh dengan 20 mM 19 ]. Dalam malaria parasit, juga apicomplexans, erythrocyte lemak ini direkrut rakit ke situs serbuan dan dapat remodeled oleh Plasmodium untuk membentuk darah tahap infeksi [37 ].Kita digunakan scanning dan transmisi elektron microscopy untuk menganalisis interaksi yang tidak terkena sinar dalam proses kontrol dan obat sel-sel diperlakukan. Pengamatan Kami menunjukkan dengan jelas bahwa sel tuan rumah diperlakukan dengan MCD atau dengan obat lain telah diuji parasit yang menempel pada permukaan sel, tetapi, tidak seperti yang tidak terkena sinar sel, tidak ada sel tuan proyeksi permukaan dikelilingi parasit. Oleh karena itu, mengganggu membran plasma lemak dari sel tuan rumah blok pembentukan permukaan proyeksi.Filipin adalah satu lagi senyawa yang telah digunakan untuk mengganggu membran kolesterol. Tidak seperti MCD, polyenic antibiotik ini tidak mengekstrak kolesterol tetapi sebaliknya mengikat dan bentuk filipin-sterol kompleks yang secara drastis menurunkan fluiditas membran plasma [30 ]. Filipin menghalang segala internalization-T. gondii oleh makrofag oleh hingga 85 %, tetapi ianya tidak berdampak signifikan terhadap interaksi dengan LLC parasit-MARKUS2 sel. Sebelumnya, Kami telah melaporkan bahwa filipin tersendiri efek pada paderi dan internalization-T. cruzi 19 .Kita juga diuji efek Lidokaina pada host-parasit interaksi. Lidokaina adalah anestesi lokal yang mengganggu lipid rakit tanpa mengubah membran kolesterol [ 38] dan telah ditunjukkan untuk menghambat infeksi eritrosit oleh Plasmodium falciparum oleh sekitar 90 % [ 39]. Pengobatan sel tuan rumah dengan Lidokaina perbalahan Athanesian atau menghalang segala kedua paderi dan internalization-T. gondii oleh LLC-MARKUS2 sel tetapi hanya diturunkan internalization di makrofag.Kajian yang sebelumnya telah menunjukkan bahwa memperlakukan sel tuan rumah dengan subunit kolera racun, yang dihasilkan oleh bakteri Vibrio kolera dan mengikat ke GM1 ganglioside, yang terkenal penanda lipid rakit 17 ], lampau yang diblokir internalization-T. cruzi oleh makrofag 19 ]. Efek yang sama telah dipelihara untuk kedua-dua paderi dan internalization langkah dalam interaksi T. gondii dengan LLC-MARKUS2 sel dan untuk internalization ke makrofag. Yang mengejutkan, hanya mempunyai efek yang kecil pada lampiran T. gondii makrofag ke permukaan.

Diambil bersama, data yang ada dengan jelas menunjukkan bahwa organisasi lipid rakit di dalam angkatan surgawi membran sel plasma adalah sangat penting untuk inisiasi yang mutakhir endositosis prokariotis yang membawa kepada internalization-T. gondii, bahkan ketika kolesterol hadir di dalam membran plasma. Diamati perbedaan antara paderi dan internalization indeks antara makrofag dan LLC-MARKUS2 sel dapat dijelaskan oleh sifat jenis sel-sel ini. Makrofag profesional fagosit dan internalization tidak diblokir sebagai efisien sebagai untuk LLC-MARKUS2 sel. Yang dapat disebabkan oleh kenyataan bahwa diamati internalization adalah hasil dari fagositosis, daripada aktif pencerobohan oleh parasit. Paderi indeks di sisi lain telah berkurang pada kedua jenis sel-sel, yang menunjukkan bahwa rakit gangguan ini mengurangi klirens langkah kunci dalam parasit serangan aktif dari sel tuan rumah.Kita juga dilakukan percobaan untuk menentukan apakah memperlakukan parasit yang sama dengan senyawa dibahas di atas juga campur tangan dengan proses interaksi. Kami mengamati menurun internalization di sebagian besar percobaan, tetapi mereka telah standar yang tinggi penyimpangan yang kemungkinan besar karena heterogeneity dari parasit digunakan, yang diperoleh dari peritoneum dari secara eksperimental pula terinfeksi tikus. Lebih jauh lagi, yang sangat kuat dan terus menerus pelepasan micronemes memperbaharui membran luar dari parasit. Pengamatan ini menyarankan bahwa organisasi dari lemak bilayer dari parasit juga memainkan sebuah peran dalam proses paderi dan internalization oleh sel tuan rumah. Kajian yang sebelumnya telah mengusulkan bahwa pertukaran komponen dari permukaan dari dua sel yang terlibat dalam proses interaksi terjadi [40 ].

DAFTAR PUSTAKA

http://downloads.hindawi.com/journals/bmri/2014/687835.pdf9