Predavanja Iz Klinike Hemije

Testovi Za Ispitivanje Funkcije Bubrega Prof dr Violeta DopsajFarmaceutski fakultet Univerziteta u Beogradu2009/2010

Dijagnostika Bolesti BubregaNajvanije funkcije bubrega: 1) izluivanje organizmu nepotrebnih sastojaka, 2) stvaranje urina 3) regulacija homeostaze elektrolita i vode, 4) endokrina funkcija Poremeaj u bilo kom homeostaznom mehanizmu dovodi do oteenja funkcija bubrega to moe dovesti do bolesti bubrega Klasifikacija na akutne i hronine bolesti bubrega na osnovu: anamneze i klinike slike laboratorijskih analiza i razliitih dijagnostikih postupaka (rtg, ultrazvuk, biopsija bubrega, itd)

Sasatav krvi i urina odraava ne samo razne funkcionalne bolesti bubrega nego i razne sistemske bolestiLaboratorijska procena bolesti bubrega: 1. Odreivanje koncentracije neproteinskih azotnih jedinjenja 2. Odreivanje stepena glomerularne filtracije 3. Procena kapaciteta sekrecije endogenih i egzogenih jedinjenja 4. Procena kapaciteta reapsopcije vode i elektrolita Opti laboratorijski "profil bubrega Odreivanje biohemijskih analiza u serumu Ureja, kreatinin, natrijum, kalijum, hloridi, fosfor, ukupan kalcijum, glukoza, mokrana kiselina, ukupni proteini Kompletna krvna slika sa sedimentacijom Kvalitativni rutinski pregled urina Urin je uzorak izbora za iskljuivanje i rano otkrivanje bolesti bubrega

Neproteinska azotna jedinjenja Ureja, kreatinin, kreatin, mokrana kiselina, amonijak (+ amino-kiseline)NPN (non protein nitrogen) termin nastao u ranom stadijumu razvoja klinike hemije kada je uklanjanje proteina iz uzorka pre izvoenja analize bilo obavezno (protein-free filtrate) Kvantifikacija neproteinskog azota odreivala se nakon prevoenja azota u amonijak, a zatim u Nessler-ovoj reakciji uto obojenje UREJA Ureja je glavni metaboliki proizvod katabolizma proteina (75% NPN) Nakon sinteze u jetri putem krvi dospeva do bubrega gde se filtrira u glomerulima, 40-70% ureje se reapsorbuje pasivnom difuzijom u tubulima, to zavisi od brzine protoka urina i hidratacije. 10% se izluuje preko GIT i koe

Krebs-Henseleit ciklus sinteze ureje u jetri iz NH3NH4+ + CO2 karbamil-fosfat-sintetaza N-acetil glutaminska kis (koenzim) 2 ATP ornitin-karbamil transferaza KARBAMIL-FOSFAT + ORNITIN sintetaza argininilibarne kiseline CITRULIN + ASPARAGINSKA KISELINA ARGININ-ILIBARNA KISELINA ARGININ ORNITIN + KARBAMIL-FOSFAT SUMARNA REAKCIJA NH3 + iz glutaminske kis NH3 + HCO3iz asparaginske kis 3 ATP UREJA + 2 H2O IZOUREJA ARGININ-ILIBARNA KISELINA ATP, arginin-sukcinat dehidrogenaza arginaza UREJA + ORNITIN UREJA ARGININ + FUMARNA KISELINA CITRULIN KARBAMIL-FOSFAT

Ureja, AzotemijeKoncentracija ureje u serumu odreena je koliinom proteina u ishrani, katabolikim stanjem organizma, i funkcijom i perfuzijom bubrega BUN (blood urea nitrogen) stari naziv, Urea nitrogen (ispravan naziv) Azotemija poviena koncentracija ureje u krvi Uremija (uremijski sindrom) veoma visoke koncentracije ureje u krvi kod bolesti bubrega Prerenalna azotemija izazvana je smanjenim protokom krvi kroz bubrege, manje krvi je u bubrezima, pa se manje ureje filtrira Uzroci: kongestivna srana insuficijencija, hemoragija, dehidratacija, ok, visokoproteinska ishrana, povean katabolizam proteina (groznica, stres, terapija kortikosteroidima, GIT hemoragije), i drugi faktori koji znaajno smanjuju volumen krvi

AzotemijePostrenalna azotemija nastaje kada postoji obstrukcija za isticanje urina kroz mokranu beiku ili uretru (nefrolitijaza, prostatizam, tumori genitourinarnog trakta), ili jaka infekcija. Vei porast ureje u serumu od kreatinina zbog pritiska urina na tubul i difuzije preostale ureje iz tubula u krv Sniena koncentracija ureje u krvi u periodu snienog unosa proteina ishranom, poveana sinteza proteina (u kasnoj trudnoi i ranom detinjstvu), teka oboljenja jetre

Razlikovanje azotemijaNormalan odnos serumske koncentracije ureje i kreatinina Ureja/Kreatinin indeks = 10:1 do 20:1 Prerenalna azotemija poviena koncentracja serumske ureje, kreatinin normalan Povien ureja/kreatinin indeks Postrenalna azotemija Povien ureja/kreatinin indeks sa povienim serumskim kreatininom Snien ureja/kreatinin indeks kod smanjene sinteze ureje (smanjen unos protena, akutna tubulska nekroza, teka bolest jetre)

Uzroci abnormalne koncentracija ureje u krviUzroci poviene koncentracija ureje u krvi Prerenalni: kongestivna srana oboljenja, ok, hemoragija, povean katabolizam proteina, dehidratacija, terapija kortikosteroidima Renalni: Akutne i hronine bubrene bolesti, glomerulonefritis Postrenalni: Obstrukcija u urinarnom traktu Uzroci sniene koncentracije ureje u krvi Smanjen unos proteina hranom, teka bolest jetre, intenzivno povraanje i diareja, trudnoa

Odreivanje UrejeSerum (najee se koristi), urin, plazma Uzeti u obzir uticaj visokoproteinskog unosa proteina hranom (ne koristiti uzorak nakon unoenja hrane) Preporuuje se nehemolizovani uzorak Ureja se razlae pod uticajem bakterija u urinu, pa se uzorak urina treba uvati u friideru, i podesiti pH0,5 mmol/l) i piruvata (>0,9 mmol/l) Adsorbovani kreatinin eluira se alkalnim pikratom 3. Jaffe/kinetika metoda, najvie se koristi u rutini, jeftina, brza

Kinetika Reakcija Na AutomatuMikroprocesor omoguava merenje apsorbancije u toku perioda od 16 do 120 sec Reakcionim vremenom uklonjen uticaj brzih i sporih hromogena Brzi nekreatinski hromogeni reaguju u toku prvih 20 sec od dodavanja reagensa Spori nekreatininski hromogeni reaguju posle 80 sec Vreme od 20-80 sec pripisuje se stvaranju kreatinin kompleksa keto kiseline i cefalosorini se ne mogu ukloniti iz reakcije i poveavaju rezultat Nije potrebna deproteinizacija jer u kinetikoj reakciji proteini kao spori hromogeni ne utiu na rezultat

4. 3,5-dinitrobenzoeva kiselina (DNBA)OHKREATININ + DNBA KOMPLEKS (PURPURNO ROZE BOJE) NA 560 nm

Suva hemija (refleksiona spektrofotometrija), samo serum Nema interferenata, ali boja nije stabilna kao sa pikratom 5. Kratinin-amidohidrolaza (kratinaza, kreatinin hidrolaza)KREATININ-AMIDOHIDROLAZA KREATININ + H2O CK KREATIN-FOSFAT + ADP PIRUVAT-KINAZA ADP + FOSFOENOLPIRUVAT ATP + PIRUVAT LDH + PIRUVAT NADH + H NAD+ + LAKTAT KREATIN + ATP KREATIN

Samo serum, bez ire primene 6. Kreatinin-iminohidrolaza (kreatinin deaminaza)KREATININ-IMINOHIDROLAZA KREATININ NH3: GLDH, amonijanom N-METILHIDANTOIN + NH3

elektrodom, kolorimetrijski-korigovati za endogeni NH3

Kodak-Ectachem slajd tehnologija (bromfenol plavo na 670nm) Samo serum, treba odrediti serumski NH3 7. Kreatinin-amidohidrolazaKREATININ-AMIDOHIDROLAZA KREATIN KREATININ + H2O KREATININ-AMIDOHIDROLAZA KREATIN + H2O SARKOZIN + UREA SARKOZIN-OKSIDAZA GLICIN + FORMALDEHID + H2O2 SARKOZIN + O2 PEROKSIDAZA H2O2 + BOJA OKSIDOVANI HROMOFOR + H2O

Druga generacija Kodak sistema (bez iminohidrolaze) Serum, urin 8. HPLC (posle eluacije u Jaffe reakciji ili na 200 nm) 9. HPLC i gasna hromatografija Masena spektrometrija je visoko specifina i referentna-definitivna metoda za kreatinin17

Za odreivanje kreatinina moe se koristiti

Serum, plazma, 7 dana na 4 C Ne koristiti ikterine i hemolizovane uzorke, smanjuju rezultat Urin (razblaenje do konc. kreatinina od 300 do 600 mol/L) 2-3 dana na 25 C, 5 dana na 4 C Referentne vrednosti Zbog vee mogunosti sluajne greke navesti metodu i standardno odstupanje metode (do 15 mol/L) Primena razliitih metoda dovodi do razlika 10-25 mol/L Serum, Jaffe metod: mukarci 53 - 106 mol/L; ene 44 - 97 mol/L Urin/24 h: mukarci I7.1 17.7 mmol/L; ene 5.3 15.9 mmol/L

GFR (eng. glomerular filtration rate) Stepen glomerularne filtracijeGFR (eng. glomerular filtration rate) Stepen glomerularne filtracije predstavlja volumen plazme koja se filtrira u glomerulima u jedinici vremena Odreuje se indirektno merenjem ekskrecije supstance u urinu koja se filtrira u glomerulima, u tubulima se ne reapsorbuje i ne sekretuje, tj potpuno se izluuje urinom GFR = V/t V = Ms/Cs (Ms-masa filtrirane supstance, Cs-koncentracija u serumu) Ms = Us x Vu (Vu-volumen urina, Us-koncentracija u urinu) GFR (mL/min) =Curin x Vurin Cserum x t

t vreme sakupljanja urina (min)

KLIRENS TESTOVI(eng: clearance-ienje) Klirens supstance predstavlja volumen plazme iz koje je supstanca uklonjena u jedinici vremena Odreivanje klirensa supstance predstavlja merenje ekskrecije supstance u urinu koja se kompletno filtrira iz krvi u glomerulima, ne sekretuje se, ne reapsorbuje i ne metabolizuje u tubulima bubrega Ove osobine imaju inulin, ureja, kreatinin Klirens testovi slue za procenu GFR Klirens inulina Inulin je polisaharid MM 51kDa, nije fizioloka supstanca (nema ga normalno u krvi) Inulin se potpuno filtrira u glomerulima a ne reapsorbije u tubulima

KLIRENS INULINA I UREJE25 mL 10% inulina se aplikuje se intravenski a zatim se nastavlja davanje 500 mL 1.5% rastvora, brzinom 4 mL/min Klirens inulina zavisi samo od volumena glomerularnog filtrata (120-130 mL/min) p-aminohipurat se koristio za odreivanje glomerularne filtracije i tubularne sekrecije Korienje ovih supstanci za klirens je skupo, dugo traje, teko za aplikaciju, vie se ne koriste Klirens ureje Prvi klirens test koji se danas se vie ne koristi zbog osobine ureje da se oko 40% reapsorbuje u tubulima Danas se koristi samo klirens kreatinina

KLIRENS KREATININASerumski kreatinin i ekskrecija u urinu funkcija su miine mase i ne zavise od unosa proteina i elektrolita Kreatinin se ne reapsorbuje u tubulima, ali se 7-10 % sekretuje u tubulima, to je veoma vano kada je < 10 mL/min, jer je vrednost lano uveana Koncentracija kreatinina u serumu znaajno raste tek kada je glomerularna filtracija na 50% normalne vrednosti Koncentracija kreatinina u krvi je indirektno proporcionalna klirensu kreatinina, tj koncentracija kreatinina u krvi raste dok GFR opada kod bolesti bubrega Ref

23

KLIRENS KREATININAIzraunavanje klirensa kreatinina je standardni metod za odreivanje GFR Klirens Cr =koncentracija kreatinina (urin) x zapremina urina (mL/24h) x 1.73 koncentracija kreatina (serum) x t (1440 min/24h) A

1.73 prosena povrina tela (m2) A aktuelna povrina tela izraunata iz visine i teine log A = (0.425 log W) + (0.725 log H) 2.144 W-telesna masa u kg, H-telesna visina u cm (Izraunavanje iz nomograma za odreivanje povrine tela)

Zbog naina izvoenja ukupan koeficijent varijacije 10% (idealno) jer se 2 puta odreuje kreatinin (serum+urin) i merenja diureze, ali moe biti vei 2-3 puta kod nemotivisanih pacijenata CV iz dana u dan za ponavljajua odreivanja ak 25%

Klirens Kreatinina: interferencijeKlirens kreatinina pod uticajem je razliitih biolokih i analitikih faktora (analitiki postupak, tubularna sekrecija kreatinina, miina masa, sakupljanje urina, lipemija, ikterus, hemoliza itd) Lekovi koji interferiraju sa tubularnom sekrecijom kreatinina: salicilati, cimetidin, trimetoprim, spirinolakton, amilorid (klirens kreatinina je lano nizak a GFR ostaje normalna) Supstance koje lano poveavaju serumski kreatinin (do 20%): glukoza, askorbinska kiselina, mokrana kiselina, acetoacetat, cefalosporini Kreatinin klirens se smanjuje sa godinama (6.5 mL/min za svaku dekadu ivota, posle 20-god) Referentne vrednosti za klirens kreatinina Mukarci: 97 137 mL/min (na 1.73 m2) ene: 88 - 128 mL/min (na 1.73 m2)

Kako prevazii greke u odreivanju klirensa kreatinina?Vie od 25 formula ukljuilo je kreatinin u serumu, telesnu masu, pol, starost i rasu u izraunavanje klirensa

1. CockroftGaultova formulaPredikcija klirensa kreatinina za odrasle Klirens kreatinina (mL/min) = 140 starost (godine) x telesna masa (kg) 0.814 x Ckreatinin (serum) (mol/L) Za ene korekcioni faktor 0.85 (15% manja TM u proseku) Od velike vanosti zbog doziranja lekova (na pr aminoglikozidi)

eGFR (eng, estimated glomerular filtration rate) 2. MDRD formula (Modification of Diet in Renal Disease)GFR(mL/min/1.73m2)=186 x x (kreatinin serum (mol/L) x 0.011312)-1.154 x (godine ivota)-0.203 x 0.742 (za ene) i x 1.212 (za crnu rasu) Formula se aplikuje na raunar i izraunava automatski iz kreatinina u serumu i godina ivota pacijenta Rezultati se izraavaju kao: eGFR60 mL/min/1.73m2 Vrednosti eGFR ispod 60 mL/min upuuje na sakupljanje 24h urina i standardno odreivanje klirensa kreatinina 5 stadijuma hronine bubrene insuficijencije: 1.GFR>90 ml/min; 2.GFR izmeu 60-89 ml/min; 3.GFR izmeu 30-50 ml/min; 4.GFR izmeu 15-29 ml/min; i 5.GFR 420 mol/L, ene > 360 mol/L Poveanje koncentracije dovodi do taloenja slobodne MK ili njenih soli: - u zglobovima (uriki artritis, giht) - u bubrezima (uriki bubreg) - obrazovanje konkremenata Uzroci za pojavu hiperurikemije: - poveana biosinteza mokrane kiseline - smanjeno izluivanje mokrane kiseline putem bubrega

Izluivanje mokrane kiseline

Sekundarna hiperurikemijaSmanjeno renalno izluivanje mokrane kiseline 1. Hronine bolesti bubrega - poremeena tubularna sekrecija mokrane kiseline 2. Acidoza (laktatna, ketoacidoza) - mlena kiselina i ketokiseline kompetiraju sa mokranom kiselinom za transportni sistem za izluivanje mokrane kiseline u tubulima 3. Poveana koncentracija alkohola u krvi poveava se koncentracija laktata 4. Uticaj lekova: diuretici (tiazid, furosemid), salicilna kiselina, tuberkulostatici (pirazinamid, izonijazid) - inhibiraju renalno izluivanje mokrane kiseline 5. Trovanja (olovo, berilijum)

PROTEINURIJE proteini u urinuPodela na osnovu mehanizma koji dovode do pozitivnog nalaza Funkcionalne Proteinurije fiziko vebanje trudnoa ortostatska proteinurija (15-20 % zdravih mukaraca) Organske proteinurije udruene sa drugim bolestima i bolestima bubrega Glomerulske proteinurije: > 3 g/ 24 h Nefrotski sindrom, uglavnom albumin u urinu i hipoalbuminemija Tubulske proteinurije (1 3 g/24 h) 2-, 1-, mikroglobulin

Kvantitativno ispitivanje propustljivosti glomerulske membraneMolekuli velike MM ne prolaze kroz glomerulski fileter,dok se molekuli male MM slobodno filtriraju u glomerulima a zatim reapsorbuju i katabolizuju u tubulskim elijama Pojava znaajne koliine proteina u urinu ima veliki kiniki znaaj i ukazuje na renalno oboljenje Klasifikacija proteinurija na: glomerulske tubulske overflow( Bence-Jones proteini, mioglobinurija) filtracija velike koliine proteina male MM koji se pojaano stvaraju zbog patolokog procesa ne mogu se reapsorbovati zbog ogranienog kapaciteta reapsorpcije u tubulima

Tamm-horsfall protein je mukoprotein velike MM, sekretuje se u distalnim tubulima i sabirnim cevicama, izluuje se 40 mg/24h

Prerenalne Proteinurije

Groznica i toksina stanja (najea, jednostavne etiologije) Venska kongestija kod oboljenja srca (najee zbog intraabdominalne kompresije renalnih vena) Renalna hipoksija kod dehidratacije, oka, teke acidoze, akutne dekompenzacije srca, jake anemije Smanjen protok krvi kroz bubrege to dovodi do hipoksinih renalnih promena i tubulske nekroze bubrega Hipertenzija (umerena i jaka hronina hipertenzija, maligna hipertenzija, eklampsija) Miksedem Bence - Jones proteini

Bence-jones ProteinurujaParaproteini koji nastaju usled greke u sintezi lakih i tekih lanaca imunoglobulina, male MM, izluuju se urinom i uz normalnu glomerularnu filtraciju, kao "overflow" zbog pojaane sinteze Paraproteinemije se javljaju kod: 1. Multiplog mijeloma 2. Krio i makro - globulinemija 3. Benigne monoklonske gamapatije (benigna proliferacija B limfocita) Prisustvo BJ proteina u urinu, koji su laki lanci paraproteina MM 22 kDa, indikacija su prisustva mijeloma (u oko 20% sluajeva) Ekskrecija BJ proteina (nekoliko grama dnevno) moe dovesti do degeneracije tubularnih elija zbog reapsorpcije velike koliine proteina, i nastanka mijelomskog bubrega i nefrotskog sindroma

Kvalitativni testovi za dokazivanje prisustva BJ proteina u urinu obuhvataju klasini test zagrevanja i Bradshaw test Pozitivan kvalitativan test osnov je za izvoenje elektroforeze proteina iz koncentrovanog urina i imunofiksacije Kvantifikacija ekskrecije BJ proteina radi se samo kod pacijenata kod kojih je dokazano prisustvo lakih lanaca, tj kod multiplog mijeloma Renalne Proteinurije Primarna oboljenja bubrega Glomerulonefritis Nefrotski sindrom, primarni i sekundarni Destrukcija renalnog parenhima: tumor, infekcija, infarkt Postrenalne proteinurije - proteini se pojavljuju urinu nakon to urin proe bubrege, esto udruene sa hematurijom Infekcije bubrene karlice ili uretera Cistitis Uretritis ili prostatistis

Ispitivanje proteinurijaPozitivan nalaz proteina iz prvog jutarnjeg urina dobijen test trakama potvruje se testom sa sulfosalicilnom kiselinom Nakon potvrenih pozitivnih proteina u urinu (kvalitativan test) radi se kvantifikacija proteina u urinu odreivanjem proteina iz 24h urina ili indeks proteini/kreatinin iz jutarnjeg urina (odrediti i ukupne proteine u serumu) Pre daljeg ispitivanja funkcije bubrega treba iskljuiti: ektrarenalne uzroke proteinurije (groznica, poviena tel. temp., jako fiziko vebanje) ortostatsku proteinuriju Proteinurija dokazana kvantitativnim testom indikacija je za ultrazvuk bubrega i opte biohemijske testove za ispitivanje renalne funkcije

Ukoliko su rezultati normalni, a proteinurija je manja od 0.5 g/24h nema potrebe za dalje isitivanje, pacijent se dalje samo prati Proteinurija vea od 0.5 g/24h uz abnormalne rezultate biohemijskih testova zahteva dalje ispitivanje (odrediti tip proteinurije) Tip proteinurije moe se odrediti elektroforezom iz koncentrovanog uzorka urina: Tubulska proteinurija ima dominantno proteine male MM koji su filtrirani ali se ne mogu reapsorbovati Paraproteini i BJ proteini Glomerulska proteinurija Proteinurija vea od 2 g/24h je uvek patoloka i najee ukazuje na glomerulsko oboljenje Biopsija bubraga je zlatni standard

Ispitivanje funkcije tubulaRee se izvode od testova za ispitivanje funkcije glomerula Pojava glukozurije sa normalnom koncentracijom glukoze u krvi kod: Renalne glukozurije (izolovano oteenje proksimalnih tubula) Fankonijev sindrom (nasledno generalizovano oteenje tubula) Test reapsorpcije bikarbonata u proksimalnim tubulima (kod sumnje na proksimalnu renalnu tubularnu acidozu) Test ei za ispitivanje distalnih tubula (sposobnost koncentrovanja urina) Test acidifikacije (distalna renalna tubularna acidoza) Aminoacidurija (hromatografija)

Test koncentrisanja urina-test eiZa ispitivanje sposobnosti distalnih tubula da koncentriu urin 15 sati pre testa pacijent relativno miruje i ne unosi tenost, jede suvu hranu bez sveeg voa i povra Ujutru, sakupljaju se 3 uzorka urina na svakih sat vremena U uslovima dehidratacije kod zdravih, maksimalna je sekrecija ADH, osmolalnost urina je 3x vea od osmolalnosti plazme (286 mOsm/kg) Bar u jednom uzorku urina kod zdravih relativna gustina u mora biti 1.025 (850 mOsm/kg) Kod smanjene renalne funkcije 5.8 2. pH krvi normalan Oralno davanje 0.1 g/kg TM NH4Cl Merenje pH urina na sat vremena 4-8h (na pH-metru):

Ako je pH > 5.4 u svim odreivanjima

Dg: Tip1 RTA

Ostali Testovi Za Ispitivanje Funkcije TubulaEkskrecija elektrolita Urin: Na: 30 90 mmol/L, Cl: 30 100 mmol/L Vrednosti koje se razlikuju za 15 mmol/l iznad ili ispod prikaznih mogu ukazivati na smanjenu sposobnost reapsorpcije ili ekskrecije 2 mikroglobulin u serumu MM 11.8 kDa niske koncentracije u plazmi Kompletno se filtrira u glomerulima, reapsorbuje i katabolizuje u proksimalnim tubulima Ne zavisi od ishrane i telesne mase kod zdravih Dobar je marker GFR, ali se poveava u inflamaciji i malignitetu Ekskrecija 2-mikroglobulina je osetljiv metod za ispitivanje integriteta tubula Cistatin C u serumu MM13 kDa, ne menja se u inflamaciji i malignitetu, danas se preporuuje kao marker praenja GFR kod hronine bubrene insuficijencije Enzimi u urinu Intravenski pijelogram