tesis para optar por el título de licenciada en ciencias

Universidad Central “Martha Abreu” de Las Villas.

Facultad de Química-Farmacia.

Departamento de Farmacia.

Tesis para optar por el título de

Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.

“Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos

de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”

Autora: Yileimys Cárdenas Expósito.

Tutores: MSc. Edisleidy Águila Jiménez.

MSc. Nancy Bernal Pérez.

Santa Clara.

2009.

Dedicatoria

Yileimys Cárdenas Expósito _ _ ____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”

A mi mamá, por estar siempre a mi lado y enseñarme el camino correcto,

por su paciencia, comprensión y dedicación. Por su infinito amor, por ser mi

más valioso tesoro, mi luz y mí guía y porque sin ella no hubiese sido posible

realizar este sueño.

A mi esposo, por ser el hombre más maravilloso que he conocido, por ser

mi amigo, mi esposo y amante, por toda su dedicación y paciencia para

conmigo, por estar siempre a mi lado y compartir mis alegrías y tristezas, por

respetarme, amarme y cuidarme, a ti amor mío dedico parte de este trabajo.

A mis queridos abuelitos, por ser muy importantes para mi felicidad y

por su inmensa colaboración.

Agradecimientos


A mis tutoras Nancy y Edisleidys, por su ayuda desinteresada, dedicación,

comprensión, por brindarme su amistad y sobre todo por tenerme mucha

paciencia, se que sin ellas no hubiera sido posible la realización de este trabajo

por todo esto y mucho más les estaré eternamente agradecida.

A mi familia, que a lo largo de este camino nunca me abandonaron.

- A mis primos Oelvis y Laraine por ser un verdadero ejemplo a seguir, por

todos los consejos que a lo largo de mi carrera me dieron, por brindarme su

mano y guiarme por el camino correcto y por todo lo que para mí representan.

- A mi madre, porque gracias a su sacrificio me he convertido en la persona que

hoy soy.

- A mi padre, por poder contar con el para todo lo que he necesitado.

- A mi abuela y abuelo por su amor, cariño y todos sus esfuerzos para que hoy

se cumpliera este sueño.

- A mi tía Milagro y Miao, por su gran preocupación a lo largo de toda mi

carrera, por su infinita colaboración y su gran cariño.

- A Vicentino y Magda, por su apoyo, cariño y amor.

Y quiero agradecer en especial a una persona que aunque no lleva mi sangre

siempre formará parte de mi familia.

- A Wayny, por su inmenso amor y cariño, por su preocupación, por brindarme

su apoyo y amistad en todo momento y por lo mucho que para mí significa.

Agradecimientos


A mis amistades, Annileidys, Dianne, Yainy, Yeilin, Dayana, Tamara, por estar

siempre pendientes de mis estudios, a Cabeza, Odalys, Guallito y Evelin, por

preocuparse por mí y aportar su granito de arena para la realización de este

trabajo.

A todos mis compañeros que de una forma u otra me ayudaron a realizar este

sueño, a Grey, Anita, Urbano, Onelys, Yusmilany, Yadira.

A mis profesores, Elisa, Luis Torres, Daimi y en especial a Mirtha Mayra, por

toda su ayuda, dedicación, confianza y comprensión, por estrecharme su mano

siempre que la necesite, por todos los consejos que me dió y ser para mi como una

madre más.

A todos, muchas gracias.

Yileimys.

Resumen


Se ha demostrado que la evaluación de la contaminación mediante la utilización de

bioensayos de toxicidad es una herramienta imprescindible en la valoración de los

potenciales efectos sobre los organismos en diversos ecosistemas, lo que ha

llevado a la incorporación de estos en el biomonitoreo de los residuos de sustancias

químicas de origen natural o sintético que son vertidas al medio sin tratamiento. En

el presente trabajo se aborda la evaluación del efecto de los extractos acuosos de

Nicotiana acuminata, piper y Crotalaria juncea producidos a mediana y gran escala

en el laboratorio de formulación de la Facultad de Química- Farmacia de la

Universidad Central Martha Abreu de las Villas utilizando el ensayo de inhibición de

la germinación y la elongación de las raíces de semillas de Raphanus sativus

(rábano), Lactuca sativa L (lechuga) y Lycopersicon esculentum ( tomate). Se

demostró al concluir el trabajo que la lechuga resultó la especie más sensible para

este tipo de estudio. Los extractos pueden ser vertidos al medio a concentraciones

menores que 0.01 % con un margen de seguridad que no van a afectar los procesos

de germinación y elongación de las raíces. Se determinó que se puede emplear el

ensayo solo utilizando las semillas de lechuga como especie de ensayo.

Índice.

Yileimys Cárdenas Expósito __ _____________________________________ “Estudios de estabilidad del aceite obtenido de las semillas de Cucurbita moschata Duch.”

INDICE.

Introducción. 1

CAPÍTULO I. Revisión bibliográfica. 4

1.1. Ecotoxicología. Generalidades. 5

1.1.1. Estudios acuáticos y terrestres. 5

1.1.2. Evaluación del riesgo ambiental. 5

1.2. Evaluación ecotoxicológica de Cuba. 6

1.3. Características de los compuestos ecotóxicos. 7

1.3.1. Actuación de los compuestos ecotóxicos en el medio ambiente. 7

1.4. Influencia de residuales naturales en el medio ambiente. 9

1.5. Ensayos de toxicidad. 11

1.5.1. Bioensayos de toxicidad. 12

1.5.2. Ensayos ecotoxicológicos en medio terrestre. 13

1.6. Consideraciones generales sobre el uso de las plantas medicinales. 16

CAPÍTULO II. Materiales y métodos. 18

2.1. Preparación de los extractos vegetales. 18

2.2. Materiales y reactivos. 18

2.3. Obtención, control y conservación de las semillas. 19

2.4. Procedimiento experimental. 19

2.4.1. Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad 20

2.5 Expresión de los resultados 21

2.5.1. Interpretación de los resultados. 21

CAPÍTULO III. Resultados y discusión. 23

3.1 Efecto de los extractos sobre la inhibición de la germinación. 23

3.2 Resultados del efecto de los extractos sobre la inhibición de la elongación de las raíces.

25

Conclusiones. 33

Recomendaciones. 34

Bibliografía. 35

Introducción 1

Yileimys Cárdenas Expósito __ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”

INTRODUCCIÓN

La ecotoxicología, disciplina científica relativamente joven, desarrollada a partir de

la toxicología y la química medioambiental comprende el estudio del destino y

efecto de agentes tóxicos en los ecosistemas incluyendo además el estudio de los

efectos tóxicos a nivel celular, individual, poblacional y comunitario. Integra varias

disciplinas, dentro de las más importantes se encuentran: la biogeoquímica

ambiental, toxicología y ecología, tratando de dilucidar los mecanismos, procesos

y respuestas, versando sobre las interacciones entre los organismos, los agentes

tóxicos y el medio ambiente.

Durante las últimas décadas la comunidad científica y reguladora se ha dado

cuenta gradualmente que se deben considerar metodologías biológicas que

incluyan una batería de ensayos con especies de los diferentes niveles tróficos en

las cuales se encuentran varias especies de: bacterias; algas azul verdosas;

levaduras; hongos; protistas flagelados y ciliados; algas microscópicas; plantas;

celenterados; nemátodos; rotíferos; lombrices de tierra; moluscos; crustáceos;

insectos; erizos de mar; peces; ranas y; mamíferos (ratones, ratas, cobayos,

conejos y otros).

Actualmente en esta rama de la toxicología son empleados los bioensayos

ecotoxicológicos que proporcionan información para la evaluación del riesgo e

investigan los efectos y mecanismos de acción de nuevas sustancias químicas.

Las alternativas más prometedoras en ecotoxicología abarcan la utilización de

unos pocos organismos con sensibilidad limitada y/o que no están protegidos por

la legislación. Estos incluyen bacterias, hongos, algas, plantas y animales

invertebrados. Sin embargo, hay autores que indican la necesidad de combinar

estos ensayos ecotoxicológicos con los químicos para evaluar dicha toxicidad

potencial y establecer su naturaleza (Repetto y col., 2001), (Bellas y col., 2005).

Lo cual nos pone ante la necesidad de establecer un balance entre los análisis

químicos, biológicos, toxicológicos y microbiológicos los cuales constituyen la

mejor estrategia para generar una base de información más amplia sobre los

peligros ambientales de estos contaminantes. La necesidad de la introducción de

Introducción 2


estas pruebas biológicas ha sido frenada por el problema de los costos asociados

con las pruebas ecotoxicológicas, especialmente las empleadas para el control

rutinario y monitoreo de los niveles de contaminantes. Uno de los aspectos que

han contribuido a este freno es el número restringido de laboratorios

especializados y los altos costos de cultivo y mantenimiento continuo de “stocks”

de organismos vivos para los ensayos. Intensas investigaciones se han llevado a

cabo en las últimas dos décadas en numerosos laboratorios para desarrollar

microbioensayos alternativos para permitir el empleo de pruebas rutinarias de

bajo costo, y con equipo y materiales básicos de laboratorio.

Entre las determinaciones que se pueden efectuar con los bioensayos se pueden

mencionar las siguientes: evaluación de reducción de toxicidad (p.ej., en plantas

de tratamiento), dosis/concentración letal/efectiva/inhibitoria media (p.ej., DL50,

CE50, CI50; en toxicidad aguda y crónica), dosis/concentración mínima inhibitoria,

concentración sin efecto observado, riesgo ecotoxicológico de aguas naturales,

efluentes y otras matrices , potencial de eutroficación de aguas naturales o de

efluentes líquidos.

La diversidad de organismos que se encuentran en la naturaleza se refleja en la

variedad de procesos metabólicos y compuestos químicos de los cuales depende

la vida en sus diferentes niveles de expresión, desde bacterias a plantas y

animales superiores. Una sustancia con propiedades tóxicas puede serlo para un

tipo de organismo pero no para otro, dependiendo con que compuestos de la

célula interactúa. Por ello, se considera que tres es el mínimo de especies con las

cuales se debe evaluar la toxicidad de una muestra, incluyendo representantes de

organismos fotosintéticos (microalgas) y animales de dos niveles de complejidad,

un invertebrado como el crustáceo (pulga de agua) Daphnia y un vertebrado como

alguna especie de pez.

En términos de toxicidad deberá evaluarse la toxicidad aguda y la toxicidad

crónica. De la misma manera, se puede evaluar la toxicidad de muestras de

efluentes líquidos antes de su descarga, en términos de toxicidad crónica. Estos

bioensayos intentan obtener información, a partir de la determinación de variables

que se vean afectadas por una exposición prolongada a concentraciones o

Introducción 3


diluciones (volumen/volumen) relativamente bajas, de manera que produzcan

efectos sub-letales.

En nuestro marco y aprovechando la experiencia adquirida en la rama de la

toxicología preclínica en la evaluación de nuevos principios activos y productos de

origen natural o sintético y ahora como miembros de la Red Nacional de

Ecotoxicología nos hemos dado a la tarea de incorporar paulatinamente una serie

de ensayos para la evaluación de nuevos productos con fines de registro y de las

aguas residuales de los laboratorios de producción existentes en el recinto

universitario como un indicador de seguridad ecotoxicológica de estos al ser

vertidos, para contribuir en gran medida al desarrollo de una política medio

ambiental consecuente con el cuidado y protección del medio ambiente nos

hemos propuesto abordar la realización del monitoreo de las producciones del

laboratorio de Tecnologia Farmaceutica perteneciente al Departamento de

Farmacia de la Facultad de Química- Farmacia de la Universidad Central Martha

Abreu de las Villas, para lo cual se ha diseñado el siguiente sistema de objetivos:

Objetivo general:

Evaluar ecotoxicológicamente tres extractos acuosos producidos en la

Facultad de Química – Farmacia de la Universidad Central Marta Abreu de

las Villas utilizando los ensayos de inhibición de la germinación y

elongación de la raíz en plantas de rábano, lechuga y tomate.

Objetivos específicos:

Determinar la Concentración letal media (CI 50) de los extractos sobre la

germinación de las raíces de semillas de plantas.

Determinar la Concentración efectiva media (CI 50) de los extractos sobre

la elongación de las raíces de semillas de plantas.

Determinar la especie más sensible en estos ensayos.

Revisión Bibliográfica 4

Yileimys Cárdenas Expósito _ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”

CAPÍTULO I. REVISION BIBLIOGRÁFICA.

1.1 Ecotoxicología. Generalidades.

La Ecotoxicología es la ciencia que se encarga del estudio de los efectos de las

sustancias químicas xenobióticas sobre la estructura y función de los ecosistemas

considerados de forma integrada, para lo que resulta indispensable el análisis de los

efectos a nivel individual y poblacional. Existen dos tipos de ecotoxicología, la

prospectiva que evalúa la toxicidad de las sustancias antes de su producción y uso y

la retrospectiva que se ocupa de confirmar si la sustancia produce daños en el

ecosistema.El principal objetivo de la aplicación de las investigaciones

ecotoxicológicas es la elucidación de indicadores de toxicidad que serán utilizadas

para la evaluación de los riesgos que pueda implicar la liberación al ambiente de

productos químicos potencialmente peligrosos (Burger J., 2000).

En la actualidad se han diseñados modelos de ecosistemas para todos los

ambientes (acuático, terrestre, aéreo y sus combinaciones) y el éxito de las

evaluaciones de Seguridad Ambiental de un producto o vertido estriba en escoger el

modelo adecuado, crear condiciones similares a las naturales, y utilizar especies

naturalmente afectadas o de alta sensibilidad. El principio fundamental de la

ecotoxicología es que los organismos vivos son herramientas esenciales para la

evaluación de la calidad ambiental, puesto que ellos son los que están expuestos a

los efectos combinados de la ecotoxicidad (Ronco A., 2002)

Pero hoy, en la etapa más rigurosamente contemporánea, se ha desarrollado un

nuevo aspecto. El paso de cantidades importantes, de tóxicos en el medio. Hay tres

factores que complican y confieren gravedad a este tema. De un lado la gran

cantidad de sustancias: todos los productos utilizados en la industria. De otro las

cantidades masivas de algunos productos, miles de toneladas en la extensión de la

tierra, por ejemplo el plomo, el mercurio o los plaguicidas. En tercer lugar que los

posibles afectados somos todos. La totalidad de la población está expuesta a los

efectos de los contaminantes, tanto las personas en correcto estado de salud como

quienes, por su patología previa, son mucho más vulnerables a la acción de un

tóxico. Y además de una manera involuntaria, pasiva y sin conocimiento concreto

del riesgo. Así se valoran ya los incrementos claros de la mortalidad por la patología



respiratoria coincidiendo con episodios puntuales de aumento de gases de origen

doméstico o industrial en la atmósfera (Kooi BW., 2008).

El fenómeno de la contaminación ha pasado a tener una importancia sanitaria de

primer orden. La defensa o protección del medio ambiente se ha convertido en un

problema político y está fijada claramente en las leyes fundamentales de algunos

países, entre ellos España.

1.1.1 Estudios acuáticos y terrestres.

Sirven para evaluar, en las especies analizadas, los efectos tóxicos tanto de

determinados compuestos y productos para su clasificación (de acuerdo con la

legislación de régimen hidráulico, para hojas de datos de seguridad, autorizaciones

de transporte, para el registro de sustancias químicas, productos fitosanitarios y

biocidas), como también de tomas de muestras ambientales (por ejemplo, en el

sector de antiguos vertederos o para la evaluación de aguas residuales).

Los tests de toxicidad, en función de los requisitos de las autoridades, se requieren

como estudios:

Agudos.

Subagudos.

De reproducción (Dutka BJ., 1989)

1.1.2 Evaluación del riesgo ambiental.

La ecotoxicología la podemos definir como la ciencia que se encarga de estudiar los

efectos de las sustancias químicas sobre las estructuras y función de los

ecosistemas. De hecho, valorar y predecir efectos sobre estructuras altamente

complejas es sin duda una tarea difícil de desarrollar y es por ello, que se han

diseñado modelos de valoración de riesgos que nos permiten predecir situaciones

adversas sobre el medio ambiente producto de la liberación de sustancias químicas,

en este caso de plaguicidas (Burger J., 2000)

La Evaluación de Riesgo Ambiental, ERA, es un buen mecanismo para la toma de

decisiones en este campo, los procedimientos de la misma , se basan en los

criterios de no efecto, en donde se considera que la utilización de los plaguicidas

debe regularse, a modo que se evite la aparición de efectos adversos sobre el

http://www.monografias.com/trabajos16/ciencia-y-tecnologia/ciencia-y-tecnologia.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/todorov/todorov.shtml#INTRO

http://www.monografias.com/trabajos7/mafu/mafu.shtml

http://www.monografias.com/trabajos13/progper/progper.shtml

http://www.monografias.com/trabajos15/medio-ambiente-venezuela/medio-ambiente-venezuela.shtml

http://www.monografias.com/trabajos12/decis/decis.shtml

http://www.monografias.com/trabajos12/decis/decis.shtml

http://www.monografias.com/trabajos13/mapro/mapro.shtml



medio ambiente, el planteamiento ecotoxicológico extrapola al campo ambiental un

axioma que establece que la mayoría de las curvas que relacionan la dosis o

concentración del tóxico a que se ve sometido un individuo, con la respuesta que en

el se produce tienen forma sigmoidea, la extrapolación se basa en utilizar la

información existente para determinar las dosis o concentraciones para la cual no

hay efectos, considerando la calidad y cantidad de la información disponible, la

Evaluación de Riesgo Ambiental ERA, permite establecer los límites de

aceptabilidad mediante procedimientos científicos basados en la información

disponible (APHA-AEEA-WPCF, 1992)

1.2 Evolución ecotoxicológica de Cuba.

En nuestro país se tienen referencias de manifestaciones tóxicas en el hombre,

ocurridas en el siglo XV, ocasionadas por la inhalación de gran cantidad de tabaco,

lo cual producía embriaguez, manifestando alucinaciones, en las que decían que

habían hablado con el SEMI, nombre que en la Isla los indígenas le daban a sus

ídolos moldeados en barro de madera grosera y tosca. Un hecho trascendental en la

historia de la Toxicología Cubana, se produce en esta época, cuando el Dr. en

Medicina y Cirugía, farmacéutico de la escuela de París, Catedrático en Fisiología,

Patología General e Higiene Privada de la Universidad de la Habana, Dr. Julio Le

Riverend y Languor (1793-1864) publicó en esta ciudad, (en la imprenta del

Gobierno), su diccionario de Reactivos Químicos Toxicológicos y Medicina Legal

con una extensión de 400 páginas; primer libro escrito en nuestro país sobre

Toxicología.

Fueron múltiples los médicos cubanos que se dedicaron a resaltar el papel que

jugaba el estudio de la Química de modo científico y su papel en el desarrollo

detallado del análisis cualitativo y cuantitativo.

En esta época los farmacéuticos eran los encargados por los tribunales de

investigar la existencia de venenos, de ahí la necesidad de estos conocimientos.

En nuestro país, las publicaciones sobre esta temática eran esporádicas y a medida

que transcurre el tiempo surgen diferentes personalidades que enriquecen sus

conocimientos y los ofrecen a favor de las investigaciones sobre las causas y

desenlace de los envenenamientos.

http://www.monografias.com/trabajos11/conge/conge.shtml

http://www.monografias.com/trabajos6/lide/lide.shtml



Con el triunfo de la Revolución, se le da un impulso a los estudios universitarios en

el país y como parte de ello, la Toxicología se inserta en la enseñanza de los

estudios de Medicina y de Farmacia en los diferentes planes de estudio, los cuales

tratan de perfeccionarse.

1.3 Características de los compuestos ecotóxicos.

Un ecotóxico es un producto químico peligroso con capacidad para ser absorbido

por cualquiera de los elementos de un ecosistema y para, por pequeña que sea la

cantidad presente, alterar los equilibrios biológicos del mismo. Muchos de ellos

tienden a persistir en el ambiente. El ser humano es un elemento más de los

ecosistemas. Con el fin de poder actuar eficazmente sobre los problemas de

ecotoxicidad, resulta muy importante establecer la relación existente entre los

productos y la contaminación ambiental. Se dice que un ambiente está contaminado

cuando en él aparecen sustancias o productos que no debieran estar, o cuando su

concentración es distinta a la que debería haber de forma natural. En ambos casos

los ciclos naturales no pueden desarrollarse adecuadamente y se rompen los

equilibrios naturales (agua, carbono, azufre o nitrógeno). Podemos afirmar, por

tanto, que todos los tóxicos son contaminantes, pero no todos los contaminantes

son tóxicos. Por ejemplo, el CO2 es un compuesto natural presente en el aire que

en las concentraciones en que aparece en la naturaleza resulta inocuo para los

animales, plantas y personas, sin embargo, el aumento de su concentración en la

atmósfera como consecuencia de la combustión de combustibles fósiles es una de

las causas fundamentales del cambio climático (Betton C., 1993)

Independientemente de su forma física (gases, disoluciones, partículas, aerosoles o

residuos sólidos) y de los focos de emisión, hay dos tipos básicos de contaminantes:

primarios, que se vierten como tales desde los focos de emisión al ambiente y

secundarios, que se forman en el ambiente por las distintas reacciones químicas en

que participan los anteriores (oxidación, síntesis, hidrólisis o fotólisis).

1.3.1 Actuación de los tóxicos en el medio ambiente.

La acción de un tóxico en un ecosistema se divide en dos etapas, la primera

denominada toxicocinética en la que el tóxico entra en el ecosistema, se acumula y



se transforma, y la segunda etapa, o toxicodinámica, que integra la acción del tóxico

y la respuesta del ecosistema:

PRIMERA ETAPA: El compuesto entra por el aire en forma de vapor o de gas,

arrastrado o diluido por el agua de lluvia, de riego, etc.. o, a veces, difundiéndose

por materiales permeables. Incluye tres fases:

a-Transporte. Introduciéndose en las cadenas alimenticias y en los ciclos

biogeológicos, alterándolos. Los principales ciclos son el del agua, el del carbono, el

del azufre y el del nitrógeno y revisten gran interés por su enorme impacto, los del

ozono, fósforo, arsénico, mercurio, cadmio, plomo, selenio, el de las nitrosaminas y

el de los productos organoclorados (plaguicidas, bifenilos, PCB, PCT,..).

b- Acumulación en el medio y en los organismos (Bioacumulación). El tóxico se

integra en la cadena trófica y va incrementando su concentración en las distintas

especies pudiendo llegar hasta el ser humano. Se mide habitualmente por medio del

Factor de Bioconcentración (FCB).

c-Transformaciones de los compuestos como resultado de reacciones

químicas o de procesos biológicos. Estos cambios pueden representar unas

veces un incremento y otras una reducción de la toxicidad. El conocimiento de los

factores de bioconcentración es útil para la evaluación del riesgo de exposición y

estimar las consecuencias a largo plazo, así como para establecer los niveles

legales en agua y alimentos.

SEGUNDA ETAPA: La acción del tóxico desencadena efectos en el medio, la

respuesta de los elementos y comunidades vivas y la reacción global del

ecosistema. Las acciones tóxicas, al igual que ocurre en relación a la salud laboral,

pueden ser de carácter agudo o crónico, sin embargo, hay una gran diferencia pues

la ecotoxicología no considera las acciones sobre individuos aislados sino sobre las

poblaciones y sobre el equilibrio del sistema. Es importante establecer esta

diferencia porque los efectos producidos y los indicadores que informan de los

mismos son distintos.

Para medir la acción ecotóxica se utilizan los siguientes conceptos:

Efectos agudos: “dosis letal media” (DL50, CE50 o CL50), parámetro que indica la

dosis o concentración que produce la muerte al 50% de los individuos de la especie

experimental.



Efectos crónicos: “ concentración de inhibición del crecimiento” o, en el caso de

pequeños invertebrados, “concentración de inmovilización” (CI50) parámetro que

indica la concentración de un tóxico en el aire, agua o tierra, que inhibe el

crecimiento o la movilidad del 50% de la población expuesta.

En función de estos conceptos se establece la clasificación general de productos

ecotóxicos.

Además, los efectos que produce una acción tóxica pueden ser directos o indirectos

y reversibles o irreversibles. Los efectos directos son consecuencia de la acción del

compuesto sobre las poblaciones de las distintas especies presentes. Los efectos

indirectos aparecen como consecuencia de las modificaciones que se producen en

las condiciones ambientales (temperatura, humedad, lluvias ácidas, incremento de

CO2).

Habitualmente, a un ecosistema pueden llegar numerosos contaminantes, unos

persistirán un largo tiempo, otros serán transformados o destruidos por el medio;

también varía el tiempo que permanecen en los organismos vivos. Como

consecuencia se produce una interacción de los distintos tóxicos que se conoce con

el nombre de toxicidad múltiple. La gran diversidad de sustancias que se liberan al

medio ambiente con las múltiples reacciones posibles que pueden tener lugar entre

ellas, hace que resulte muy complejo determinar con rigurosidad los efectos que

resultan de la toxicidad múltiple. Sin embargo, a modo de ejemplo, describimos un

fenómeno que sí es conocido, como es el caso de la “potenciación gas-polvo”, en

que las partículas, por simple adsorción potencian la concentración de gases y

vapores facilitando el transporte y la incidencia del tóxico en el órgano humano u

organismos expuestos. Así, en los seres humanos, para reducir a la mitad la

capacidad respiratoria se precisan 60 ppm de SO2, pero si se añaden 4 mg/m3 de

partículas de cloruro sódico éste efecto se consigue con sólo 18 ppm de SO2 y, si

incorporamos 10 mg/m3 de partículas de cloruro sódico la respuesta se multiplica 15

veces, pues la concentración de SO2 precisa se reduce a 4 ppm (Hursthouse

2009).

1.4 Influencia de residuales naturales sobre el medio ambiente.



La acción del hombre sobre el planeta ha sido tan notable, especialmente en el

último siglo, que se puede afirmar que no existe ecosistema que no esté afectado

por su actividad. Desde hace milenios el hombre ha explotado y modificado la

naturaleza para subsistir, pero en los últimos decenios además ha producido miles

de sustancias nuevas que se han difundido por toda la atmósfera, la hidrosfera, los

suelos y la biosfera (Dutka BJ., 1989)

Todos los organismos consumidores viven de la explotación del ecosistema y la

especie humana también necesita explotarlo para asegurar su supervivencia. De la

naturaleza se obtienen los alimentos y a la naturaleza se devuelven los residuos que

generamos con nuestra actividad. La energía que empleamos la obtenemos, en su

mayoría, de la combustión de reservas de compuestos de carbono (petróleo,

carbón, gas) almacenados por el trabajo de los productores del ecosistema a lo

largo de muchos millones de años.

Entre las acciones humanas que más influyen en el funcionamiento de los

ecosistemas tenemos:

Agricultura y ganadería

Obtención de energía y materias primas

Reciclado de residuos

Destrucción de ecosistemas naturales

Introducción de organismos ajenos al ecosistema.

La actividad humana mueve muchas especies de unos lugares a otros. A veces

conscientemente y otras sin querer, al transportar mercancías o viajar de unos sitios

a otros.

Muchas de estas especies son beneficiosas por su aprovechamiento agrícola o

ganadero, como la patata y el maíz que fueron introducidas en Europa y son un

importantísimo recurso alimenticio. Otras sirven para controlar plagas. Pero algunas

son muy perjudiciales, porque no tienen depredadores que las controlen y se

convierten en plagas. Siempre hay que tener en cuenta que la alteración del

ecosistema es muy difícil de prever y sus efectos secundarios difíciles de controlar

(Fairbrother 2001).

http://www.tecnun.es/asignaturas/ecologia/Hipertexto/07Energ/120PetrolGas.htm

http://www.tecnun.es/asignaturas/ecologia/Hipertexto/07Energ/110Carb%F3n.htm

http://www.tecnun.es/asignaturas/ecologia/Hipertexto/04Ecosis/110ProPri.htm

http://www.tecnun.es/asignaturas/ecologia/Hipertexto/09ProdQui/113ContrPla.htm

http://www.tecnun.es/asignaturas/ecologia/Hipertexto/01IntrCompl/110Complej.htm

http://www.tecnun.es/asignaturas/ecologia/Hipertexto/01IntrCompl/110Complej.htm



1.5 Ensayos de toxicidad

Los ensayos de toxicidad son los bio ensayos empleados para reconocer y evaluar

los efectos de los contaminantes sobre la biota. En los bioensayos se usa un tejido

vivo, organismo, o grupo de organismos, como reactivo para evaluar los efectos de

cualquier sustancia fisiológicamente activa.

Estos ensayos, básicamente, consisten en la exposición de grupos de organismos,

a determinadas concentraciones del tóxico por un tiempo determinado. Los

organismos deben estar en buenas condiciones de salud, previamente aclimatados

a las condiciones del ensayo, y se mantienen en condiciones ambientales

constantes. Además se dispone de grupos de control (que no se exponen al tóxico).

Luego se miden y registran los efectos biológicos observados en cada uno de los

grupos control y tratados y, posteriormente, se efectúa un análisis estadístico de los

datos obtenidos .

Los efectos tóxicos a evaluar pueden ser: mortalidad, inmovilidad, inhibición del

crecimiento de la población, alteración del comportamiento, etc. Se determinan

distintas variables como, por ejemplo, la concentración letal 50 (CL 50), que es la

concentración letal para el 50 % de los individuos expuestos. Las condiciones de los

cultivos y los ensayos deben estar altamente estandarizadas para permitir la

comparación de los resultados.

Los ensayos de toxicidad permiten establecer los límites permitidos para los

distintos contaminantes, evaluar el impacto de mezclas sobre las comunidades de

los ambientes que las reciben y comparar la sensitividad de una o más especies a

distintos tóxicos o a diferentes condiciones para el mismo tóxico. Es útil para la

investigación básica del fenómeno de toxicidad, establecer criterios o patrones de

calidad de aguas superficiales o efluentes, la evaluación del impacto ambiental y del

riesgo ecológico y el monitoreo de las condiciones de un cuerpo de agua.

Generalmente, no es suficiente para proteger la biota registrar en un ecosistema

dado las concentraciones de las sustancias químicas; los programas para

monitorear tales sustancias suelen ser muy caros, y aquellas de alta toxicidad

generalmente deben detectarse en concentraciones muy bajas, usando equipos

costosos y personal muy entrenado; y en un solo ambiente puede haber cientos de

contaminantes con efectos muchas veces no aditivos. Por lo tanto, se necesitan los



ensayos biológicos que son relativamente simples, rápidos y económicos, y pueden

brindar información adicional sobre el riesgo potencial, incluyendo efectos tóxicos

como generación de cáncer, malformaciones, desórdenes de conducta, efectos

acumulativos, antagonismos y sinergismos.

Los ensayos pueden ser de laboratorio (con un número reducido de especies, y en

condiciones estandarizadas que reproducen sólo en forma muy parcial las

condiciones naturales en el ambiente), o de campo (con “encierros” sometidos a las

condiciones del medio).

Mediante los ensayos de toxicidad se estudian las relaciones dosis o concentración,

efecto y dosis o concentración - respuesta (efecto: cambio biológico evaluable por

una escala de intensidad o severidad; respuesta: proporción de la población

expuesta que manifiesta un efecto definido).

Los organismos empleados para los ensayos deben tener alta sensibilidad a los

tóxicos, ya que al establecer las concentraciones seguras para ellos se espera

proteger a todo el ecosistema, pero hay que tener en cuenta que distintas especies

tienen diferente sensitividad a distintas sustancias químicas. Más de 150 especies

desde bacterias hasta mamíferos se usaron como organismos para test, pero sólo

unas 40 tuvieron cierta aprobación oficial.

De todos modos, ninguna especie aislada podría representar adecuadamente un

ecosistema entero en sensitividad toxicológica, por lo que hay organizaciones que

recomiendan una serie de ensayos crónicos incluyendo, por ej: algas, dáfnidos y

peces . Se utilizan métodos integrados (secuencial, para evaluar la toxicidad de

sustancias químicas puras, y simultáneo, para deshechos que contienen varias

sustancias diferentes). Los ensayos deberían complementarse con monitoreos

biológicos y el uso de indicadores ecológicos (EPA/600/3-88/029, 1989).

1.5.1 Bioensayos de toxicidad

Los bioensayos de toxicidad son procedimientos de laboratorio empleados para

evaluar los efectos tóxicos potenciales de contaminantes químicos, efluentes

industriales, o muestras de agua de un cuerpo receptor sobre biomodelos sensibles.

Los efectos se evalúan a través de respuestas letales (mortalidad) en estudios de

toxicidad aguda o respuestas subletales (crecimiento, comportamiento,



reproducción) a través de estudios de toxicidad crónica.

Entre las especies mas utilizadas se encuentran:

· Fitoplancton (Chlorella vulgaris)

· Zooplancton: microcrustáceos de agua dulce (Daphnia spp)

microcrustáceos marinos (Artemia salina)

especies de hidrozoos y rotíferos

· Peces de agua dulce (Brachidario rerio, Poecilia reticulata)

· Plantas terrestres (Lactuca sativa) (OECD, 1984).

1.5.2 Ensayos ecotoxicológicos en medio terrestres.

a) Ensayos de Toxicidad aguda en Lombriz de Tierra Eisenia foetida. Se evalúa la

toxicidad de los productos en el suelo a través del Ensayo de toxicidad por contacto

sobre papel de filtro según los métodos descritos en OCDE 1984, Prueba nº207 y

del Ensayo de toxicidad sobre suelo artificial (14 días) según métodos descritos en

OECD-207,1984.

b) Ensayo de germinación de semillas con Lactuca sativa (5 días).

El parámetro a evaluar son los efectos sobre la germinación según el método EPA

600/3-88/029 (Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites.

A.8.7. Lettuce root elongation (Lactuca sativa) (1988)), determinando el NOEC,

LOEC y CEX.

c) Ensayo de emergencia y crecimiento en plantas terrestres (14 días).

Determinar la inhibición de la germinación de semillas y la inhibición del crecimiento

de las plantas (Lactuca sativa), se sigue la Línea directriz OCDE nº 208 (2006).

-Ventajas del uso de las plantas Como parte integral del ecosistema, las plantas superiores son ampliamente

utilizadas por ser organismos eucarióticos, y por lo tanto más comparables a la

mayoría de las especies de la flora y la fauna superiores, y constituyen una eficiente

herramienta de trabajo para medir alarma de peligro ambiental, además de poseer

las siguientes ventajas:

Las plantas son más sensibles a estrés ambiental que otros sistemas de

ensayos disponibles.



Fácil manipulación y almacenaje.

Bajo costo.

Buena correlación con otros sistemas de pruebas (Clarkson DT., 1965).

Entre las pruebas a corto plazo con plantas que más se han utilizado para la

evaluación toxicológica ambiental se encuentran:

1. Prueba de toxicidad a corto plazo de la prolongación de la raíz de un vegetal.

La justificación para realizar este bioensayo radica en la importancia de eventos de

desarrollo temprano en el crecimiento y supervivencia de las plantas. La

prolongación de la raíz es inhibida a concentraciones más bajas de las sustancias

tóxicas que para el caso de la germinación de las semillas; por lo tanto, puede ser

un indicador más sensible de efectos biológicos. Este bioensayo puede ser

ejecutado con cualquier número de especies, las cuales resulten económicamente

importantes, sean fácilmente disponibles, germinen y crezcan rápidamente. Una de

las semillas más comúnmente utilizadas en esta prueba son las semillas de Lactuca

sativa L(Dutka BJ., 1989).

El bioensayo con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) es un ensayo estático de

toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se evalúan los efectos

fitotóxicos de un compuesto puro o de una mezcla compleja en el proceso de

germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros

días del crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los efectos

fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la

prolongación de la radícula y del hipocotilo. A diferencia del bioensayo tradicional de

germinación de semillas, la evaluación del efecto en la prolongación de la radícula y

del hipocotilo de las plántulas permite la evaluación del efecto tóxico de compuestos

solubles presentes en concentraciones tan bajas que no son suficientes para inhibir

la germinación, pero que sí pueden retardar o inhibir completamente los procesos

de prolongación de la raíz o del hipocotilo, lo que depende del modo y sitio de

acción de los contaminantes(Dutka BJ., 1989)

Este ensayo evalúa los constituyentes solubles del agua (aguas superficiales, aguas

subterráneas, suelos o eluatos de sedimentos y lixiviados), teniendo en cuenta para

el resultado la cantidad de semillas germinadas y la media del crecimiento de la raíz.

Se calcula la EC50 que no es más que la concentración que reduce la longitud de la



raíz en un 50 % en relación con el control. Dutka BJ y colaboradores evaluaron la

calidad de sedimentos y agua mediante el empleo de diferentes bioensayos, y

reportaron similitud entre los resultados con esta prueba y el resto de los bioensayos

probados(Dutka BJ., 1989).

Otros autores también han utilizado esta prueba en la evaluación ecotoxicológica de

muestras de agua y sedimentos, bioensayo para la estimación de la toxicidad por la

medición de la media del crecimiento de la raíz de cebollas (Allium cepa L). Este

método es una herramienta fácil y sensible para la medición de la toxicidad total

causada por tratamientos de sustancias químicas. Los resultados de este ensayo se

ajustan bien a una batería de pruebas compuesta por organismos procariontes y/o

eucariontes. Es aplicable a los siguientes tipos de muestras:

Aguas naturales (lagos, ríos y pozos).

Agua potable (agua de grifo diferentes tuberías.

Aguas residuales domésticas e industriales, incluyendo lodos y lixiviados.

Sustancias químicas solubles en agua y con sustancias químicas insolubles

en agua y solventes.

El ensayo con bulbos de cebolla (Allium cepa L.) es un bioensayo de toxicidad

aguda (72 horas) semiestático (con renovación diaria de la solución de ensayo).

Como punto final de evaluación de efectos fitotóxicos se cuantifica la inhibición

promedio en la prolongación de las raíces del bulbo.10

El grado de toxicidad de las sustancias químicas de prueba es estimado por la

medición de la longitud de cada uno de los bultos de las raíces (10 cebollas son

empleadas para cada concentración o menos en dependencia de si sólo están

disponibles pequeñas cantidades de muestra). Para el reporte de la prueba, se toma

un valor medio del crecimiento para cada una de las series. También se calcula la

EC50 (Fiskejö G., 1983).

Con el empleo de esta prueba en el monitoreo de aguas residuales por Fiskesjö G

se demuestra también su alta correlación con otros sistemas de ensayo,

involucrando la toxicidad general (crecimiento de las raíces) y la genotoxicidad

(aberraciones cromosómicas). Por otra parte, se sugiere el empleo de la prueba

como un bioensayo normado para el monitoreo ambiental.



Fiskesjö G resumió algunas de estas ventajas, entre las que se encuentran la

toxicidad (EC50 para la media del crecimiento de la raíz), que puede ser obtenida

dentro de la prueba; buena correlación con otros sistemas de prueba, y además del

equipamiento normal del laboratorio, sólo se necesita de un microscopio con una

cámara, si se quiere realizar la prueba citológica con las puntas de las raíces

(Fiskesio G., 1993)

1.6 Consideraciones generales sobre el uso de las plantas medicinales.

Desde la época de los aborígenes, las plantas medicinales han sido a través de los

tiempos el recurso más utilizado por el hombre y los animales para aliviar o curar

sus dolencias. Los primeros herbolarios datan de la época de los asirios, los

babilonios y los fenicios y son una recopilación de los conocimientos de la época

sobre las propiedades curativas de las plantas. Así comenzó la Historia de la

Fitoterapia (Navarro C., 2002).

Así, los nuevos fitofármacos cápsulas, tabletas y líquidos de complejos productos

vegetales extraídos con sofisticados métodos y valorados en modelos biológicos

novedosos y prometedores. Las plantas volvieron vestidas de alta tecnología y de

una novedosa mercadotecnia (Cañigueral S., 2000).

Esto ha significado el nacimiento de la nueva fitoterapia, en que la preparación y

validación de las formulaciones a base de diversas especies vegetales se realiza

por profesionales especializados, capaces de satisfacer las necesidades que el

paciente reclama en aspectos importantes como la prevención y la salud. El 25 por

ciento de los medicamentos tradicionales contiene sustancias de origen vegetal, y

los fitofármacos son medicamentos elaborados exclusivamente con principios

activos de origen vegetal (Cañigueral S., 1998).

La utilización tradicional de plantas medicinales, sumada a los avances en

tecnología, influyó en los cambios que la industria farmacéutica, los centros de

investigación y la agranoindustria experimentaron los procesos de estudios,

desarrollo y producción. Su notable avance permitió generar diversos productos de

calidad uniforme, eficaz y seguro. Estos aspectos hacen que el enfoque para definir

la calidad en plantas medicinales y aromáticas varíe de acuerdo al uso y destino

(Peris JB., 1996).



La toxicidad de los preparados fitoterapéuticos suele ser baja y los efectos

secundarios son reducidos, lo que no quiere decir que no haya interferencias o

efectos secundarios. Pero bien es cierto que no alcanzan el nivel de las

especialidades farmacéuticas habituales (Stübing G. y col., 2004).

No obstante es necesario verificar los posibles efectos tóxicos que estos pudieran

tener así como su influencia al interactuar con el medio ambiente.

El Piper aduncum L. es una planta cuyos nombres más conocidos son “Condorcillo”,

“Matico”, hierba del soldado entre otros. Se ha observado que en esta especie

existe bastante confusión respecto de los nombres “Condorcillo”, “Matico”, pues en

varias zonas del Perú se conocen con este nombre a 3 ó 4 especies diferentes del

Género Piper y a la especie Jungia Paniculada (DC.) Gray. Perteneciente a la

familia ASTERACEA todas estas especies se las denominan igual y se le atribuye

propiedades similares. Su uso es múltiple y variado, como en dolencias

gastrointestinales (diarrea aguda o crónica), enfermedades del tracto respiratorio

(antiinflamatorio, antitusígeno), en infecciones del aparato genital, cicatrizante de

úlceras internas y externas (Torres-Santos EC y col, 1999).

La Nicotiana Acuminata Hook pertenece a la familia Solanaceae y se conoce

vulgarmete con el nombre de Tabaco del cerro o tabaco silvestre, es una planta

anual erecta de rápido crecimiento, 0.5 a 2 m de altura. Tallo viscoso en toda su

extensión con pelos inconspicuos, apretados, muy cortos, dorados o parduscos,

ramas inferiores largas ascendentes a menudo numerosas, las superiores

progresivamente mas cortas. Su uso tradicional es fundamentalmente ornamental

(www. es.wikipedia.org/wiki/Nicotiana).

La Crotalaria juncea pertenece a la Familia Leguminosas, es una variedada no

comestible de boniato, es de crecimiento rápido que se utiliza para la producción de

fibra en el Indo-Pakistán. También es bueno para su uso como abono verde en

muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo y como una fuente de nitrógeno

orgánico. Se suprime las malezas, frena la erosión del suelo, la raíz y reduce la

población de nematodos-nudo (Charchar JM. Y col., 1981)

Materiales y métodos

Yileimys Cárdenas Expósito___ _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”

18

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Preparación de los extractos

Los extractos acuosos utilizados de Piper aduncum L., Crotalaria juncea y

Nicotiana acuminata proceden del Laboratorio de Tecnología Farmacéutica

perteneciente al Departamento de Farmacia de la Facultad de Química- Farmacia

de la Universidad Central Martha Abreu de las Villas.

2.1.1 Preparación de las diluciones

Para realizar la curva dosis-respuesta se preparan 6 diluciones seriadas en escala

logarítmicas 100; 10; 1; 0,1; 0,01% respectivamente lo que nos que permite

establecer el intervalo de concentración conveniente para obtener valores de

efecto entre 100 y 0% necesarios para calcular la CE50 siempre partiendo de los

extractos puros y tomando como control agua destilada.

2.2 Reactivos y materiales

• Material biológico: semillas de Raphanus sativus (rábano), Lactuca sativa L (lechuga) y Lycopersicon esculentum ( tomate).

• Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparación se recomienda utilizar reactivos Grado ACS y agua destilada

• Cápsulas de Petri de 100 mm de diámetro.

• Papel de filtro Whatman núm. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro. El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes características:

— Trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de líquido.

— Resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las plántulas sin dañarlas.

— Ausencia de residuos tóxicos (ej. blanqueadores).



19

— Que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las semillas).

• Matraces aforados de 50 mL.

• Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL.

• Regla u otro elemento de medición.

• Pinzas.

• Toallas de papel.

• Bolsas plásticas.

• Cámara oscura termostatizada (22± 2 °C).

2.3 Obtención, control y conservación de las semillas.

Las semillas de rábano, lechuga y tomate fueron suministradas por la Empresa

Provincial de Semillas Varias, MINAGRI- Villa Clara con certificado de calidad

otorgado por especialistas del Centro Provincial de Sanidad Vegetal. Estas son

semillas sin tratamiento con fungicidas o plaguicidas, con buen poder germinativo

y baja variabilidad en la elongación de la radícula.

Las semillas seleccionadas se almacenan a 4 °C, en oscuridad y en ambiente

seco. Conservadas en estas condiciones mantienen su vigor al menos durante

dos años. Un indicador de la reducción de la vitalidad y envejecimiento de las

semillas es la reducción en el poder germinativo y el aumento en la variabilidad de

las medidas de elongación de radícula en el control negativo. En este caso se

recomienda realizar las pruebas de toxicidad utilizando un nuevo lote de semillas.

2.4 Procedimiento experimental.

• Después de preparadas las diluciones a utilizar.

• Colocar en cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro.

• Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la

fecha y hora de inicio y término del bioensayo.



20

• Saturar el papel de filtro con 2 ml de la dilución evitando que se formen bolsas

de aire.

• Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente treinta semillas, dejando

espacio suficiente entre ellas para permitir la elongación de las raíces.

• Colocar las placas en un mueble tapados con bolsa plástica (para evitar la

evaporación de la sustancia de prueba) en total oscuridad a una temperatura de

22 +/- 2 º C.

• Incubar durante 120 horas.

• Determinar el número de semillas que germinan.

• Determinar la longitud de las raíces de las plantas que germinan (OECD-208,

1984).

2.4.1 Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad

Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos

expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control

negativo sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de

muestra.

Terminado el periodo de exposición (120 h), se procede a cuantificar el efecto en

la germinación y en la elongación de la radícula.

Efecto en la germinación

Se registra el número de semillas que germinaron normalmente, considerando

como criterio de germinación la aparición visible de la radícula.

Efecto en la elongación de la radícula.

Se utilizó una regla para medir cuidadosamente la longitud de la radícula de cada

una de las plántulas correspondientes a cada concentración de tóxico o dilución

de muestra y a los controles. La medida de elongación de la radícula se considera

desde el nudo (región más engrosada de transición entre la radícula) hasta el

ápice radicular.

El procesamiento estadístico de toda la información se realizó en Microsoft Excel

2003, y con el paquete de programas STATISTICA, versión 5 para Windows

(US EPA, 1989).



21

Control de calidad de la prueba

El ensayo deberá repetirse en caso de que los controles presenten:

En el control negativo:

• Porcentaje de germinación inferior al 90%.

• Alta variabilidad en la elongación de la radícula (CV>30%).

• Exposición a la luz durante el proceso de imbibición: inmediatamente después de

colocar las semillas sobre el papel de filtro, se recomienda tapar y envolver las

cápsulas de Petri cubriéndolas de la luz (para el caso de semillas fotoblásticas

negativas).

• Temperatura de ensayo: las semillas expuestas a una temperatura superior

(apenas unos grados) a la óptima para la germinación, no germinarán aunque se

les coloque posteriormente a temperaturas inferiores (termodormancia o

dormancia inducida por la temperatura).

2.5 Expresión de los resultados.

Se realizan los siguientes cálculos:

• Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula de las plántulas

de cada repetición.

• Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula, con el promedio de

elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación del control

negativo.

• Porcentaje de inhibición en la germinación.

Con estos datos se elabora la gráfica dosis-respuesta colocando en la ordenada el

porcentaje de inhibición y en la abscisa, la concentración. Mediante un método

gráfico o el uso de programas estadísticos, se calcula la concentración que

produce el 50% de inhibición (CI50/CE50) para cada punto final evaluado. Para el

caso de muestras en donde la inhibición es inferior al 50%, o para determinar el

valor correspondiente al NOEC o LOEC, se realiza el análisis de comparación de

medias (t Student, Dunnett) para verificar la significación estadística en el

porcentaje de efecto



22

2. 5.1 Interpretación de los resultados

Los efectos cuantificados sobre la elongación de la radícula son efectos

subletales. La inhibición en la germinación podría considerarse como un efecto

letal, siempre y cuando podamos corroborar que finalizada la exposición a una

muestra las semillas no germinaron por muerte del embrión, y que no existe

simplemente un retraso en el proceso de germinación, manteniéndose la

viabilidad de la semilla.

Resultados y discusión.

Yileimys Cárdenas Expósito _____________________________________ “Evaluación ecotoxicológica de tres extractos acuosos de plantas en semillas de rábano, lechuga y tomate.”

23

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

3.1 Efecto de los extractos sobre la inhibición de la germinación.

Al analizar los efectos letales de los extractos estudiados, medidos a través de la

inhibición de la germinación de las semillas de las especies de plantas utilizadas en

el ensayo mostrados en la tabla # I podemos observar el comportamiento de los

tres extractos en las especies estudiadas de forma general en cuanto a los que

daños agudos se refiere en este indicador la especie más sensible es la lechuga

pues los valores del % de inhibición de la germinación en los tres extractos es

menor lo cual indica que es la más afectada por los tóxicos disueltos en el agua del

medio donde ella se desarrolla. Haciendo una análisis mas detallado del efecto de

los extractos en la tres especies ensayadas podemos observar que el rábano es la

especie menos afectada por los componentes de dicho extracto ya que el valor de

su concentración letal media es mayor respecto al tomate y la lechuga que

disminuyen respectivamente lo que nos indica la mayor sensibilidad en la

germinación de las semillas de lechuga, de forma general el comportamiento de la

inhibición de la germinación de los demás extractos es rábano< tomate< lechuga.

Resultados estos que de alguna manera son coincidentes con estudios realizados

por Wang y col. Donde solo realizan los ensayos para la evaluación de productos y

muestras ambientales de diferentes orígenes solo en esta especie, lo cual reafirma

nuestra tesis acerca de la sensibilidad de la misma ante la exposición a tóxicos

ambientales y nos pone en condiciones de abordar en evaluaciones futuras, este

ensayo en esta especie en los ensayos de rutina de nuestro laboratorio (Wang W.,

1987).

La inhibición de la germinación en el estudio de toxicidad de muestras ambientales

complejas o con compuestos volátiles reportadas en la literatura transcurrido el

tiempo del estudio, en algunos casos han observado que al finalizar el periodo de

exposición, la inhibición en la germinación es elevada, pero si se extiende el periodo

de ensayo, sin renovar la exposición a la muestra, las semillas comienzan a

germinar. La vitalidad de las semillas que no han germinado es posible verificarla

mediante la prueba de tetrazolium para viabilidad, pudiendo de esta manera



24

asignarle con certeza a la inhibición de la germinación, el valor e importancia de un

efecto letal. No obstante esto, la inhibición en la germinación registrada al finalizar la

prueba, se considera fitotoxicidad, aunque el efecto en la germinación sea

reversible, aspecto este que no fue contemplado en nuestro estudio pero que nos

pone ante una variante a tener en cuenta en próximos ensayos siempre y cuando la

composición de la muestra a evaluar sea compleja en cuanto a componentes (Ellis

y col., 1985).

Al analizar los datos de los extractos podemos decir que de forma general el orden

de toxicidad para rábano es extracto 1 = extracto 3 >extracto 2, para el tomate el

comportamiento de la toxicidad fue extracto 3 >extracto 2 > extracto 1 y para el

caso de la lechuga que a nuestra consideración ha sido la especie mas sensible el

orden resultó extracto 2 < extracto 3 < extracto 1 pues al desconocer la

composición de los extractos no podemos compararlos entre si pero si tomando

como variable una misma especie de planta.

Tabla I: Resultados de la inhibición de la germinación de los extractos

estudiados.

Extracto Especie % inhibición de la

germinación (CI50)

Extracto 1 Rábano 52.3

Lechuga 7.8

Tomate 38.0


Lechuga 1.4

Tomate 12.0


Lechuga 1.7

Tomate 5.2



25

Leyenda:

Extracto 1: Extracto acuoso de Nicotiana acuminata

Extracto 2: Extracto acuoso de piper

Extracto 3: Extracto acuoso de Crotalaria juncea

3.2 Resultados del efecto de los extractos sobre la inhibición de la elongación

de las raíces.

Otro aspecto importante en este ensayo son los efectos provocados por los

extractos estudiados sobre la elongación o crecimiento de la raíz, los cuales son

analizados como efectos subletales ya que una sustancia o muestra en cuestión

puede no afectar en principio la germinación pero si el crecimiento y desarrollo de la

raíces . Estos resultados son mostrados en la tabla # II donde analizamos el efecto

del extracto 1 sobre el crecimiento promedio de las plantas de cada grupo de

tratamiento y su desviación estándar utilizados para calcular la inhibición de la

elongación la raíz del extracto 1, si analizamos los valores de % de inhibición

notaremos las diferencias con respecto a la inhibición de la germinación como se

comentó anteriormente ya que la inhibición del crecimiento ocurre a diluciones

mayores es decir que los daños tóxicos se observan en las diluciones mayores

respecto al control.

Tabla II: Resultados del efecto del extracto 1 sobre el crecimiento de las

raíces y desviación estándar

Media DE

rábano Lechuga Tomate rábano Lechuga Tomate

Control (-) 4.9 2.9 3.21 1.04 0.84 1.17

100 0.1 0.1 0.51 0.11 0.17 1.05

10 1.3 0.2 2.80 0.87 0.25 1.82

1 3.6 0.7 3.93 1.33 0.97 1.48

0.1 4.4 0.9 4.04 1.41 0.95 1.27

0.01 4.8 1.6 4.73 1.38 1.34 1.21



26

Al analizar el gráfico 1 donde se muestra el efecto del extracto 1 sobre la elongación

de las raíces de las especies estudiadas podemos observar que el rábano y el

tomate tuvieron un crecimiento similar, diferenciándose significativamente con lo

ocurrido con la lechuga donde se observa claramente la magnitud de la inhibición de

la elongación las raíces, pero si analizamos más detalladamente cada extracto

podemos ver en el gráfico 2 el comportamiento de las tres especies en los

diferentes diluciones observamos que el extracto puro produjo una inhibición de la

elongación muy marcada respecto al control y se observa que a medida que

diluimos el extracto el efecto disminuye, pero siempre en la lechuga el efecto toxico

es mayor lo que nos reafirma la sensibilidad de esta especie ya que en todas las

diluciones hay diferencias significativas con respecto al control lo cual no ocurre con

las demás especies que a partir de la dilución del 0.01 % no se observan diferencias

significativas para un p<0.05.

Planta; LS Means

Current effect: F(2, 522)=212.32, p=0.0000

Effective hypothesis decomposition

Vertical bars denote 0.95 confidence intervals

Rábano lechuga tomate

Planta

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

L r

aíz

(1

)

Gráfico 1: Efecto del extracto 1 sobre la elongación de las raíces de rábano,

lechuga y tomate.



27

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

Control (-) 100 10 1 0.1 0.01

Concentración (%)

Larg

o r

aíz

(m

m)

rábano

Lechuga

Tomate


lechuga y tomate en las diluciones de estudio.

Los resultados del efecto del extracto 2 sobre la media del crecimiento de las raíces

de las plantas y la desviación estándar son mostrados en la tabla III los cuales nos

permiten graficar el efecto de las diluciones del extracto sobre el crecimiento de las

raíces

Tabla III: Resultados del crecimiento y desviación estándar del extracto 2

Rábano Lechuga Tomate

Conc Media DE Media DE Media DE

Control

(-) 6.1 1.0 4.25 1.82 4.68 0.65

100 0.1 0.1 0.00 0.00 0.00 0.00

10 2.0 1.0 0.18 0.43 1.68 1.23

1 2.4 1.1 0.80 0.96 2.73 1.06

0.1 4.6 1.5 1.12 0.90 3.04 0.99

0.01 6.1 1.6 4.02 1.41 3.84 0.93



28

En el gráfico 3 se muestra el efecto del extracto 2 sobre la elongación de las raíces

de rábano, lechuga y tomate donde se denota que hay diferencias entre las

especies utilizadas pues el crecimiento es menor significativamente en la lechuga,

comportándose de forma similar al extracto 1 en cuanto a sensibilidad rábano<

tomate<lechuga, reafirmando la observación de la futura utilización de la lechuga

como especie a utilizar en este tipo de ensayo siempre y cuando el producto no sea

para ser utilizado sobre esta especie.

Planta; LS Means





Planta

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

L r

aíz

(1)


lechuga y tomate.

Si analizamos el comportamiento de las tres especies en las diferentes diluciones,

mostrados en el gráfico 4, observamos que el extracto puro provocó una inhibición

de casi la totalidad de la germinación de las semillas de lechuga y tomate, solo en el

caso del rábano hubo un ligero brote de las raíces y a medida que se aumentó la

dilución el efecto fue disminuyendo hasta la dilución de 0.01 % donde las diferencias

fueron no significativas respecto al control para un p<0.05.



29

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Control 100 10 1 0.1 0.01

Concentración (%)

Larg

o d

e l

a r

aíz

(m

m)

rábano

Lechuga

Tomate


lechuga y tomate en las diluciones estudiadas.

Los resultados del efecto del extracto 3 sobre la inhibición de la elongación de las

raíces de las tres especies son mostrados en la tabla IV, resultados que al graficar

nos permite obtener el gráfico 4 donde observamos que la lechuga resultó ser la

especie más afectada en cuanto al crecimiento de las raíces

Tabla IV: Resultados del crecimiento y desviación estándar del extracto 3

Media DE

Rábano Lechuga Tomate Rábano Lechuga Tomate

Control (-) 7.2 2.8 4.90 1.61 0.61 1.19

100 0.2 0.0 0.02 0.18 0.00 0.07

10 1.7 0.3 1.06 1.10 0.38 1.19

1 2.8 0.8 2.29 1.15 0.81 1.41

0.1 4.3 1.3 3.25 1.44 1.00 1.23

0.01 5.2 2.0 4.06 1.12 0.92 1.18



30

Realizando un análisis más detallado de la influencia del extracto 3 sobre la

inhibición de la elongación de las raíces de las tres especies utilizadas obtenemos el

gráfico 5 donde podemos denotar que el extracto puro provocó ua inhibicion

marcada en lechuga y tomate, aumentando el largo de las raíces a medida que

aumentó la dilución del extracto.

Planta; LS Means





Planta

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

L r

aíz

(3)


lechuga y tomate.

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

Control (-) 100 10 1 0.1 0.01

Concentración (%)

Larg

o d

e la r

aíz

(m

m)

rábano

Lechuga

Tomate



31


lechuga y tomate en las diluciones estudiadas.

A modo de resumen acerca de los resultados obtenidos en la inhibición de la

germinación y la elongación de las raíces de los extractos estudiados en las

especies de plantas utilizadas confeccionamos la tabla V con el objetivo de poder

comparar los efectos de los extractos sobre ambos proceso los cuales son

afectados por la toxicidad de los compuestos disueltos en el agua, como podemos

observar en la tabla y a nuestro juicio el efecto sobre el crecimiento de las raíces es

un indicador más fino ya que a concentraciones menores hay signos de daños

tóxicos pues modifican los mecanismos por los cuales se produce el crecimiento.

Tabla V: Comparación del efecto de los extractos sobre la germinación y el

crecimiento.

Extracto Especie % inhibición de la

germinación (CI50)

% Inhibición de la

elongación de la raíz

(CI50)

Extracto 1 Rábano 52.3 3.11

Lechuga 7.8 0.016

Tomate 38.0 28.0


Lechuga 1.4 0.053

Tomate 12.0 1.0


Lechuga 1.7 0.087

Tomate 5.2 0.51

Otro aspecto a considerar es el mayor desarrollo en la elongación de la radícula en

algunas muestras con respecto al control. La exaltación en un punto final no debe

ser interpretada como un efecto favorable o estimulante. En la aplicación de la

prueba con semillas a muestras ambientales, conjuntamente con otros organismos



32

como parte de una batería, se ha detectado en diferentes ocasiones que la

exaltación en la respuesta en la radícula se corresponde con toxicidad frente a otros

ensayos de la batería.

Conclusiones 33


CONCLUSIONES.

En los extractos acuosos de Nicotiana acuminata Hook, Piper aduncum

L. y Crotalaria juncea a diluciones mayores o iguales a 0.01 % no se

muestran signos de toxicidad sobre las especies estudiadas.

En el ensayo de inhibición de la germinación para la especie rábano los

extractos de mayor toxicidad fueron el de Nicotiana acuminata Hook y

Crotalaria juncea, con una concentración letal de 52.3% y 52.8%

respectivamente, mientras que para el tomate el extracto mas tóxico fue el

de Crotalaria juncea con una concentración letal de 5.2% y para la

especie lechuga el de mayor toxicidad fue el de Piper aduncum L con una

concentración letal de 1.4%.

En el ensayo de inhibición de la elongación de la raíz para la especie

rábano el extracto de mayor toxicidad fue el de Crotalaria juncea, con una

concentración letal de 0.24%, mientras que para el tomate el extracto mas

tóxico fue el de Crotalaria juncea con una concentración letal de 0.51% y

para la especie lechuga el de mayor toxicidad fue el de Nicotiana

acuminata Hook con una concentración letal de 0.016%.

La especie más sensible en los ensayos realizados fue la lechuga.

Recomendaciones 34


RECOMENDACIONES

Emplear este ensayo solo utilizando la lechuga para la evaluación de la

toxicidad de muestras ambientales.

Realizar el ensayo en otras especies recomendadas en las Guías para

ensayos ecotoxicológicos en plantas, con sensibilidad similar a la lechuga y

que se puedan utilizar indistintamente en nuestras condiciones.

Incorporar otros ensayos ecotoxicológicos para la evaluación de muestras

ambientales.

Realizar el monitoreo de aguas residuales de otros laboratorios del recinto

universitario para conocer la toxicidad de las mismas.

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tesis para optar por el título de licenciada en ciencias

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