tesis composion quimica_de_veneno_de_abeja[1]
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COMPARACIÓN DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS VENENOS DE
ABEJAS (Apis mellifera) DE VENEZUELA Y BRASIL.Proyecto de Investigación
Jaimes. C., Fraida J. Rangel. V., Eudysmar.Tutor: Prof. Carlos Yánez
Universidad de Los AndesFacultad de Farmacia y
Bioanálisis.Escuela de Bioanálisis.Dpto. de Toxicología y
Farmacología
Mérida, Julio 2009
INTRODUCCIÓINTRODUCCIÓNN
Grupo más grande
Reino Animal
LAS LAS ABEJASABEJAS
REINO
Los Insectos
Constituyen
Dentro del cual
Se clasifican Taxonómicamente en:
ESPECIE
GENERO
FAMILIAORDEN
CLASE
PHYLUM
Animalia
mellifera
ApisApidae
Hymenóptera
Insecta
Arthropoda
Insectos venenosos
HymenóptHymenópteraera
Insectos con Alas
Membranosas
Grupo
Con características como:
Organización Social
Beneficios al
Ecosistema
Beneficios
Económicos
Animales venenosos de
mayor importancia
Alta MORTALIDAD
de sus Picaduras
Debido
APOCRITA
SYMPHYTA
Se dividen en:
Carecen de
Aguijón
Hábitos Alimenticios
Variados
PARASITOIDES
NÉCTAR
Poseen
aguijón
DEPREDADORAS
ASPECTOS ASPECTOS GENERALESGENERALES
LAS LAS ABEJASABEJAS(Apis mellifera)
Insecto Social
Hembras de la ColoniaSe diferencian
en
Reinas Fértiles
Trabajadoras
EstérilesEncargadas de:
VIGILANCIA
BÚSQUEDA DE
ALIMENTOS
Marcadas por la edad
Esta dotado de
CARACTERÍSTICAS
Diferentes Zonas
Climáticas
DIFERENTES ESPECIES DE
ABEJAS
Dando origen a
Permiten la adaptación
a
VENENVENENOO
VENENO = APITOXINA
Mezcla Comple
ja
Sustancia
Toxica
IncluyeAlto Peso Molecular
Bajo Peso Molecular
Reacciones
Alérgicas
Debido a
Compuestos
Orgánicos
Acción de las
Enzimas que
posee
Producto
Interior del
abdomen
Generado
Que produce en los individuos
HombreAnimal
es
PoseeCantidad y
proporciones de los
componentes
Varían Entre un especie y
otra
Efectos que pueden variar por
EdadFlores
Frecuentadas
APARATO PICADORCompuesto
por:
Glándula de
Veneno
Canal Inoculad
orAlcalina
Ácida
Conformado por
Aguijón Quitino
soDos
lancetas latero-
inferiores
Estilete Dorsal
Profundas de
Introducirse
Difícil de Retirar
Asociada al
Deslizables hacia atrás y hacia
delante
Punta Aguzad
a
Ubicado en un
conductoDel cual protruye en estado de
Reposo
De la Victima
Sistema
Sufre adaptaciones y modificaciones
fisiológicas
En las ESTRUCTU
RAS
Externas
Internas
Partes del Aparato
Ovopositor
Partes del Aparato
ReproductivoTransformándose así
Los Ovarios, Glándulas
Accesorias y Ductos
En órganos que:
PRODUCEN
ALMACENAN
CONDUCEN
APARATO APARATO PICADORPICADOR
La toxina
Aparato Inoculado
r del veneno
EL VENENOComo
Respuesta:
DEFENSIVA
DOMINANCIA
De la colmena
De la misma abeja
Entre Reinas
CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS
•Liquido acuoso.
•Aproximadamente 88% de
agua.
•Transparente.
•Sabor amargo y acido (pH 4,5
a 5,5).
•Densidad mayor a la del
agua.
•Hidro y Acido Soluble.
•Insoluble en alcohol.
•Color crema (deshidratado).
COMPONENTES DEL VENENO
FOSFOLIPASA A2
HIALURONIDASA
FOSFATASA ACIDA
PROTEÍNAS
MELITINA
APAMINA
PÉPTIDO DEGRANULADOR DE
MASTOCITOS
PÉPTIDOS
CATECOLAMINAS
HISTAMINA
SEROTONINA
AMINAS
TERTIAPINA
SECAPARINA
OTROS
COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL
VENENO
PROTEÍNASFOSFOLIPAS
A A2
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
10-12 % del peso seco del
veneno
Enzima Extracelular
Actúa Sinérgicamente
MELITINA
FIBRAS POSGANGLIONARES Sistema Nervioso Autónomo
Periférico
Aumento en la
Liberación
Aumento en la
Recaptacion
ACETILCOLINA O
bse
rvánd
ose
dism
inució
nFrecuencia
Peso Molecular
Inicio de Potencial
PLACA MOTORA
14 KDa Provocando
Sobre
PROTEÍNASFOSFOLIPAS
A A2
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
10-12 % del peso seco del
veneno
Enzima Extracelular
Peso Molecular
14 KDa
HIDROLISA
Fosfatidilcolina
Fosfatidiletanolamina
Fosfatidilserina
Originando
DESTRUCCION DE LA MEMBRANA
Hemólisis
Lesión Tisular
Formándose ISOLECITINA
De las células
CebadasLiberando HISTAMINA
PROTEÍNASHIALURONID
ASA
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
Conformada por 350 residuos de
aa.
Peso Molecular
50 KDa
Cataliza la Despolimerizac
iónÁCIDO HIALURÓNICO
Aumentando la permeabilidad
capilar
Esparcimiento del Veneno
Actuando como
Factor de Difusión
A los tejidos
Por degradación de los polímeros
ÁCIDO ARAQUIDONIC
OIntracelular
PROTEINASFOSFATASA
ÁCIDA
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
PEPTIDOSMELITINA
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
Pequeño de 26 residuos de aa.
Peso Molecular
2,84 KDa
Péptido Antipático
Representa el 50% de las proteínas
totales del veneno
Mejora la Actividad
FOSFOLIPASA A2Actuando
comoCoadyuvante para la
presencia de Calcio
Actividad Enzimáti
ca
MELITINA
NecrotizantePosee
AcciónCitolítica
Sobre Diferentes Tipos Celulares
Mecanismos no
Enzimáticos
mediante
PEPTIDOSMELITINA
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
Péptido Antipático
Pequeño de 26 residuos de aa.
Peso Molecular
2,84 KDa
Membrana Plasmática
Desorganizando
Se une a
Lípidos Proteínas
Representa el 50% de las proteínas
totales del veneno
Aumentando la Permeabilidad
induciendoCambios en la
composición iónica
Muerte Celular
PEPTIDOSAPAMINA
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
Representa el 2% del total del
veneno
Pequeño de 18 residuos de aa.
Peso Molecular
2,034 KDa
Hiperactividad
efe
ctos
Tiende a
Desencadenar Efectos
Cardioestimulantes
Tener Propiedades
Antiarritmicas
APAMINA
Aumentando los reflejos
Polisinápticos
Profundos
Intensos
Medula
Espinal
Sob
re
Espasmos Musculares
Excitación de las vías
Polisinápticas
Provocando
PEPTIDOS
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
Pequeño de 18 residuos de aa.
Peso Molecular
2,034 KDa
APAMINARepresenta el 2%
del total del veneno
Actúa SinérgicamenteFOSFOLIPASA A2
Aumentando
Niveles de Cortisol
Plasmático
APAMINA
Inhibe los canales de
Calcio
Conductancia del Potasio
Actividad Farmacológic
a
Sistema Nervioso Central
Dependientes
Mas notable en
PEPTIDOS
Características
Moleculares
Acción en el
Organismo
Pequeño de 18 residuos de aa.
Peso Molecular
2,034 KDa
APAMINARepresenta el 2%
del total del veneno
Productos Amínicos
Naturaleza no alérgica
Acetilcolina
Histamina
Serotonina
Catecolaminas
Dopamina
Adrenalina
Noradrenalina
Propiedades
Inflamatorias
Vasoactivas
de
con
Contribuyen al
Se encuentran
Reacción local del
envenenamiento
Acelera la absorción de alérgenos del
veneno
Peña L y col,.2006
Coadyuvantes en procesos
alergénicos
Péptidos
de
Enzimas
Aminas
los cuales son
Ácido Fórmico
Ácido Clorhídrico
Ácido Orto-fosfórico
Enzima α-glucosidasa
Inhibidor de proteasas
Fosfato
Magnesio Glucosa
Secaparina
Aceites Volátilesy en
menores concentraci
ones
Tertiapina
Fructosa
Propiedades Fisicoquímic
as
Efecto Fisiopatológ
ico
Péptido de 21 aas
Actúa en canales
muscarinicos de K+ en cel. del miocardio
Péptido de 25 aas
No se conoce su actividad biológica.
Vit P, 2005; de Roodt A y col., 2005; Huertas V y col., 2008
DOSIS LETAL 50
TOXICIDADVeneno
de Abejas
del
DESCONOCIDO
Por vía endovenosa
2,5 – 2,8 mg/ Kg
en
y en
Humanos Humanos
Ratones Ratones
Peña L y col,.2006
JUSTIFICACIÓJUSTIFICACIÓNN
Inexistencia de Suero Antiofídico de Abejas (Apis mellifera) de
América LatinaEstudio realizado para su
elaboración en Brasil por el C.E.V.A.P.
Ampliación del estudio
Variedades de venenos
Colombia
VenezuelaMéxico
Importación a América Latina
Se necesit
aComparar venenos
Venezuela
Brasilpar
a
Menores costos de inversión
Lograr suero
antiofídico
específico y eficaz
a países latinoamericano
s
PLANTEAMIENTO PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMADEL PROBLEMA
PROBLEMA
Cual es la composición química de los venenos de Cual es la composición química de los venenos de abeja abeja Apis mellifera Apis mellifera venezolanas y brasileña venezolanas y brasileña
ANTECEDENTESANTECEDENTES
COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL VENENO DE ABEJA
Muestras de Veneno
Pool de Veneno
Establecieron que
Reúne veneno de ≠ individuos
de la misma especie
Caract. individuale
s
Edad
Sexo
Dieta
Promedia a la población
Permite analizar pocas
cantidades
Sumado a la espectrometría
Técnicas de determinación de
proteínasYanez y
col.Establecieron
que la Espectroscopia de masadetermin
aProteín
asPéptid
os> 20 KDa
Establecieron que la
Geles de 2D de
electroforesis
presenta como
Desventaja
Detecta proteínas
de un extracto
biológico
Ventaja
↓ Sensibilida
d>
20KDa
Favreau y col.
Favreau y col.
Los métodos de manipulación e
ident. Dependen
deMasa especifica
Niveles caract.
Cantidad de
veneno
Disponibilidad en bases de
datos
Avilés y col.
Identificación de la composición química
Peiren
Emplearon
Electroforesis
Espectroscopia
Sobre veneno de
abeja
Identificaron
No determinaro
nMelitina (50%)
Fosfolipasa A2 (10-12%)
Api m6
Hialuronidasa
Péptido degranulad
or de mastocitos
Apamina
Tertiapina
Por su ↓ PM
Peiren
Técnicas de detección
Establecieron que
Electroforesis
Espectroscopia
Identifica proteínas
de
HimenópteroHimenópteros s
Brochetto y col.
Determinaron que
Técnicas Cromatográfi
cas Identifican
sub-especies de Apis
mellifera Analizando
muestras de veneno
HPLC
es susceptibles al modo de extracción
Estimulación
eléctricaRuptura
de glándula
Ya s
ea p
or:
COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL VENENO DE ABEJA
Muestras de Veneno
Técnicas de determinación de
proteínas
Variación de los componentes
químicos
Creer y col.
100 especímenes
de serpientes Ceraste
Analizaron
Y determinaro
n Variaciones
en la composició
n del veneno
Debido a:
Selección Natural
Dietas de los
individuos
Dep
end
en d
e
La región que habitan
Métodos de obtención del
VenenoDepablos
y col.Evaluaron
Extractor electrónico de
apitoxina
Obteniendo
↓ Mortalidad de abejas (0,03%)
siendo
Ecológico
Eficaz
Red Eléctrica
Gota de Veneno
Placa de Vidrio
Identificación de la composición química Técnicas de
detección
COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL VENENO DE ABEJA
Muestras de Veneno
Técnicas de determinación de
proteínas
HIPÓTESIS HIPÓTESIS
HIPÓTESIS
Los venenos de abejas correspondientes a la Los venenos de abejas correspondientes a la especies especies Apis mellífera Apis mellífera de origen venezolano y de origen venezolano y brasileño presentan diferencias en cuanto a su brasileño presentan diferencias en cuanto a su
composición química composición química
OBJETIVOSOBJETIVOS
OBJETIVOS
GENERAL
ESPECÍFICOS
Identificar taxonómicamente la existencia de abejas Apis mellífera en un apiario del estado del Mérida.
Comparar la composición química de los venenos de abejas (Apis mellifera) de una región venezolana (Mérida) y una brasileña (Säo Paulo).
Aplicar métodos de estimulación por electroshock para la obtención del veneno de abejas (Apis mellifera). Determinar los constituyentes del veneno de abeja (Apis mellifera) de una región venezolana (Mérida), mediante la utilización de técnicas apropiadas. Determinar los constituyentes del veneno de abeja (Apis mellifera) de una región brasileña (Säo Paulo), mediante la utilización de técnicas apropiadas. Comparar las composiciones químicas de las abejas (Apis mellifera) de una región venezolana (Mérida) y brasileña (Säo Paulo).
MATERIALES Y MATERIALES Y MÉTODOS MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
MARCO METODOLÓGICO MARCO METODOLÓGICO
DISEÑO DEL ESTUDIO TIPO DE ESTUDIO
UNIVERSO POBLACIÓN
MUESTRA CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Expo facto Experimental
Correlacional
Aplicado
Conjunto de abejas de la especie Apis mellífera
que habitan en un apiario
Composición química del veneno de abejas Apis mellífera venezolanas y
brasileñas
Pool de veneno (extracciones obtenidas
de cada una de las poblaciones de abejas)
Ausencia de colonias de la especie Apis
mellifera
Muestras de veneno
No recolectadas por método de electroshock
No preservadas adecuadamente
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Obtención de Muestra de
Veneno
Abejas Venezola
nas
Abejas Brasileña
s
En un Apiari
o
Identificación
taxonómica
1.700 msnm
Edo. Mérida
22 ºC
Obtenido por
importación
En un Apiario
Identificación
taxonómica
636 msnm
Reg. Botacatu
25 ºC
C.E.V.A.P
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Extracción del Veneno
A través de una
Trampa de Electroshock
Fundamento
Estímulos con
Impulsos eléctrico
s
sobre adquiriendo
Peq. cant. de veneno
Sin causar muerte
Pool de veneno
formando
Diseño Elaboración
Será realizada
por
C.E.V.A.P
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S
Obtención de Muestra de
Veneno
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Manejo del Veneno
los Pools de
Venenos
Se conservaran
por
Liofilización
En que se
Elimina la
humedad
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S
Extracción del Veneno
Obtención de Muestra de
Veneno
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Análisis del Veneno
Venenos liofilizad
os
Se separaran moléculas
Proteínas
Péptidos
de u
na
Mezcla compleja
Proceso de
Diálisis
Proteínas
Solvente y Sales
Se separa
Basado en tamaño
molecular
Adecuara a
pH neutro a las
proteínas Por acción
delAcido Fórmico
a 0,1 m
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S
Manejo del Veneno
Extracción del Veneno
Obtención de Muestra de
Veneno
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Análisis del Veneno
Venenos liofilizad
os
Se separaran moléculas
Proteínas
Péptidos
de u
na
Mezcla compleja
Proceso de
Diálisis
Manejo del Veneno
Extracción del Veneno
Obtención de Muestra de
VenenoAplicación de
Columnas Cromatográfi
cas
deExclusión o
Filtración de gelSe
disolveráVeneno Liofiliza
do
Ácido Acético
Actuara comoFase
MóvilBuffer
Lavado de
Columna
Ejercerá
Mecanismo de
exclusión
Esferas de gel de ≠ diámetros
de poros
A través de
Según la
Proteína a separar
Proteína Fosfolipasa
Hialuronidasa
PM (Da) 14.000 50.000Sephadex G75
L. de exclusión
3.000-80.000
Proteína Melitina Apamina PM (Da) 2.840 2.038
Sephadex G25L. de
exclusión1.000-5.000
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S
Obispo T, 2002
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Análisis del Veneno
Venenos liofilizad
os
Se separaran moléculas
Proteínas
Péptidos
de u
na
Mezcla compleja
Proceso de
Diálisis
Manejo del Veneno
Extracción del Veneno
Obtención de Muestra de
VenenoAplicación de
Columnas Cromatográfi
cas
Presencia de
proteínas
Se evaluara
porActividad Enzimátic
a Espectroscop
ia de masa
Actividad microbiana
Otra
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Análisis del Veneno
Venenos liofilizad
os
Se separaran moléculas
Proteínas
Péptidos
de u
na
Mezcla compleja
Proceso de
Diálisis
Manejo del Veneno
Extracción del Veneno
Obtención de Muestra de
VenenoAplicación de
Columnas Cromatográfi
cas
Presencia de
proteínas
Componentes de menor tamaño
Se aplicara
Electroforesis
P.Celulosa
P.Poliacrilamida
En
Con gradiente
75 vol/cm
Se basa
Sep. moléculas por carga
Ventajas del procedimient
o
Separa proteín
as
Identifica
proteínas
con corridas de
Sustancia
problema
Patrones
En la misma placa
MA
TER
IALE
S Y
M
ÉTO
DO
S
Universo a estudiar
COMPARACIÓN
Origen
Venezolano
(Mérida)
Brasileño(Säo
Paulo)
Abeja Especie:
Apis mellifera
VENENOIdentificación Composici
ón Química
Apiario
Identificación
Taxonómica
Muestras de
Veneno
Trampa
Abeja ESTIMULACIÓN ESTIMULACIÓN electroshock
Importación
Muestras de
Veneno
POOL DE VENENOPOOL DE VENENO
Identificación de
componentes
Composición Química
Comparación Comparación Química de los Química de los
VenenosVenenos
Métodos de Conservaci
ón:-Liofilización-Diálisis
Materiales:
-Buffer-Membrana
Métodos de
Análisis:Cromatograf
íaElectroforesi
s
Materiales:Columnas,
Resinas, Tubos de ensayo. Gel,
Placas. Electrodos, Patrones, Reactivos
PLA
N D
E
TR
AB
AJ
O