tesina alejandra calderón

5/13/2018 Tesina Alejandra Calder n - slidepdf.com

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Universidad de Granada

Facultad de Medicina

Departamento de Antropología Física

Estudios sobre ADN antiguo.

Posibilidades desde

una Perspectiva Histórica:

El caso de las Islas Canarias

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

ALEJANDRA CALDERÓN ORDÓÑEZ

MÁSTER EN ANTROPOLOGÍA FÍSICA Y FORENSE

EVOLUCIÓN HUMANA, PALEOANTROPOLOGÍA Y PALEOECOLOGÍA

TUTOR:Dr. Juan Carlos Álvarez Merino

DIRECTORES:Dra. Matilde Arnay de La RosaDra. Rosa Irene Fregel Lorenzo

GRANADA, 2010



Facultad de Medicina

Departamento de Antropología Física

Estudios sobre ADN antiguo.

Posibilidades desde

una Perspectiva Histórica:

El caso de las Islas Canarias

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

MÁSTER EN ANTROPOLOGÍA FÍSICA Y FORENSE

EVOLUCIÓN HUMANA, PALEOANTROPOLOGÍA Y PALEOECOLOGÍA

Vº Bº del TutorTrabajo de investigación que presentala Lcda. Alejandra Calderón Ordóñez,tutelado por el Doctor Juan CarlosÁlvarez Merino, Departamento deMedicina Legal, Toxicología yPsiquiatría (UGR); y dirigido por la Dra.Matilde Arnay de La Rosa,Departamento de PrehistoriaAntropología e Historia Antigua (ULL);y la Dra. Rosa Irene Fregel Lorenzo,Departamento de Genética (ULL).

Septiembre de 2010



ÍNDICE

............................................................................................CAPÍTULO 1 - Introducción 2

CAPÍTULO 2 - .......Estado de la cuestión en los estudios de ADN antiguo 3

.............................................2.1. Historia de los estudios de ADN antiguo 3

................................................................................2.2. ADN mitocondrial 4

......................................................................2.3. Fuentes de ADN antiguo 5

CAPÍTULO 3 - ......................Particularidades del ADN antiguo y su estudio 7

........................................................................3.1. La molécula del ADN 7

..................................................................................3.2. La degradación 7.............................................................................3.3. La Contaminación 12

3.4. Los inhibidores................................................................................. 14

CAPÍTULO 4 - ........Posibles soluciones a las dificultades metodológicas 16

.............................4.1. Determinación de la presencia de ADN endógeno 16

............................4.2. Solventando las consecuencias de la degradación 17

......................................................4.3. La lucha contra la contaminación 19

..................................................4.4. Cómo contrarrestar los inhibidores 20

.......CAPÍTULO 5 -Métodos de extracción, amplificación y secuenciación 24

5.1. Métodos de extracción .............................................………………….. 24

................5.2. Métodos para aumentar el éxito de la PCR ………………….. 26

...........................5.3. Métodos de secuenciación de segunda generación 28

5.4. Criterios de autentificación .............................................................. 29

.......................CAPÍTULO 6 - Algunas áreas de aplicación del ADN antiguo 34

...........................CAPÍTULO 7 -Estudios de ADN sobre la población canaria 38

7.1. Fundamentación de los estudios genéticos...............………………….. 38

7.2. Los Primeros estudios genéticos en la población canaria: Grupos

sanguíneos y polimorfismos enzimáticos……………………………………….. 39

7.3. Marcadores uniparentales…………………………………………………….. 42

7.3.1. Linajes maternos: el ADN mitocondrial……………………………. 42

7.3.2. Linajes paternos: el cromosoma Y………………………………….. 45

7.4. Los marcadores autosómicos: el sistema CD4/Alu……………………… 47



7.5. Estudios de ADN antiguo en Canarias……………………………………… 48

CAPÍTULO 8 -Métodos para determinar el sexo genético en restos

................................................................................................................................humanos . 51

8.1. La amelogenina........................................................…………………... 51

8.2. El cromosoma Y para confirmar el sexo……………………………………. 56

8.3. El papel de los SNPs y las inserciones Alu…………………………………. 58

CAPÍTULO 9 - Importancia histórica de los estudios genéticos para la.................................................................................................determinación del sexo 61

...............................CAPÍTULO 10 - Posibilidades en el archipiélago Canario 68

CAPÍTULO 11 - Propuesta metodológica: Posibles enfoques de los.....................................................................estudios de ADN antiguo en Canarias 72

.......................................................................................CAPÍTULO 12 - Conclusiones 75

..........................................................................................CAPÍTULO 13 - Bibliografía 77



Agradecimientos

En primer lugar quisiera agradecer a mi familia, y especialmente a mis padres y a José

Pablo, por creer en mi y en este loco sueño, sin ustedes me habría rendido hace tiempo.

A Matilde por apoyarme, por ayudarme a solucionar problemas, por ser un modelo aseguir y por estar ahí a lo largo de este camino, espero seguir recorriéndolo con ella a mi

lado.

Al grupo de bioantropología de la Universidad de La Laguna, Aioze, Guacimara, Alejandro

y Nuria, gracias por compartir este sueño y por mantener la ilusión en nuestro proyecto de

futuro, espero que sigamos trabajando juntos mucho tiempo.

A Vicente por haberme abierto las puertas del laboratorio y haberme ayudado en mis

primeros pasos dentro de un universo nuevo para mi, como lo era la genética.A Rosi, la mejor profesora de biología molecular que uno puede tener, gracias por todos

los buenos consejos y correcciones, espero estar a la altura de todo lo que he recibido.

A Bertila y a Cristo, por ser un apoyo incondicional a pesar de seguir caminos diferentes.

Gracias por todas las oportunidades que me han dado, espero seguir siendo infiel a mis

muertos muchos veranos más.

A toda la gente de El Salt, tanto a los que llevan muchos años como a los que acaban de

llegar, por hacer de cada verano una experiencia única en la que recargar energías paraseguir trabajando. A Jorge, Diana, Caro, Richard, Leo y Efra gracias por ser grandes

compañeros de laboratorio, por crear un ambiente de trabajo estupendo y hacerme

partícipe de grandes conversaciones.

A J. Carlos Alvarez, por su apoyo durante mi estancia en Granada, gracias por ayudarme

a saber por donde empezar.

A todos mis amigos de El Puerto y de Bogotá, por estar ahí cuando los he necesitado y

por escucharme aunque no siempre supieran de lo que les estaba hablando.

Estudios sobre ADN antiguo. Posibilidades desde una Perspectiva Histórica: El caso de las Islas Canarias

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1. Introducción

El presente trabajo se inserta dentro de una de las vías de investigación del grupo

de bioantropología de la Universidad de La Laguna. Con él se pretende dar continuidad auna disciplina, la del ADN antiguo, que hasta el momento ha dado muy buenos

resultados. Se lleva a cabo con el convencimiento de que una profundización en este tipo

de investigaciones, desde el punto de vista histórico, puede resultar de gran interés dentro

de la vocación multidisciplinar del equipo de investigación.

Teniendo en cuenta que el objetivo principal de este trabajo es la interpretación

histórica, resulta fundamental la participación en los estudios de ADN antiguo deinvestigadores con una formación en Historia, que les permita plantear determinadas

preguntas, así como interpretar los resultados desde una perspectiva que realmente

contribuya a la construcción de las explicaciones históricas. Como consecuencia resulta

necesario una formación multidisciplinar, para que los historiadores cuenten con

herramientas técnicas y metodológicas dentro del campo de la biología molecular que les

permitan resolver algunos de los problemas planteados.

Este trabajo es una consecuencia directa de esa necesidad de formación en el

campo del ADN antiguo. Será la base metodológica que servirá de fundamento para el

desarrollo de trabajos posteriores encaminados hacia una tesis doctoral. Por ello, se

plantearon unos objetivos que constituyan, al finalizar esta fase de la investigación, la

base teórico-metodológica de las investigaciones posteriores, tanto en cuestiones de

biología molecular como en posibles vías de trabajo en el archipiélago canario.

Dentro de esos objetivos se encuentra un acercamiento a la conformación de los

estudios de ADN antiguo como disciplina, para entender el contexto en el que se inserta

esta línea de investigación.

Resulta fundamental conocer y entender las principales características de las

muestras utilizadas en los estudios de ADN antiguo, para poder comprender las

dificultades metodológicas de éstas y las posibles soluciones que se han propuesto parasubsanar estos problemas.


2



Teniendo en cuenta la perspectiva histórica de este trabajo, es fundamental realizar

un repaso sobre algunos de los principales estudios históricos que han utilizado los

análisis de ADN antiguo como parte de su metodología, sobre todo aquellos en los que

éstos fuesen fundamentales para sustentar las conclusiones obtenidas. Dentro de estalínea, otro objetivo será intentar determinar algunas de las aportaciones que puede dar la

determinación genética del sexo dentro del campo de la historia, y las problemáticas

particulares de estos enfoques. Todo lo anterior permitirá plantear posibles objetos de

estudio y vías de investigación con los estudios de ADN antiguo para una futura tesis

doctoral.

2. Estado de la cuestión en los estudios de ADN antiguo

2.1. Historia de los estudios de ADN antiguo

La historia del ADN antiguo se remonta poco en el tiempo, pero desde sus inicios

ha tenido un gran impacto mediático que condujo a especulaciones, tanto en la prensa

como en las películas, que hicieron creer que era posible devolver la vida a criaturas

antiguas (Wayne et al., 1999). Cada nuevo descubrimiento servía para confirmarle alpúblico la impresión de que los científicos se estaban acercando rápidamente hacia esa

meta.

Los primeros trabajos sobre ADN antiguo aparecieron a mediados de los ochenta

cuando Higuchi (1984) obtuvo fragmentos del ADN mitocondrial de la extinta quagga,

usando un espécimen conservado en un museo. Poco tiempo después, Pääbo (1985)

publicó una secuencia parcial del ADN mitocondrial de un momia egipcia de 2430 años.Ninguno de estos dos análisis pudo ser reproducido, y en la actualidad las secuencias

obtenidas son vistas con cierta cautela. Lo anterior no significa que, en su momento, estos

estudios no tuvieran un gran impacto, porque implicaban la posibilidad de que las

moléculas de ADN sobrevivieran largos periodos de tiempo. La investigación en ADN

antiguo presenció un avance substancial con el advenimiento de la PCR, reacción en

cadena de la polimerasa, que permitió la amplificación de cantidades muy pequeñas de

ADN (Mullis et al., 1986). La aplicación de esta técnica pronto revelaría los dos grandesproblemas del ADN antiguo, la degradación y las grandes posibilidades de contaminación

(Paabo et al., 1989).


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En los últimos años se ha ido confirmando el límite teorético de supervivencia del

ADN alrededor de 100.000 años, con algunas excepciones en el permafrost que tampoco

superan el millón de años. Por ello, los primeros estudios que se publicaron con

secuencias de una antigüedad cercana al millón de años, son cada vez vistos con mayor escepticismo (Cooper and Wayne, 1998). Algunas de estas investigaciones iniciales

serían las realizadas sobre fósiles de magnolia con una antigüedad de entre 17 y 20

millones de años. Su publicación alentó a muchos investigadores a buscar ADN de

animales como los dinosaurios o insectos preservados en ámbar; uno a uno estos

resultados fueron cuestionados mostrando que en su gran mayoría eran consecuencia de

la contaminación (Wayne et al., 1999). Incluso se demostró que insectos mucho más

recientes preservados en copal, un estado anterior al ámbar de las mismas resinas, eraninservibles como fuente de ADN antiguo, con lo que se evidenciaba la diferencia entre una

preservación morfológica y la conservación de moléculas de ADN (Lindahl, 1997).

2.2. ADN mitocondrial

Dentro del campo del ADN antiguo el ADN mitocondrial ha jugado un papel

fundamental debido a sus peculiares características (Pakendorf and Stoneking, 2005,Álvarez JC, 2001). En la especie humana, éste consiste en una molécula circular

bicatenaria, compuesta por 16.569 ± 20 pares de bases. La primera característica que

hace al ADN mitocondrial especialmente útil para los estudios de muestras antiguas es el

gran número de copias que hay en cada célula, desde cientos hasta miles de ellas, en

comparación con la dos copias por célula del ADN nuclear; lo que le da una mayor

probabilidad per-locus de ser recuperado usando las técnicas comunes de laboratorio. La

segunda característica es la herencia por vía materna exclusivamente, lo que permite alos investigadores trazar los linajes maternos de las poblaciones a lo largo del tiempo. La

última de estas características es la mayor tasa de mutación del ADN mitocondrial en

comparación con el nuclear, lo que resulta ventajoso al estudiar los cambios que se han

producido a lo largo del tiempo. El ADN mitocondrial está compuesto principalmente por

ADN codificante, con la excepción de una fragmento largo de aproximadamente 1100

pares de bases conocido como la región control. Dentro de esta zona se encuentra la

región hipervariable, que por su alta tasa de sustitución (la más alta de todo el ADNmitocondrial), se ha convertido en el centro de las investigaciones de ADN antiguo.


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Los estudios iniciales sobre la variación del ADN mitocondrial se basaron en el

análisis de RFLPs. Con la llegada de la PCR y de los métodos de secuenciación, se

empezaron a hacer RFLPs de los productos de la PCR, así como análisis de las

secuencias del primer sector hipervariable (HVR1), que se encuentra dentro de la regióncontrol (Pakendorf and Stoneking, 2005). Será en 2001 cuando se secuenciará el primer

genoma mitocondrial antiguo en su totalidad (Ho and Gilbert, 2010), cuando dos equipos

presentaron el genoma del moa (Cooper et al., 2001, Haddrath and Baker, 2001). Pasaron

cinco años hasta que en 2006 se presentaron dos secuencias independientes del mamuth

lanudo (Krause et al., 2006, Rogaev et al., 2006). La realización de estos genomas ha

sido posible gracias a mejoras técnicas y metodológicas en la secuenciación, como la

PCR de emulsión y la pirosecuenciación.

2.3. Fuentes de ADN antiguo

Una de las primeras cuestiones que se deben explicar son las posibles fuentes de

ADN antiguo. Se debe partir de la base de que cualquier substancia de origen biológico

es candidato potencial para proporcionar ADN antiguo, aunque algunas de ellas suelen

dar mejores resultados (O'Rourke et al., 2000).

El hueso suele considerarse como una fuente óptima de ADN antiguo ya que la

unión del ADN con la hidroxiapatita suele ayudar a disminuir su degradación. Se ha

demostrado la relación entre la preservación morfológica a nivel microscópico y la

posibilidad de obtener ADN antiguo, aunque no hay necesariamente una relación directa

entre éstas y la antigüedad de la muestra. La mala preservación a nivel macro, no

siempre implica una mala preservación a nivel micro, por lo que en principio cualquier muestra es potencialmente portadora de ADN. En la medida de lo posible deben tomarse

muestras de huesos sin lesiones, ya que éstas son una fuente potencial de

contaminación; también se debe intentar que se obtengan de regiones anatómicas con la

menor importancia antropológica y morfológica posible.

El uso de dientes como fuente de ADN antiguo tiene múltiples ventajas. Entre ellas

la de poder disponer de muestras independientes y múltiples de cada individuo. Se debenelegir dientes sin caries porque éstas permiten la entrada de ADN contaminante dentro de

la cavidad pulpar. El ADN puede ser extraído bien triturando el diente hasta convertirlo en


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polvo, o seccionando el diente para extraer el material del interior de la cavidad pulpar.

Este último método es especialmente útil en las muestras arqueológicas ya que no se

altera la morfología del diente.

En el caso de utilizar tejidos blandos como fuente de ADN, se debe intentar escoger tejidos que no se encuentren en la superficie, para disminuir el riesgo de

contaminación por manipulación. Parece ser que el tejido blando disecado es una de las

mejores fuentes de ADN, porque la deshidratación protege al ADN de procesos de

descomposición como la hidrólisis, de la que se hablará más adelante. Este tipo de tejidos

también presentan una mayor cantidad de inhibidores, que como se hablará en apartados

posteriores, dificultan la amplificación del ADN.

Además de estas fuentes principales, existen otros lugares de donde es posible

obtener ADN. Uno de estos son los pelos, aunque es bastante difícil obtener ADN cuando

estos no tienen raíz, como suele suceder en los casos arqueológicos, autores como

Gilbert (2007b) opinan que pueden ser una buena fuente de ADN . Los coprolitos son otra

fuente potencial de ácidos nucleicos, aunque su utilización implica algunos problemas

específicos que se discutirán posteriormente. Se han realizado algunos intentos con

plantas de hasta 500 años de antigüedad, de los que de momento se han obtenidoalgunos resultados prometedores. También se ha logrado obtener ADN antiguo a partir del

estudio de sedimentos (Hofreiter et al., 2003, Willerslev et al., 2003).


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3. Particularidades del ADN antiguo y su estudio

3.1. La molécula de ADN

Para la realización de los estudios de ADN antiguo es necesario considerar algunas

de las características particulares de las muestras con las que se trabaja. Éstas hacen

necesario una aproximación un poco diferente a la que es usual en los estudios de ADN

moderno.

En primer lugar se deben aclarar algunas de las características básicas del ADN

que permitan entender las particularidades descritas en los siguientes apartados. Lamolécula de ADN es un polímero compuesto de unidades de azúcar desoxirribosa 2’

unidas entre sí a través de enlaces fosfodiéster. A cada azúcar se une una purina

(adenina o guanina) o una pirimidina (citosina o timina) en la posición 1’ gracias a un

enlace glucosídico. En los organismos vivos la molécula de ADN está constantemente

hidratada, por lo que nunca está realmente seca. Además el ADN nuclear se encuentra

unido fuertemente alrededor de proteínas histonas que al parecer absorben algunos de

los daños producidos por el ambiente alrededor de las moléculas (Poinar, 2002).

El ADN antiguo presenta tres principales problemas que se producen a raíz de

algunas de las características de las moléculas, de los procesos postdeposicionales de

los restos tras la muerte de los individuos y de los métodos de laboratorio necesarios para

su análisis. Estos problemas son la degradación, la contaminación y la presencia de

inhibidores.

3.2. La degradación

Durante la vida de cualquier organismo, su ADN está siendo constantemente

sometido a diferentes procesos de degradación. Sin embargo, los seres vivos cuentan con

mecanismos enzimáticos de reparación del ADN. Estos mecanismos dejan de funcionar

en el momento de la muerte, haciendo que los daños ejercidos en el ADN se vayan

acumulando con el paso del tiempo. A continuación se explicarán los principales procesosde degradación y sus consecuencias en los estudios de ADN antiguo.


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Dentro de los tipos de degradación más comunes encontramos la ruptura de las

cadenas de ADN, las lesiones por oxidación, los “crosslinks” de ADN y las lesiones

hidrolíticas. Estos procesos se van acumulando progresivamente hasta que el ADN pierde

su integridad y se descompone con una pérdida irreversible de la información contenidaen la secuencia de nucleótidos. (Paabo et al., 2004). Ahora se procederá a explicar las

principales características de este tipo de lesiones.

Una de las consecuencias de la degradación es la disminución del tamaño en las

cadenas de ADN, quedando reducidas a entre 100 y 500 pb en promedio. Este descenso

se debe tanto a procesos enzimáticos que suceden poco tiempo después de la muerte

como a la fragmentación hidrolítica no enzimática, de los enlaces fosfodiester, en laestructura del fosfato y el azúcar, que generan cadenas simples. Los enlaces glucosídicos

entre las bases nitrogenadas y los azúcares también son sujetos de fragmentación

hidrolítica dando como resultado posiciones sin base. (Paabo et al., 2004).

Además de las lesiones ya mencionadas hay otras que también afectan a la

longitud de las secuencias que es posible amplificar con la PCR. Este segundo tipo de

lesiones bloquean la elongación de las hebras de ADN por la Taq polimerasa. Muchas deestas lesiones son inducidas por radicales libres, como los radicales de peróxido (O₂), los

de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) y los radicales hidroxilo (OH), que se generan, entre

otras causas, como consecuencia de la radicación de fondo.

Existen algunos lugares dentro de las cadenas de ADN que son más susceptibles

al ataque de la oxidación; entre estos están los enlaces dobles, tanto de las pirimidinas

como de las purinas. (Paabo et al., 2004). El ADN extraído de restos fósiles es susceptiblea ser fragmentado por la enzima endonucleasa III, que es específica de las pirimidinas

oxidadas y que bloquea la acción de la Taq polimerasa.

Otro tipo de lesión son los “cross-links” que también bloquean la acción de la Taq

polimerasa, uno de estos casos serían los productos de Maillard. Identificados

principalmente en coprolitos, estos son formados por la reacción de los grupos carbonilo,

que reducen los azúcares con los aminos primarios de los aminoácidos (Poinar, 2002).


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También existen otro tipo de daños, muchos de ellos desconocidos, comunes en el

ADN antiguo y que generan problemas porque, a pesar de que la amplificación es posible,

generan la incorporación de bases equivocadas durante la PCR. La forma más común de

estas modificaciones es la pérdida hidrolítica de los grupos amino de las bases adenina,citosina, 5-metilcitosina y guanina, dando como resultado hipoxantina, uracilo, timina y

xantina, respectivamente. Los productos de la desaminización de la citosina (uracilo), del

5-metilcitosina (timina) y de la adenina (hipoxantina) tienen una especial relevancia en la

amplificación del ADN antiguo porque generan la inserción incorrecta de bases (A en lugar

de G y C en lugar de T) en el momento de las síntesis de nuevas hebras por parte de la

polimerasa. (Paabo et al., 2004). Actualmente también se ha llegado a la conclusión de

que las modificaciones son mayoritariamente de C a U (Brotherton et al., 2007, Gilbert etal., 2007a, Stiller et al., 2006). Esto traerá como consecuencia que los productos

amplificados tengan un sesgo hacia transiciones de CG a TA y una menor cantidad de AT

en GC. Sin embargo, estas reacciones bioquímicas pueden ser lo suficientemente

limitadas como para que el evento de mutación original pueda ser identificado(Mulligan,

2005).

Otra consideración importante es que este tipo de lesiones al parecer no ocurrende una forma aleatoria sino que se concentran en unos puntos calientes o “hot spots”,

existiendo al parecer una relación entre estos puntos y los lugares de sustituciones

evolutivas, por lo que a la hora de analizarlos pueden llevar a errores, al ser confundidos

con cambios evolutivos esperados. (Willerslev and Cooper, 2005)

Estos procesos de degradación son similares a algunos procesos químicos que

pueden ser reproducidos y estudiados en el laboratorio. Los resultados de este tipo deinvestigaciones sugieren que bajo las condiciones ambientales de la mayoría de los

depósitos arqueológicos y geológicos, la información genética relevante no se conserva

por más de 10⁵ años. (Chelomina, 2006).

También debe tenerse en cuenta que, organismos como las bacterias, los hongos y

los insectos, pueden afectar la integridad del ADN. (Poinar, 2002). Algunos autores

recogen estudios en los que se plantea que el rompimiento de las moléculas de ADN seda principalmente en los momentos cercanos a la muerte de un ser vivo, sobre todo en el


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hueso porque después las moléculas de ADN se unirían a la hidroxiapatita ralentizando

las lesiones hidrolíticas ya mencionadas. (O'Rourke et al., 2000).

Aunque no todos los científicos están de acuerdo sobre cuál es el límite temporal

para la conservación del ADN, se suele dar un límite general en torno a los 100.000 años.Lo que si está bastante claro es que la conservación depende más de las condiciones

ambientales específicas de los diferentes lugares de deposición de los restos que del

tiempo transcurrido. Es así como Smith (2003) plantea la importancia de conocer lo que él

denomina como la “historia térmica” de unos restos para poder evaluar la posible

conservación del ADN.

Es necesario resaltar que el índice de degradación del ADN no es lineal (Yang,1997), al parecer la degradación se reduce de manera importante después de un

decaimiento rápido que sucedería a la muerte de un ser vivo. Como ya se ha mencionado

la degradación de ADN depende de factores como la temperatura, el pH y la fuerza iónica

de la solución acuosa. También se ha detectado que la presencia de ciertos químicos

orgánicos, como los tocoferoles y los flavonoides, que son liberados por el propio

organismo o que son producidos por microorganismos en el sedimento, pueden inhibir la

función de algunas de las enzimas que destruyen el ADN.

Basándose en la manera como actúan los procesos de degradación descritos

anteriormente, se podría pensar que las bajas temperaturas y los ambientes secos son

algunas de las condiciones ideales para la preservación del ADN (Willerslev and Cooper,

2005). Es por esto que los hielos glaciares y el permafrost (tierras permanentemente

congeladas), con sus bajas temperaturas constantes, parecen ser apropiados para la

conservación a largo plazo de microorganismos y biomoléculas, como explicandetalladamente Willerslev et al (2004). Los ADNs antiguos con una cronología más lejana

que han sido autentificados vienen todos del permafrost. Entre ellos se incluye el ADN

mitocondrial de un mamut de más de 50.000 años, el ADN mitocondrial de un bisonte de

65.000 años, así como el ADN proveniente de cloroplastos de plantas de entre 300 y

400.000 años. Además de las bajas temperaturas, otras características de este tipo de

ambientes como la rápida deshidratación y las altas concentraciones salinas también

pueden haber contribuido a la conservación de las moléculas de ADN, pero incluso aquíhabría un límite de conservación que no superaría el millón de años (Willerslev and

Cooper, 2005).


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Además de los factores medio ambientales de los lugares de deposición, el

almacenamiento posterior a la excavación también puede ser un factor determinante para

la conservación del ADN. Como explica Geigl (2008) cuando se compara la cantidad de

ADN preservado en huesos fósiles que han sido sometidos a procedimientosarqueológicos normales, como lavado, secado y almacenamiento en lugares sin aire

acondicionado, y aquella encontrada en restos recién excavados se ha podido determinar

que es mucho mayor la degradación del ADN durante el almacenamiento que mientras los

restos están enterrados. De hecho el índice de éxito de las amplificaciones por PCR de

huesos excavados recientemente fue de más del doble (46%) sobre aquellos que fueron

almacenados siguiendo los procedimientos tradicionales (18%). Incluso la cantidad de

fragmentos de ADN con una longitud promedio de 150 pb puede llegar a ser seis vecessuperior en los huesos excavados hace poco que en aquellos sometidos a procedimientos

“estándar”. El autor concluye que el índice de degradación del ADN en fósiles

conservados en regiones con un clima moderado, como el norte de Francia, puede llegar

a ser 70 veces más rápido que en aquellos restos que se encuentren directamente en el

sedimento. Una de las posibles explicaciones para este fenómeno es que la temperatura

de almacenamiento estaría por encima de la temperatura de preservación, a lo que se

uniría a un descenso del pH y a una desalinización de los huesos como consecuencia dellavado de los mismos.

Una vez explicados algunos de los principales procesos de degradación de las

moléculas de ADN, es fundamental repasar brevemente las consecuencias de estos

fenómenos, sobre todo las incorporaciones erróneas de nucleótidos. Como explica Pääbo

(2004) la existencia de estas bases modificadas suele ser evidente cuando se clonan los

productos de la PCR provenientes de restos antiguos y el número de diferencias entre losdistintos clones es bastante superior a la observada en las amplificaciones de ADN

moderno. Hay dos tipos de evidencias para detectar la desaminización como la principal

causa de las incorporaciones equivocadas. La primera es que el ADN antiguo es sensible

a la ADN-uracilo-glicocilasa, una enzima que retira el uracilo del ADN. En segundo lugar

se producen un gran número de cambios de C a T y de G a A que se observan en los

clones de los productos amplificados. Estos cambios serían consistentes con la presencia

de residuos de C desaminizados que son idénticos a los residuos de uracilo (U) y quecausan la incorporación de residuos de A en lugar de los de G por la Taq polimerasa.


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Otros de los posibles efectos de la degradación para los estudios de ADN antiguo

son los presentados por Mulligan (2005). Entre ellos se encuentran la limitación en la

longitud de los productos de amplificación como consecuencia de la fragmentación del

ADN. Los bajos o casi indetectables niveles de ADN antiguo que permiten la amplificaciónpreferencial de ADN contaminante, de lo que se hablará en detalle en el apartado

siguiente. Marlmström (2007) encontró una relación proporcional entre el incremento de

moléculas endógenas amplificadas y la reducción del tamaño del amplicon. La inserción

aleatoria de nucleotidos por la polimerasa en las posiciones sin base y la denominada

“Jumping PCR” en la que fragmentos discontinuos de ADN se terminan uniendo a lo largo

de la reacción de amplificación.

3.3. La contaminación

El segundo problema al que se enfrentan los investigadores de ADN antiguo es la

posibilidad de contaminación con ADN moderno. Este peligro se debe a que la técnica

principal que permite la recuperación de ADN tan degradado como es habitual en las

muestras antiguas, la PCR, necesita una gran sensibilidad para lograr este objetivo. Esto

puede ser contraproducente porque será igualmente sensible a contaminacionesmodernas mínimas y al estar este ADN en mejores condiciones, será preferentemente

amplificado sobre las muestras en peor estado.

Teniendo en cuenta este factor, Geigl (2008) hace una clasificación de los

diferentes momentos en que las muestras pueden ser contaminadas y de qué manera

esto ocurriría.

El primer caso sería la contaminación post-excavación en la que, como

consecuencia de la rápida degradación del ADN endógeno una vez que los huesos fósiles

son desenterrados y sometidos a procesos como el lavado, el secado y el

almacenamiento, se incrementa la posibilidad de obtener falsos positivos provenientes de

ADN moderno, sobre todo si se compara con otro tipo de muestras como aquellas

provenientes del permafrost. Esto sucede porque entre menor sea la cantidad de ADN

endógeno presente en un hueso, mayor será el riesgo de que el ADN modernocontaminante, proveniente del ambiente, sea finalmente analizado. Existen algunas

investigaciones donde se ha intentado rastrear el ADN aportado por los excavadores,


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como sería el caso de un estudio hecho sobre dientes humanos provenientes de

contextos neolíticos (Sampietro et al., 2006) o el de huesos con antigüedades entre 200 y

3300 años que fueron manipulados de forma indebida intencionalmente (Bouwman et al.,

2006). Otro estudio que confirmaría este resultado fue el realizado en huesos de perro

almacenados en museos en los que se detecto la presencia de ADN humano (Malmstromet al., 2005). Un último ejemplo sería el trabajo realizado sobre muestras de la Isla

Canaria de La Palma, en el que se recuperó el ADN externo de dientes y se encontró que,

en la mayoría de los casos, aunque se podía recuperar el ADN de los antropólogos, éste

no coincidía con el ADN endógeno (Fregel et al., 2009b).

Algunas fuentes de contaminación pueden provenir del sudor de los excavadores e

investigadores, así como del agua utilizada en el lavado que se suele realizar de loshuesos. En cuanto a la profundidad de esta contaminación se han presentado resultados

contradictorios. Mientras que algunos estudios muestran que la contaminación se

mantiene en la superficie del hueso, no penetrando más allá de 1 o 2 mm, otros

evidencian como la manipulación de huesos humanos, en este caso provenientes de un

contexto medieval y que habían sido excavados en los años setenta, no mostraban

coincidencias con el ADN de los investigadores, por lo que se infirió que los perfiles

contaminantes encontrados pertenecían a los excavadores iniciales (Gilbert et al., 2006).La explicación que se da a este fenómeno es que los huesos y dientes fosilizados pueden

ser muy susceptibles a la contaminación con ADN moderno durante el proceso de

excavación, ya que los poros de los tejidos calcificados aún estarían abiertos, cerrándose

en el posterior proceso de secado.

El problema es que el ADN exógeno puede mostrar las mismas sustituciones en las

bases de los nucleotidos que el ADN antiguo, en éste último como consecuencia del dañode las bases, pudiéndose interpretar entonces el moderno como antiguo con lo que se

producirían unos resultados falsos (Sampietro et al., 2006).

El segundo momento en el que se puede producir la contaminación es en los

procesos de extracción del ADN y de la PCR. Podemos encontrar moléculas de ADN en el

ambiente, en este caso aportadas por los investigadores, siendo inevitable su presencia

en los laboratorios y en los reactivos. Partiendo de la base de que el ADN humano y delos microbios está de forma ubicua en todos los laboratorios (Willerslev and Cooper,

2005), resulta prudente asumir que todos los reactivos y herramientas están


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contaminados con ADN humano y microbiano cuando los envía el proveedor. Una

limpieza de los reactivos, por ejemplo con ultrafiltración, y de las distintas herramientas

resulta esencial. Los reactivos y el equipo comercial marcado como estéril no están

garantizados como libres de células viables o de ácidos nucleicos.

El último tipo de contaminación es la de arrastre o “carry over”; ésta se produce

como resultado de la presencia de miles de millones de copias de ADN procedentes de

amplificaciones y clonaciones anteriores que se encuentran muy concentradas, por lo que

es relativamente fácil que se dispersen por el ambiente. Esto tiene una gran relevancia ya

que estas moléculas son idénticas a la que se utilizaron en primer lugar, pudiendo llegar a

distorsionar las replicaciones que se hagan en un mismo laboratorio. Las cifras

presentadas por Willerslev (2005), permiten hacerse una idea de la magnitud delproblema. Una reacción de PCR exitosa puede contener entre 10¹² - 10¹⁵ moléculas

amplificadas en un volumen inferior a los 50 µl. Por ello el movimiento del aire cuando se

abren los tubos o la transferencia de líquidos crea y dispersa gotas de un tamaño mínimo,

que pueden contener más de un millón de copias de la molécula origina por cada 0.005

µl. Esto hace que los productos de la PCR se puedan dispersar rápidamente a través de

las superficies del laboratorio, de los corredores e incluso expandirse a edificios enteros

por medio del movimiento del personal o de los sistemas de ventilación. Teniendoentonces en cuenta que una gota ínfima puede contener fácilmente mil veces más ADN

amplificable que el contenido de un gr de muestra de especímenes antiguos (10⁵ - 10⁶

copias), se hace indispensable que los laboratorios de ADN antiguo estén aislados tanto

física como logísticamente de otros estudios de biología molecular. Hay otro tipo de

medidas para reducir la contaminación que serán discutidas en apartados posteriores.

3.4. Los inhibidores

Un tercer problema que se presenta en los estudios de ADN antiguo son los

denominados inhibidores de la PCR. Son sustancias que se encuentran junto al ADN

antiguo, sobre todo provenientes del medio ambiente, y cuyo problema es que evitan que

la Taq Polimerasa realice su trabajo durante la reacción en cadena. La mayor parte de

estos según O’Rourke (2000) son taninos, ácidos húmicos y ácidos fúlvicos, todos ellos

comunes en los procesos de degradación del suelo. Junto con los productos de Maillard,que ya fueron mencionados con anterioridad, los inhibidores de este tipo suelen dar una


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coloración marrón a los extractos de ADN. Kemp (2006) hace referencia a otros

inhibidores, además de los ya mencionados, y a sustancias como los productos de la

porfirina, hematinas y el colágeno tipo I que actúan como inhibidores; junto a ellos

menciona a los productos de Maillard que, aunque no desactivan a la polimerasa, pueden

ser considerados inhibidores ya que el ADN atrapado en estos productos, derivados de lacondensación de algunos azúcares, no puede ser alcanzado por la polimerasa.

Además de la coloración, los extractos con inhibidores al ser sometidos a

electroforesis suelen aparecer como una “nube” borrosa, entre azul y verde cuando se les

ilumina con luz UV. Cuando no se amplifica ADN, la presencia de inhibidores puede

sospecharse si no se producen dímeros de primer durante la PCR.

Estos tres son los principales problemas de los estudios de ADN antiguo y por lo

que muchos de los resultados resultan cuestionables. Sin embargo, desde las primeras

publicaciones se ha producido un gran avance en la búsqueda de técnicas que aumenten

la fiabilidad de los estudios que se realizan.


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4. Posibles soluciones a las dificultades metodológicas

Desde que se realizaron los primeros estudios sobre ADN antiguo se empezaron a

buscar estrategias para superar algunos de los problemas que plantean las característicasde este tipo de moléculas. En este apartado se explican algunas de las propuestas que se

han publicado en los últimos años para los distintos retos metodológicos que plantean los

estudios de ADN antiguo.

4.1. Determinación de la presencia de ADN endógeno

Teniendo en cuenta que la mayoría de las muestras son ejemplares únicos con unalto valor arqueológico y el carácter destructivo, en muchos casos, de este tipo de

análisis, es necesario buscar medidas que nos ayuden a seleccionar aquellas muestras

con más posibilidades de dar resultados positivos. Existen varias técnicas denominadas

“screening methods” o métodos de rastreo que intentan determinar las posibilidades de

que una muestra contenga ADN endógeno.

Así Hofreiter (2001) plantea que los métodos de rastreo rápidos son cruciales paraidentificar las muestras que están tan mal preservadas que no vale la pena intentar

amplificarlas. Resalta los análisis de aminoácidos como un método que ha demostrado

ser muy útil para evaluar la conservación del ADN. Destacan aquellos procedimientos que

tienen en cuenta la cantidad total de aminoácidos preservados en un espécimen, su

composición y la extensión de la racemización de varios de ellos. Esta última consiste en

el cambio de la estructura tridimensional de los aminoácidos con el paso del tiempo.

Este tipo de análisis pueden ayudar a sustentar la autenticidad de las secuencias

de ADN obtenidas de un espécimen, ya que demuestran que las condiciones de

preservación son tales que la obtención de macromoléculas es posible. Otro método

posible, aunque menos extendido y estudiado, para intentar ver la presencia de ADN

antiguo es el de la pirólisis unida con una cromatografía de gases y espectrometría de

masas (GC/MS). Consiste en un análisis en el que las macromoléculas son

descompuestas con calor y los productos de esta reacción son luego analizados.


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Existen otros métodos para medir el nivel de degradación de los huesos, muchos

de ellos basados en distintas aplicaciones de los rayos X, en los que no se entrará en

excesivo detalle pero que es necesario por lo menos mencionar. Hiller (2006) hace

referencia a algunos de ellos como el uso del espectro de transformación de infrarrojos deFourier (FTIR) para calcular los índices de cambio en los cristales del hueso, la difracción

de rayos X (XRD) para determinar la composición de los cristales y la densidad del hueso,

así como la emisión de rayos X de partículas inducidas (PIXE) que examina las

substituciones químicas diagenéticas en la estructura mineral. Sin embargo, Hiller (2006)

se centra en la propuesta de otro método, la dispersión de rayos X en ángulos pequeños

(small-angle X-ray scattering o SAXS) que se considera de utilidad porque permite

examinar los cristales de hueso en función de su distribución por tamaños,proporcionando un indicador directo de la preservación o alteración de los propios

cristales biogénicos. El estudio de Hiller (2006), profundiza en la aplicación de este

método y su importancia para determinar la buena conservación de los tejidos óseos,

además de la relación entre la alteración de la fase mineral del hueso y la posible

conservación de biomoléculas como el ADN.

4.2. Solventando las consecuencias de la degradación

Aunque a través de los métodos de rastreo se considere que una muestra está lo

suficientemente bien preservada como para realizar estudios de ADN antiguo, esto no

significa que ésta no se encuentre degradada de una u otra manera. Es por eso que se

han realizado importantes esfuerzos para solventar algunos de los efectos de la

degradación. En el caso de los “cross-links” Reiss (2006) recoge algunas de laspropuestas que se han planteado para contrarrestarlos. Entre ellas está un protocolo que

busca reparar los “cross-links” entre las distintas hebras antes de la PCR, sometiendo a

las muestras a un tratamiento con ligasa y ADN polimerasa, que son las enzimas

responsables de la reparación del ADN en la célula viva; los primeros experimentos de

este tipo fueron realizados con muestras de Homo, aunque también se han probado en

especímenes antiguos del grupo Equidae. Como complemento se menciona el

tratamiento con N- bromuro de phenacylithiazolium (PTB) para eliminar algunos “cross-links” como los productos de Maillard, procedimiento que será explicado más adelante.


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Otra de las consecuencias de la degradación son las incorporaciones erróneas que

se han mencionado en apartados anteriores. Una aproximación a su tratamiento de cara a

los estudios de ADN antiguo es la planteada por Pääbo et al. (2004). En ella se evidencia

la necesidad de distinguir entre las incorporaciones erróneas inducidas por los daños quetiene el ADN antiguo y los errores de la Taq polimerasa que ocurren en cualquier PCR sin

importar las condiciones del ADN de la muestra. Una manera de conseguirlo es realizando

múltiples amplificaciones de los extractos de ADN y clonar los productos de esas PCR. La

comparación entre las secuencias de múltiples clones de esas amplificaciones, revelará

las diferencias en los nucleótidos que ocurren en todos los clones de una amplificación,

pero no en las demás amplificaciones que han usado la misma muestra. La mayor parte

de esas substituciones, que pueden considerarse consistentes, se deberán a erroresocurridos durante los primeros ciclos de la PCR. Por el contrario, las substituciones

adicionales que se observen en clones individuales, se podrán deber a incorporaciones

erróneas ocurridas en ciclos posteriores de la PCR. Por ello si las frecuencias entre estos

dos tipos de incorporaciones son comparadas, se podrá establecer la diferencia entre las

substituciones inducidas por daños en el molde original de ADN y aquellas que se dan

como consecuencia de las tasas de error inherentes a la PCR. Esto permitirá afinar la

fiabilidad de las secuencias, al poder corregir algunos errores de éstas.

Algunas incorporaciones específicas, como las debidas a la desaminización de los

residuos de citosina en residuos de deoxiuridina o la desaminización unida a una

oxidación que resulta en residuos de 5-hidroxiuridina, pueden ser solventadas tratando el

ADN molde con glicocilasa de uracilo-ADN. (Paabo et al., 2004).

Para valorar el nivel de degradación de una muestra se recomienda utilizar la PCRen tiempo real. Como explica Pruvost (2004) este tipo de PCR permite determinar la

cantidad de moléculas de ADN con las que se inicia la reacción en cadena. Entre mayor

sea la cantidad inicial menor será el riesgo de incorporaciones que den una secuencia

equivocada. Se puede llegar incluso a establecer un mínimo de moléculas como barrera

inferior para considerar válidos los estudios de este tipo. Esta metodología es una de las

más utilizadas actualmente, como lo evidencia la existencia de artículos muy recientes

que, con algunas modificaciones, la siguen empleando para la cuantificación demoléculas de ADN (Vural, 2009).


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Como complemento de lo anterior, en los últimos años se han empezado a utilizar

nuevos tipos de polimerasas ‘premium’, que tienen unos índices de incorporaciones

erróneas inferiores a los de la Taq, así como una mayor sensibilidad. Entre éstas se

encuentran la ‘Platinum Taq Hifidelity’ de Invitrogen (Carlsbad, CA) y la ‘Amplitaq Gold’ de

Applied Biosystems (Foster City, Ca) (Gilbert and Willerslev, 2007).

4.3. La lucha contra la contaminación

Como se explicó en el apartado anterior, la contaminación es uno de los mayores

problemas en los estudios de ADN antiguo, siendo quizás el tema sobre el que más se ha

escrito. A continuación se hará una pequeña revisión de algunas de las propuestas que se

han planteado para intentar llevar al mínimo los niveles de contaminación (Malmstrom etal., 2007).

Para evitar la contaminación en el proceso de excavación y de análisis

antropológico de los huesos, se recomienda la utilización de guantes así como, en la

medida de lo posible, tener un control de las personas que han tenido acceso a los restos

y sus perfiles genéticos para poder contrastarlos con las secuencias obtenidas de los

restos antiguos y descartarlos como fuentes de éstas. También se aconseja no lavar loshuesos por las diversas razones que se han ido mencionando (Geigl, 2008).

Los métodos seguidos una vez en el laboratorio de biología molecular deben ser

igualmente cuidadosos. Geigl (2008) plantea que la QPCR (PCR cuantitativa) ha

demostrado ser uno de los mejores métodos para la cuantificación tanto de la

contaminación en los reactivos como de la cantidad de ADN encontrada en un fósil. En

primer lugar se hace una QPCR con varias tandas de reactivos; una vez obtenida lamedia de ADN en los mismos, ésta se utiliza como baremo. Lo anterior implica que, sólo

se considera fiable un resultado cuando la frecuencia de amplificaciones positivas del total

de PCRs realizadas está muy por encima de los niveles de los reactivos solos. Este tipo

de estudios se hacen sobre todo en las investigaciones sobre animales de las familias de

las vacas y los cerdos, porque algunos de los reactivos, como la BSA, tienen un origen

bovino o porcino.

En cuanto a la contaminación por arrastre o “carry-over”, las medidas mínimas

recomendadas son la separación física, tanto de los espacios donde se realiza la


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extracción, como del laboratorio de pre-PCR y el de post-PCR. A esto se deberían unir

infraestructuras de presión positiva y de irradiación ultra violeta como medidas que

pueden ayudar a disminuir los riesgos de contaminación. Otra cuestión es que la

circulación de personal a lo largo de las jornadas debe ser en un sólo sentido, desde los

lugares de extracción hacia los de pre-PCR y por último a los de post-PCR, evitando almáximo la circulación inversa. (Geigl, 2008).

4.4. Cómo contrarrestar los inhibidores

Para otra de las grandes dificultades que se dan en los estudios de ADN antiguo,

los inhibidores, se han buscado múltiples soluciones. Esto se debe en parte a que la

manera como actúan los inhibidores y su naturaleza no son aún plenamentecomprendidas por los científicos.

En Kemp (2006) podemos encontrar, dentro de su propuesta de la extracción con

columnas de sílica, un repaso por los principales métodos para intentar combatir los

inhibidores, que se podrían dividir en dos grupos. En primer lugar aquellos que

contrarrestan los efectos de los inhibidores mediante la manipulación del ADN molde, los

reactivos de la PCR o las condiciones de los ciclos en la PCR. El segundo grupo estaríacompuesto por aquellos métodos que eliminan los inhibidores durante la extracción del

ADN antes de la amplificación por PCR.

Dentro del primer grupo de técnicas estaría el diluir los extractos de ADN con agua

libre de éste, siendo una de las más utilizadas. En este caso los inhibidores estarían

disueltos lo suficiente como para permitir la amplificación. La explicación sobre el por qué

de la efectividad de esta técnica no está aún del todo clara, teniendo en cuenta que larelación entre la cantidad de inhibidores y de ADN se mantiene constante. Sin embargo,

es posible que exista un umbral para los inhibidores en donde la concentración de estos

sea la clave, independientemente de la cantidad de ADN. La contrapartida de esta técnica

es que puede influir en la efectividad de la amplificación en casos donde ya de por sí el

ADN está degradado y en bajas concentraciones. Una de las soluciones planteadas para

este problema es lo que se ha denominado ‘Booster PCR’. Este protocolo consiste en tres

rondas de doce ciclos de amplificación a una baja temperatura de anillamiento, en la queen cada uno se utiliza como molde el ADN proveniente de la ronda anterior, siendo el

resultante de estas tres rondas, el ADN molde para la PCR definitiva. Lo que se consigue


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con esto es diluir los inhibidores mientras se mantiene una alta concentración del ADN

molde.

En los casos en que la inhibición se da por una inactivación de la polimerasa,

aumentar el número de unidades de la Taq en las reacciones de PCR puede contrarrestar dicho efecto. A pesar de ello, en estudios realizados con muestras degradadas, que

suelen tener un menor número de moléculas para amplificar, el aumento en la cantidad de

Taq puede ser contraproducente ya que, al incrementar la sensibilidad de ésta también

aumenta el riesgo de contaminación. La utilización de la BSA (Bovine serum albumin), que

bloquea algunos inhibidores de PCR, estaría promoviendo indirectamente la actividad de

la polimerasa.

Dentro de la segunda categoría de técnicas, las que eliminan los inhibidores

durante la extracción, se encuentra el uso de CTBA (cetyltrimethylammonium bromide)

para incrementar el ADN obtenido de huesos quemados. Éste también se puede utilizar

acompañado con PVP (polyvinyl pyrrolidone) ya que ambos se unen a los polifenoles y a

los polisacáridos, que son inhibidores, aislándolos del ADN.

Para eliminar ácidos húmicos, así como polisacáridos, se han desarrolladoprocedimientos para unir el ADN a bloques de agarosa, para luego lavarlos con una

solución de lisis seguida de un tampón de TE. Esta técnica se aprovecha de la diferencia

de tamaños entre las macromoléculas de ADN y el menor tamaño de las moléculas de los

distintos inhibidores, que se deslizan fuera de la agarosa. Otra de las ventajas de esta

técnica es que el ADN que se une a la agarosa, que se derrite a bajas temperaturas,

puede ser utilizado directamente como molde de la PCR.

También se ha demostrado que las muestras precipitadas con isopropanol durante

la extracción presentan unos niveles inferiores de inhibidores que aquellas muestras

precipitadas con etanol o las concentradas con las columnas Centricon 30. Además la

precipitación con isopropanol parece contribuir a la remoción de la coloración marrón de

los extractos de ADN, así como a una reducción en la intensidad de la fluorescencia azul

presente durante la electroforesis, siendo éstas dos muestras indirectas de la eliminación

de al menos una fracción de los inhibidores.


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Partiendo de la hipótesis de que los inhibidores más problemáticos se unen a la

doble hebra de ADN, autores como Kemp (2006) han propuesto un procedimiento para

liberar los inhibidores en solución mediante la desnaturalización del ADN con 0.4mM

NaOH. Cuando la solución se pasa por columnas como las Microcon-100, la membranaretiene el ADN mientras que los inhibidores de menor tamaño pasan a través de ésta.

Luego el ADN vuelve a ser naturalizado para ser utilizado como molde de la PCR. Algunos

críticos de este proceso consideran que no es el más adecuado para extractos con poca

cantidad de ADN.

Otro método es el uso de una gran variedad de columnas de geles y cuentas para

remover los inhibidores. Algunos de estos forman parte de kits comerciales como lascolumnas Sephadex G-50 o G-200, o las Bio-gel P-6 y P-30, entre muchas otras. La

efectividad de éstas en la eliminación de los inhibidores es bastante variable. Dentro de

este grupo estarían también las columnas de silica (Qiaquick) que han demostrado ser

más efectivas que la extracción tradicional con fenol-cloroformo para eliminar los

inhibidores (Kemp et al., 2006).

Las técnicas presentadas hasta ahora varían en su efectividad, dependiendo decuáles sean los inhibidores de cada muestra. Como su determinación no siempre es fácil,

se pueden cometer errores a la hora de escoger qué métodos aplicar a cada muestra,

haciendo que las amplificaciones no resulten por causa de inhibidores que no se han

tenido en consideración. Partiendo de este problema Kemp et al. (2006) proponen la

aplicación de una técnica, la ‘repeat silica extraction’, que al ser menos específica ayuda a

eliminar un mayor número de inhibidores. Ellos demuestran que es una técnica lo

suficientemente amplia como para funcionar con muestras de hueso y coprolitos de lasque se sabe que contienen una gran cantidad de inhibidores y de las que no habría sido

posible obtener resultados positivos con otras técnicas, como la dilución o la incorporación

de BSA. Este proceso se basa en el principio de que en unas determinadas condiciones

de temperatura y pH, el ADN se une a la sílica permitiendo lavar el resto de productos que

haya en el extracto, incluidos los inhibidores. Una vez lavados, se cambian las

condiciones para que la sílica libere el ADN, que se encontrará purificado y podrá ser

utilizado como molde de la PCR. En casos donde fuese necesario este proceso se puederealizar dos veces sobre la misma muestra para así aumentar su efectividad.


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Otros autores (Audic and BeraudColomb, 1997, O'Rourke et al., 2000, Handt et al.,

1994, Kim et al., 2008) también mencionan las ventajas de la extracción con sílica en lo

que respecta a los inhibidores. Algunos como O’Rourke (2000) apuntan que, en

comparación con varias combinaciones de extracciones con fenol-cloroformo, aquellasrealizadas con kits de gel de sílica (Qiagen Qiaquick preps) son mucho más eficientes. En

estos casos las columnas actúan como concentradores, removiendo la pigmentación que

suele quedar después de la extracción con fenol-cloroformo. Sin embargo, también tienen

inconvenientes porque la cantidad de solución que puede ser cargada cada vez en las

columnas es limitada; esto implica una mayor manipulación de las muestras lo que

aumenta las posibilidades de contaminación o de pérdida de la muestra. A pesar de esto,

los índices de amplificación siguen siendo bastante altos en estos protocolos, debido a lamenor presencia de inhibidores.

Aunque no funciona exactamente como un inhibidor, los productos de Maillard

también afectan los resultados de la PCR como se ha explicado anteriormente. En los

últimos años se ha visto que el añadir Bromuro de N-phenacylthiazolium (PTB) puede

contrarrestar los efectos de estos productos, que se encuentran sobre todo en los

coprolitos. Fue utilizado por primera vez en la extracción de ADN de coprolitos delPleistoceno tardío (Poinar et al., 1998). Al parecer el PTB mejora el rendimiento de las

amplificaciones mediante su unión a las proteínas derivadas del azúcar que pueden

atrapar al ADN. Independientemente de su efectividad, parece ser que el PTB no causa

ningún daño a la extracción de ADN y se puede incorporar de manera sencilla a los

protocolos de extracción (Mulligan, 2005), añadiendose en el mismo momento en que se

incorpora la proteinasa K, por lo que su utilización no suele estar de más. En un principio

se añadieron concentraciones de 1mM, aunque se han llegado a añadir concentracionesde incluso 200mM en la extracción de ADN de dientes (Gilbert et al., 2003). El

descubrimiento de este producto químico no tuvo relación con los estudios de ADN

antiguo, sino con un estudio en pacientes diabéticos con diversos problemas debido a un

exceso de azúcares reductoras (glucosa) en la sangre. Estos azúcares producen “cross-

links” que pueden derivar en cataratas y en un endurecimiento de las arterias. Fue en la

búsqueda de una solución para este problema cuando se descubrió que el PTB podía

restaurar el colágeno afectado por los ‘cross-links’ a su estado natural, viéndose así suutilidad para tratar el ADN antiguo.(Poinar, 2002)


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5. Métodos de extracción, amplificación y secuenciación

5.1. Métodos de extracción

Una vez conocidas algunas de las técnicas más exitosas para combatir los

problemas del el ADN antiguo, resulta necesario un breve repaso por los principales

métodos de extracción del ADN . El propósito de esta explicación es clarificar cómo la

mayoría de los elementos mencionados se van incorporando en unos protocolos cada vez

más estandarizados que permiten una optimización de este tipo de estudios. Además,

conocer los protocolos de extracción básicos resulta fundamental para entender las

propuestas metodológicas de apartados posteriores. Por último, su conocimiento permiteentender el estado actual de las investigaciones de ADN antiguo, en lo que respecta a

estandarizaciones metodológicas.

El protocolo propuesto por Maca-Meyer (2002), explicado a continuación, incluye

los pasos que se encuentran en la gran mayoría de publicaciones, aunque pueden existir

pequeñas variaciones. En este caso se habla de la extracción en piezas dentarias, por ser

de las más usuales en este tipo de estudios, pero las características generales delproceso son las mismas que en otro tipo de tejidos. Este protocolo se basa en el uso de la

sílica propuesto por Höss y Pääbo (1993). Se eligió porque al tener un número reducido

de pasos resulta mejor a la hora de combatir la contaminación.

1. Limpieza de las muestras: Antes de proceder a la extracción de ADN se debe realizar

una limpieza de las piezas dentarias para descontaminar la superficie de éstas. Este es

un proceso muy importante para intentar eliminar el ADN exógeno proveniente de laspersonas que han manipulado las muestras. Para ello se lavan con una solución de alto

poder depurinizante (15% ácido clorhídrico), la cual inactiva el ADN superficial

(Izaguirre, 1998). A continuación se enjuaga repetidas veces la superficie del diente con

agua estéril y se deja secar bajo la luz UV durante cinco minutos por cada cara (Sarkar

and Sommer, 1990). Una vez secos los dientes se colocan entre dos placas metálicas y

se pulverizan golpeando con un martillo. Estos restos se introducen en un tubo de 15

ml de polipropileno (Costar), porque se vio que el uso de los de poliestireno daba comoresultado amplificaciones fallidas.


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2. Al diente pulverizado se le añade aproximadamente 1 ml de una solución comercial de

tiocianato de guanidina (DNAzol® (MRC, Cincinnati, OH) (Chomczynski et al., 1997) y

se deja a temperatura ambiente entre 3 y 4 días agitando esporádicamente. Pasado

este tiempo, se purifica el ADN mediante el uso de unas columnas comerciales de sílica

(QIAquick, Qiagen), según el siguiente protocolo:a. Los tubos con las extracciones se centrifugan durante 5 minutos a 4.000 r.p.m. y se

recogen alícuotas de 300 µl de la fase acuosa que se introducen en un eppendorf

de rosca de 1,5 ml.

b. A cada eppendorf se le añade 1 ml de tampón de unión (suministrado por Qiagen) y

45 µl de acetato sódico 3M pH 5,2.

c. Se pasa el extracto por las columnas centrifugando durante 1 minuto a 4.000 r.p.m.

d. Se añade a cada columna 500 µl de solución de lavado (suministrado por Qiagen) yse centrifuga 1 minuto a 4.000 r.p.m.

e. Se añade a cada columna 750 µl de acetona (Merck) y se centrifuga durante 1

minuto a 4.000 r.p.m.

f. Se añaden nuevamente 400 µl de solución de lavado y se centrifuga durante 1

minuto a 4.000 r.p.m.

g. A cada muestra se le añade 30 µl de agua estéril y 30 µl de TE (Tris-EDTA pH 8) y

se dejan durante 15 minutos en un baño a 50ºC.h. Se centrifugan las muestras durante 2 minutos a 13.000 r.p.m., se pasan los

extractos de ADN a tubos eppendorf de rosca de 0,5 ml y se guardan a -20ºC

Como complemento, Mulligan (2005) nos plantea algunas de las diversas

modificaciones que se pueden efectuar al protocolo anteriormente expuesto, así como

algunas precauciones que se deben seguir cuando se utiliza el EDTA para la

descalcificación de tejidos óseos.

i. Si el material del que se obtendrá el ADN se encuentra en buenas condiciones y se

presume la presencia de ADN endógeno, cantidades menores de hueso o diente

pueden ser utilizadas permitiendo el uso de tubos más pequeños que suelen facilitar el

trabajo.

ii. Es posible que distintas cantidades de ADN y de inhibidores sean extraídas durante la

descalcificación con EDTA. Por ello se recomienda que durante el proceso dedescalcificación el EDTA sea cambiado después de unos pocos días, reemplazándose


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por EDTA fresco, para luego procesar por separado los dos extractos de EDTA como si

fueran muestras distintas.

iii. El uso del PTB en las investigaciones recientes parece ayudar a eliminar los productos

del Maillard, como ya se explicó en apartados anteriores.

iv. La Silica-GuSCN también suele ser utilizada con frecuencia en los primeros pasos dela extracción de ADN, combinada con niveles bajos de EDTA (en lugar de confiar

únicamente en las altas concentraciones de EDTA). Muchos de los kits de purificación

de ADN se basan en un protocolo de Silica-GuSCN, como por ejemplo el “Wizard Plus

Megaprep DNA Purification System” (Promega, Madison, WI). En este tipo de

protocolos , el GuSCN ayuda a unir el ADN a la silica para que las impurezas que no se

han unido puedan ser lavadas. Sin embargo, los métodos basados en la Silica deben

ser usados con precaución porque en algunos casos el ADN antiguo puede estar unidoa proteínas causando que éste no interactue de la manera de debiera con las resinas a

las que debería unirse, trayendo como consecuencia la pérdida de ADN.

v. La completa descalcificación de los huesos bien preservados puede requerir varias

semanas si la extracción se realiza a 4ºC, aunque normalmente ésta es llevada a cabo

en 3 o 4 días cuando se realiza a temperatura ambiente. El nivel de descalcificación

puede ser monitorizado tocando el material que se encuentra dentro del EDTA,

evidentemente utilizando guantes, comprobando la existencia de fragmentos sin acabar de descalcificar.

5.2. Métodos para aumentar el éxito de la PCR

El segundo proceso en el análisis del ADN antiguo es la PCR (Polymerase Chain

Reaction), o amplificación, en el que se realizan copias del ADN molde con el fin de poder

analizarlas correctamente, como ya se ha explicado.

Durante este procedimiento también se han investigado ciertas técnicas que

ayudan a combatir algunos de los problemas presentados por el ADN antiguo. Mulligan

(2005), nos explica las técnicas que han demostrado ser más productivas. Muchas de

ellas también son mencionadas por otros autores como Chelomina (2006):

a. Mayor cantidad de Taq polimerasa y mayor número de ciclos de amplificación: Unamayor cantidad de Taq polimerasa y un mayor número de ciclos de amplificación

suelen ser usados en los casos donde se trabaja con ADN antiguo. Las cantidades


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típicas son de entre 1 y dos unidades de polimerasa y entre 40 y 50 ciclos. La

reamplificación de una alícuota de un producto de PCR o de una banda purificada de

ADN no es recomendable porque aumenta las posibilidades de introducir

contaminación.

b. PCR de “Hot-start”: Consiste en retener un componente esencia de la PCR hasta que lareacción haya alcanzado una temperatura que inhiba la unión de primers de manera

inespecífica o la oligomerización de los primers. Se utiliza para optimizar el campo de

los productos de PCR deseados y evitar amplificaciones inespecíficas. La PCR de “Hot-

start” puede conseguirse, bien usando complejos de anticuerpos de la polimerasa en el

que las enzimas se encuentran inactivas hasta que alcanzan los 95ºC por 5-10 minutos

(por ejemplo Amplitaq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA) o utilizando cuentas

de cera en las que el Mg²⁺ sólo es liberado luego de un calentamiento prolongado (por ejemplo Hot Wax Beads; Invitrogen, Carlsbad,CA).

c. Espermidina: Los bajos niveles de espermidina pueden facilitar la amplificación de

algunas muestras de ADN. Sin embargo, el exceso de espermidina puede inhibir la

amplificación por lo que primero se debe intentar la amplificación sin espermidina. En

algunos estudios se ha determinado que la concentración de espermidina debe estar

entre 400 y 800 µM.

d. El Bovine serum albumin (BSA), el glicerol, el dimetilsulfoxido (DMSO) y la formamida:El BSA y el glicerol son usados para estabilizar la interacción entre las proteínas y el

ADN, mientras que reactivos como el DMSO y la formamida, facilitan la separación de

las hebras de ADN al dificultar el emparejamiento de bases. A pesar de ello, el

mecanismo de estas interacciones no está bien estudiado y la determinación del aditivo

más conveniente debe ser seleccionado por medio de ensayo y error. Las

concentraciones típicas de estos aditivos son: 10-100µg/ml BSA, 10% glicerol, 5-10%

DMSO y 2,5-10% de formamida. La BSA y el DMSO son los aditivos más utilizados,sobre todo porque suelen ser los que dan más resultados positivos en la amplificación.

e. PCR anidada: Es la amplificación de un único producto de PCR a través del uso de dos

pares de primers en una amplificación en secuencia en la que el blanco de la segunda

PCR está contenido dentro del producto de la primera PCR. Esta estrategia permite

que productos de PCR débiles (o invisibles) puedan ser reamplificados aunque

aumenta la especificidad de la reacción al usar dos pares de primers.

f. Betaína: Se ha sugerido que la betaína ayuda a estabilizar las proteínas contra ladesnaturalización térmica facilitando la separación de las hebras de ADN mediante la


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isoestabilización de las mismas. La betaína en concentraciones de entre 0,5 y 2,2 M,

tanto en la presencia como en la ausencia del DMSO, ha demostrado que aumenta la

amplificación del ADN y mejora la consistencia de la amplificación. También se ha

demostrado que la betaína inhibe algunas de las ADN polimerasas, por lo que su

incorporación puede hacer necesaria la modificación de los protocolos de PCR.g. PTB: Como ya se ha mencionado, parece que la incorporación del PTB puede ayudar a

contrarrestar los productos de Maillard.

h. Mayor cantidad de Mg²⁺: Si existe un residuo de EDTA en el extracto de ADN

proveniente de la descalcificación, ésta puede reducir la concentración de Mg²⁺ en la

PCR por debajo de los niveles óptimos.

i. “Touchdown” PCR: Consiste en reducir la temperatura de anillamiento entre 5 y 10ºC

durante los primeros diez ciclos de la PCR. Es un método utilizado cuando no se sabecon certeza la temperatura de anillamiento de los primers con el ADN. Aunque esta

incertidumbre no debería existir en los casos de ADN antiguo, puede que este método

facilite la amplificación de un extracto de ADN complejo caracterizado por moléculas

fragmentadas y la posible presencia de químicos desconocidos, como los inhibidores.

5.3. Métodos de secuenciación de segunda generación

En los últimos años, se han desarrollado nuevos métodos de secuenciación, que

poco a poco se irán imponiendo. Estos son los llamados métodos de segunda generación,

y ya empiezan a utilizarse en los estudios de ADN antiguo (Mardis, 2008). Este tipo de

métodos harán cada vez más viable la secuenciación de genomas completos (WGS),

ampliando así, de manera radical, el tipo de resultados que se pueden obtener de las

muestras antiguas. Este tipo de tecnología se basa en la construcción de librerías de

secuencias que luego se utilizan para leer una secuencia desconocida. En el campoespecífico del ADN antiguo este tipo de tecnología ha permitido obtener muestras

directamente de los genomas nucleares de osos de las cavernas, de mamuts o de

Neanderthales. Aunque no se entrará en detalle sobre este tipo de técnicas, es necesario

mencionarlas, ya que seguramente serán de uso común en un futuro no muy lejano.


28



5.4. Criterios de autentificación

Una vez comprendidas las principales particularidades de los estudios de ADN

antiguo resulta evidente la necesidad de establecer unos criterios de autentificación de losresultados. A continuación se explicaran los propuestos por Pääbo (2004), ya que suelen

ser utilizados como referente. Sin embargo, es necesario mencionar que otros autores,

como Cooper y Poinar (2000), también han propuestos una lista de criterios que, aunque

con algunas pequeñas diferencias, Pääbo ha complementado siguiendo la misma línea.

La existencia de estos criterios, por otra parte, no significa que sean respetados en todas

las investigaciones. Roberts (2008) nos da algunos ejemplos de ello en su repaso sobre

los artículos que hacen referencia a los estudios de ADN antiguo en el campo de lapaleopatología, mostrando que en una gran cantidad de casos estos criterios no son

respetados ni presentados en los resultados de las investigaciones.

Lista de criterios

1. Los productos amplificados deben ser clonados rutinariamente y múltiples clones deben

ser secuenciados. Esto permite que cualquier heterogeneidad en el producto

amplificado pueda ser detectada sin ambigüedades. También permite estimar elespectro de errores.

2. Controles negativos de extracción deben realizarse a la vez que las extracciones de

materiales antiguos. De manera similar, siempre deben realizarse controles negativos

de PCR cuando se amplifica ADN antiguo. De hecho, teniendo en cuenta que la

contaminación de los reactivos de laboratorio puede encontrarse en cantidades tan

pequeñas que sólo se detecte esporádicamente en los controles negativos, se deben

realizar varias amplificaciones sin ningún ADN molde por cada experimento. Se hademostrado útil la utilización de tres controles.

3. Repetir las amplificaciones de una misma extracción o de diferentes extracciones de un

mismo espécimen es necesario por al menos tres razones. La primera, porque es útil

para detectar la contaminación de una extracción o amplificación en particular. La

segunda razón es porque se podrían obtener resultados en los casos donde hay muy

pocas moléculas en la muestra y donde sólo de manera esporádica se encuentren

moléculas de ADN molde en los distintos extractos o en las alicuotas de estos. Tresextractos puede ser un número razonable de intentos de extracción antes de descartar

un espécimen de interés como carente de ADN útil. La tercera razón es que las


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repeticiones posibilitan la detección de las incorporaciones erróneas de nucleótidos que

conllevan cambios consistentes.

4. La cuantificación del número de moléculas de ADN amplificables presentes en un

extracto permite determinar si la cantidad de moléculas con las que se inicia la PCR es

muy poca, lo que aumenta la posibilidad de que ocurran cambios consistentes. Se deberesaltar que la cuantificación basada en la PCR debe hacerse de manera independiente

para cada pareja de primers utilizados, porque diferentes primers pueden tener una

eficiencia variable al inicio de la amplificación. Si hay un gran número de moléculas

presentes (más de 1000 puede servir como baremo), y sólo se espera un tipo de

secuencia de ADN, no hace falta realizar más de dos amplificaciones ya que es muy

poco probable que ocurran cambios consistentes. Si el número de moléculas presentes

es inferior, es necesario realizar varias amplificaciones. La manera más económica deproceder en estos casos es realizar primero dos amplificaciones y secuenciar varios

clones de cada una. Si se observa una diferencia consistente entre los dos grupos de

secuencias se debe plantear la realización de más amplificaciones. En el caso de que

se estudie el ADN mitocondrial, o secuencias de las que el individuo sólo debería tener

un tipo de ADN, una tercera amplificación suele ser suficiente para determinar cual de

las dos variantes presentes es reproducible. Si se está estudiando una secuencia

autosómica para la que pueden existir dos alelos, cuando se empiece con un númeroelevado de moléculas, las dos amplificaciones deben presentar aproximadamente un

número igual de los dos alelos. En el caso de que se empiece con pocas moléculas, se

hacen necesarias múltiples amplificaciones sucesivas para distinguir los individuos

homocigotos de los heterocigotos. Sin embargo, si el genotipo de los individuos no es

de interés, dos o tres amplificaciones serán suficientes.

5. Debe darse una correlación inversa entre la eficiencia de la amplificación y la longitud

del fragmento amplificado. Este criterio es un indicador muy simple de la extensión dela degradación y de las lesiones bloqueantes presentes en el molde de ADN antiguo.

Existe una gran variedad en la longitud de las amplificaciones que pueden conseguirse

de distintos especímenes; aunque la mayoría de restos antiguos no permiten

amplificaciones de más de 100 o 200 pares de bases de ADN mitocondrial, algunos

pocos restos de pájaros no voladores de Nueva Zelanda con unos cuantos miles de

años de antigüedad permitieron recuperar fragmentos de unas 500 pb en una sola

amplificación y se han reportado fragmentos de hasta 1,6 kb en restos provenientes delpermafrost. En general se puede afirmar que si los fragmentos más cortos no se

amplifican mejor que los fragmentos largos, en comparación con secuencias de ADN


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moderno, podemos estar frente a una fuente de ADN contaminante. Si las secuencias

más largas se determinan mediante el solapamiento de segmentos más pequeños, las

posiciones variables en los lugares de los primers o de las zonas que se solapan deben

confirmar que las dos secuencias están unidas.

6. Las pruebas bioquímicas de preservación macromolecular sirven para dos propósitos.En primer lugar apoyan la afirmación de que un espécimen está lo bastante bien

conservado como para que en él se encuentren moléculas de ADN. En segunda

instancia pueden ser usados como un método rápido de rastreo para identificar

especímenes que, basándose en su estado general de conservación, puedan contener

ADN como ya se ha expuesto con anterioridad. Para esto se han sugerido varias

técnicas; siendo la más utilizada el análisis de los amino ácidos presentes en los

especímenes, y la medición de la preservación de los mismos. Estos métodos hanevolucionado bastante en los últimos tiempos, aunque parece ser que la combinación

de la cantidad total de amino ácidos, su composición y su grado de racemización son

una aproximación útil para valorar la preservación del ADN en huesos y dientes. A

pesar de que la cinética de la racemización depende de la posición de los ácidos

aspárticos en la cadena de proteína, los especímenes que contienen muy pocos

aminoácidos poseen una composición de éstos que indica que sus macromoléculas

han sido reemplazadas por microorganismos o se han racemizado extensamente,haciendo poco factible que contengan ADN endógeno. Otros métodos alternativos para

este tipo de valoraciones incluyen la estimación de la relación entre fragmentos

péptidos y aminoácidos sencillos, por medio del espectómetro de masas o la histología

directa del hueso; la determinación de los daños del ADN con cromatografía de gases y

espectrometría de masas; la medición de la porosidad y densidad del hueso y el

microscopio de transmisión de electrones. De momento no se han realizado estudios a

gran escala sobre la correlación directa de cada una de estas técnicas con lapreservación de ADN antiguo, a pesar de la gran aportación que representarían.

7. Algunas secuencias de ADN derivados de organelos como las mitocondrias, se

encuentran frecuentemente en el genoma nuclear. Como el ADN mitocondrial es el de

mayor interés en la mayoría de los proyectos de ADN antiguo, estas integraciones

nucleares pueden, en ocasiones, ser amplificadas en la PCR y ser confundidas con las

secuencias del ADN de los organelos. Es más probable que esto suceda cuando los

primers usados difieren de la secuencia de los organelos de ADN de un espécimenindividual pero no de la versión de esta misma secuencia que existe como una

inserción nuclear. El resultado de ello serían conclusiones erróneas con respecto a


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variaciones intraespecíficas así como a la filogenia de las especies. Para evitar este

problema se pueden usar diferentes grupos de primers solapados y variables para

amplificar la misma secuencia, porque es muy poco probable que dos grupos de

primers distintos amplifiquen preferentemente la misma inserción nuclear. En cualquier

caso, en especies en las que exista un gran número de copias nucleares del ADNmitocondrial, se pueden obtener varias secuencias de todos los pares de primers, por lo

que la determinación de las secuencias de ADN mitocondrial resulta imposible.

8. Los resultados cruciales deben ser reproducidos en un segundo laboratorio. Este

criterio se ha sugerido al asimilarse la seriedad de la amenaza de la contaminación

para la autenticidad de los resultados. Éste cumple la misma función que los controles

negativos en la extracción y en la PCR en el laboratorio. Sería una precaución adicional

para excluir la existencia, poco probable, de un contaminante que no apareciera en loscontroles negativos. Se debería realizar sobre todo cuando se produzca un resultado

novedoso e inesperado con grandes consecuencias. En estos caso, las muestras

deben enviarse directamente, y de manera independiente, desde el museo o la

excavación a los dos laboratorios para que los potenciales contaminantes no puedan

ser transferidos entre los laboratorios.

9. Como criterio complementario se puede obtener el ADN externo, en el caso de

muestras dentales, para poder compararlo con el ADN endógeno (Fregel et al., 2009b).

Como explica Fregel (2010), se ha destacado que, además de seguir los criterios

de autentificación, hay que realizar un control a posteriori de los resultados (Bandelt,

2005). Para el estudio de secuencias de ADN, existen tres indicadores que pueden

cuestionar la autenticidad de los datos obtenidos:

1. Principio de expectación filogenética: si los resultados reflejan los marcadorespresentes en el equipo de excavación o en el personal de laboratorio, y no lo que se

podía esperar a partir del origen geográfico de las muestras antiguas, es muy probable

éstos estén afectados por contaminación. Por ello es necesario disponer de un panel

de secuencias de cada uno de los investigadores que han manipulado las muestras,

desde el momento de la excavación hasta su análisis molecular.

2. Estructura en mosaico: esto ocurre cuando la secuencia obtenida se compone de

varios fragmentos solapantes, que por separado tienen diferentes sentidosfilogenéticos, y en conjunto, no pertenecen a ningún haplotipo conocido. Esta estructura

en mosaico puede ser debida a contaminación o a la mezcla de muestras.


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3. Espectro anormal de mutación: cuando existe una aglomeración de mutaciones poco

comunes a lo largo de una molécula antigua, dicho resultado debe descartarse, ya que

posiblemente las modificaciones postmortem hayan transformado el material genético

inicial, de forma que ya es imposible conocer su haplotipo real.


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6. Algunas áreas de aplicación del ADN antiguo

Una vez comprendidas las limitaciones y las posibilidades de los estudios de ADN

antiguo, se plantean algunas de las áreas de investigación posibles con este tipo deestudios. Para ello se recurrirá una vez más a Pääbo (2004) que hace un somero

recorrido por las principales áreas de aplicación y las posibilidades de cada una. Antes

resulta necesario mencionar algunas de las disciplinas involucradas en este tipo de

investigaciones (Cipollaro et al., 2005); entre ellas está la arqueología, la geología, la

vulcanología, la antropología, la paleopatología, la histología, la química, la biología

molecular, la genética, la microbiología, la botánica, la zoología y la bioinformática .

Ya dentro de las áreas de aplicación, la primera sería la filogenia de las especies

(Debruyne and Barriel, 2006). Las secuencias de ADN antiguo permiten relacionar

especies que se ha extinguido con especies vivas a través de la filogenia molecular.

Algunos ejemplos de las más de 50 especies extintas estudiadas serían las

investigaciones realizadas sobre los lobos marsupiales australianos (Krajewski et al.,

1997, Krajewski et al., 1992, Thomas et al., 1989), los moas de Nueva Zelanda (Cooper et

al., 2001, Cooper et al., 1992, Haddrath and Baker, 2001) o los gansos endémicoshawaianos (Paxinos et al., 2002). Este trabajo se ha desarrollado sobre todo dentro de los

museos de historia natural, ya que cuentan con grandes colecciones con las que realizar

diversos análisis moleculares. En estos casos es más común recurrir al estudio de

secuencias de ADN mitocondrial o de cloroplastos ya que al haber más copias de estos

por célula existe una mayor probabilidad de que se conserven. Esto implica algunas

limitaciones porque al tener unas tasas de mutación menores, es más difícil resolver la

filogenia de algunas especies que, o bien se han separado recientemente, o de forma tanrápida que las diferentes partes del genoma tienen una filogenia diferente (Paabo et al.,

2004). En algunos casos como el de los moas, esto se ha superado al haber sido posible

la amplificación de algunas secuencias de ADN nuclear.

Una segunda área seria la de la historia de las poblaciones y la filogeografía, que

estudiarían los cambios de las poblaciones a través del tiempo. Esto se puede hacer

gracias a la conservación de muchos individuos de una misma localidad, bien sea en losmuseos, que en este campo cobran gran importancia (Wandeler et al., 2007), o como

consecuencia de excavaciones arqueológicas. Un ejemplo de esto serían los estudios


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realizados en tres poblaciones de ratas canguro en California, en donde se compararon

los especímenes de los museos con las poblaciones actuales. Se puede demostrar que

las poblaciones han tenido una continuidad a lo largo del tiempo, o por el contrario han

sido remplazadas por otras como consecuencia muchas veces de procesos antrópicos

(Ramakrishnan and Hadly, 2009, Garrigan and Hammer, 2006).

Un área de gran importancia para la comprensión de nuestra historia más remota

sería el estudio de los homínidos. De momento el impacto de los estudios de ADN antiguo

ha sido bastante limitado, por los límites temporales de la conservación, además de los

grandes problemas de contaminación con ADN humano moderno. Sin embargo, se han

podido vislumbrar algunas pistas sobre la relación entre los humanos anatómicamente

modernos y los neanderthales, que habitaron Europa desde hace unos 300,000 añoshasta hace poco menos de 30.000 años, aunque teniendo que hacer frente a una

compleja problemática (Green et al., 2009, Millar et al., 2008, Goldstein and Chikhi, 2002).

Se han generado intensos debates sobre la posibilidad de una contribución genética de

estas poblaciones a las poblaciones actuales; los primeros resultados que se han

obtenido parecen demostrar que ésta contribución no tuvo lugar. Sin embargo,

publicaciones recientes parecen haber encontrado evidencias de lo contrario (Dalton,

2010), por lo que el debate sigue abierto. Dentro de este campo también han cobradoimportancia los análisis que intentan responder cuestiones sobre el origen de los

humanos modernos (Harpending and Rogers, 2000). Se puede hablar principalmente de

dos corrientes, aquellas que defienden un origen en África con una posterior expansión

por los demás continentes (teoría del OOA), y la segunda que defiende un origen

multiregional de los humanos anatómicamente modernos. En este caso también el debate

sigue abierto, aunque la primera teoría ha cobrado fuerza a la vez que ha ido matizando

algunos de sus planteamientos iniciales.

Otro de los posibles campos de investigación hace referencia al estudio de

coprolitos. El análisis de ADN de este tipo de muestras puede proporcionar información no

sólo sobre el individuo que ha dejado la muestra sino también sobre los alimentos,

animales o vegetales, que haya ingerido. Este tipo de estudios también se realizan en

animales salvajes en peligro, o de los que es difícil obtener una muestra de tejido.

Un paso más en la arqueología de la genética molecular fue la demostración de

que los sedimentos del permafrost, así como algunos contenidos en cuevas, conservan


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en ocasiones restos de ADN amplificable. Además, el ADN en este tipo de condiciones se

conserva durante periodos de tiempo más largos, habiéndose llegado a obtener

resultados con muestras de casi medio millón de años. Esto abre la posibilidad de

detectar la presencia de organismos incluso cuando no haya restos macroscópicamente

identificables. Sin embargo, esto plantea un inesperado nivel de complejidad a los análisistanto de los coprolitos como de los sedimentos, básicamente porque es imposible saber

hasta que punto se han desplazado hacia arriba o hacia abajo las partículas y las

moléculas, lo que dificulta la adscripción cronológica certera de las muestras. Otra de las

limitaciones sería la imposibilidad de obtener secuencias más largas por medio del

solapamiento de fragmentos más cortos mediante “Jumping PCR”, porque los segmentos

podrían provenir de diversos individuos, o incluso de especies relacionadas, lo que implica

una limitación en la resolución taxonómica.

Dentro del campo de la arqueología, existen numerosas preguntas y áreas para las

cuales los estudios de ADN antiguo pueden ser de gran ayuda. Kemp (2007) y Larsen

(2002) nos plantean sólo algunos de los múltiples temas en los que se pueden aplicar

este tipo de análisis. Entre ellos encontramos la determinación del sexo molecular como

herramienta para comprender distintos comportamientos humanos en los que el sexo de

los individuos juega un rol fundamental, como por ejemplo los sacrificios humanos en losaztecas (De La Cruz et al., 2008). Otros de estos ejemplos serían los análisis de

movimientos poblacionales así como de migraciones; también se pueden determinar

relaciones biológicas entre individuos de un mismo enterramiento, lo que permitiría una

mejor comprensión de las relaciones familiares. Por otro lado se pueden hacer

reconstrucciones de la dieta o de estratificaciones económicas basándose en el acceso a

determinados recursos.

Centrándose en investigaciones con un caracter más histórico, vale la pena resaltar

los estudios de patógenos como virus y bacterias. Diversos artículos hablan sobre la

recuperación de ADN de la Mycobacterium tuberculosis o de la Yersinia pestis, así como

del virus de influenza de la gran epidemia de 1918 (Larsen, 2002). Es un campo

potencialmente muy interesante porque la evolución de algunos patógenos parece ser lo

suficientemente rápida como para permitir seguir el cambio genético a través de décadas

o de siglos. En contrapartida, existen diversas fuentes potenciales de contaminación; por ejemplo, las bacterias en la tierra pueden tener secuencias similares las de la bacteria de

la tuberculosis, por lo que algunos de los estudios han sido cuestionados. Esto hace


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necesario el desarrollo de estudios rigurosos sobre cuestiones técnicas que den como

resultado unos criterios de fiabilidad (Roberts and Ingham, 2008).

Otro campo de estudio de gran relevancia para la historia es la investigación

centrada en los orígenes de la domesticación. En estos, diferentes loci que no seseleccionaron durante la domesticación, como los del ADN mitocondrial, puede ser

utilizados para examinar si diferentes poblaciones contribuyeron al pool genético de las

especies domésticas o si este proceso se originó en una única región. También se pueden

identificar los genes seleccionados durante la domesticación, ya que estos tendrán una

variación más baja en comparación con la de sus ancestros salvajes. Una vez que estos

genes hayan sido identificados se podría, en principio, determinar el momento en el que

los diferentes rasgos fueron seleccionados mediante el análisis de la variación en lasmuestras antiguas. Ejemplos de este tipo de estudios serían los realizados en especies

animales como los caballos, las vacas o en especies vegetales como el maíz

(Schlumbaum et al., 2008).

Aunque no se trata directamente de un campo del ADN antiguo, es necesario

resaltar la similitud de este tipo de estudios con algunos de los realizados en el campo de

la genética forense. Como resalta Vural (2009) las modificaciones moleculares y ladegradación de las muestras forenses son similares a las experimentadas por las

muestras arqueológicas. Esto significa que la aproximación técnica a su tratamiento

puede ser similar. Las muestras arqueológicas se podrían asimilar a lo que se suele

denominar muestras mínimas en el ámbito forense. Esto abre la posibilidad de aprovechar

la tecnología desarrollada y los laboratorios acondicionados para cuestiones forenses, en

el estudio de ADN antiguo, como ya se hace en diversos centros.


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7. Estudios de ADN sobre la población canaria.

7.1. Fundamentación de los estudios genéticos

Uno de los principales objetivos de los estudios genéticos en seres humanos es el

estudio de la variabilidad, que se da como reflejo de la historia evolutiva de nuestra

especie (Relethford, 1998). Esto implica la determinación del origen y evolución de las

distintas poblaciones mediante el estudio de las variantes genéticas, que suelen

producirse por fallos en el proceso replicativo, o como consecuencia de la recombinación

genética o de la pérdida de segmentos de ADN. La migración, el aislamiento o la

selección, por otro lado, contribuyen a la diferenciación genética de las poblaciones. Elestudio de dicha variabilidad también es un complemento de la investigación histórica,

porque plantea nuevas vías de interpretación, o confirma hipótesis ya planteadas.

En los inicios de las investigaciones sobre variabilidad no era posible el estudio

directo del material genético, por lo que se utilizaban ciertos caracteres morfológicos

como marcadores de variabilidad. Entre estos estarían el color de la piel o del cabello y

marcadores antropométricos como los índices craneales o la constitución corporal. Sinembargo, hay que tener en cuenta que estos marcadores no representan la diversidad

total del genoma, porque sólo tienen que ver con genes o grupos de genes relacionados

con dichos caracteres fenotípicos. A esto se le añaden las dificultades que plantean como

consecuencia de su herencia compleja, de la subjetividad a la hora de clasificar a los

individuos y de que pueden verse influenciados por el ambiente (Fregel, 2010).

En un segundo periodo, los estudios poblacionales se fundamentaron en dos tiposde marcadores. Por un lado se utilizaron técnicas inmunológicas para determinar

diferencias poblacionales en los antígenos eritrocitarios. Posteriormente, se realizaron

análisis de polimorfismos en proteínas, tanto estructurales como enzimáticas. A pesar de

los aportes de este tipo de estudios para la comprensión de la historia evolutiva del

hombre, se demostró una relativa homogeneidad entre poblaciones, lo que implica que al

no haber una variabilidad excesiva, resulta difícil determinar con exactitud la historia

evolutiva de las poblaciones (Jorde et al., 1998). Al igual que ocurre con el estudio demarcadores morfológicos, en este caso también nos centramos en una parte específica


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de la porción traducida del genoma que, por lo tanto, puede verse afectada por la

selección natural.

Finalmente, los avances técnicos permitieron el análisis directo de la variación a

nivel de ADN, empezando por las hibridaciones y terminando con la secuenciacióndirecta, pasando por el uso de enzimas de restricción. La PCR será, como ya se ha

mencionado, la principal responsable de estos avances, al permitir la amplificación de

fragmentos discretos de ADN en cantidades suficientes para un análisis más exhaustivo.

Este tipo de estudios se puede realizar desde diferentes enfoques de los que

Fregel (2010), nos presenta los principales. Entre ellos encontramos la utilización de

marcadores localizados en los autosomas (cromosomas no sexuales), en el ADNmitocondrial y en los cromosomas sexuales, X e Y. Estos análisis se pueden abordar

mediante procedimientos diferentes como la caracterización de determinadas mutaciones

puntuales o SNPs (Single nucleotide polimorphism) y la secuenciación no sesgada de

fragmentos de ADN. Aunque muchos de ellos se llevan a cabo con muestras modernas,

resultan fundamentales para poder interpretar los resultados obtenidos de las muestras

arqueológicas.

7.2. Los Primeros estudios genéticos en la población canaria: Grupos sanguíneos y

polimorfismos enzimáticos

Antes de entrar a describir los diversos tipos de estudios que han pretendido

explicar la variabilidad de la población canaria, tanto en el pasado como en el presente,

es fundamental hacer algunas aclaraciones sobre el proceso de conformación de la

sociedad canaria actual. Hasta la llegada de los europeos a finales de la Edad Media, lapoblación canaria tenía un substrato norteafricano, ya que los aborígenes estaban

relacionados con grupos beréberes. Luego de la incorporación del archipiélago a la

corona castellana a finales del siglo XV, se produciría una aportación de población desde

Europa, en especial desde la Península Ibérica. Además de estas dos poblaciones

parentales, también hay que tener en cuenta la llegada de esclavos subsaharianos

durante la edad moderna, aunque su aporte sea inferior al de las otras dos poblaciones

(Maca-Meyer et al., 2004b).


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El grupo sanguíneo del sistema ABO es fundamental para las transfusiones y

transplantes, ya que entre individuos de grupos incompatibles se produce una destrucción

y aglutinación de las células sanguíneas (Landsteiner, 1901), como consecuencia de una

reacción del sistema inmune ante unas células que reconoce como extrañas al

organismo. Las bases de este fenómeno son las diferencias antigénicas de cada uno delos grupos sanguíneos, determinadas a su vez, por la presencia o no de determinados

residuos de azúcares en las glicoproteínas y glicolípidos de las membranas de los

eritrocitos. Estos grupos carbohidrato se incorporan a la membrana gracias a la acción de

las glicotransferasas A y B. Las diferencias antigénicas de los eritrocitos responden a

mutaciones en el gen que codifica la glicosiltranferasa, que incorporará un tipo u otro de

oligosacárido, o ninguno en el caso del alelo O (Daniels, 1995).

En lo que respecta a los estudios en el archipiélago canario serían Schwarzfischer

y Liebrich (1963), quienes realizarían uno de los primeros análisis genéticos para

determinar el grupo sanguíneo ABO en restos aborígenes. Estos consistieron en el uso de

antígenos eritrocitarios, en los que se pudo observar una alta frecuencia del alelo O,

similar a a encontrada en tribus beréberes del Atlas (Gaud, 1942, Masserlin, 1951), lo que

estaría en consonancia con las evidencias arqueológicas y antropológicas que relacionan

a la población aborigen con pueblos beréberes.

Estos estudios se verían complementados por aquellos que caracterizaban a la

población canaria actual para el grupo ABO, así como para otros grupos sanguíneos

como Rh, MNSs, FY y P (Fregel, 2010). Las frecuencias alélicas de esta población se

encontrarían dentro del rango de las poblaciones europeas, aunque se detectó una

aportación africana minoritaria. Este sería el caso de La Gomera, donde se encontraron

unas frecuencias del alelo O similares a las encontradas en el Magreb y a las de losestudios realizadas en momias aborígenes canarias.

A finales del siglo XX se realizaron algunos avances importantes en la comprensión

del funcionamiento de los genes relacionados con los grupos sanguíneos. Yamamoto

(1990b) logró clonar y secuenciar el gen de la glicosiltranferasa, determinando las

mutaciones que caracterizan los grupos A, B y O. Las únicas diferencias entre la

glicosiltranferasa A y B son 7 mutaciones puntuales, de las cuales sólo 4 determinan uncambio de aminoácido. La principal diferencia entre la glicosiltranferasa A y O radica en la

deleción de una citosina en posición 261, que da lugar a un codón de parada prematuro y


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a la formación de una proteína enzimáticamente inactiva (Yamamoto et al., 1990a).

Complementando lo anterior, los avances de la biología molecular también han permitido

el estudio exhaustivo de la región codificante de la glicosiltranferasa, encontrándose una

gran cantidad de variantes alélicas, sobre todo dentro del grupo O (Yip, 2002). Algunos

alelos de este grupo son bastante abundantes, como el caso del O01 y el O02 , siendodetectados en todas las poblaciones estudiadas hasta el momento. Sin embargo, también

se han identificado otras variantes menos frecuentes, que evidencia una distribución

geográfica más restringida. Para las Islas Canarias son importantes los alelos O03 y O12 ,

ya que son bastante raros y se encuentran en los lugares de origen de dos de las

poblaciones parentales del archipiélago, los vascos y los beréberes (Roubinet et al.,

2001).

En los últimos años se han realizado nuevos estudios sobre los grupos sanguíneos

ABO (Fregel et al., 2005), en los que se ha confirmado la presencia de los alelos O03 y

O12 en Canarias; además se ha visto una correlación negativa entre las distancias

geográficas con el continente africano y las frecuencias insulares; esto sería congruente

con una colonización aborigen desde el este hacia el oeste, cuyas huellas serían visibles

todavía hoy. Estos complementan otros estudios autosómicos en la determinación de las

estimas de mezcla: siendo la Península Ibérica la que da un mayor aporte (82%), conalgunos matices ya que en islas como la Gomera la aportación norteafricana asciende

hasta un 62%.

El segundo tipo de estudios que se realizaron en los inicios de las investigaciones

genéticas en el archipiélago, son aquellos relacionados con los polimorfismos

enzimáticos. Su determinación está basada en la caracterización de isoenzimas, que son

aquellas que catalizan la misma reacción química pero que poseen diferencias en sussecuencias aminoacídicas. El análisis de polimorfismos enzimáticos fue utilizado por

primera vez para el estudio de las moscas Drosophila pseudoobscura (Hubby and

Lewontin, 1966); para ello se emplearon métodos electroforéticos y de tinción de

proteínas. Esta técnica fue luego aplicada a la caracterización de poblaciones humanas

(Harris, 1966), siendo muy usada hasta que se desarrollaron las técnicas que permitieron

el análisis directo del ADN.

En el caso de Canarias se analizaron ocho enzimas sanguíneas, tanto en la

población del archipiélago como en las parentales, la Península Ibérica y el noroeste


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africano (Cabrera et al., 1996, Pinto et al., 1996b). Al igual que ocurre con los grupos

sanguíneos, las frecuencias de estas alozimas en Canarias son similares a las típicas de

las poblaciones caucásicas, aunque la presencia de la variante alélica R en el locus ACP

(fosfatasa ácida) y del alelo G6PD A+ (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), que suelen

relacionarse con poblaciones negroides, podría interpretarse como evidencia de uncomponente africano, aunque no demasiado significativo, en la población canaria actual.

7.3. Marcadores uniparentales

7.3.1. Linajes maternos: el ADN mitocondrial

Se hace referencia a aquellos que son transmitidos exclusivamente por uno de losdos progenitores. Dentro de los linajes maternos estaría el ADN mitocondrial. Este es el

material genético que se encuentra presente en las mitocondrias, orgánulos donde se

genera la energía necesaria para el funcionamiento celular. Como ya se ha mencionado

nos encontramos ante una molécula bicatenaria, circular, cerrada y sin extremos. El

ADNmt contiene un pequeño número de genes que codifican dos ARN ribosómicos, 22

ARN de transferencia y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa.

Debido a algunas de las características particulares de este tipo de ADN, que se

han expuesto con anterioridad, como la ausencia de recombinación o la herencia por vía

materna, ha sido posible una reconstrucción de la historia evolutiva de nuestra especie. Al

no recombinar, las diferencias existentes entre dos secuencias de ADNmt se deberán

únicamente a nuevas mutaciones. Estas modificaciones se irán acumulando con el paso

del tiempo, dando lugar a secuencias cada vez más diferentes que serán el reflejo de

linajes cada vez más alejados. El conjunto de mutaciones acumulado en una molécula deADNmt es lo que se denomina haplotipo. Estos pueden relacionarse entre sí mediante el

uso de redes filogenéticas, que permiten clasificarlos en un orden jerárquico, en función

de las mutaciones compartidas. A un grupo de haplotipos que poseen mutaciones en

común, o mutaciones basales, se le denomina haplogrupo. Si se parte de la suposición de

que no existe retromutación, se puede deducir que las mutaciones basales relacionan a

los distintos linajes dándoles un origen común. Además, dada que la tasa de mutación es

conocida, se puede estimar el origen y el tiempo de las migraciones humanas.


42



Esta clasificación parece sencilla, pero existen varios factores que pueden

complicar su realización. Entre estos encontramos la alta tasa de mutación de la HVR

(región hipervariable), que puede hacer que las relaciones filogenéticas se vean

emborronadas como consecuencia de la retromutación. Esto ocurre particularmente enciertas zonas con tasas de mutación particularmente altas, los llamados “hotspots”. Una

posible solución es la ampliación de la región estudiada, por ejemplo recurriendo a la

secuenciación completa del ADNmt, ya que fuera de la región hipervariable, el número de

retromutaciones y mutaciones recurrentes es mucho menor.

Cuando se empezó a analizar la variabilidad del ADNmt en distintas poblaciones,

se encontró una diferencia bastante acuciada entre los linajes del África subsahariana ylos demás (Cann et al., 1987). A esto se unía que uno de los haplogrupos más antiguos

aparecía exclusivamente en África, apoyando la teoría del Out of Africa (OOA), que como

ya se ha planteado, propone un origen reciente de los humanos anatómicamente

modernos en el continente africano, desde donde se habrían expandido. Esto implicaría

que todos los linajes actuales provendrían de un ancestro común africano, la “Eva

mitocondrial”. Los estudios de este tipo han ido avanzando, permitiendo un refinamiento

del árbol filogenético del ADNmt, que a su vez brinda la posibilidad de una clasificación enhaplogrupos y subhaplogrupos cada vez más detallada (Torroni et al., 2006).

Como resultado del estudio global de los haplogrupos del ADNmt, fue posible su

adscripción a regiones geográficas específicas (Richards et al., 2000). Tres de estos

haplogrupos, el L1, L2 y L3, aparecen en el África subsahariana. Nueve, H, I, J, K, T, U, V,

W, y X, comprenderían la mayoría de los linajes europeos, norteafricano y caucásicos del

sudeste asiático. Por último, tendríamos a los haplogrupos A, B, C, D, E, F, G, M y Q quese relacionarían con las poblaciones de Asia, Oceanía y los nativos americanos. Como

complemento de esto se encuentran los estudios sobre las edades de coalescencia de los

grandes macrohaplogrupos. Se detectó una primera expansión que partiría de África hace

59.000-69.000 años aproximadamente. Por un lado se colonizaría el oeste asiático y la

India y, de manera independiente, seguiría hacia el sur alcanzando el sudeste asiático. En

un momento posterior, hace alrededor de 39.000-52.000 años, la rama del oeste asiático

se dispersó de forma radial llevando linajes caucásicos al norte de África y Europa,alcanzando la India y expandiéndose al norte y el este de Asia. Las migraciones más


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recientes han desdibujado, aunque no las han eliminado completamente, las huellas de

las expansiones primitivas del hombre moderno (Maca-Meyer, 2001).

Las investigaciones sobre la población canaria, se inician con el estudio preliminar

de ADNmt que comparó la población de la isla de Tenerife con las poblaciones que seconsideraron más cercanas, tanto histórica como geográficamente, la Península Ibérica,

el norte de África y el África subsahariana (Pinto et al., 1996a). En este trabajo se estimó

que la población canaria estaría conformada por una aportación del 43% de linajes

norteafricanos, un 36% de peninsulares y un 21% de subsaharianos. Estos resultados

evidenciaban una diferencia importante con aquellos obtenidos del estudio de marcadores

autosómicos, que estimaron una contribución norteafricana de un 21%, peninsular de un

71% y subsahariana de un 8% (Pinto et al., 1994, Roberts, 1966). Una posibleinterpretación de estos datos sería la existencia de una fuerte asimetría sexual, en la que

los linajes maternos tendrían, comparativamente, una mayor aportación norteafricana y

subsahariana.

Con posterioridad se llevó a cabo un análisis del ADNmt de la población canaria

más amplio, que incluía a individuos de todas las islas (Rando et al., 1999). Se hizo la

secuenciación de la HVR del ADNmt, estudiándose también, varias posiciones diagnósticomediante RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que refinaron la asignación

dentro de los haplogrupos. Además de los esperados linajes típicamente europeos, se

encontró un subtipo del haplogrupo beréber U6, el U6b1, que sólo ha sido detectado en el

archipiélago, y que permite hacer una relación directa entre la población aborigen de las

islas con el noroeste africano. De este haplogrupo se han realizado estudios detallados en

los que se ha podido rastrear su filogeografía, partiendo de un proto U6 en el Próximo

Oriente desde donde empezaría un proceso de expansión y diversificación, que incluiríala aparición de los subhaplogrupos canarios (Maca-Meyer et al., 2003). A pesar de ello, la

estima de la aportación norteafricana, con tan solo un 33%, fue inferior a la obtenida por

Pinto y col. (1996a) siendo mayoritaria la contribución europea con un 65%.

Esta caracterización de los linajes maternos también contribuyó a la explicación del

proceso de colonización del archipiélago por parte de los aborígenes. Basándose en la

composición haplotípica de las diferentes islas, es posible establecer una correlaciónnegativa entre la heterocigosidad insular y la distancia al continente africano; lo que


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apuntaría a una colonización con un único evento migratorio de este a oeste, procedente

del noroeste africano (Rando et al., 1999).

7.3.2. Linajes paternos: el cromosoma Y

La contrapartida del ADNmt está representada por la región no recombinante del

cromosoma Y, que constituye el 95% de su longitud (Jobling and Tyler-Smith, 1995).

Como consecuencia de su herencia por vía paterna y de que no se produce

recombinación, esta región se transmite, con la excepción de las mutaciones acumuladas,

de padres a hijos sin modificación. Tiene dos diferencias fundamentales con el ADNmt; la

primera es que es de mayor tamaño, 60x10⁶ pb en comparación con las 16x10³ pb del

ADNmt, y la segunda es que aparece en un menor número de copias, una por célula encomparación con las 3.000 copias aproximadas del ADNmt.

Otra de las problemáticas que presentan los estudios de la región no recombinante

del cromosoma Y, en comparación con el ADNmt, es su baja tasa de mutación, que es

entre 5 y 10 veces menor que la de éste. Lo anterior no ha influido para que en la

actualidad se hayan descrito más de 600 SNPs asociados al cromosoma Y (Karafet et al.,

2008). Además, como consecuencia de su baja tasa de mutación (Thomson et al., 2000),se producen una menor cantidad de retromutaciones y mutaciones recurrentes, lo que

aumenta la certeza de que la presencia compartida de un mutación defina a un grupo de

cromosomas relacionados por descendencia, facilitando la construcción de los árboles

filogenéticos (Karafet et al., 2008, Underhill et al., 2001, Ellis et al., 2002) .

Como contrapartida, esta baja tasa de mutación representa un problema cuando se

intenta una división en subhaplogrupos más refinada. En este tipo de casos, se recurre aluso de marcadores de evolución rápida como los microsatélites, que permiten identificar

grupos monofiléticos dentro de los haplogrupos (Cruciani et al., 2004, Semino et al., 2004)

El uso de microsatélites también resulta necesario para determinar las edades de

coalescencia de un determinado haplogrupo, ya que el número de variantes acumuladas

dentro de un determinado linaje, está directamente relacionado con su edad (Jobling and

Tyler-Smith, 2003).


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Los estudios basados en el cromosoma Y han demostrado, sobre todo

recientemente, ser bastante eficaces a la hora de intentar dilucidar el origen, evolución y

dispersión de las poblaciones humanas. De la misma manera que ocurrió con el ADNmt,

se pudo determinar que la distribución geográfica global de los haplogrupos, eraespecífica a determinadas regiones, y que su filogenia apoyaba la teoría del “Adán

Cromosómico Y”, análogo a la “Eva mitocondrial”, que habría vivido en África hace un

90.000-130.000 años (Underhill et al., 2000). En lo que respecta a su distribución, los

haplogrupos A y B estarían asociados al África subsahariana; los haplogrupos E,J y T se

distribuirían por África, Oriente Medio y el sur de Europa; los haplogrupos R, G, I lo harían

por el Oriente Medio, el Cáucaso y el Mediterráneo. Por último, los haplogrupos C, D, K, F,

H, L, M, O, Q y S aparecerían en Asia, Australia, Oceanía y América (Karafet et al., 2008,Underhill and Kivisild, 2007).

En el caso de Canarias, los estudios del cromosoma Y se realizaron una vez

determinada la composición genética de los linajes maternos. Para ello se analizaron 24

marcadores bialélicos y 5 microsatélites del cromosoma Y en poblaciones de las siete

islas (Flores et al., 2003), con el propósito de compararlas con aquellos del noroeste

africano y la Península Ibérica (Bosch et al., 2001, Flores, 2001, Flores et al., 2004, Hurleset al., 1999, Underhill et al., 2001). Los resultados mostraron que, al contrario de lo que

sucedía con el ADNmt, el pool genético paterno tiene un origen mayoritariamente europeo

(>90%), lo que vendría a confirmar una asimetría sexual, consecuencia de la colonización

europea. Sin embargo, la presencia de linajes africanos como el E-M81 apunta a una

pervivencia relativa de linajes aborígenes. Basándose en la distribución y la edad de estos

linajes africanos, se planteó un proceso de colonización en dos fases, lo que coincidiría

con algunos de los resultados obtenidos mediante estudios antropológicos, arqueológicosy lingüísticos (Navarro-Mederos, 1997, Springer, 2001), aunque sería contradictorio con el

único evento migratorio detectado para el ADNmt (Rando et al., 1999). Estudios similares

se han realizado en las islas atlánticas portuguesas, Madeira y Azores, lo que permite una

comparación con unas situaciones histórico-geográficas similares (Goncalves et al.,

2005).


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7.4. Los marcadores autosómicos: el sistema CD4/Alu.

Este tipo de marcadores son fundamentales si se pretender obtener una visión

conjunta de la evolución de las poblaciones, ya que son un complemento necesario a loslinajes exclusivamente maternos o paternos.

Entre los marcadores autosómicos usados en los estudios poblacionales, el

sistema de haplotipos CD4/Alu es bastante utilizado ya que es una herramienta efectiva si

se pretende trazar el origen y la expansión del hombre moderno (Tishkoff et al., 1996), así

como estimar la mezcla entre poblaciones (Destro-Bisol et al., 1999). Este sistema está

conformado por dos loci asociados, un locus bialélico cuyo estado ancestral es la pérdidaparcial de un elemento Alu y una repetición en tándem de un pentanucleótido (5’ TTTTC

3’).

En un primer momento se aplicó este sistema a las poblaciones parentales de

Canarias (Península Ibérica, noroeste africano y África subsahariana) (Flores et al.,

2000). A continuación se utilizó este mismo marcador para caracterizar a las poblaciones

de las islas, para poder realizar una comparación. Aunque la distribución de los haplotiposCD4/Alu en Canarias no presentó una diferencia marcada con la de la Península Ibérica,

si se obtuvieron algunos resultados que apuntan a una influencia norteafricana (Flores et

al., 2001). Entre estos resultados estaría la presencia del haplotipo 110(-), que se

relaciona directamente con el noroeste africano, y que apareció en la mayoría de las islas

con una distribución que, en algunas de ellas, no se diferenciaba significativamente de las

del noroeste africano. Asimismo, se pudo determinar una correlación inversa entre la

heterocigosidad haplotípica de las islas y su distancia con la costa africana, lo queapoyaría los resultados obtenidos en el estudio de los linajes mitocondriales (Rando et al.,

1999).

También se han realizado estudios en las siete islas sobre diez inserciones

autosómicas Alu. Éstas se encuentran dispersas a lo largo del genoma humano, se dan

como eventos únicos en nuestra evolución y son aparentemente neutrales en la selección

natural (Maca-Meyer et al., 2004b). En estas investigaciones se han detectado alelosespecíficos de la Península Ibérica y del noroeste de África. La contribución ibérica se

situaría entre el 62 y el 78%, la norteafricana entre el 23 y el 38% y la del África


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subsahariana alrededor del 3%, lo que sigue sugiriendo un legado aborigen y esclavo en

la población actual del archipiélago.

7.5. Estudios de ADN antiguo en Canarias.

Los estudios de ADN en muestras antiguas presentan gran interés, tanto en el área

de genética de poblaciones, como en la de los estudios históricos. Para la primera

representan una vía de confirmar los resultados obtenidos en los estudios con la

población actual. Para los segundos pueden representar información fundamental en el

camino de reconstrucción de los modos de vida de las poblaciones del pasado.

Uno de los primeros estudios que se realizaron sobre muestras antiguas fueron losque se hicieron con los restos provenientes de la excavación de la Iglesia de La

Concepción, en Santa Cruz de Tenerife. Debido a la necesidad de realizar algunas

reparaciones arquitectónicas en el edificio, se realizó una excavación arqueológica que

permitió el acceso a restos pertenecientes a la población del siglo XVIII de esta ciudad.

En esos momentos, la colonización europea del Nuevo mundo se hallaba en su auge, y

Santa Cruz era uno de los puertos más importantes para la relación entre las Islas

Canarias y el continente americano. El análisis de la composición genética de estapoblación, así como su comparación con la población actual, resulta vital para entender la

magnitud del impacto de las poblaciones europeas y africanas sobre el sustrato aborigen

del archipiélago, además de desvelar relaciones con América no detectadas con

anterioridad (Maca-Meyer, 2005).

En este caso se procedió al estudio de la secuencia de la región hipervariable I

(HVRI) del ADN mitocondrial y de RFLPs (Region Fragment Length Polymorphisms)diagnósticos. Se estudiaron 208 dientes provenientes de 33 fosas y 5 dientes de la Ermita

de San Blas, a 15 Km de Santa Cruz. El 37% de las secuencias pertenecían al grupo H, el

1,56% eran de origen americano, el 15,63% eran de haplogrupos africanos. El subgrupo

U6a, de asignación norteafricana se encontró en una frecuencia del 1,56%, mientras que

el U6b1, el subgrupo específico canario se halló en el 8,59% de los casos. Se concluyó

que la contribución por vía materna a la población canaria de esta época sería de un 50%

norteafricana, 40% Europea y un 10% subsahariana (Maca-Meyer, 2005). También sehizo el análisis del gen de la amelogenina, del que se hablará más adelante, para

determinar el sexo genético de los individuos (Arnay de la Rosa, 2009, Maca-Meyer,


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2005). Sobre estos restos también se realizó un estudio que pretendía estudiar la

evolución de las frecuencias alélicas del sistema ABO y su relación con el impacto de la

colonización europea. Este estudio confirmaría la historia demográfica de las islas

propuesta por estudios previos desde la arqueología y la antropología. En este estudio las

frecuencias alélicas relacionan claramente a los aborígenes canarios con las poblacionesberéberes del norte de África (Fregel, 2009).

En lo que respecta a los estudios sobre restos aborígenes, habría que destacar el

realizado por Maca-Meyer y col. (2004a), en el que se detectaron los linajes U6 en una

proporción mayor a los presentados por la población canaria actual. Sin embargo, al no

encontrarse correspondencias exactas de los linajes U6b1 en el norte de África, no ha

sido posible establecer el origen exacto de los colonizadores prehispánicos.

Otro ejemplo de estudios sobre muestras antiguas en el archipiélago, sería el

realizado sobre material aborigen de la isla de La Palma (Fregel et al., 2009b). En este se

analizaron 38 dientes provenientes de contextos aborígenes. Se obtuvieron secuencias

informativas de 30 individuos (78,9%). El 93% de los linajes eran originarios del oeste de

Eurasia, y el 7% restantes tenían una adscripción del África subsahariana. La gran

mayoría de los haplotipos (70%) tenían sus correspondientes en el norte de África. Sinembargo, el subtipo U6b1, sigue sin encontrarse en el norte de África, a pesar de ser la

cuna de expansión del linaje U6. El grupo H1 resultó ser el más abundante en La Palma,

estando definido por la transición 16260, aunque es bastante raro en el norte del

continente africano. Esto se interpreta como que la región exacta de donde provienen los

ancestros de los aborígenes canarios no ha sido estudiada aún, o las poblaciones han

sido remplazadas por migraciones humanas posteriores. La gran diversidad genética

encontrada en La Palma (alrededor del 95%), se encuentra en unos niveles similares a losde Tenerife, a pesar de encontrarse más alejada del continente. Este descubrimiento iría

en contra de la suposición que se ha hecho sobre una colonización desde el continente

de isla en isla con un posterior aislamiento. Por otra parte, la gran similitud entre la

población aborigen de La Palma y de Tenerife también iría en contra la idea de una

colonización marítima independiente de cada una de las islas sin un contacto posterior

entre ellas. Los resultados de este estudio encajarían mejor dentro de un modelo de

migración frecuente entre las islas.


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Sobre el cromosoma Y también se han realizado investigaciones con restos

aborígenes y de la Edad Moderna. En éstas se consiguió entender mejor la manera como

la colonización europea afectó el pool genético femenino y masculino de los aborígenes,

desde el momento de la conquista hasta la actualidad. Se concluyó que la presencia de

linajes autóctonos del norte de África, como el E-M81, así como algunos marcadoresabundantes en esta región (E-M78 y J-M267) en las poblaciones aborígenes, apunta a

que éste sea el lugar de origen más probable para estos grupos. En comparación con las

poblaciones aborígenes, la muestra histórica del siglo XVIII muestra una disminución de

las frecuencias de los haplogrupos norteafricanos y un aumento de los europeos. Estos

estudios también ayudarían a demostrar una evolución sexual asimétrica en las

poblaciones más recientes, lo que podría explicarse como resultado de una discriminación

negativa hacia los hombres aborígenes en el momento de la reproducción en favor de loshombres europeos (Fregel et al., 2009a).

Por último, hay que mencionar los diversos casos en los que se han utilizado los

estudios de ADN antiguo para la determinación genética del sexo en restos aborígenes

(Arnay-De-La-Rosa et al., 2009, Arnay-De-La-Rosa et al., 2007). Sin embargo, estos

estudios serán explicados en detalle en otros apartados.


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8. Métodos para determinar el sexo genético en restos humanos

8.1. La amelogenina

El uso de la biología molecular para determinar el sexo de individuos provenientes

del registro arqueológico, ha significado un avance importante en el análisis de restos

infantiles, así como de adultos cuyos esqueletos se encuentran bastante incompletos

(Schmidt et al., 2003). Para la determinación molecular del sexo se ha ido imponiendo el

uso del gen de la amelogenina (Nakahori et al., 1991a, Nakahori et al., 1991b), que

codifica una de las proteínas fundamentales en el desarrollo de los brotes dentales, y que

exhibe un dimorfismo de longitud entre el cromosoma X y el cromosoma Y (106 y 112 pb).Si comparamos el gen de la amelogenina con los loci específicos del cromosoma Y que

se usaron en los intentos iniciales para determinar el sexo (Hummel and Herrmann, 1991),

la gran ventaja de la amelogenina radica en que al estar presente en los dos cromosomas

sexuales, actúa como un control positivo interno (Maca-Meyer, 2002).

El alelo del cromosoma Y contiene algunas variaciones en su primer intrón,

incluyendo una deleción de 189 pb (Nakahori et al., 1991b). El problema de utilizar estadiferencia para asignar el sexo es que implicaría la amplificación de un fragmento

demasiado grande para lo que se espera obtener de una muestra de ADN antiguo. Es por

eso que se está utilizando una región en la que existe una deleción de 6 pb en el intrón 1

del gen homólogo en el cromosoma X, región en la que se centra también Maca-Meyer

(2002). Para ello se usaron unos primers publicados por Sullivan y col (1993).que dan

productos de amplificación de 106 y 112 pb para los cromosomas X e Y, respectivamente.

Estos son:Amel-A 5’ CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG 3’

Amel-B 5’ ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 3’

Sin embargo, al tener una experiencia negativa con estos primers, Maca-Mayer plantea

mantener el primer Amel-A y diseñar un tercer primer de tal forma que el producto de la

amplificación fuera más pequeño (60 y 66 pb para los cromosomas X e Y

respectivamente). La secuencia sería:

Amel-C 5’ AATRYGGACCACTTGAGAAAC 3’ Donde R=A/G, Y=C/T


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En los primeros momentos de aplicación de esta técnica, fueron necesarios

algunos estudios sobre la fiabilidad del mismo. Lo que se solía hacer era utilizar una

población bien caracterizada antropológicamente, es decir con el sexo de los individuos

bien determinado. Luego se realizaban los análisis genéticos a ciegas, para poder comparar ambos resultados. Éste sería el caso del estudio realizado por Matheson y Loy

con restos de cráneos humanos de unos 9400 años de antigüedad, provenientes de

Turquía (2001). En este caso se demostró que el gen de la amelogenina al tener

fragmentos bastante grandes podría presentar problemas de amplificación. Aquí, en lugar

de intentar utilizar fragmentos del gen más pequeño, como lo hace Maca-Meyer (2002),

se propone la alternativa del uso del método de repeticiones alfoides de los cromosomas

X e Y.

Podemos encontrar múltiples ejemplos de la utilización de este gen para la

determinación del sexo genético. Entre ellos estaría el estudio hecho por Faerman (1995),

en el que analiza esqueletos neolíticos provenientes de Israel. De este estudio es

necesario resaltar la importancia que se da al análisis de distintas concentraciones de

ADN, ya que debido a la degradación y a los inhibidores, si hay demasiado o muy poco el

resultado de la amplificación puede verse seriamente afectado. Aquí también se resalta lautilidad de la biología molecular para sexar individuos infantiles, o aquellos cuyos restos

se encuentren fragmentados de tal forma que los métodos antropológicos tradicionales

sean insuficientes. Una última cuestión a destacar es que, en este caso, el gen del

cromosoma Y produjo mejores resultados que el del cromosoma X, lo que es de gran

utilidad. En los casos en los que sólo amplifica el Y se puede afirmar que es un individuo

masculino, pero además en los que sólo se amplifica el gen del cromosoma X también se

puede asegurar que es una mujer, porque los resultados no serían consecuencia de unaamplificación preferencial de este gen sobre el del cromosoma Y. En este caso, además,

se utilizan tres primers diferentes en lugar de dos, como ocurre en otros estudios, uno

común y dos que son alelo-específicos. Esto permite realizar una identificación de los dos

cromosomas sin ambigüedad porque, a diferencia de los estudios en los que se utilizan

sólo dos primers, y en los que un individuo con la banda de hembra podría ser un macho

con poca cantidad de ADN, los primers alelo-específicos generan amplificaciones

independientes.


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Este tipo de estudios también se suelen complementar con el análisis de otras

cuestiones. Este sería el caso de los análisis realizados por Cipollaro y col. (1998), sobre

restos del yacimiento arqueológico de Pompeya, en el que utiliza el gen de la

amelogenina para comprobar la relación entre los buenos resultados de los análisishistológicos, y la posibilidad de recuperar ADN de muestras antiguas. En este caso la

amplificación de la amelogenina no sólo resuelve un problema antropológico e histórico,

sino también la posible conservación de macromoléculas en yacimientos conformados

como consecuencia de un determinado tipo de erupciones volcánicas.

La determinación del sexo utilizando el gen de la amelogenina también ha

representado un gran avance para la antropología física como lo evidencian Arnay y col.(2007). En un estudio con restos aborígenes de la isla de Gran Canaria se compararon los

resultados obtenidos mediante el análisis de la amelogenina, con aquellos producidos

utilizando funciones discriminantes de la mandíbula. El objetivo era afinar la precisión de

estas medidas, para el caso de una población específica. Éste sería un claro ejemplo de

la manera como la biología molecular puede contribuir a la contrastación de hipótesis

fundamentales dentro de los estudios de restos humanos. También se demuestra, una vez

más, que métodos como las funciones discriminantes deben ser usados con gran cautela,al estar su efectividad fuertemente condicionada por las características de cada población.

La misma metodología con ligeras variaciones se ha mantenido vigente y ha sido aplicada

en investigaciones recientes sobre restos aborígenes de la isla de la Gomera, para

intentar ver una posible relación entre el sexo de los individuos y los patrones dietéticos

de los mismos, aunque en principio parece no haber una diferencia notable (Arnay-De-La-

Rosa et al., 2009).

En los últimos años se han ido mejorando las técnicas para la identificación del

sexo en especímenes antiguos, aunque la fundamentación teórica sigue siendo la misma.

Schmidt (2003), por ejemplo, presentó un método de PCR multiplex que supone una

mejora en este tipo de análisis. En él, se coamplifica la amelogenina, dos STRs del

cromosoma X (DXS6789 y DXS9898) y dos STRs específicos del cromosoma Y (DYS391

y DYS392). Esta coamplificación aumenta de manera considerable la validez de los

resultados al obtener diferentes datos que los confirmen de manera simultánea. Estosnuevos planteamientos se producen, al menos en parte, para contrarrestar un posible

sesgo hacia la identificación de individuos como femeninos, como consecuencia de la


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pérdida de alelos que impidan la amplificación de la secuencia de la amelogenina en el

cromosoma Y (Santos et al., 1998). Esta técnica viene del mundo forense, siendo muy

apropiada para muestras muy degradadas, ya que la longitud de los productos

amplificados está entre 91 y 116 pb, con los primers que propone Schmidt (2003). La

técnica fue probada en material óseo de una caverna de la Edad del Bronce deLiechtenstein, con unos 3.000 años de antigüedad. Otra de las ventajas de los

marcadores utilizados es que los loci se encuentran cerca del centrómero de los

cromosomas, lo que hace que su degradación sea menos rápida, ya que esta comienza

por el final de los telómeros. Además los marcadores del cromosoma X utilizados tienen

altas tasas de heterocigocis, por lo que en muchos de los casos en los individuos

femeninos se ven dos alelos, lo que confirma su asignación. Como complemento a la

determinación del sexo, Schmidt (2003) también propone la utilización de estosmarcadores para determinar el parentesco, ya que son STRs con una estructura similar a

la de los STRs autosómicos. Además, los STRs del cromosoma Y se heredan como los

haplotipos y algunos STRs del cromosoma X de una manera similar que permite usarlos

en estudios de parentesco amplio.

Las nuevas técnicas para la visualización de los resultados también han entrado en

los estudios sobre el gen de la amelogenina. Así Zoledziewska y col. (2003) utilizan lahibridación con oligonucleótidos marcados con fluorescencia y la electroforesis capilar

para realizar un estudio sobre restos óseos de diversa antigüedad, desde 1 año hasta el

Neolítico, pasando por la Edad del Bronce. En este caso también se utilizan fragmentos

más cortos para aumentar la sensibilidad en el caso de muestras muy degradas. Una vez

más esto puede ser contraproducente porque también se aumentan las posibilidades de

contaminación, lo que hace necesario un control muy estricto para poder validar los

resultados.

La pirosecuenciación, un método de secuenciación relativamente nuevo, basado

en una reacción enzimática quimicoluminiscente, también ha sido utilizada en estudios

más recientes sobre este gen. Este método se fundamenta en la detección luminométrica

de los pirofosfatos liberados durante la incorporación de nucleótidos, en donde cada señal

luminosa es proporcional al número de nucleótidos incorporados. En este caso se

utilizaron primers que flanquean una inserción de 3 pares de bases (GAT) en elcromosoma Y, colocada en la posición 1499-1501 del nucleótido en el gen humano de la


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amelogenina. La posición respectiva del cromosoma X es la 1680 (Tschentscher et al.,

2008). En este caso se hicieron pruebas en muestras que, debido a la degradación, no

habían dado resultados en ensayos anteriores usando métodos convencionales. Sin

embargo, utilizando la pirosecuenciación, gran parte de ellas produjeron resultados

positivos. La escasa longitud de los fragmentos amplificados se muestra como una granventaja, y puede resultar de gran ayuda en muestras degradadas como las de ADN

antiguo.

Los métodos para la determinación del sexo genético se han ido puliendo,

subsanando algunos de los problemas de las primeras investigaciones. Este es el caso

del trabajo presentado por Codina (2009), en el que se propone una PCR multiplex para

determinar el sexo de muestras degradadas; aunque se centra en muestras forenses estametodología podría ser aplicada a restos antiguos, por la similares características que ya

se han comentado. La propuesta consiste en la co-amplificación de dos regiones

diferentes del gen de la amelogenina (55/58 y 106/112 bp para los alelos AMELX/AMELY

respectivamente), una ampliación de 93 pares de bases del gen SRY y cuatro loci mini X-

STR (DXS7424, DXS8378, DXS6803 and GATA 172D05 (cuyos productos de

amplificación máximos no superan las 140 pares de bases)). La elección de estos

marcadores tiene como criterios: el pequeño tamaño de los amplicones, altos niveles deheterocigocis, una distribución equilibrada de frecuencias, así como un alto polimorfismo.

Estas condiciones fueron probadas para su nivel de sensibilidad, midiendo su

especificidad con el ADN humano y su comportamiento en casos con mezclas de ADN,

obteniéndose resultados positivos. Este replanteamiento se da porque se ha visto que

pueden producirse resultados erróneos cuando se da una mutación en el sitio de

ligamiento de los primers, tanto en el gen AMELX como en el AMELY; además se suele

tener más problemas para amplificar el AMELY lo que puede dar como resultado falsosfemeninos (Codina et al., 2009).

En uno de los estudios más recientes publicados sobre restos antiguos, Gibbon

(2009) nos muestra una de las últimas propuestas para estudiar la amelogenina. En este

caso se complementan dos sistemas de identificación. El primero se basa en el análisis

de la secuencia de 10 SNPs específicos a cada sexo, para ver si ambos cromosomas

estaban representados (en los varones) o sólo el X (en las hembras). El segundo utilizaun “indel” de 6 pares de bases. En este caso se utilizó la estación automatizada de


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electroforesis Experion (Bio-Rad), que utiliza una tecnología de micro-separación de

fluidos, que transporta volúmenes muy pequeños de líquidos, lo que permite una

separación y detección rápida de las muestras. El uso de esta tecnología tiene como

ventaja, no sólo la poca cantidad de muestra que debe cargarse (1µl), sino también su

alto nivel de sensibilidad, con lo que se pueden detectar muestras que serían invisiblescon otros métodos. En este caso se utilizaron los materiales de la colección de esqueletos

humanos de Raymond Dart que, en su gran mayoría provienen de hallazgos fortuitos en

las cercanías de Johannesburgo, no siendo producto de excavaciones arqueológicas. La

combinación de ambos métodos produjo resultados positivos en un 46,66% de los

especímenes, un porcentaje muy aceptable dentro de los estudios de ADN antiguo

(Gibbon et al., 2009).

8.2 El cromosoma Y para confirmar el sexo

Los estudios sobre genes específicos del cromosoma Y también pueden ser

utilizados para determinar el sexo genético, incluso cuando éste no sea el objetivo

principal de una investigación. Este tipo de estudios se fundamentan en que estos

marcadores sólo serán amplificados en individuos masculinos. El problema es que su

ausencia no necesariamente implica que estemos frente a un individuo femenino, ya queésta puede ser también consecuencia de la degradación del ADN o la inhibición, que

impidan la amplificación de determinados fragmentos. Uno de los primeros estudios de

este tipo es el presentado por Hummel y Herrmann (1991), en el que se hizo un estudio

sobre restos que ya habían sido identificados como varones, según sus rasgos métricos y

morfológicos. Algunos pertenecen a los siglos XVII y XVIII y otros a la Edad Media, y

provienen de distintos enterramientos en Alemania. Los primers utilizados en este caso

amplificarían un fragmento de 154 pb inscrito dentro de una secuencia de repeticiónespecífica del cromosoma Y de 3.4- kb. Los amplicones serían luego sometidos a un

proceso de digestión con la enzima Eco RI dando como resultado 2 fragmentos, uno de

102 pb y otro de 52 pb.

Los estudios del cromosoma Y sirven además para establecer relaciones de

parentesco entre individuos masculinos. Tal es el caso del estudio de Gerstenberger y col.

(1999), en el que se estudian ocho individuos provenientes de un enterramiento de lafamilia de los Condes de Königsfield, utilizado entre 1546 y 1749, y que según la


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documentación fue utilizado sólo para enterrar varones. Sin embargo, los estudios

morfológicos así como los ajuares de algunos de los esqueletos llevaron a dudar sobre el

sexo de los mismos. Teniendo en cuenta las características de la muestra se realizaron,

combinados con el análisis de la amelogenina, estudios de STRs autosómicos y de

marcadores específicos del cromosoma Y, que confirmarían no sólo las relaciones deparentesco sino también el sexo de los individuos, ya que al ser tan polimórficos y cortos

como su contrapartida autosómica son igualmente adecuados en los estudios de ADN

antiguo. Se utilizaron los loci DYS19, DYS390, DYS389I/II en una amplificación de

cuadruplex, y los primers fueron modificados para que los productos no superaran las 94

pb. Finalmente se clasificaron dos individuos como femeninos y el resto como masculinos.

Dentro de los estudios de cromosoma Y, también se han utilizado SNPs (SingleNucleotide Polymorphisms). Tal es el caso de las investigaciones presentadas por

Bouakaze y col. (2007), en las que un grupo de 13 SNPs del cromosoma Y, fueron

utilizados para identificar los haplogrupos del cromosoma Y más frecuentes en Asia,

aunque como ya mencionamos un resultado paralelo es la confirmación del sexo de los

individuos estudiados. El análisis se hizo mediante la co-amplificación de 13 fragmentos

dentro de dos PCR de multiplex, que fueron luego detectados con una reacción de

minisecuenciación utilizando el SNaPshot Multiplex Kit y la electroforesis capilar. Seanalizaron 11 muestras antiguas provenientes del sur de Siberia y con unas dataciones de

entre 5.500 y 1.800 años BP. La importancia de este estudio es que permite demostrar la

aplicación y la utilidad de los SNPs en muestras degradadas. En este caso los primers

también fueron rediseñados para que los amplicones se encontraran entre las 81 y las

155 pb. Una vez más vemos que la longitud de los productos de amplificación es un

elemento fundamental cuando se trabaja con muestras degradadas. Además se tuvo en

consideración que la diferencia entre unos amplicones y otros fuera la suficiente para nogenerar confusiones durante la electroforesis capilar. También hubo que realizar una

adaptación respecto a los primeros intentos realizados con ADN moderno. En lugar de

una sola reacción con los 13 marcadores, se tuvo de diseñar una de 6 y otra de 7

marcadores por amplificación, lo que los autores argumentan es consecuencia de las

particularidades del ADN antiguo. De 11 muestras analizadas se obtuvieron resultados

positivos en 9, lo que implica un alto grado de eficiencia de este método (Bouakaze et al.,

2007).


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8.3. El papel de los SNPs y las inserciones Alu

Los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), son mutaciones que afectan a un

único nucleótido. Aunque no presentan la hipervariabilidad característica de losmicrosatelites, representan una fuente casi inagotable de marcadores repartidos por todo

el genoma. Hay una estimación de un SNP por cada 1300 pares de bases y hasta el

momento se han identificado más de un millón de SNPs dentro del proyecto del genoma

humano; además son adaptables a genotipación automatizada a gran escala, mediante el

uso de técnicas basadas en, por ejemplo, la hibridación de oligonucleotidos, la extensión

de primers y la pirosecuenciación. Uno de las aplicaciones recientes más prominentes de

los SNPs son los estudios basados en el cromosoma Y. Estos suelen producirse dentro deestudios de evolución, pero como ya se ha mencionado, resultan igualmente útiles para la

confirmación del sexo genético de los individuos (Hellborg and Ellegren, 2003). También

se han realizado algunos estudios sobre los SNPs propios del cromosoma X que serían

complementarios a los primeros, y que podrían actuar como control interno, en la

determinación del sexo, al confirmar que los resultados negativos para los marcadores del

cromosoma Y no son consecuencia de la degradación general de la muestra (Vasques

and Pereira, 2001).

La principal ventaja para los estudios de ADN antiguo se encuentra en la longitud

de la región de ADN que se estudia. De hecho, siendo la secuencia necesaria mucho mas

corta, los perfiles de SNPs pueden tener una gran aplicación en estudios donde sólo se

dispone de muestras pequeñas y degradadas. Además, se ha demostrado que un grupo

relativamente pequeño, de aproximadamente 50 loci sería comparable con los multiplex

de STRs existentes (Petkovski et al., 2003).

A pesar de su utilización relativamente reciente, los SNPs han ido cobrando fuerza

rápidamente. Además en su estudio se han ido aplicando las técnicas más novedosas del

campo de la biología molecular. Un ejemplo de este es el estudio publicado por Vallone

(2004), en el que se construyeron nuevas extensiones de primers multiplex específicas de

determinados alelos (ASPE), además se utilizaron nuevos kits comerciales de hibridación

específica de alelos (ASH) para examinar 50 marcadores Y-SNP. Entre estas dos técnicashabía un solapamiento de 10 loci lo que permitiría comprobar la concordancia entre los


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resultados de los dos métodos. En el caso del cromosoma Y se han caracterizado

alrededor de 600 SNPs en la región no recombinante de éste (Karafet et al., 2008). En

este caso se utilizaron los SNPs para hacer una clasificación en haplogrupos, pero es

necesario insistir en su utilidad complementaria como confirmación del sexo.

Como ya se he mencionado en apartados anteriores uno de los posibles problemas

en la aplicación del método de la amelogenina es la posible deleción en el gen AMGY que

impida su amplificación y que de como resultado un falso femenino. Como lo explica

Cadenas y col. (2007) parece haber una relación entre estas deleciones y determinados

haplogrupos, proviniendo de unos linajes paternos determinados. Como solución a este

problema se propone la utilización del conocimiento actual de los SNPs del cromosoma Y,

para complementar y contrastar los resultados de los estudios más tradicionales como elde la amelogenina.

Otra propuesta para el problema de las deleciones viene del campo de las

investigaciones forenses. Njoroge y col. (2010), plantean la utilidad de las inserciones Alu.

Los elementos Alu son secuencias repetitivas de ADN, que constituyen una clase única de

marcadores moleculares que han atraído la atención en los últimos años como

consecuencia de su abundancia en el genoma humano, lo que permite obtener resultadosde PCRs incluso con pequeñas cantidades de ADN. Son secuencias diméricas de ADN de

aproximadamente 330 pb de longitud y son derivadas del gen de ARN 7SL. Este tipo de

inserciones polimórficas se han utilizado en estudios poblacionales, en determinaciones

de paternidad y en aplicaciones forenses. En particular, estos elementos pueden usarse

para la determinación del sexo así como para determinaciones étnicas, ambos elementos

no siempre sencillos utilizando únicamente STRs. En este caso se utilizó la electroforesis

basada en micro-chips, sobre todo por sus separaciones muy rápidas, además de supotencial para procesar muestras en paralelo, y la posibilidad de automatizar el proceso,

aunque su funcionamiento se basa en los mismos principios de la electroforesis

tradicional. En este caso se utilizaron los loci Alu STXa y Alu STYa, para la determinación

del sexo. La selección de las inserciones está condicionada porque la región homologa en

el cromosoma X e Y no puede ser un loci polimórfico, que es lo que permite usar el

tamaño del amplicon como criterio para diferenciar los femeninos de los masculinos,

también es importante asegurarse de que no hay interferencias con determinacionesétnicas. Las pruebas de este método se realizaron mezclando una cantidad determinada


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de ADN masculino, con diferentes concentraciones de ADN femenino, lo que también

muestra la utilidad de la metodología en el caso de mezclas, porque los resultados

mantenían el ratio entre X e Y correspondiente a la mezcla de ambos tipos de ADN. En

principio esto puede no ser de gran trascendencia en los estudios de ADN antiguo, pero si

lo es en casos forenses. Otra de las ventajas de este tipo de inserciones es que al serespecíficas de los primates no se amplifica ADN de otras especies (Njoroge et al., 2010).


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9. Importancia histórica de los estudios genéticos para la determinación del sexo

Una vez explicadas las cuestiones metodológicas relativas a la determinación del

sexo en restos antiguos, se hace necesario entender la gran trascendencia que este tipode estudios pueden tener en la búsqueda de comprensión de los diversos procesos

históricos. Quizás una manera más clara de explicar esta cuestión sea por medio de

ejemplos. Por ello a continuación se presentarán algunos casos de aplicaciones históricas

de los estudios genéticos, en especial aquellos relacionados con la determinación del

sexo. En algunos casos, la genética ayuda a confirmar hipótesis planteadas, pero en otros

presenta unos resultados contradictorios con las explicaciones de determinados

fenómenos, por lo que se hace imprescindible replantear diversas cuestiones,enriqueciendo así las interpretaciones históricas, herramienta fundamental para entender

determinados aspectos de las sociedades del pasado.

El primer ejemplo que se plantea es el estudio que se hizo sobre unos restos

infantiles de época romana. El conocimiento del género de los niños encontrados en

diferentes contextos arqueológicos tiene implicaciones, no sólo porque puede

relacionarse con el tipo de enterramiento, sino también porque puede establecerse unposible rol del género en relación con cuestiones de sacrificios infantiles o infanticidio. En

este caso se trata de más de 100 neonatos encontrados durante las excavaciones

arqueológicas del yacimiento de Ashkelon, con una antigüedad de más de cinco mil años;

los restos serían de época romana, ya que el yacimiento fue colonizado por este pueblo

en el siglo I d.C. . Los restos fueron encontrados debajo de una casa de baños, construida

en el siglo IV d.C. y utilizada hasta el siglo VI d.C. Los restos infantiles se hallaban en las

cañerías de una cloaca junto con restos de animales, trozos de cerámica y algunasmonedas aisladas; no se observaron signos de un enterramiento cuidadoso o de algún

tipo de ajuar. Este sistema casual de desecho de los restos, contrasta con las cuidadas

jarras de enterramientos infantiles pertenecientes al mismo periodo, encontrados a corta

distancia. A partir del tamaño de los huesos y del desarrollo dental se ha determinado que

todos eran neonatos, con entre uno y dos días de vida. La combinación de una muerte tan

temprana en una cantidad tan grande de niños y la manera en que fueron depositados,

plantea la posibilidad de infanticidio, más que la de muerte por causas naturales. Ninguno


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de los esqueletos mostraba malformaciones, planteándose entonces que serían otros

factores, como el género, los motivos para el infanticidio (Faerman et al., 1998).

El ADN para el estudio se extrajo de polvo de hueso, obtenido de 43 fémures

izquierdos, para evitar analizar al mismo individuo dos veces. Se utilizó el procedimientode extracción de purificación con chelex, así como el método basado en la sílica. La

determinación del sexo se hizo utilizando alelos de la amelogenina en el cromosoma X e

Y. La amplificación fue exitosa en 19 de los 43 especímenes estudiados. Catorce serían

varones y cinco hembras, dando como resultado una frecuencia significativamente más

alta de niños que de niñas (P<0.05). La razón inicial para decidir que los individuos

analizados eran víctimas de infanticidio, era la falta de niños de más de dos días de edad

así como su deposición casual en la cloaca. Si este sitio hubiera servido como lugar dedepósito de niños que hubieran fallecido de muerte natural pero que fueran considerados

tan poco importantes o demasiado jóvenes para ser merecedores de ritos funerarios

completos, se podría esperar encontrar individuos que por lo menos alcanzaran los tres

meses de edad. Esta idea se ve complementada por una variedad de fuentes escritas que

hablan sobre el tema. Lo que sorprende a Faerman y col. (1998), es que la mayoría de

estudios concuerdan en que en esta época era mucho más común el infanticidio femenino

que el masculino, por lo que los resultados obtenidos irían en contra de la idea inicial deque la mayoría de los restos pertenecerían a niñas. Existen varias referencias a la

utilización de los baños, como el excavados en este caso y que probablemente fueran

privados, como burdeles. Además en este caso parecen estar situados en lo que los

autores denominan “el barrio rojo” de Ashkelon, por lo que su doble propósito parece

confirmado. Todo lo anterior los lleva a concluir que probablemente los individuos

infantiles sean hijos no deseados de las cortesanas que servían en estos baños. Esta

explicación no sólo confirmaría el uso de este tipo de establecimientos como burdelessino que, a su vez, explicaría la predominancia de individuos infantiles masculinos. A

pesar de que ambos sexos eran reclutados para trabajar como prostitutos en el mundo

bisexual romano, las hembras tendrían mayor demanda. Por eso proponen que las

prostitutas de Ashkelon se quedaran selectivamente con algunos de sus hijos ilegítimos,

la mayoría niñas, para continuar con la profesión y que descartaran a otros (Faerman et

al., 1998).


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Existe un estudio similar a éste realizado en el Reino Unido (Mays and Faerman,

2001), cuyo objetivo inicial era confirmar la hipótesis sobre el infanticidio femenino, que se

basaba en las fuentes y en la diferencia de enterramientos femeninos y masculinos

adultos. Datos combinados de unos 2400 enterramientos adultos revelaban unaproporción de 1.46:1 a favor de los varones. Sin embargo, una vez más los resultados no

fueron los esperados por lo que se hizo necesario un replanteamiento de las

interpretaciones dadas. En el registro arqueológico se ha identificado el infanticidio

cuando se observa un pico importante en los individuos muertos muy cerca del final del

periodo de gestación, ya que si las muertes se debieran exclusivamente a causas

naturales, las edades de los individuos serían más variadas sin picos tan significativos

alrededor del nacimiento. En el caso de Gran Bretaña se dan estos picos durante laépoca romana, pero la curva de la edad de la muerte se dispersa en la época medieval,

por lo que se plantea el infanticidio como explicación a este cambio en la distribución.

Los restos que se utilizaron provenían de dos enterramientos romano-británicos,

Ancaster, Lincolnshire y Thistleton, Rutland. Los dos forman parte de un conjunto de

yacimientos que han sido estudiados y en los cuales la distribución de la edad de muerte

sugiere infanticidio. Se obtuvieron huesos de 31 individuos, 12 de Ancaster y 18 deThistleton, a los que en primera instancia se les midieron los huesos largos para estimar

la edad de la muerte. En este caso el estudio se hizo también mediante la amplificación

de los alelos de la amelogenina en el cromosoma X y del Y. De los 31 individuos

estudiados se obtuvieron resultados para 13, seis de Ancaster y siete de Thistleton, de los

cuales nueve especímenes fueron identificados como varones y cuatro como hembras.

Cabe resaltar que se detecto una preferencia para la amplificación del alelo del

cromosoma Y, por lo que se hizo necesario usar otros primers, que amplificaranfragmentos más pequeños, para que no se diera un sesgo hacia los individuos

masculinos y se pudiera amplificar el alelo X, incluso de muestras con un peor estado de

conservación, y no se quedaran fuera estos individuos femeninos. Las edades de los

individuos sobre los que se obtuvieron resultados, estaría alrededor de 38-41 semanas, lo

que corresponde con el final del periodo de gestación. La proporción de los sexos de este

estudio sería de 2.25:1 en favor de los varones. Como consecuencia del pequeño número

de individuos que fue posible sexar, esta proporción no difiere de manera significativa deaquella presente en las proporciones de neonatos naturales 1.05:1. Estos resultados, por


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tanto no respaldan la hipótesis de un exceso de muertes femeninas perinatales; pero los

resultados no son concluyentes debido al bajo éxito de las amplificaciones,

probablemente por una pobre conservación del ADN en las muestras (Mays and Faerman,

2001).

Otro ejemplo de aplicaciones históricas a los estudios del sexo genético de los

individuos es el presentado por De La Cruz y col. (2008) sobre los niños sacrificados a los

antiguos dioses aztecas de Tlatelolco. El ritual de sacrificio de niños a los antiguos dioses

aztecas de la lluvia está documentado por los cronistas españoles del siglo XVI. Sin

embargo, poca evidencia arqueológica al respecto había estado disponible hasta que se

realizaron las excavaciones del Templo Mayor de Tenochtitlán y en Tlatelolco, dos

ciudades fundadas en dos isletas vecinas en el Lago de Tezcoco, y cuyas ruinas seencuentran hoy en día en la mitad de Ciudad de México. En las excavaciones recientes

del templo R (1428-67 d.C.) se recuperaron los restos de 37 subadultos y seis adultos,

acompañados por diversos objetos de valor. En su conjunto representan evidencia de una

ofrenda de sacrificio en una sola ceremonia y cuyos restos fueron depositados con gran

cuidado y orden. Diecisiete individuos infantiles y un adulto fueron enterrados en urnas

cerámicas globulares, mientras que el resto fueron enterrados directamente en el suelo.

La identificación del sexo de las víctimas de los sacrificios puede contribuir a un mejorentendimientos de estas ceremonias.

La muestra estaba compuesta por 43 individuos, 37 subadultos y 6 adultos,

encontrados bajo la plataforma del templo R en el centro ceremonial de Tlatelolco. La

mayoría de los esqueletos subadultos se encontraban bastante bien conservados, sólo

encontrándose cuatro en estado fragmentario. Sin embargo, los esqueletos adultos se

encontraban bastante fragmentados quizás como consecuencia de un desmembramientode los cuerpos. Como controles positivos se utilizaron restos arqueológicos cuyo sexo

había podido ser determinado de manera fiable, mediante la utilización de criterios

morfológicos. La edad de los individuos se determinó con base en el desarrollo dental

según Ubelaker (1989). Las extracciones se hicieron a partir de las costillas, utilizando el

hueso completo, excepto en los casos en los que las costillas se encontraban rotas en los

que se hizo un corte a más o menos un centímetro de la fractura y descartando este

pedazo. En algunos casos también se realizaron extracciones a partir de los arcosneurales de las vértebras. La amplificación fue, una vez más, de los alelos del gen de la


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amelogenina. También se realizaron análisis de algunos SNPs del cromosoma Y, aquellos

que definían los haplogrupos del cromosoma Y Q-M242 y Q-M3 (De La Cruz et al., 2008).

Las edades de los individuos fue estimada utilizando análisis morfométricos

estándares, siendo la mayoría de los subadultos (66%) niños de hasta tres años. Seobtuvo ADN amplificable de 32 de los 37 subadultos y de los 6 adultos de Tlatelolco.

Inicialmente todos fueron identificados como masculinos por la presencia del amplicon del

cromosoma Y. Sin embargo, sólo se pudieron replicar los resultado en 26 individuos. En

las replicaciones que se hicieron en un segundo laboratorio sólo hubo una contradicción

en los resultados, que los autores atribuyen a la pérdida de un alelo en este caso

concreto. La alta proporción de éxito (60%) es atribuida a la buena preservación de los

restos esqueléticos de ese yacimiento arqueológico en particular y a los diversos métodosutilizados para la extracción del ADN (De La Cruz et al., 2008).

En la tradición azteca, Tlaloc era el principal dios de la lluvia y era ayudado por un

grupo de dioses con pequeños cuerpos, colectivamente conocidos como los Tlaloque. Se

creía que estos pequeños dioses vivían en las colinas y montañas y que controlaban la

lluvia (Román, 1990). Ehecatl-Quetzalcoatl, el dios azteca de la lluvia, era considerado

parte de los Tlaloque y servía como aquel que soplaba los obstáculos del camino parahacer camino para la lluvia. El culto dedicado a Ehecatl-Quetzalcoatl como un dios de la

lluvia y las características especiales de ofrenda masiva encontradas en este templo

llevaron a plantear la hipótesis de que este complejo ceremonial fuera el lugar de una

ceremonia extraordinaria llevada a cabo durante la gran hambruna de 1454-57 d.C., una

fecha consistente con la fundación de este templo (Guilliem, 1999). Considerando que los

Tlaloque también eran patrones de varias enfermedades, se ha propuesto que los aztecas

creían que los propios dioses elegían a estos niños para los sacrificios, siendo estaelección manifestada por los síntomas de las enfermedades que presentaban los niños.

Análisis osteopatológicos y de patologías dentales de los niños sacrificados en

Tenochtitlán y Tlatelolco muestran que muchos de ellos se encontraban en condiciones de

salud precarias. Sin embargo, no se han hecho comparaciones cuantitativas entre las

patologías encontradas en estos individuos y aquellas presentes en la población en

general (De La Cruz et al., 2008).


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Según Broda (1971), las víctimas escogidas para los sacrificios en los antiguos

rituales aztecas se convertían en la personificación viva del dios a quien eran ofrecidas.

En el caso de los Tlateloque, los niños eran frecuentemente seleccionados para

personificar estas pequeñas deidades. También se ha propuesto que los niños eranescogidos como víctimas de los sacrificios porque su juventud les daba una pureza

propicia para comunicarse con los dioses y obtener su favor (López Austin, 1984). Los

resultados de este estudio tienden a apoyar la postura de Broda porque, partiendo de que

Ehecatl-Quetzalcoatl era una deidad masculina, las víctimas masculinas personificarían

mejor al dios que las femeninas. Por ende, los resultados de los estudios morfológicos y

moleculares presentados en el trabajo de De La Cruz y col. (2008) apoyan la

interpretación arqueológica de la ceremonia llevada a cabo en el templo dedicado aEhecatl-Quetzalcoatl en Tlatelolco.

Un tercer caso de aplicación histórica de los estudios de ADN antiguo sería el

presentado por Dudar y col. (2003), en el que se recupero ADN de un cementerio de

pioneros canadienses del siglo XIX. Los genotipos obtenidos se usaron para inferir las

relaciones de parentesco. Estos resultados son relacionados con la información obtenida

de las prácticas mortuorias y los registros históricos para sustentar las conclusiones sobreesta sociedad en particular. Dentro de los estudios de ADN antiguo se encuentra el

potencial de establecer definitivamente genotipos individuales y, por tanto, determinar

posibles prácticas de enterramiento relacionadas con el parentesco, siendo un ejemplo de

esto el caso de los Romanov, la antigua familia imperial rusa. Sin embargo, si se pretende

hacer una contribución significativa a un entendimiento más amplio de la historia de las

poblaciones, las investigaciones sobre ADN antiguo deben ir más allá de las relaciones

biológicas individuales para incluir sistemas de parentesco de las poblaciones del pasado.El trabajo sobre los pioneros canadienses, es una investigación preliminar sobre la

eficacia de los análisis de ADN antiguo para determinar un sistema de parentesco dentro

del registro arqueológico. Para ello se utilizan aproximaciones estadísticas provenientes

de las teorías del parentesco convencionales y de las ciencias forenses (Wenk et al.,

1996, Allen et al., 1998). El ADN recuperado de las muestras de huesos y dientes fueron

sometidas al análisis del ADNmt y de distintos STRs para determinar los genotipos que

permitieran calcular la probabilidad de parentesco matrilineal por azar (PrMKBC por sussiglas en inglés) y un índice de parentesco (IK por sus siglas en inglés). El sistema de


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parentesco de esta sociedad se infiere mediante la integración de las relaciones

biológicas putativas con la cultura material arqueológica, los registros históricos y otras

fuentes etnohistóricas de información (Dudar et al., 2003).

Los restos provienen del cementerio de Harmony Road en Toronto y se componende 38 individuos: 27 adultos jóvenes, adultos y seniles (15 varones y 12 hembras, seis

sub-adultos de menos de 18 años y cinco infantiles que murieron antes del primer año.

Las fechas estimadas para la utilización de este cementerio, están entre 1827 y 1850,

para 7 individuos, 1850 y 1878, 16 individuos, y 1878 y 1900 (12 individuos). También se

consulto un inventario del cementerio que incluye 117 enterramientos con 38 apellidos, de

los cuales 11 representan familias multiregionales. Para establecer los haplotipos

mitocondriales y una base de datos de frecuencias alélicas de los STRs se utilizaronmuestras provenientes del cementerio de la iglesia anglicana de St. Thomas, Belleville,

Ontario, que estuvo en uso desde 1821 hasta 1874 (Dudar et al., 2003).

También se realizó la determinación del sexo genético para contribuir a la

identificación individual mediante la comparación con documentación histórica de los

enterramientos. Además se hizo la amplificación de la región hipervariable II del ADNmt,

así como el polimorfismo del gen de la tirosina hidroxilasa humana (HUMTH01), unarepetición en tándem de cuatro nucleotidos (AATG). También se aplicaron sistemas

comerciales de tipado multiplex para amplificar seis loci STR. Unificando los datos de

estos análisis fue posible generar 45 perfiles únicos de ADN antiguo, con coherencia

filogenética. Algunas de las conclusiones que se proponen es que el sistema de

parentesco tiene una residencia patrilocal, lo que explicaría el comportamiento de los

linajes mitocondriales, y aunque se intento apoyar esta hipótesis con los resultados

obtenidos de los STRs, estos eran demasiado escasos como para proponer cualquieropción de manera concluyente.


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10. Posibilidades en el Archipiélago Canario

Una vez planteados algunos ejemplos sobre la gran utilidad de los estudios de ADN

antiguo para la interpretación histórica, se propondrán algunas de las posibles vías deinvestigación en las Islas Canarias. Se trata de algunas cuestiones que se han ido

trabajando desde diversas perspectivas y disciplinas y en las cuales la biología molecular

puede hacer una aportación fundamental. Para ello se propondrán cuatros ejemplos de

cuestiones históricas del archipiélago, para las cuales la identificación del sexo genético

sería un gran avance en la comprensión de estos procesos.

El primero hace referencia a la cuestión del infanticidio en Gran Canaria, como unsistema de control de la natalidad. Sobre este asunto hay varias informaciones

etnohistóricas y algunos datos arqueológicos, en especial los encontrados en el

yacimiento de Cendro, Telde, un asentamiento troglodita del Guanartemato de Telde

(Cuenca Sanabria J., 1996). Las fuentes etnohistóricas hacen referencia a la práctica del

infanticidio por parte de los aborígenes canarios, como medida drástica para controlar la

natalidad en momentos de carestía alimenticia, que en ocasiones se ha justificado en la

insularidad y por ende en la limitación de los recursos. Las excavaciones del yacimientode cendro se iniciaron en 1983 y que se continuaron por varios años. El asentamiento de

Cendro haría parte junto con Tara y Caserones del complejo conocido como Telde en

fuentes históricas, como los escritos de Torriani y sus mapas.

A mediados del siglo XV la isla de Gran Canaria fue víctima de un periodo de gran

inestabilidad, en el que se sucedieron guerras, epidemias y una alta mortalidad, que

produciría casi 30 años de inestabilidad social y económica, agravada por una hambrunageneralizada, consecuencia de los años de luchas. Una de las soluciones que presentaría

el consejo de guerra aborigen, o Sabor, sería la adopción de la medida conocida como el

“Estatuto de matar niñas”. Algunos autores sitúan este hecho en torno a la segunda mitad

del siglo XV, aunque también puede haberse producido después de intensificarse la

guerra tras la caída de la colonia europea de Telde en 1473 (Cuenca Sanabria J., 1996).

Varias fuentes hacen referencia a este fenómeno, aunque no se ponen de acuerdo en

cuanto al tiempo en el que este tipo de medidas se mantuvieron vigentes, así como si sólose aplicaban a las hembras o a todos los niños por igual:


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“Había en esta isla muchos hombres, y muchas más mujeres, que se dice juntarse

catorce mil hombres. Y viendo cómo iban en crecimiento, y los mantenimientos les

faltaban y no se cogían frutos que bastasen a su sustento, por no vivir en estrechura,

entrando en consulta y congregación, que llamaban sabor, acordaron y hicieron un

estatuto que se matasen todas las hembras que de allí adelante naciesen, con tal que no

fuesen los primeros partos que las mujeres hacían (porque a tales vientres reservaban

para su conservación), y así supliesen los frutos que la tierra produjese, y no les faltasen,

como había sucedido años atrás. Este estatuto y ordenanza duró poco años, porque fue

Dios servido dar en esta isla una grave enfermedad, en que de tres partes de la gente

faltaron las dos” (Abreu Galindo, 1977).

“Pocos años antes de que la isla de Canaria fuese conquistada, bien por fecunda

influencia del cielo o por vivir la gente con salud por espacio de muchos años, seguían

naciendo sin que os acompañasen en igual cantidad las defunciones. De este modo,

creció la gente en tanta cantidad, que ya no bastaban las cosechas para su manutención,

y empezaron a padecer carestía, a tal punto, que, obligados por la necesidad, para que

no perecieran todos, hicieron una ley inhumana, que matasen todos los hijos después de

primer parto; en cuya crueldad sólo fueron iguales a sí mismo.” (Torriani, 1959).

Algunos de los materiales más relevantes de las excavaciones de Cendro serán los

restos antropológicos. En primer lugar porque se trata de huesos de recién nacidos y de

neonatos, que no son demasiado comunes en los yacimientos del archipiélago. En

segundo lugar porque parte de estos individuos se encontraban depositados en el interior

de vasijas cerámicas y rodeados de una gran cantidad de fragmentos óseos animales,

cerámicos y algunas piezas líticas. Para J. Cuenca y col (1996) estos restos seríanevidencias en favor de la hipótesis sobre el infanticidio. Los posibles análisis para la

determinación del sexo en restos de los que autores como Cuenca denominan

“Horizontes de infanticidio”(1996), pueden resultar claves para intentar comprender este

tipo de procesos históricos.

Los estudios de biología molecular también pueden significar una salto cualitativo

importante en el camino de reconstrucción de los modos de vida de las poblaciones delpasado, como los aborígenes canarios. Un ejemplo de esto es el estudio sobre restos de


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la Gomera que se ha mencionado en apartados anteriores (Arnay-De-La-Rosa et al.,

2009). En éste se ve como la determinación del sexo, entre otras aplicaciones de los

estudios genéticos, ayuda por un lado a confirmar los datos obtenidos de los análisis

antropológicos y por el otro permite responder a preguntas sobre las diferencias de

género en estas sociedades. En este estudio en particular parece no haber una diferenciamarcada entre la alimentación de hombres y mujeres. Sin embargo, al no contarse con

resultados de un gran número de individuos, estas conclusiones resultan de momento

provisionales. Es por ello que este sería un camino de estudio viable en el resto del

archipiélago; la comparación de las condiciones generales de vida, nutrición, patologías,

etc. con el sexo determinado con el ADN antiguo pueden dar una nueva posibilidad de

enfocar este tipo de estudios, teniendo en cuenta el componente de género en nuestra

comprensión de las sociedades pre-hispánicas canarias.

Las poblaciones aborígenes canarias resultan particulares en muchas cuestiones

con respecto a otras poblaciones, tanto del norte de África como de la Península Ibérica.

Es por ello, que en muchas ocasiones resulta difícil aplicar los mismos criterios sobre todo

en lo que respecta a cuestiones antropológicas. Las funciones discriminantes resultan

muy útiles para identificar el sexo de restos humanos incompletos, lo que permite estudios

de paleodemografía al contar con una muestra mucho mayor clasificada. El problema deesta metodología es que su efectividad depende de cada población, por lo que la

tendencia es a realizar y utilizar funciones construidas a partir de poblaciones lo más

cercanas posibles a la población estudiada. Por ello resulta fundamental dar continuidad a

estudios como los realizados por Arnay y col. (2007), en donde se utilizan los análisis de

ADN antiguo para poner a punto funciones discriminantes específicas de la población

canaria. En este ejemplo se utilizaron sólo las mandíbulas, pero los resultados positivos

obtenidos permiten pensar en que este sistema puede ser igualmente útil con funcionesde otras regiones anatómicas.

La incorporación de los análisis de genética molecular en el archipiélago canario,

no se restringen al estudio de los restos aborígenes. Dentro de la denominada

“arqueología histórica” también tienen un amplio rango de posibilidades, ya que en estos

casos los restos suelen aparecer en un mal estado de conservación, lo que dificulta la

observación macroscópica para la determinación del sexo. Esta aplicación se podríaplantear desde dos enfoques diferentes, pero complementarios. El primero se centraría en


70



el estudio de la niñez. En investigaciones recientes sobre la infancia durante la Edad

Moderna en el archipiélago (Ramos Pérez, 2009), se han podido entrever particularidades

en los modos de vida de este grupo frente a los adultos. Sin embargo, debido a la

dificultad para determinar el sexo de los individuos infantiles, no se ha podido precisar si

estas diferencias tienen además un componente de género. Es en este tipo de preguntases donde la biología molecular puede resultar fundamental, ya que permitiría una

clasificación de los individuos según su género, lo que haría posible una comparación

entre ambos grupos.

El segundo enfoque se vincularía con los estudios que se han realizado sobre los

modos de vida de las poblaciones de la Edad Moderna, como el que se hizo con los

restos excavados en la Iglesia de La Concepción, en Santa Cruz de Tenerife (Arnay de laRosa, 2009). Este caso sería un ejemplo de como el estudio de cuestiones

paleonutricionales, mediante análisis de oligoelementos o de isótopos estables, puede

verse beneficiado de la aplicación de la determinación del sexo genético. En este caso

sirvió para corroborar que no hay diferencias significativas entre los resultados

paleonutricionales de hombres y mujeres. Aún si las hubiera, la relación entre los dos

resultados, lleva a plantearse preguntas que deben intentar responderse desde la

interpretación histórica. La importancia de los estudios de ADN antiguo en este tipo decasos es que llevan a plantear hipótesis que de otra manera quizás ni siquiera se tendrían

en consideración.

Aunque estos son algunos ejemplos puntuales, parece bastante claro que las

posibilidades de compaginar los estudios de ADN antiguo en general, y la determinación

del sexo genético en particular, a las investigaciones históricas en Canarias puede

significar un avance importante sobre las preguntas que se pueden llegar a plantear y,quizás, a responder.


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11. Propuesta Metodológica: Posibles enfoques de los estudios de ADN antiguo en

Canarias.

Una vez comprendido el estado de la cuestión de los estudios de ADN antiguo,tanto a nivel general como en el contexto del archipiélago canario, se plantean algunas de

las posibles opciones a seguir en esta disciplina.

Teniendo en cuenta los trabajos arqueológicos que se están realizando en la

actualidad, sobre todo en la isla de Gran Canaria, se puede llegar a pensar en la

posibilidad de analizar series más amplias. En el caso de restos aborígenes aquellos

provenientes de la necrópolis de Maspalomas resultan verdaderamente interesantes. Alser parte de un mismo yacimiento arqueológico se pueden proponer investigaciones que

pretendan establecer posibles relaciones genéticas entre los distintos individuos, así como

las similitudes y diferencias de los comportamientos y tratamientos, tanto antemortem

como postmortem, según el sexo de los individuos. También se están realizando

excavaciones de “arqueología histórica” que permitirían ampliar los datos obtenidos de

investigaciones anteriores, como los de la Iglesia de La Concepción, y compararlos entre

sí para estudiar las posibles similitudes y diferencias.

Una segunda propuesta, que podría llevarse a cabo con el material disponible en el

presente, es de carácter más metodológico. Se trataría de intentar comparar la

preservación del ADN en restos recién excavados con aquellos que llevan almacenados

varios años. Aunque ya existen algunos estudios de este tipo (Sampietro et al., 2006), en

este caso resultaría particularmente interesante porque serían restos provenientes del

mismo yacimiento, por lo que las demás condiciones serían las mismas y se podríaestablecer realmente una comparación entre muestras cuya única diferencia sería el

tiempo que ha transcurrido desde el momento de su excavación. La diferencia entre

ambas situaciones ha sido comentada en numerosas ocasiones, ya que parece ser un

factor determinante en la posibilidad de que se conserven moléculas de ADN endógeno

en restos antiguos. De llevarse a cabo, este estudio permitiría de alguna manera

cuantificar el peso específico de este factor y por tanto valorar mejor las posibilidades de

obtener resultados positivos en determinadas muestras.


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En cuanto al tipo de análisis sobre las muestras, las posibilidades son muy

diversas. Sin embargo, existen kits que permiten el análisis de varios marcadores a la vez

que posibilitarían obtener perfiles bastante amplios de los individuos estudiados. Se debe

enfatizar en que cuando se diseñen los experimentos se incluyan marcadores sexuales

como la amelogenina, porque aunque no siempre la determinación del sexo sea el centrode la investigación, se ha demostrado de manera bastante contundente a lo largo de este

trabajo, las ventajas que esta información puede tener para los historiadores. Teniendo en

cuenta que en la mayoría de las ocasiones incluir este marcador no implica un aumento

significativo en la dificultad de los análisis, parece ser que la relación coste beneficio

justifica el que se tenga en cuenta.

Como complemento a estos marcadores, y considerando los avances de losúltimos años, resultaría interesante intentar aplicar algunas de las técnicas más recientes.

Es por eso que se propone comprobar e incluso mejorar los resultados obtenidos con

marcadores como la amelogenina, en su aplicación más tradicional, con los obtenidos

mediante el uso de SNPs tanto de este gen como de otros relacionados con los

cromosomas sexuales. Esto permitiría que algunas muestras más degradadas puedan dar

resultados positivos, lo que ampliaría el tamaño la muestra, y por lo tanto la fiabilidad de

las relaciones y conclusiones obtenidas a partir de ésta. Esto también puede sercomplementado con la aplicación de marcadores específicos del cromosoma Y, que

sustenten y autentifiquen los resultados de otros marcadores. Partiendo de los grandes

problemas que presenta el ADN antiguo se hace patente que todas estas propuestas son

necesarias para verificar los resultados obtenidos, dando así mayor credibilidad a este

tipo de estudios.

Una última cuestión fundamental en el futuro de los estudios de ADN antiguo en elarchipiélago canario, es su integración dentro de un discurso histórico más amplio. Este

planteamiento supone que, más allá de los retos técnicos y metodológicos que suponen

este tipo de estudios, y cuya superación ya es un mérito en sí mismo, los resultados

obtenidos estarán incompletos si no se incorporan dentro de una interpretación histórica.

Antes de acometer estudios de este tipo, se deben plantear unas hipótesis y objetivos de

carácter histórico para los que la biología molecular pueda ayudar a dar respuesta. En

esa medida las posibilidades de futuro del ADN antiguo en Canarias son muy elevadas.Primero porque se están presentando oportunidades de estudios con materiales mejor

contextualizados que aquellos de los que se ha podido disponer hasta el momento. En


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segundo lugar, porque existe un banco de resultados que se han obtenido de diversos

análisis y que se encuentran a la espera de ser interpretados e introducidos dentro de una

discurso histórico que nos acerque a la comprensión de las sociedades que habitaron las

islas en el pasado. Sólo si se consigue este objetivo, se podrá realmente hablar de

interdisciplinariedad, porque si no se seguirá fallando en una verdadera articulación de lasdiferentes disciplinas y seguirá trabajando cada uno por su lado.


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12. Conclusiones

- Cuando se analizan las características de los estudios de ADN antiguo se pueden ver

claramente todas las dificultades que conllevan, pero a su vez es posible vislumbrarcomo, en multitud de casos, éstas son superadas por los investigadores. Siendo una

disciplina con múltiples complicaciones teóricas, técnicas y metodológicas, los intentos

que en estos estudios se emprenden no resultan inútiles ya que en el caso de obtener

resultados positivos, los datos obtenidos son de gran valor.

- Los resultados que pueden llegar a dar este tipo de estudios, permiten a los

investigadores plantearse preguntas que en otros momentos resultaban impensables.Sin embargo, como demuestra el camino recorrido desde las primeras publicaciones

sobre estos temas, la prudencia debe ser una máxima, ya que las posibilidades de

errores son muy altas. Las implicaciones de estas afirmaciones erróneas pueden ser de

gran envergadura por lo que se debe intentar utilizar todos los mecanismos de

verificación, para garantizar, en la medida de lo posible, la veracidad de los resultados.

- A pesar de las grandes dificultades planteadas por el análisis de muestras de lascaracterísticas aquí planteadas, un repaso por las últimas investigaciones pone de

manifiesto que muchas de ellas se han ido subsanando. Las posibilidades son muy

variadas y la elección de unas sobre otras debe determinarse de acuerdo a las

características específicas de cada investigación. A su vez podemos llegar a pensar que

los avances en los próximos años traerán solución a los problemas no resueltos o

perfeccionarán las ya existentes.

- Una vez analizados los estudios de ADN antiguo queda patente la necesidad de una

verdadera interdisciplinariedad. Ésta implica que los investigadores de las distintas áreas

implicadas establezcan verdaderos canales de comunicación. Se debe partir de la

construcción de un lenguaje común que permita a los investigadores establecer unos

canales de comunicación y unos objetivos conjuntos, para cuya consecución cada uno

aporte distintos enfoques desde sus propias áreas de conocimiento. Debe haber un

verdadero interés por los conocimientos aportados por otros, porque sólocomprendiéndolos es posible integrarlos dentro del propio trabajo. Para ello es


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indispensable una formación mínima en las distintas áreas que permita el entendimiento

mutuo.

- El trabajo conjunto y el diálogo constante entre los diferentes implicados en el proceso

de investigación, arqueólogos, antropólogos, biólogos, etc. resulta fundamental para

garantizar el éxito de los análisis. Problemas particulares de este tipo de muestras,pueden ser subsanados con relativa facilidad si realmente existe una colaboración por

parte de todos los investigadores. Esto ayudará a evitar problemas que puedan poner en

juego los resultados de las diferentes disciplinas implicadas.

- Siendo conscientes de la limitación del material disponible para el estudio de ADN

antiguo, se hace indispensable un uso responsable del mismo. Es por ello que este tipo

de investigaciones deberían estar guiadas por preguntas inmersas dentro de un discursohistórico. De otro modo se harán gran cantidad de análisis que agotaran las muestras

disponibles pero cuyos resultados no aportarán una información relevante para entender

los procesos históricos en los que estos individuos se vieron inmersos.

- Se puede decir que los estudios de ADN antiguo plantean una nueva perspectiva para

diversas preguntas históricas. En ocasiones como complemento y afirmación de

hipótesis existentes y, en otras, planteando dudas sobre interpretaciones que parecíanclaras, lo que puede conllevar al replanteamiento de las mismas.

- Por último, queda patente que son más las preguntas planteadas que las respuestas.

¿Hasta qué punto los estudios de ADN antiguo son fiables? y si lo son, ¿Hasta donde

pueden ser útiles para responder preguntas históricas? o ¿Qué tipo de respuestas nos

pueden dar?¿Son estas de interpretación unívoca a la hora de introducirlas dentro de un

discurso histórico?. Éstas son sólo algunas de las dudas que quedan expuestas y a lasque se debería intentar dar respuesta en investigaciones posteriores.


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