TEMA 2: Função das Membranas Celulares

Receptores, enzimas membranares esinalização intracelular

Licenciatura em Engenharia Biomédica2005/06

Luís Martinho do Rosário(Depto. de Bioquímica / FCTUC)

Moléculas de sinalização extracelular / I

BionBiom/#2-26

►Mediadores químicos locais

Actuam somente no ambiente local (difusão extracelular)

►HormonasInteractuam com células-alvo em zonas remotas do organismo (transporte pelo sangue)

►NeurotransmissoresInteractuam com células-alvo pós-sinápticas(difusão na fenda sináptica)

Exemplos: factor de crescimentonervoso – NGF (proteína); histamina(derivado de aminoácido); prostaglandinaE2 (derivado de ácido gordo)

Exemplos: insulina (proteína); somatostatina (pequeno péptido); adrenalina (derivado de aminoácido);testosterona (esteroide)

Exemplos: glicina, noradrenalina,ácido γ-aminobutírico – GABA, acetilcolina(aminoácidos e derivados); encefalinas(pequenos péptidos)

BionBiom/#2-27

Moléculas de sinalização extracelular / II◙ Solúveis em água

Maior parte das hormonas e mediadores químicoslocais Todos os neurotransmissores

Adrenalina

Ligam-se a RECEPTORES na MEMBRANA PLASMÁTICA

Célula-alvoem repouso

Célula-alvoactivada

ligando

receptor

receptor ocupadopelo ligando

activação de viasde sinalização intracelular

(produção de segundos mensageiros)◙ Pouco solúveis em água (hidrofóbicas)

Hormonas esteroides e hormonas da tiroide

Testosterona

regulação da transcriçãode genes

ligando

proteínatransportadora

receptorintracelular

Ligam-se a RECEPTORES INTRACELULARES

BionBiom/#2-28

Receptores membranares◘ IONOTRÓPICOS

Ou “canais operados por receptores”. Integram um canal iónico,aberto por ligação do neurotransmissor

◘ METABOTRÓPICOS► Receptores com sete segmentos transmembranares (7-TMS)► Receptores catalíticos com um único segmento transmembranar

Receptores ionotrópicos Ex: receptor de acetilcolinanicotínico

Superfamília de receptores tipo colinérgico▓ 5-HT3 (serotonina)▓ GABA-A▓ Glicina

▓ Acetilcolina (nicotínico)

Superfamília de receptores glutamatérgicos ionotrópicos▒ N-metil-D-aspartato (NMDA) Ca2+ (Na+)▒ AMPA / Kainato

Na+ (Ca2+)

Cl-

(Entrada de Na+ Despolarização Activação de CCSVs) Entrada de Ca2+ [Ca2+]i

BionBiom/#2-29

Receptores catalíticos com um único segmento transmembranar

Ex: - Receptor de insulina- Receptor de factor de crescimento da epiderme (EGF)- Receptor de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)

InsulinaSítio de reconhecimento do ligando(insulina)

Domínio transmembranar

Domínio catalítico(actividade de tirosina cinase) Inclui sub-domínio

regulador

Associação oligomérica induzidapor insulina

Interacção entre domínios catalíticos

Actividade de tirosina cinase(inclui auto-fosforilação)

Receptores 7-TMS

BionBiom/#2-30

╬ Sítio de reconhecimento externo de ligandos╬ Sete segmentos transmembranares helicoidais╬ Sítio de reconhecimento interno de proteínas G

Proteínas G: proteínas que ligam nucleótidosde guanina (GTP e GDP)

GTP

Receptor

L

Ligando

GGα

Enz

2os mensageiros

Enzimamembranar

Receptor7-TMS

Enzimamembranar

Segundosmensageiros

Enzimasintracelulares

Respostascelulares

Agonista

+

+/-

+/-Prot G

+

BionBiom/#2-31

Proteínas G heterotriméricas

► Heterotrímeros (subunidades α, β e γ) no estado inactivo

► Subunidade α tem actividade de GTPase (GTP→GDP+Pi)

Gαβγ/GDP Enz inactiva Enz inactiva

Gαβγ/GTP

Gβγ

Gα/GTP Enz activaEnz inactiva

Gα/GDP

1. 2.

3. 4.

BionBiom/#2-32

cAMP como segundo mensageiro

ATP cAMP(adenosina 3’,5´-monofosfato)

5’-AMP

Adenil ciclase Fosfodiesterase

H2O

PPi 2PiH2O

Pirofosfatase

processo endergónico

processo exergónico

processo exergónicoSíntese

Ex: Receptor de glucagãoReceptor adrenérgico β(β1 ou β2)

cAMP

Activa PKA

Fosforilação de proteínas

Ex: Agonista βGlucagão

Respostas celulares aagonistas β ou glucagão

Degradação

Gs: Proteína G estimuladora (αsβγ)- sensível à toxina da cólera

Gi: Proteína G inibidora (αiβγ)- sensível à toxina pertussis- activada pelo receptor adrenérgico α2

Glicogénio (n) Glicogénio (n-1) + Glicose-1-fosfatoGlicogénio fosforilase

GlicoseGlucagão ou adrenalina

BionBiom/#2-33

Proteína cinase dependente de cAMP (PKA)

Sub. reguladora

Sub. catalíticaR2C2

inactivo

activas

ATP + Proteína Proteína - P + ADPcAMP / PKA

fosforilação em resíduosde serina / treonina

Proteína + Pi

fosfatase

Amplificação de sinais

Um complexo agonista–receptor Activação de várias moléculas de proteína G

Uma molécula de Gs activada Activação de várias moléculas de adenil ciclase (AC)

Uma molécula de AC activada Síntese de várias moléculas de cAMP e activação devárias moléculas de PKA

Uma molécula de PKA activada Fosforilação de várias moléculas de proteína-alvo

Um único evento de ligaçãoagonista-receptor

Activação de milhares demoléculas de proteínas-alvo

RESPOSTA CELULAR

Segundos mensageiros derivados de fosfolípidos membranares

BionBiom/#2-34

PIP2 DAG

(1,4,5)IP3

PLC: Fosfolipase CPIP2: Fosfatidilinositol-4,5-

-bisfosfatoDAG: Diacilglicerol(1,4,5)IP3: Inositol 1,4,5-trifosfatoPKC: Proteína cinase C

Fosfolipase CProteína cinase C

(activa)

Receptor 7-TMS(activo)

Proteína cinase C(inactiva)

DAG - lipofílico, activa PKC(1,4,5)IP3 - hidrossolúvel, activa

receptores do RE / RSExos de receptores 7-TMS acoplados a PLC: acetilcolina muscarínico, adrenérgico α1, glutamato metabotrópico

Domínio de ligaçãodo substrato

Domínio do pseudo--substrato

Proteína-alvocPKC

ATP + Proteína Proteína- P + ADP

fosforilação em resíduosde serina / treonina

Ca2+ intracelular como segundo mensageiro

BionBiom/#2-35

Mecanismos de produção- Influxo / canais (membrana plasmática)- Libertação de reservatórios / receptores-canais (ER / SR)

Mecanismos de terminação- Ca2+ ATPases (membrana plasmática, ER / SR)- Trocador Na+/Ca2+

- Tomada por outros organelos (ex: mitocôndria)

Libertação de Ca2+ de reservatórios intracelulares

Receptor de (1,4,5)IP3

4 subunidades iguais (6-TMS) delimitam um poro

Activador: (1,4,5)IP3

Receptor de rianodina

4 subunidades iguais (4-TMS)

delimitam um poro

Activadores:Ca2+, cADPR(rianodina, cafeína)

Ligação de Ca2+ e activação de proteínas

BionBiom/#2-36

+ Ca2+ ↔Ca2+

Ca2+Actividade

1 2

1: Proteína ligante de Ca2+

2: Proteína reguladora

Alteração conformacionalda proteína ligante de Ca2+

Ca2+

Ca2+

OH H

OHH

Mg2+

Ca2+

Raios iónicosMg2+ …. 0.6 ÅCa2+ …. 0.95 Å

Calmodulina e proteína cinase dependente de Ca2+ / calmodulina

BionBiom/#2-37

Proteínas ligantes de Ca2+

(exemplos)

● Proteína cinase C (PKC)● Anexinas● Troponina C● Calmodulina (CaM) ~ 15 kDa

liga 4 iões Ca2+ (loops entreα-hélices)

Proteínas dependentes de CaM(exemplos)

● Cinase das cadeias leves da miosina● Cinase da fosforilase do glicogénio● Fosfatases (calcineurina)● Fosfodiesterases● Sintase do óxido nítrico● Cinases dependentes de CaM (tipos I-IV)

CaMK: CaM/Ca2+ promove a desrepressão do local catalítico (ocupadopela sequência do pseudo-substrato do domínio regulador, na ausência de CaM/Ca2+)

fosforilação de proteínas em resíduos de serina / treonina

Sinalização por óxido nítrico (NO)

L-arginina Citrulina + NONOS

O2 NADPH

NOS: Sintase do óxido nítricoRegulação por NO• Fluxo sanguíneo e vasodilatação• Agregação plaquetária• Neurotransmissão e neuromodulação• Defesas imunitárias• Outras

Isoformas

nNOS (ou neuronal, NOS-1)eNOS (ou endotelial, NOS-3)

iNOS (ou indutível, NOS-2)

Mensageiro intercelular

Produção Ex: célulasendoteliais vasculares

Difusão

Acção Ex: músculoliso vascular

constitutivas, activadaspor Ca2+/CaM (via receptores)

Induzidas por transcrição de genes(via citoquinas, endotoxinas, etc)

elevada afinidade para com Ca2+/CaM Efeitos de NODependentes de cGMP• Guanil ciclase solúvel (sGC)Independentes de cGMP• Nitrosilação de proteínas, hemoglobina,

oxigénio / superóxido BionBiom/#2-38

GMP cíclico (cGMP) como segundo mensageiro

GTP cGMP + PPiGC

GC: Guanil ciclaseRegulação por cGMP• Tonicidade do músculo liso• Fototransdução• Homeostasia de fluidos

e electrólitosClasses de GC

• Membranar (pGC) receptor activado por péptidosnatriuréticos, guanilina, endotoxinas

• Solúvel (sGC) citossólica, activada por ligação de NO a um grupo hemo

(pGC)

(sGC)

PKG+

Alvos de cGMP

• Proteína cinase dependente de cGMP (PKG)(cinase serina / treonina)

• Canais activados por nucleótidos cíclicos(fototransdução na retina)

• Fosfodiesterases reguladas por cGMPBionBiom/#2-39

Fosfodiesterases reguladas por cGMP e vasodilatação

PDEPDE: Fosfodiesterase

cGMP 5’-GMP

H2O

Degradação do sinalFamílias de PDEs

• Específicas para cAMP• Específicas para cGMP: PDE5 (plaquetas / músculo liso /corpus cavernosum), PDE6 (fototransdução) e PDE9• Especificidade mista para cAMP/cGMP

Inibidor de PDE5 cGMP

Relaxação do músculo liso do corpuscavernosum, aumento do fluxo sanguíneo

e erecção do pénis

BionBiom/#2-40