Técnicas de muestreo para el control microbiológico.

Dra. Keiko Shirai

Muestreo Es la sucesión de pasos

para asegurar que la muestra  posea las características esenciales del lote.

Muestra Una porción de material

tomada y seleccionada de tal forma que sea representativa del lote (IUPAC).

La muestra seleccionada para el análisis debe ser representativa del lote entero del alimento y lo suficientemente grande para poder llevar acabo todas las determinaciones.

La técnica de análisis sea ejecutada con estricto apego a la metodología establecida.

Comparación con normas o estándares de calidad

Para realizar un muestreo en forma práctica se utiliza el "Sentido Común". La experiencia de los procesos de fabricación permite que el muestreo puede resolverse al tanteo.

Ejemplo 1: tomando muestras al principio y al final de la jornada;

Ejemplo 2: tomando como muestra el último producto de cada serie (como se hace con algunos alimentos precocidos y congelados).

Desde el punto de vista microbiológico….

¿Cómo debo de realizar el muestreo?¿Qué cuidados debo de tener para

evitar un resultado erróneo?

Criterios Generales de Muestreo.

estéril y envuelto evitar contaminación

del ambiente. rotular o etiquetar. Consignar información

transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeración o en congelación.

evitar agua de deshielo reducir tiempo comprendido

entre recolección y entrega de la muestra.

muestras líquidas deben encontrarse homogéneas

¿Cómo manejar una muestra sólida? ¿Cómo evitar heterogeneidad?

se recomienda un peso de 100 gramos

a granel o en recipientes o piezas grandes integrar una muestra representativa

pueden tomarse muestras de la superficie y profundas

obtención de muestras superficiales

usar líquidos de dilución con bajo potencial redox para anaerobios estrictos

Para muestras sólidas

en alimentos congelados

Una vez que tengo la muestra estoy listo para trabajar…

Pero cómo empezar…

1. Recuento en placa

2. Número más probable

3. Reducción de colorantes

4. Recuento directo al microscopio

Técnicas de manejo de muestras.

Si es muestra líquida congelada fundirla y homogeneizarla.

evitar escurrimientos para muestras sólidas se licua o

se puede usar un mortero estéril. El volumen que se transfiere

nunca será menor del 10% de la capacidad total de la pipeta,

Recuento en placa: Dilución para conteo de microorganismos viables

¿Cuántas pipetas estériles deberé de utilizar para evitar contaminación y error?

Cuenta en placa Consiste en contar

colonias que se desarrollan después de cierto tiempo

presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en la muestra. Vertido Superficie

Reglas para conteo en placa

1. 30 a 300 colonias2. Contar todas las colonias de la placa. 3. Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones

subsecuentes: 1. 301-500 colonias se divide en dos partes y el número de colonias contadas se

multiplica por 2. 2. 501-800 colonias se divide en cuatro partes 3. >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por

el número de cuadros que ocupa la caja. 4. Multiplicar el número de colonias por el inverso de la dilución 5. Redondear la cifra obtenida a dos dígitos al inicio de la cifra

por ejemplo:

129 se reporta 130 2,417 se reporta 240049 se reporta 49

Agua peptonada 0.1% pH 6.8-7

Solución amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7

Solución de Ringer Medio enriquecido para

clostridios Solución de sacarosa al

20% o NaCl al 15%, osmófilos y halófilos respectivamente.

Diluyentes de uso general

Factores que afectan el recuento en placa

1. Métodos de muestreo2. Distribución de los microorganismos en el alimento3. Naturaleza de la flora del alimento4. Naturaleza del alimento5. Antecedentes del alimento previos al examen6. Adecuación nutricional del medio utilizado para el

cultivo en placas 7. Temperatura y tiempo de incubación8. pH, aW y potencial de óxido reducción9. Tipo de diluyente10. Número relativo de microorganismos en la muestra11. Existencia de otros microorganismos competidores

o antagonistas

Número más probable: Recuento en tubo

supone una concentración de microorganismos pequeña

estimación estadística de la densidad de bacterias en el alimento

permite la inclusión de agentes selectivos

se utiliza como una etapa de enriquecimiento que busca aumentar la concentración de microorganismo de interés.

Se considera positivos aquellos que después de incubados presenten enturbiamiento, cambio de color, formación de gas.

Pruebas presuntivas

Ejemplo para coliformes Caldo Lauril sulfatoFermentación de carbohidratos como caldo

lactosado.

De los tubos positivos de la prueba presuntiva se inoculan a la prueba confirmativa. El número de tubos positivos y negativos determinará el Número Más Probable

Ejemplo para coliformes caldo EC.

Pruebas confirmativas

Tabla Número Más P

robable

Número Más Probable

Ventajas Sencillo Es más probable que los resultados coincidan

entre laboratorios a diferencia del recuento en placa.

Con medios selectivos y diferenciales se puede determinar el número de microorganismos a que grupo pertenecen.

Desventajas Gran cantidad de material No se puede observar la morfología de las

colonias Poco exacto

Se basa en el tiempo transcurrido para que tenga lugar la reducción del colorante es inversamente proporcional al número de microorganismos existentes en la muestra.

Método de la reducción de colorantes

Resazurina Azul pizarra al rosa

o al blanco

morada rosa

dihydroresorufin

blanco

Azul de metileno

Ventajas Sencillas, rápidas, baratas y solamente

las células viables reducen los colorantes.

Desventajas Las sustancias reductoras propias de

los alimentos pueden afectar el resultado.

No todos los microorganismos reducen de igual modo los colorantes.

Recuento directo al microscopio

Consiste en: Frotis de la

muestra ó cultivo en portaobjetos

Tinción mediante un colorante

Observación al microscopio y recuento

Para calcular el número de microorganismos por ml de la muestra: Calcular el promedio contado por cada

cuadro Multiplicar el promedio por 10,000 para

obtener el número de células por ml de la muestra diluida.

Multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.

Ejemplo

Suponga que diluyó la muestra original (0.1 ml) en 9.9 ml de diluyente

La cuenta en 5 de los 25 cuadros grandes fue de 132 y 128 células.

Ejemplo resuelto

El promedio de células fue de 130 x 5 o 650 células por área contada (650 células por 0.1 microlitro).

Multiplicamos las 650 células por área contada por 10,000 para obtener el número de células/ml de muestra diluida (6,500,000)

Multiplicamos 6,500,000 cells/ml por 100 (factor de dilución) para obtener 650,000,000 por ml of muestra original.

Ventajas Sencillo y rápido Se puede apreciar la morfología

Desventajas Cansado Se cuentan viables y no viables Las partículas del alimento no siempre pueden

ser diferenciados sustancias Las células microbianas no están distribuida

uniformemente con respecto a células aisladas.

Algunas células no se tiñen bien. Conteos elevados.