TÉCNICAS DE FIJACIÓN, TINCIÓN Y MONTAJE DE

LAMINILLAS PERMANENTES.

PREPARACIONES PERMANENTES: el diagnostico con este tipo se aplica en gota gruesa, frotis de heces o directamente preparando protozoarios, helmintos o bacterias, este se realiza utilizando básicamente microcopia de campo claro.

FUNDAMENTO: Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces eliminadas(color, presencia de sangre y/o moco, consistencia etc.).

La fijación: tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente una estructura similar a la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por otra parte la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.

Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alterarían las estructuras de la bacteria: en ningún momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar.

Tinción Simple:

utiliza un solo colorante.

Bacteria Francisella tularensis teñida con azul de metileno

Tinción de Gram:

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30 seg)

Cuando se realiza una tinción de Gram a partir de un cultivo se observan bacilos de morfología curvada y Gram negativos

TincionesSon técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no, determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos:

En el caso de los Gram (+) la muestra fue sarcina, puesto que una tonalidad violeta fijada en su estructura determina la presencia de la misma puesto que fijó en su estructura el cristal violeta.

Tinción de Gram:

Y en el Gram (-) salmonella identificada por la presencia de muchas estructura un poco triangulares de color rojo. En la muestra anterior eran gran positivo por su coloración morada.

Dividida en Gram positivo y Gram negativo.

Tinción Ácido Resistente:

Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el ácido y toman el color azul.

Tinción de Giensa:

El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos de la células.

Tinción de Esporas:

Se usa Wirtz-Conklin o verde de malaquita

Tinción de Cápsula:

Se usa colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos encapsulados creando resistencias.

Tinción de Flagelos:

Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.

Material:

Realización de los tipos de tinciones

Portaobjetos.

Mechero Bunsen. Asa de siembra.

Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

Cubetas de tinción o similar.

Colorantes para las tinciones.

Cristal violeta Lugol alcohol-Acetona

Safranina.

TINCIÓN SIMPLE

Es la tinción en que se utiliza un solo colorante.Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza básica.

La técnica es la siguiente:

1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.

2. Cubrir con colorante la preparación y dejarlo actuar durante un minuto.

3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

Esta técnica permite observar la morfología y tamaño de las bacterias, así como los tipos de agrupaciones que forman.

4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) empleando el aceite apropiado.

Bacteria Francisella tularensis

Medio de cultivo

Materiales:

Mechero de busen Caja de petriAsa de platino

Matraz Erlenmeyer Probeta graduada Tripie

horno

Tela de alambre con centro de albestoVaso precipitado

Balanza granataria Estufa bacteriana

Procedimiento:

1.-Anivelamos la balanza y pesamos el papel.

2.-con el peso del papel sumamos los gramos de agar de sangre.

3.-se pesa el agar sangre.

4.-destapamos el matraz y echamos el cultivo adentro del matraz.

5.- se mide el agua destilada en la probeta graduada que es 20ml.

6.- se le echa el agua destilada adentro del matraz para disolver el cultivo.

8.- se ponen a hervir el medio moviéndolo, una vez que comience a hervir se quita el mechero para que no rebose.

7.- una vez que esté bien disuelto el medio de cultivo , lo tapamos, luego se agarra el tripie y la tela de alambre para poder hervir el medio de cultivo con el mechero de Fisher.

9.- después se mete al horno por 15min. A 150°c.

10.- después de que se saca del horno se lleva ala mesa para así pasarlo ala caja de petri.

11.- se le quita el algodón al matraz y se le pasa ala llama ala boquita dos o tres veces y se echa en medio de las cajas de petri el medio de cultivo, se le saca las burbujas en el caso que si se les llega a formar (con el asa esterilizado se pueden quitar).

12.- se deja abierto por 5min. Para que se evapore un poco el medio.

13.- se tapa la caja de petri después de a verse concluido los 5min.

14.-se deja enfriar un poco mas, después se levantan suavemente para meterlo al refrigerador.

15.-despues de dos o tres horas ya se puede usar el medios de cultivo.

16.- se saca el medio del refrigerador y se llevan ala mesa.

17.- se prende el mechero y se voltean el medio.

18.- se agarra la sangre y se deposita adentro de el medio de cultivo sin romper el medio.

19.- con el asa ya esterilizado se afora de los lados 4 a 5 veces

20.-se vuelve a tapar la caja de petri y se lleva ala estufa bacteriana a 37°c por 24 horas si no se ve el desarrollo bacteriano se saca y se dice que no hubo desarrollo bacteriano (no hay bacterias).

21.- una ves que hay un desarrollo bacteriano con el asa esterilizado se enfría en el cultivo donde no halla colonias y se agarra una colonia cuando se necesita hacer frotis o otras cosas.

Microorganismos Tipo de coloniaEscherichia coli Verdosas con brillo

metálico y centro negro azulado

Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes

Proteus mirabilis Incoloras

Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes

Shigella flexneri Incoloras

Salmonella typhimurium Incoloras

Tinción de Gram

Conocer la técnica de tinción de Gram, conocer el procedimiento y observar las bacterias en microscopio clasificándolas en Gram. Positivas y Gram. Negativas.

OBJETIVO

MATERIALES

Microscopio Torundas de algodónCajas petri con medio de cultivo

Mechero de bunsenSoluciones de cristal violeta

LugolAceite de inmersión

Agua destilada

yodo

acetona

Asa de platino

safraninaportaobjeto

Procedimiento:

1.- realizar un frotis en forma habitual.

3.- lavar el frotis con agua de la llave. 4.- cubrir el frotis con el cristal violeta por un minuto.

2.-se fija con el mechero de busen.

5.- cubrir el frotis con lugol por un minuto.

6.-lavar el frotis con agua de la llave.

7.-colocar el frotis en posición inclinado y decolorar con alcohol- cetona hasta dejar de arrastrar colorante.

8.-lavar el frotis con agua de la llave.

9.- cubrir en frotis con safranina por un minuto.

10.- lavar el frotis con agua de llave.

11.-dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

12.-limpiar la parte de debajo del frotis con una torunda de alcohol.

13.- poner sobre el frotis extendiéndola una pequeña cantidad de aceite de inmersión.

14.-abservar el frotis en el microscopio con el 100 o 10 x.

Tinción diferencial Gram: Bacillus subtilis Gram positivo. Aumento 1000x

Resultados que puede dar:

Tinción diferencial Gram: Escherichia coli DH5α Bacilos Gram negativo. Aumento 1000x

TINCIÓN DE ESPORAS

Fundamento:Las especies de los géneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de formar endosporas que son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.), formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. La formación de endosporas es un carácter de gran importancia en la biología de un microorganismo.La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana bacteriana frente a la tinción, por lo que se utilizan técnicas especiales de coloración con verde malaquita o fucsina básica (en caliente) como colorantes.

Material:

Portaobjetos.

Asa de siembra

Mechero BunsenPapel de filtro.

Verde malaquita (solución acuosa al 2%).

Microscopio. Safranina.

Cultivo de Bacillus en medio sólido.

Método:1. Hacer un frotis de cultivo en medio sólido (preferentemente de al menos 48 horas) de Bacillus sphaericus y Bacillus thuringiensis. Secar al aire y fijar con calor.

2. Colocar el porta sobre un trípode y cubrir la preparación con papel de filtro de aproximadamente el mismo tamaño que la extensión (tienen por objeto mantener húmeda la preparación y evitar que los bordes del porta se manchen de colorante).

3. Añadir la solución de verde malaquita (solución acuosa al 2%), calentar con el mechero nuevamente, sin que llegue a hervir, hasta la emisión de vapores blancos. Continuar calentando durante 5 minutos. Añadir más colorante si éste se evapora. Es importante que la muestra no se seque.

4. Lavar con agua intensamente y quitar el papel de filtro.

5. Teñir con safranina (como colorante de contraste) durante 1 minuto.

6. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.Se verá la endospora teñida de color verde y las células vegetativas de color rojo.

Interpretación de los resultados:La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteriaconstituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Por ejemplo, Bacillus sphaericus posee una endospora esférica con localización terminal y deformante de la célula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca un abombamiento característico denominado en huso.

TINCIÓN DE CÁPSULA

Fundamento:La cápsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulación de material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. Las cápsulas se pueden clasificar en función del grado de asociación con la superficie celular, o por su consistencia:Cápsula periférica: asociada a la superficie

celular sólo en determinadas condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior.

Cápsula integral: íntimamente asociada con la superficie celular, con la pared celular

Cápsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partículas.Además, es deformable y carente de límites precisos.

Cápsula rígida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partículas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un límite exterior definido.

Hay una cierta confusión en la nomenclatura de las cápsulas. Por eso cabe destacar que CÁPSULAS en sentido estricto son aquellas de tipo rígido e integral. Capas mucilaginosas son las de tipo flexible y periférico.

Microscopio

Material:

Cepas bacterianas: Klebsiella en medio líquido

Tinta chinaPortaobjetos

cubreobjetos

1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, añadir unagota de tinta china y mezclar bien.

2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensión de células con tinta china. Evitar que se formen burbujas.

3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será absorbido por los papeles.

5. Observar al microscopio, se debe de ver la célula teñida de negro y la cápsula en blanco.

4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse lasmanos con jabón.

Tinción ácido-alcohol resistente

Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. A estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido.Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las microbacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M.leprae (lepra).

Microscopio Portaobjetos Asa de siembra Cultivo bacteriano Pinzas

Mechero de alcohol Papel de filtro azul de metileno fucsina-fenol mezcla de ácido y alcohol

Materiales:

1.-Prepara un frotis bacteriano.

2.-Cubrir la preparación con carbofucsina.

3.-Lavar con agua el resto de colorante.

Procedimiento:

3.-Decolorar con la mezcla ácido-alcohol.

4.-Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se añade más carbofuxina para que no se seque en ningún momento.

Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.

Teñir con azul de metileno 1 min.

Lavar con agua el resto de colorante.

Examinar al microscopio.

Secar la preparación.

Resultados:

Técnica de kodakaLos flagelos son apéndices bacterianos para la locomoción.El numero y distribución de flagelos es una características constante de la especie y tiene valor taxonómico. Según el arreglo de los flagelos, las bacterias se pueden agrupar en: Monotricas: cuando solo tiene un flagelo.Lofotricas: las que presenta dos o mas flagelos (mechón) en uno o ambos extremos.Anfitricas: que presentan un solo flagelo en cada extremo.Peritricas: las que presentan flagelo en toda la superficie.

Tinción de flagelos

Cultivo de pseudomonas sp. De 18 horas en agar sangre.Colorante de kadaka recién preparado.1 frasco de koplic.Porta objeto

Materiales

Procedimiento:

1.-En un portaobjeto limpio dibujar un círculo y en la cara opuesta colocar sobre cada círculo una pequeña gota de agua destilada.

2.-Con una asa tocar la superficie de una colonia, no debe tocar el cultivo. Transferir las bacterias tomadas alas gotas de agua colocadas en el portaobjeto, para ello tocar la gota con la puta de la aguja, dejándola entre 10 y 10 segundos en contacto con agua. No agitar el asa ni realizar movimientos bruscos al movimiento de depositar las bacterias pues los flagelos son estructuras muy frágiles que fácilmente se desprenden.

3.- dejar secar la preparación al aire. No flamear. Es importante secar la preparación al aire y no calentarla, pues el calor distorsiona los flagelos.

4.- cubrir las preparaciones con el colorante durante 5 a 10 minutos. Colocar la lamina en el frasco de koplic y lavar 2 o 3 minutos con agua del tubo. Se requiere un lavado intenso por ambos lados de la lamina para evitar artefactos que puedan influir en la observación. Escurrir y dejar secar al aire libre.

5.- observe con el objetivo de inmersión y analizar la preparación de la periferia hacia el centro. Es recomendable iniciar el análisis en la periferia de la preparación, pues allí se concentran las células flageladas.