tecnicas de biologia molecular en bacteriologia
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TECNICAD DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EN MICROBIOLOGIATRANSCRIPT
DETECCION DETECCION GENOTIPICA DE LA GENOTIPICA DE LA RESISTENCIA A LOS RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOSANTIMICROBIANOS
Por Ana Cristina Villagra de Por Ana Cristina Villagra de TrejoTrejo
Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología
Objetivos:Objetivos:
““Conocer los aportes de la Conocer los aportes de la Biología Molecular en la Biología Molecular en la
detección genotípica de la detección genotípica de la Resistencia a los Resistencia a los
Antimicrobianos” Antimicrobianos”
Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología
Temas a abordar:Temas a abordar: Técnicas de Biología Molecular y BacteriologíaTécnicas de Biología Molecular y Bacteriología Breve reseña sobre los métodos usados.Breve reseña sobre los métodos usados. Reacción de la Polimerasa en Cadena.Reacción de la Polimerasa en Cadena. Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico.Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico. Aplicación en la Microbiología clínica de la Aplicación en la Microbiología clínica de la
PCRPCR DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA.ANTIMICROBIANA.
Técnicas de Biología Molecular Técnicas de Biología Molecular en Bacteriologíaen Bacteriología
Métodos de hibridización.Métodos de hibridización. DNA/RNA sondas.DNA/RNA sondas.
Métodos de amplificación de ADN.Métodos de amplificación de ADN. PCR.PCR.
PCR de Tiempo Real.PCR de Tiempo Real.
NABSA – LCR.NABSA – LCR.
Métodos de separación de ADN.Métodos de separación de ADN. PFGE – RFLP.PFGE – RFLP.
Métodos de secuenciamiento de ADN.Métodos de secuenciamiento de ADN.
Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología
Temas a abordar:Temas a abordar: Técnicas de Biología Molecular y BacteriologíaTécnicas de Biología Molecular y Bacteriología Breve reseña sobre los métodos usados.Breve reseña sobre los métodos usados. Reacción de la Polimerasa en Cadena.Reacción de la Polimerasa en Cadena. Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico.Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico. Aplicación en la Microbiología clínica de la Aplicación en la Microbiología clínica de la
PCRPCR DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA.ANTIMICROBIANA.
Métodos de hibridizaciónMétodos de hibridización
SouthernblotLos fragmentos de ADN se encuentran en un gel de agarosa.
Se transfieren a membranas de nylon o nitrocelulosa.Por la presión creada por una cámara conectada a bomba de vacío.Los fragmentos de ADN van desde el gel a la membrana.En dirección de la presión generada por el sistema.
Métodos de amplificación de Métodos de amplificación de ADN.ADN.
PCR: Reacción de la Polimerasa en CadenaPCR: Reacción de la Polimerasa en Cadena
““La PCR es una herramienta La PCR es una herramienta integral en Biología Molecular, integral en Biología Molecular, que debido a su versatilidad y que debido a su versatilidad y
fácil estandarización se ha fácil estandarización se ha convertido en una pieza clave convertido en una pieza clave
tanto en el área de la tanto en el área de la investigación como en el investigación como en el
diagnóstico”.diagnóstico”.
Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico
Técnica de amplificación genética.Técnica de amplificación genética.ETAPAS DE LA PCR:ETAPAS DE LA PCR: ((Reacción en cadena de la polimerasa)Reacción en cadena de la polimerasa)
Extracción y purificación de los ácidos nucleicosExtracción y purificación de los ácidos nucleicos
Amplificación de un segmento seleccionado del genoma.Amplificación de un segmento seleccionado del genoma.
Detección de fragmentos amplificados por PCR (amplicones)Detección de fragmentos amplificados por PCR (amplicones)
Del microorganismo aislado Directamente de la muestra
PCR propiamente dicha
Por electroforesis en gel de agarosa y tinción con
bromuro de etidio.
Por hibridación con sondas específicas marcadas con
fluorocromos
Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico
PCRPCR ( Reacción en cadena de la polimerasa): ( Reacción en cadena de la polimerasa): primera etapa.
Proteinasa K:Proteinasa K: 2hs a 65 °C , 2hs a 65 °C , inactivar 10 minutos.inactivar 10 minutos.
Preparación y agregadoPreparación y agregado : : MixMix
Primer Primer
DNTPs (2 mM)DNTPs (2 mM)
Buffer Taq 10 XBuffer Taq 10 X
Mg (25mM)Mg (25mM)
H2OH2O
TaqTaq
MoldeMolde
Volumen finalVolumen final
Controles: negativo 3 l de agua destilada.Positivo 1 l de cepa control+2 l de agua destiladaDe inhibición 1 l de cepa control+2 l de muestra.
Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico
Técnica de amplificación genética.Técnica de amplificación genética.PCR: segunda etapa
Procesos
Son controlados por diferentes Tº para los tres fenómenos básicos:
Desnaturalización
Annealing.
Extensión.
Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico
Técnica de amplificación genética.Técnica de amplificación genética.PCR(tercera etapa): Observación con el transiluminador
PCR de Tiempo RealPCR de Tiempo Real
““En la PCR a tiempo Real, los En la PCR a tiempo Real, los procesos de amplificación y procesos de amplificación y detección se producen de detección se producen de
forma simultánea en el forma simultánea en el mismo vial cerrado, sin mismo vial cerrado, sin
necesidad de ninguna acción necesidad de ninguna acción posterior”posterior”
Métodos de separación de Métodos de separación de ADNADN
PFGE: PFGE: Electroforesis de campo pulsante.Electroforesis de campo pulsante.
““Explora todo el Explora todo el cromosoma cromosoma
detectando la detectando la variabilidad existente variabilidad existente
en los lugares de en los lugares de restricción de la restricción de la
enzima utilizadas para enzima utilizadas para la digestión del ADN”la digestión del ADN”
Métodos de separación de Métodos de separación de ADNADN
Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología
Temas a abordar:Temas a abordar: Técnicas de Biología Molecular y BacteriologíaTécnicas de Biología Molecular y Bacteriología Breve reseña sobre los métodos usados.Breve reseña sobre los métodos usados. Reacción de la Polimerasa en Cadena.Reacción de la Polimerasa en Cadena. Biología Molecular/Diagnóstico BacteriológicoBiología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico.. Aplicación en la Microbiología clínica de la Aplicación en la Microbiología clínica de la
PCRPCR DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA.ANTIMICROBIANA.
Reacción de la Polimerasa en Reacción de la Polimerasa en Cadena.Cadena.
Diagnóstico Molecular y Diagnóstico Diagnóstico Molecular y Diagnóstico BacteriológicoBacteriológico
Menor desarrollo en comparación con el Menor desarrollo en comparación con el diagnóstico virológico.diagnóstico virológico.
Muchas especies bacterianas de importancia Muchas especies bacterianas de importancia clínica son cultivadas y caracterizadas clínica son cultivadas y caracterizadas fenotípicamente.fenotípicamente.
Gran desarrollo de métodos de diagnósticos Gran desarrollo de métodos de diagnósticos fenotípicos automatizados o semiautomatizados.fenotípicos automatizados o semiautomatizados.
Técnicas tradicionales mas baratas q las Técnicas tradicionales mas baratas q las moleculares.moleculares.
Aplicación en Microbiología Aplicación en Microbiología Clínica de la PCRClínica de la PCR
Identificación rápida de Identificación rápida de agentes infecciosos en agentes infecciosos en pacientes críticos.pacientes críticos.
Identificación de agentes Identificación de agentes no viables o no no viables o no cultivables.cultivables.
Identificación y Identificación y caracterización de caracterización de organismos fastidiosos.organismos fastidiosos.
Tipificación de cepas para Tipificación de cepas para estudios epidemiológicos.estudios epidemiológicos.
Ejemplo microorganismosCausantes de Sepsis o
Meningitis.
Mycobacterium tuberculosoBordetella pertussis.Bartonella henselae.
Micosis invasiva por Aspergills
Herpes virus Virus respiratorios.
Enterovirus.
uEjemplo bacterias causantes De infecciones alimentarias.
o DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA..
DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA
DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Ventajas de los Métodos Genéticos:Ventajas de los Métodos Genéticos: Se pueden entregar resultados en Se pueden entregar resultados en
menor tiempo.menor tiempo. Útil en agentes de crecimiento lento.Útil en agentes de crecimiento lento. Solo útil si se conoce la genética del Solo útil si se conoce la genética del
mecanismo de resistencia.mecanismo de resistencia. Los métodos convencionales detectan Los métodos convencionales detectan
la resistencia en forma global.la resistencia en forma global.
DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Ventajas de los Métodos Genéticos:Ventajas de los Métodos Genéticos: Se pueden realizar directamente Se pueden realizar directamente
sobre muestras clínicas.sobre muestras clínicas. Útil en agentes no cultivables.Útil en agentes no cultivables. Si se hicieran con equipos de PCR a Si se hicieran con equipos de PCR a
tiempo Real, al usar equipos cerrados, tiempo Real, al usar equipos cerrados, se disminuye al máximo el riesgo se disminuye al máximo el riesgo biológico frente a agentes peligrosos.biológico frente a agentes peligrosos.
DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Microorganismo Antimicrobiano Gen blanco Métodos Moleculares
Staphylococcus spp Meticilina y
lactámicosAdquisición del gen
MecAPCR
Southern hibridization
Enterococcus spp. Vancomicina
Genes Van D y Van C (1,2,3)
VanB y VanA PCR - RFLP.
GéneroEnterobacteriaceae
Ceftazidima.Cefotaxima. Aztreonam.
Genes que codificanβLEE (plasmídicas)
PCR - RFLP.
Streptococcus pneumoniae Penicilina pbp 1 A
PCR - RFLP.
ETH implicados en la diseminación epidémica de
genes de resistenciaResistencia
principal
Fenotipo Genotipo
Otras resistenciasa
Microorganismos Comentarios
VanA (Van, Tei)
vanA - Enterococcus spp, Streptococcus spp, Lactococcus Corynebacterium, Bacillus circulans, Staphylococcus aureus
- ETH epidémico en Europa. - Gran polimorfismo genético específico de área geográfica.
VanB(Van) vanB - E. faecium, E. faecalis, S. bovis, S. gallolyticus
ETH epidémico en Europa.
VanB (Van)
vanB (Amp)b E. faecium, E. faecalis, S. bovis, S. gallolyticus
ETH epidémico universalmente Extraordinario polimorfismo genético específico de área geográfica.
HLRGm aac(6´)
aph(2´´)
- E. faecalis, ETH epidémico universalmente
Staphylococcus aureus
ETH implicados en la diseminación epidémica de
genes de resistenciaResistencia principal
Fenotipo Genotipo
Otras resistenciasa
Microorganismos Comentarios
BLEE clase A (cefotaximasa)
βla
CTX-M-9
Tmp, Sm, Spec
Enterobacteriaceae ETH epidémico en España
BLEE clase A (cefotaximasa)
la
CTX- M-2
ß-lactamic,
AAGG
Enterobacteriaceae ETH epidémico en Argentina
BLEE clase A la
GES-1
Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa
No descrito en España pero sí en Europa. Ejemplo de diseminación de genes en distintos ETH
Quinolonas qnr In36 (Tmp,ß-lac, Ag, Su)
In37 (Ag, Cm, Rf, ß-
lac, Su)
Escherichia coli ETH encontrado en China
ETH implicados en la diseminación epidémica de
genes de resistenciaResistencia principal
Fenotipo Genotipo
Otras resistenciasa
Microorganismos Comentarios
BLEE clase B la
IMP-1
la
IMP-2
In31 (Ag, Cm, Su)
Otros ( variable)
Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter, Klebsiella,
Citrobacter
No descrito en España pero sí en Europa y otros continentes Ejemplo de diseminación de gen de resistencia y variables alélicas en distintos ETH
macrólidos mef (A) - Streptococcus pneumoniae ETH epidémico en Italia
macrólidos mef (E) - Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureusMecanismos de Resistencia
S/a Oxa R/a Oxa ------- ------- ------- ------- 2 a
------- -------- ------- 3’ -------- ------- 4 -------- -------
Gen Mec A
PBP 2 a
R/a PenicilinasCefalosporinasCarbapenems
AMS.
Staphylococcus aureusMecanismos de Resistencia
Comportamiento frente a Oxacilina
Resistencia
Falsa R: * Hiperproducción de Lactamasa Mec A (-) (AORSA) * PBP modificada ( < afinidad: MODSA)
R.verdadera: * Homogénea (fácil detección) Mec A (+) * Heterogénea (Clases 1-2 y 3.)
Staphylococcus aureusMecanismos de Resistencia
PBP 2 a vs. CIM y Grado de Expresión
CIMs Grado de
expresiónR. Heterogénea
R. Homogénea.
Clase 1 1,5 – 3 g/ml 1/ 10 (7-8) cel RClase 2 6 – 12 g/ml 1/10 (4-6) cel RClase 2-3 25 – 50 g/ml Clase 3 100 - 200 g/ml 1/10 (2-3) cel R
Clase 4 > ó = 400 g/ml todas
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureusR/a Macrólidos y R/a Macrólidos y
LincosamidasLincosamidas R/a Macrólidos: Eflujo……gen msrA.R/a Macrólidos: Eflujo……gen msrA. R/a Clindamicina: Metilación del R/a Clindamicina: Metilación del
rRNA 23S……….gen erm. (Tb se rRNA 23S……….gen erm. (Tb se llama MLS)llama MLS)Interpretación:
Sin achatamiento: S/a Clinda.Con achatamiento: R/a ClindaLa detección de R inducible a Clinda, en este aislamiento aparenta
Determinar R/a Clinda, aunque en algunos pacientes podría ser efectiva”
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureusResistencia a VancomicinaResistencia a Vancomicina
Recomendaciones: Halo = o > a 15 mm: S/a
Vanco. Halo = o < a 14 mm hacer
CIM.
DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Microorganismo Antimicrobianos Gen blancoMétodos
Moleculares
Isoniacida
Genes KatGinhAahpC PCR - RFLP.
Complejo Rifampicina Gen rpoB PCR.
Mycobacterium Etambutol Gen embB PCR
tuberculosis. Estreptomicina Gen rrs PCR - RFLP.
Pyrazinamida Gen pncA PCR
Complejo MAI
Mycobacterium avium-intracelulare Macrólidos Gen 23S rRNA PCR
Mycobacterium tuberculoso
Detección de genes de Resistencia
Isoniacida Se producen mutaciones en los Genes:kanG, inhA y aphC
Rifampicina
Etambutol
Estreptomicina
Fluorquinolonas
Mutación en el gen rpo
Mutación en el gen embB.
Mutación en los genes rpsL y rrs.
Mutación en los genes gyrA y B
DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Microorganismo Antimicrobiano Gen blancoMétodos
Moleculares
Virus de la Inmunodeficiencia
humana Inhibidores de la
(VIH)transcriptasa
reversa Gen pol RT-PCR-DNA
Inhibidores de la
proteasaGen de la
proteasa RT-PCR-RFLP
Citomegalovirus GanciclovirGenes UL97 y
UL54 PCR-DNA
Virus de la hepatitis C (VHC) Interferón
Variante genética de VHC RT-PCR-RFLP
Enterobacteriaceae: tipos de Enterobacteriaceae: tipos de ββLEELEE
ββLEELEE
TEM SHV OXA CTX-M PER GES TLA
Métodos Moleculares para Métodos Moleculares para Detección de Detección de ββLEELEE
Sondas de Hibridización:Sondas de Hibridización:
Para Genes TEM, SHVTécnica laboriosaNo distingue entre LEE y no LEE
No puede determinar las variantes de TEM o SHV
PCRPCR Ídem a sonda de hibridización
Métodos Moleculares para Métodos Moleculares para Detección de Detección de ββLEELEE
PCR – RFLP. PCR – RFLP. Fácil de realizar, detecta cambios Fácil de realizar, detecta cambios
nucleotídicos, detecta variantes de nucleotídicos, detecta variantes de ββLEE.LEE.LCR.LCR.Determina variantes de Determina variantes de ββLEE, utiliza gran LEE, utiliza gran
variedad de primersvariedad de primersSecuenciación ADN.Secuenciación ADN. Es el gold standard, puede detectar todas Es el gold standard, puede detectar todas
las las variantes, técnica cara y laboriosa.variantes, técnica cara y laboriosa.
Desventajas de los Métodos Desventajas de los Métodos Genéticos en la Detección de la Genéticos en la Detección de la
ResistenciaResistencia Falta de Sensibilidad si la concentración del Falta de Sensibilidad si la concentración del
microorganismo es baja en la muestra.microorganismo es baja en la muestra.
Para cada antimicrobiano se requieren Para cada antimicrobiano se requieren diferentes pruebas.diferentes pruebas.
La Resistencia a un determinado La Resistencia a un determinado antimicrobiano puede ocurrir por varios antimicrobiano puede ocurrir por varios mecanismos asociados mecanismos asociados
a diferentes genes de resistencia.a diferentes genes de resistencia.
Desventajas de los Métodos Desventajas de los Métodos Genéticos en la Detección de la Genéticos en la Detección de la
ResistenciaResistencia Para algunos agentes, los mecanismos Para algunos agentes, los mecanismos
genéticos de resistencia son aun genéticos de resistencia son aun desconocidos.desconocidos.
Pueden detectar resistencia expresada a Pueden detectar resistencia expresada a un nivel que no sea clínicamente un nivel que no sea clínicamente relevante.relevante.
Falsos positivos por contaminación de la Falsos positivos por contaminación de la muestra.muestra.
Estandarización y control de calidad Estandarización y control de calidad multicéntrico aún en etapas iniciales.multicéntrico aún en etapas iniciales.
Muchas Gracias por Muchas Gracias por su atención.su atención.