Techniki immunochemiczne

opierają się na specyficznych oddziaływaniach między

antygenami a przeciwciałami

Oznaczanie immunochemiczne RIA - ( ang. Radio Immuno Assay) techniki radioimmunologiczne

EIA - (ang. Enzyme Immuno Assay) techniki immunoenzymatyczne

ELISA - (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test immunoenzymosorbcyjny

Immunoblotting (Western blotting)

Immunostrącanie

Chromatografia immunopowinowactwa

Metody

immunochemiczne

ELISA

TYPY TESTU ELISA

Bezpośredni Pośrednie

Schemat reakcji ELISA wykonywanych na ćwiczeniach

Immunoblotting

Techniki chromatograficzne (rozdzielcze)

- chromatografia gazowa (GC) -

- nisko- i wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) -

- elektroforeza kapilarna (CE) -

Metody chromatograficzne (rozdzielcze)

w oznaczaniu hormonów roślinnych

(GC, HPLC)

Hormony roślinne

Typowy schemat

przygotowania próbki

do analizy GC i LC

Zastosowanie metod chromatograficznych

w analizie materiału biologicznego

Każdy układ biologiczny jest mieszaniną substancji chemicznych. Analiza poszczególnych

składników takiego układu wymaga często ich wcześniejszego rozdzielenia.

Termin chromatografia oznacza efekt rozdziału (separacji) składników mieszaniny,

obserwowany podczas ich przepływu z fazą ruchomą wzdłuż powierzchni fazy

nieruchomej (stacjonarnej). Cząsteczki składników mieszaniny, które słabo

oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej unoszone przez płynącą fazę ruchomą,

zaś cząsteczki przyciągane mocniej poruszają się wolniej. Fazą stacjonarną może być

ciało stałe, ciecz na stałym nośniku lub żel, a fazą ruchomą może być gaz lub ciecz.

kolumna chromatograficzna

Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych • Ekstrakcja z fazy stałej (SPE)

• Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

• Chromatografia gazowa (GC)

• Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

• Elektroforeza kapilarna (CE)

Każdy proces chromatograficzny

składa się z trzech etapów:

• dozowanie próbki

• rozdział składników

• detekcja rozdzielonych składników

Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych: • Ekstrakcja z fazy stałej (SPE)

• Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

• Chromatografia gazowa (GC)

• Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

• Elektroforeza kapilarna (CE)

detektor

Wysokosprawna (wysokociśnieniowa)

chromatografia cieczowa (HPLC)

HPLC

Zestaw do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej

Od prawej: komputer sterujący aparatem i rejestrujący dane, pompa z

zaworem dozującym, kolumna wewnątrz termostatu i różnego rodzaju

detektory rozdzielanych substancji, np. UV-vis, fluorescencyjny, MS-MS.

Przykładowy chromatogram

uzyskany metodą HPLC

(detektor fluorescencyjny)

HPLC - rozdział składników

Kolumny chromatograficzne

HPLC – dozowanie próbki

HPLC - detekcja składników

HPLC - detekcja składników

Chromatografia gazowa - GC

Chromatografia gazowa - GC

Air

Hyd

rog

en

Ga

s C

arrie

r

H

RESET

Chromatografia gazowa - GC

Chromatogram GC składników soku z pomarańczy

Wpływ warunków termicznych na rozdział w GC

(a) izotermiczny w 45oC

(b) izotermiczny w 145oC

(c) programowany w 30oC

do 180oC

Warunki rozdziału:

GC – dozowanie próbki

Kolumna

Kolumny kapilarne stosowane w chromatografii gazowej

Przekroje kolumn do

GC w powiększeniu

Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych

Najbardziej znanym typem faz stacjonarnych są polisiloksany. Każdy atom krzemu

w łańcuchu zawiera dwie grupy funkcyjne. Typ i ilość grup decyduje o

właściwościach fazy stacjonarnej, a tym samym kolumny.

Poli(35% - difenylo- 65% dimetylosiloksan)

Poli(dimetylosiloksan)

GC - detekcja składników - FID

GC - detekcja składników - ECD

Węglowodory 1

Etery, estry 10

Alifatyczne alkohole, ketony, aminy,

związki mono Cl, i mono F

100

Związki mono Br, di Cl, I, di F 1000

Anhydrydy i związki tri Cl 10000

Związki mono I, di Br, poli Cl i poli F 100000

Związki di I, tri Br, i poli F 1000000

Względna czułość detektora wychwytu elektronów (ECD) w stosunku do różnych związków organiznych

Kiedy w gazie nośnym pojawia się inna

substancja , właściwości chłodzące gazu

nośnego się zmieniają. Generuje to

powstawanie sygnału w detektorze

Drut oporowy wewnątrz detektora

jest chłodzony przez przepływający

gaz nośny

Flo

w

Flo

w

GC - detekcja składników - TCD

Uniwersalny detektor cieplno-przewodnościowy (TCD)

Techniki łączone

Zastosowanie instrumentalnych technik analitycznych do

detekcji w chromatografii gazowej i HPLC

(techniki łączone)

Chromatograf

Spektrometr mas - HPLC-MS, GC-MS

Spektrometr podczerwieni - HPLC-IR, GC-IR

Spektrometr absorpcji atomowej - HPLC-AAS, GC-AAS

Jądrowy rezonans magnetyczny - HPLC-NMR, GC-NMR

Techniki instrumentalne nie tylko wykrywają obecność substancji, ale

również dokonują jej analizy, przez co potwierdzają autentyczność mierzonej

substancji w danym szczycie sygnału.

Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas

Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas

- Detektor wykonuje co sekundę widmo masowe (skan) wycieku z kolumny.

- Analizowane są jony o masach większych niż jony gazu nośnego.

- Każda substancja ma charakterystyczne dla siebie widmo mas.

Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas

Zasada działania spektrometru masowego

Spektometria mas

Widmo masowe pochodnej metylowej (B) i metylowo-sililowej (A) kwasu indolilo-3-

octowego (IAA) oraz (po prawej) - najintensywniejsze jony danego widma.

A jak zinterpretować obecność w widmie jonów o m/z = 189 i 261?

Interpretacja obecności w widmie jonów o m/z = 189 i 261

Masa cz. IAA = 175

Reszta Me = 15

Reszta TMS = 73

Masa cz. H = 1

IAA + TMS + Me – 2H = 261

IAA + Me - H = 189

Widmo masowe metylowo-sililowej pochodnej GA20

Oznaczanie IAA w próbce ekstraktu z pożywki pohodowlanej bakterii

wykonane techniką MS-Full scan i MS-SIR

Dodatkowe zalety detektora ze spektrometrem mas

Wytwarzanie lotnych pochodnych

(derywatyzacja)

Wytwarzanie lotnych pochodnych związków organicznych

Aby możliwa była analiza GC substancji organicznych należy przeprowadzić je w

stan gazowy. Jednakże ogromna większość z tych substancji to ciała stałe o wysokiej

temperaturze wrzenia. Nielotność tych substancji wywołana jest złożonością budowy

(wysoka masa cząsteczkowa) i w dużej mierze obecnością w cząsteczkach polarnych

grup funkcyjnych: –COOH, –NH2, –SH2, –OH. Zablokowanie tych grup wydatnie

obniża temperaturę wrzenia i zwiększa trwałość związków organicznych.

Metody blokowania grup funkcyjnych:

- pochodne TMS (sililowe)

OH

O

OH

OH HO

CH 2 OH

1

2 3

4

5

6

+ Si

CH 3

CH 3

CH 3

5 Cl

O-Si(CH3)3

(CH3)3-Si-O

O

O-Si(CH3)3

CH 2 O-Si(CH3)3

1

2 3

4 5

6

5HCl +

Glukoza Trimetylochlorosilan

(TMS-Cl)

O-Si(CH3)3

- uzyskiwanie pochodnych acetylowych (acylowych)

Bezwodnik kwasu

octowego

+

+

- uzyskiwanie pochodnych sililowych

R C OH CH 3 OH H 2 SO 4

O

R C O CH 3

O

CH 2 O C R

CH O C R

CH 2 O C R

O

O

O

CH 3 OH

O

R C O CH 3

CH 3 ONa

Kwasy tłuszczowe (nielotne) Reflux

+ 3

+ +

- pochodne (estry) alkilowe

RCOOH + R2OH RCOOR2

RCOOH + CH2N2 RCOOCH3 + N2

reakcja z diazometanem

Lotna pochodna

Tłuszcze

Lotna pochodna

(biopaliwo!)

Analizy jakościowa i ilościowa

w GC i HPLC

Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC

Czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę nazywany jest

czasem retencji (tR). Czas retencji przypisany jest pikowi

odpowiadającemu danej substancji. Jest to więc podstawowy

parametr identyfikujący substancję w analizie GC i HPLC.

Res

po

nse

GC Retention Time on Carbowax-20 (min)

Chromatogram mieszaniny

węglowodorów

Heksan

Oktan Dekan 1.6 min = tR R

esp

on

se Badana próbka Wykryta

substancja może być heksanem

1.6 min = tR

Retention Time on Carbowax-20 (min)

Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC

Analiza jakościowa

Identyfikacja substancji na podstawie czasu retencji

Od

po

wie

dź

det

ekto

ra

Stężenie próby (mg/litr)

2

4

6

8

10

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Pow

ierz

chn

ia p

iku

1 m

g/l

itr

2 m

g/l

itr

3 m

g/l

itr

Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC

Analiza ilościowa

- wyznaczanie stężenia substancji na podstawie krzywej wzorcowej

- Wyznaczanie stężenia substancji na podstawie wzorca wewnętrznego

- Wyznaczanie stężenia substancji na podstawie znakowanego wzorca

wewnętrznego (w GC-MS)

• Specyficzna odmiana techniki dodatku wzorca. Specyficzność ta polega na tym,

iż w tym przypadku dodawaną substancją jest znana ilość związku, który

różni się od analitu jedynie składem izotopowym

• W trakcie analizy ilościowej wyznaczane są stosunki sygnałów dla

odpowiednich jonów masowych (co najmniej dwóch) uzyskanych w trakcie

analizy próbki rzeczywistej, próbki wzorca oraz próbki rzeczywistej z

dodatkiem wzorca

• Do określenia zawartości analitu w badanej próbce potrzebna jest jedynie

znajomość ilości izotopowo znaczonego analitu dodanego do próbki

Technika rozcieńczenia izotopowego w GC-MS

12.05 12.10 12.15 12.20 12.25 12.30 12.35 12.40 12.45 12.50 12.55 12.60Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

Jas 370 SIR of 5 Channels EI+ 227.002.56e6

12.10

12.5712.25

Jas 370 SIR of 5 Channels EI+ 224.002.34e6

12.13

12.60

Jas 370 SIR of 5 Channels EI+ TIC

8.61e612.10

12.13

12.25

12.44

Metoda rozcieńczenia izotopowego

Chromatogram JA-Me, d3-JA-Me, H2JA-Me z użyciem techniki SIM. A – analiza jonu o m/z 227

Th; B – analiza jonu o m/z 224 Th; C – analiza sumy jonów o m/z 151,153,224,226 i 227 Th.

wzorzec wewnętrzny

analit

can=powan/powwz x cwz x wsp

1 ng d3JM 1ul (550 V, rep 6)

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 3000

100

%

0

100

%

Jas 179 761 (11.271) Cm (758:764-(664:699+883:922)) SIR of 5 Channels EI+ 6.11e5151

224

153 226

Jas 181 734 (11.226) Cm (729:737-(626:646+801:864)) SIR of 5 Channels EI+ 7.89e4151

227

153

226

Porównanie intensywności wybranych jonów (m/z 151, 153, 224, 226, 227) estru metylowego

kwasu jasmonowego (JA-Me) (A) oraz standardu wewnętrznego d3JA-Me (B)

Metoda rozcieńczenia izotopowego

Zastosowania techniki GC/MS

• Analiza składu mieszanin poreakcyjnych

• Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe)

• Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej

• Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach,

artykułach pożywczych itp.

• Analizy antydopingowe

• Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów

narkotyków)

• Analizy zanieczyszczeń środowiska

Tematy ćwiczeń

Zadanie 1. Wykrywanie wirusa pelargonii PFBV metodą immunoenzymatyczną

Zadanie 2. Oznaczanie zawartości witaminy C w sokach z warzyw i owoców

metodą HPLC i fluorymetryczną

Zadanie 3. Analiza jakościowa auksyn metodą GC-MS

Specyficzne metody

spektroskopowe

Fotoakustyczna metoda oznaczania etylenu