t.c. sağlık bakanlığı türkiye halk sağlığı...

T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu

3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya 1


Yersinia pestis'inYüksek Duyarlılıklı

Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay (LAMP) ile Moleküler Tanısı

Bekir Çelebi, Alparslan Ceritli, Selçuk KILIÇ

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Ulusal Biyoterör Tanı Laboratuvarı2


VEBA

1) Ağrılı hassas bölgesel LAP “bubo”2) Pnömonik (akciğer) Veba3) Septisemik Veba

İnsandan bulaşma ve yüksek mortalite İdeal biyolojik harp maddesi

Hızlı, güvenilir ve risk içermeyen tanı (Moleküler Tanı)1) Y. pestis YPF/YPR 3a (41.7-kb Y.pestis –spesifik bölge ) 276 bp2) Y. pestis Caf 1 (Kapsüler 1 antijen) 517 bp

Klinik tablo

3

Radnedge L et al. Identification of nucleotide sequences for the specific and rapid detection of Yersinia pestis. Appl Environ Microbiol. 2001 Christensen DR et al. Detection of biological threat agents by real-time PCR: comparison of assay performance on the R.A.P.I.D., the LightCycler, and the Smart Cycler

Yersinia pestis’in oluşturduğu fatal seyirli akut bir enfeksiyon

3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya


AmaçYersinia pestis’in tanısı için moleküler tabanlı tanı kitinin

geliştirilmesi

Biyolojik Harp Maddeleri’nin (BHM) sahada tanısı (Çevresel örnek) Klinik tanıda kullanım olanağı

Kullanım Alanı

Tek bir cihazda; Enzimatik yöntemle tek basamakta DNA’sının eldesi PCR reaksiyonunun tek bir döngüde gerçekleştirilmesi

Gerçek zamanlı bulanıklık /floresans izlemi (Görsel tanımlama)

LAMPisotermal Nükleik Asid

Çoğaltma

3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya4

Hızlı Kolay uygulanabilirBasit UcuzGüvenilir


Yp LAMP Primerset 1-3

Analiz

•Y.pestis ve diğer Yersinia sp.

Primer Seçimi:

Y.p 3a primer set No: 3

6

MATERYAL-YÖNTEM:LAMP primer dizaynı ve en iyi primerin seçimi


3a


MATERYAL

• RSKK 375,376,377, 168• NCTC 10329,10029 & 2868• Y. Pestis (Ins. Pasteur) • RSKK 195 (California)

1. Yersinia spp.(Y. enterocolitica; Y.pseudotub., Y. aldovae; Y. frederiksenii; Y. intermedia; Y. kristensenii)

2. Yersinia dışı GNB ve GPB(A.baumannii; Alcaligenes sp. B.anthracis;C.freundii; Enterobacter sp; E. faecalis; E. coli;H.influenzae; Klebsiella sp.; P.mirabilis;P.aeruginosa; S.enterica; S.flexneri;S.maltophilia; S.marcescens; S.aureus;S.epidermidis; GABHS)

3. Y.Pestis içermeyen klinik örnek (n=20)4. Y.Pestis içermeyen çevresel örnek (n=10)

1. Y.pestis içeren klinik örnek (n=50)2. Y.pestis eklenmiş ‘Toprak’ (n=5)3. Y.pestis eklenmiş ‘Su ‘(n=5)4. Tavşan Karaciğer dokusu (n=4)

1. Y.pestis içeren klinik örnek (n=50)2. Y.pestis eklenmiş ‘Toprak’ (n=5)3. Y.pestis eklenmiş ‘Su ‘(n=5)4. Tavşan Karaciğer dokusu (n=4)

Analitik Duyarlılık - Saptama Limiti (LOD) ÖZGÜLLÜK (n= 24 bakteri)

Simüle örnek


T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuT.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu

Balgam(n=10)

Balgam(n=10)

Lenf aspiratı(n=20)

Y. pestis (+) Simüle Örnek

Kan (n=20)Kan (n=20)

Y.

pes

tis

108

CFU

/mL

Y.

pes

tis

pla

smid

ko

ntr

ol

105 CFU /mL

104 CFU /mL

103 CFU /mL

500 CFU /mL

250-100-50-25-10-5-4-2-1

Enzimatikyöntemle

ekstraksiyon

MATERYAL-2


9

Rxn 25 µL GspSSD DNA Polimeraz(Sarmal yer değiştirme aktivitesi)

LAMP (Genie II, Optigene, UK) Hızlı çoğaltma (< 30 dk) melting curve analizi Portatif (pille çalışma ve 2 kg) Tümleşik ekran USB ile kolay veri aktarımı floresan ve lüminesan işlemi

desteklemesi

LAMP Çalışması


10

‘MELT CURVE’ ANALİZİ

LAMP Amplifikasyonlar


BULGULAR


11

SYBR Green ve (GspM 2.0 LF DNA polimeraz)

1. Amplikon; % 2.0 Jel elektroforez2. Sekans

1. SYBR Green içermeyen örnekler

2. SYBR Green içeren örnekler

3. UV-transillüminatör SYBR içeren

Bulgular-2


LAMP

Kültür Simüle Örnek†

Çevresel Örnek†

Y.Pestis(n=8)

Yersinia sp. & Diğer Bakteriler

(24 bakteri28 örnek )

Kan#

(n=20)LAP

(n=20)Balgam

(n=10)KC

(n=4)Toprak

(n=5)Su

(n=5)

Sonuç Pozitif Negatif Poz Poz Poz Poz Poz Poz

Saptama Sınırı* 1 Negatif 10 2 2 2-5 10 1

12

CFU† Simüle örneklerden DNA eldesi için enzimatik yöntem ile spin kolonlu ekstraksiyon yöntemi karşılaştırılmıştır.#Kandaki saptama sınırı için kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi ve kan miktarı belirleyicidir.

BULGULAR-3

Y.pestis (-) 20 simüle klinik ve 10 çevresel örnek NegatifY.pestis (-) 20 simüle klinik ve 10 çevresel örnek Negatif



31

Bu sonuçlara göre, LAMP PCR yönteminin duyarlılığı (ve özgüllüğü) %100 olarak bulunmuştur.

PCR

Saptama Sınırı (LOD)*

Kültür Kan LAP Balgam KC Toprak Su

Konvansiyonel Yp- 3a PCR 50 1000 100 100-250 100 1000 100

In-house Yp-Pla RT-PCR < 5 25 25-50 25 25 50 5

In-house Yp- Caf1 RT-PCR 2 25 25 20 20 50 5

LAMP 1 10 2 2 2-5 10 1

*CFU


BULGULAR-4


BULGULAR-5Analiz Süresi ve Test Maliyeti

YöntemDNA ekstraksiyonu

Çoğaltma süresi Toplam İşlem

ZamanıToplam Maliyet#

(Test)Otomatize Manual

Konvansiyonel 30 dk > 3 saat 4 saat 4.5 - 8.0 saat 30

RT-PCR 30 dk > 3 saat 60-75 dk >1.5 - 4.5 saat 70

LAMP 10 dk 30 dk 40 dk (< 1 saat) 20-30

# Ekstraksiyon dahil



SONUÇ…

Biyoterörist saldırılarda ve endemik bölgelerde;klinik ve çevresel örneklerde kullanılma potansiyeli olduğu

kanısına varılmıştır.

Analitik

Avantajlar

Sonuç & Yorum

Yüksek duyarlılık ve özgüllük

LAMP yönteminin duyarlılığı RT-PCR yönteminden daha yüksek.

Basit (tek bir cihazda DNA izolasyonu ve amplifikasyonunyapılabilmesi),

Kolay uygulanabilir (analizin iki aşamada yapılabilmesi),Hızlı (toplam analiz süresi ≈ 45 dakika)EkonomikCihaz ve deneyimli personel olmadan uygulanabilme potansiyeli


t.c. sağlık bakanlığı türkiye halk sağlığı...

Documents