tạo tấm tế bào sừng tự thân

TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ BỎNG SÂU Ở TRẺ EM

Huỳnh Duy Thảo, Nguyễn Bảo Tường, Trần Thị Thanh Thủy, Trần Công Toại

Bộ môn Mô – Phôi, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch Khoa Bỏng, BV. Nhi Đồng I

NỘI DUNG

ĐẶT VẤN ĐỀ1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3

KẾT QUẢ4

KẾT LUẬN5

ĐẶT VẤN ĐỀ

SỐ LIỆU BV. NHI ĐỒNG I

• Mỗi năm có khoảng 2000 bệnh nhi khám và điều trị tại khoa bỏng

• 1/3 bỏng < 10% diện tích cơ thể• 1/3 bỏng rộng > 30% (80 – 90%)=> nhóm bệnh có nguy cơ tử vong cao, nguy cơ

tàn tật cao và mang di chứng ảnh hưởng nặng nề đến thẩm mỹ

CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ

• Vài trăm ngàn => vài chục triệu• Cá biệt : 120.000.000 đồng=> thực hành giảm chi phí kháng sinh/ngày điều

trị

GIẢI PHÁP ĐIỀU TRỊ BỎNG NẶNG Ở TRẺ EM

• 1/3 bỏng rộng > 30% diện tích cơ thểÞ Tìm được nguồn da ghép để ghép sớmÞ Khó khăn: + Không ghép được nguồn da đồng loại, dị

loại + Chỉ sử dụng được vật liệu che phủ: màng

trung bì, màng ối, màng collagen nhận tạo …

ĐÂY LÀ NHÓM CẦN THIẾT PHẢI ĐƯỢC GHÉP DA

• VÌ:Þ Có nguy cơ tử vong caoÞ Cần nhiều da để ghépÞ Chi phí điều trị cao: nằm viện lâu, dùng nhiều

kháng sinh …

MỤC TIÊU CUỐI• Trẻ hòa nhập hoàn toàn với xã hộiÞ Không tàn tậtÞ Không tự ti, mặc cảm về ngoại hìnhÞ Nâng cao chất lượng cuộc sống

BỎNG SÂU Ở TRẺ EM

TH1 TH2 TH3

ẢNH HƯỞNG RẤT NẶNG NỀ ĐẾN BẢN THÂN, GIA ĐÌNH VÀ XÃ HỘI


TH1 TH2 TH3

GIẢI PHÁP GHÉP DA TỰ THÂN


TH1 TH2 TH3

GIẢI PHÁP HẠN CHẾ


TH1 TH2 TH3

GIẢI PHÁP TẤM TẾ BÀO SỪNG

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CẤU TẠO MÀNG ỐI

THU NHẬN MÀNG ỐI

CẤU TẠO MÔ DA

Tế bào lớp đáy

Tế bào lớp gai

Tế bào lớp hạt

Phóng thích thể mỏng

Thể mỏng

Hạt keratohyalin

Bộ máy Golgi

Thể mỏng

Ty thể

Ribosom

Màng cơ bản

Tế bào hóa sừng

Vỏ tế bào

Lớp sừng

Lớp gai

Lớp hạt

Lớp đáy

CƠ CHẾ TỰ ĐỔI MỚI

CƠ CHẾ BIỆT HÓA

Tế bào gốc biểu mô

Tế bào khuếch đại chuyển

Tế bào gốc

biểu mô

Các tế bào biểu bì đã biệt hóa

Tế bào gốcBiểu mô


ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG

Tế bào gốc

Tự làm mới


Biệt hóa Tế bào đang biệt hóa ở hậu kỳ của gián phân

Tế bào lớp gai

Tế bào lớp hạt

Tế bào lớp vảy sừng

ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG

- Nhuộm p63: đỏ - Nhuộm involucrin: xanh lá cây

Màng lọc của đĩa lồng

Tế bào sừng

Môi trường nuôi tế bào sừng

Màng collagen

MÔ HÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG

Đĩa lồng

Mẫu da người

Nuôi, nhân tế bào sừng

Cấy tế bào sừng lên màng collagen

Tạo nhiều lớp tế bào sừng trên màng

collagen

Đánh giá

Phân lập tế bào

Màng collagen

Loại biểu mô

Màng ối người

Theo dõi, đánh giá sản phẩm

Ghép tự thân trên bệnh nhân

TẠO MÀNG COLLAGEN TỪ MÀNG ỐI

-Hóa chất: + Nước cất + Dung dịch PBS + Nước muối sinh lý + Trypsin 0.25%

ĐÁNH GIÁ MÀNG ỐI

BA

Kết quả nhuộm trichrom (A) và nhuộm PAS (B) của màng ối đã loại biểu mô

Màng ối được thu nhận trong DPBS – kháng sinh

Rửa, lắc trong DPBS cho sạch máu

Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô

Đóng gói

Lắc trong trypsin/EDTA 30 phút, 37oC

Để khô tự nhiên trong tủ cấy khoảng 2 giờ

Chiếu xạ bằng tia , suất liều 25kGy

Bảo quản ở nhiệt độ phòng

GIÁ TH NUÔI C Y T BÀO S NGỂ Ấ Ế Ừ

GIÁ TH Ể = Màng collagen (t màng i ng i)ừ ố ườ

TH1 TH2 TH3

PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, NHÂN KHỐI TẾ BÀO SỪNG

TH1 TH2 TH3

MẪU DA

A B

QUY TRÌNHMẫu da được thu nhận trong

DPBS – kháng sinh

Rửa trong DPBS, loại bỏ lông, mỡ, một phần lớp trung bì

Cắt thành từng mảnh nhỏ

Tách rời lớp biểu bì và lớp trung bì

Thay môi trường sơ cấp bằng môi trường không huyết thanh

Ủ trong trypsin 0,25% - EDTA 0,02% (tỷ lệ 1 - 4) 18 giờ, 4oC

Huyền phù để thu nhận tế bào sừng rời

Nuôi tế bào trong môi trường sơ cấp ở 37oC, 5% CO2 với mật độ 3 x 105 tế

bào/cm2 bề mặt chai nuôi trong 2 ngày

Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2, thay môi trường 2 ngày/lần

Biểu bìTrung bì

ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG

0.959

0.721

0.565

0.419

0.321

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2 3 4 5 6

Ngày

M?t

đ? q

uang

ĐÁNH GIÁ NST ĐỒ

KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GIEN M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

300bp

600bp

500bp

400bp

+ M - Thang+ 1, 3, 5, 7, 9 - Sản phẩm khuếch đại các gen tương ứng p63 (440bp), K14 (390bp), K5 (475bp), involucrin (373bp), -actin (587bp)+ 2, 4, 6, 8, 10 - Sản phẩm khuếch đại gen của mẫu da bình thường đối chứng tương ứng p63, K14, K5, involucrin, -actin

TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG

ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP

A B

Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen


Kết quả tạo tấm tế bào sừng. Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không khí (A Kính hiển vi đảo ngược, 100X) và (B, H&E).

A B


AMàng collagen B

Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho tấm tế bào sừng. Sau 7 ngày các tế bào bắt màu nâu: dương tính p63.A: Mẫu nghiên cứuB: Mẫu da người


Màng collagen

BÁO CÁO S B NH NG TR NG H P Ơ Ộ Ữ ƯỜ ỢNUÔI C Y DA ĐÃ TH C HI NẤ Ự Ệ

KẾT LUẬN

KẾT LUẬN• Thứ nhất, tấm tế bào sừng có thể dùng điều trị tổn thương mất da ở trẻ em

=> giảm diện tích da cho để ghép, giảm đau hậu phẫu và cho sẹo mềm mại

hơn so với kỹ thuật ghép da mỏng hiện đang sử dụng.

• Thứ hai, việc sử dụng tấm tế bào sừng vẫn còn những khó khăn như diện

tích da nuôi cấy chưa đủ che phủ toàn bộ thương tổn, khó đánh giá độ bám

dính, sẹo vẫn phì đại, đỏ và ngứa nhưng tốt hơn sẹo do ghép da mỏng hoặc

để lành tự nhiên.

• Thứ ba, cần nghiên cứu thêm để giải quyết những tồn tại trên và nghiên cứu

thêm để nhuộm màu cho tấm tế bào sừng để đáp ứng nhu cầu thẩm mỹ, ghép

thêm tấm lưới sợi trên bề mặt tấm tế bào sừng để cố định mảnh ghép tốt hơn,

gửi mẫu nuôi cấy nhiền đợt để có thể che phủ toàn bộ vết thương …

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO• Thứ nhất, đồng nuôi cấy tế bào sắc tố để tạo màu sắc cho mảnh ghép.

• Thứ hai, thử nghiệm nuôi trực tiếp không qua nhân khối để rút ngắn thời

gian ghép cho bệnh nhi.

• Thứ ba, ghép thành nhiều đợt để gia tăng thể tích ghép cho bệnh nhi.

tạo tấm tế bào sừng tự thân

Health & Medicine