アジレント・テクノロジー

SureSelectターゲットエンリッチメントシステム

GENOMICS PROTEOMICS METABOLOMICS

AT C T G A T C C T T C T G A A C G G A A C TA A T T T C A AG A AT C T G A T C C T T G A A C TA C C T T C C A A G G T GIntegrated Biology Solutions

次世代 DNAシーケンシング　効率化の切り札

ラン数も、コストも、データ量も、

Mappingの手間も解析時間も、劇的に削減！

それが SureSelect効果。

従来の全ゲノムシーケンス

SureSelect導入

2

ヒト全エクソンを１チューブでキャプチャ、１ランでシーケンス。シーケンシング新時代の到来です。

次世代高感度 DNAマイクロアレイ開発で培われた高品質ロングオリゴ合成技術を活用

シーケンシングを高速かつ大量に並行して行うことで、分子生物学の研究分野に革命をもたらした次世代シーケンサ。

しかし、ヒトをはじめとする哺乳動物や植物のゲノムでは Coding領域が全ゲノムに占める割合が少なく、Coding領域のカバレッジをあげるためにラン数を増やすと、時間とコストが増大するだけでなく、データ量が膨大になるという大

きな問題がありました。そのため、多検体でゲノムの特定領域のシーケンスを比較する研究は事実上困難でした。この

問題を解決するのが、アジレント・テクノロジーの SureSelectです。ハイブリダイゼーションの技術を用い、シーケンシング前にゲノム上の特定部位を高効率にエンリッチすることにより、次世代シーケンシングの効率とコストを劇的に

改善します。次世代 DNAシーケンシングのパワーを広く研究者に開放する、画期的な手法です。

とうとうヒトの全エクソンを１ランでシーケ

ンスできる時代が到来しました。

アジレントの SureSelectは、ゲノム上の特定部位を 120merの長い高品質オリゴにより選択的にキャプチャします。この技術を用い、

ヒト全エクソンを１チューブでキャプチャし

て濃縮する画期的なカタログ製品を、世界で

はじめて製品化しました。

また、ヒト、マウス、ラットの他に様々なモ

デル生物種に対応した、キャプチャ領域を自

由に選択してライブラリを作成できるWEBツールを提供しています。

120merの高品質ロングオリゴ

アジレント社は、DNAマイクロアレイで 5logのダイナミックレンジと感度を達成するため、ガラス基板にインクジェットでロングオリゴを in situ合成する過程に徹底的に改良を加えました。その結果、脱プリンを抑え、か

つ極めて高いカップリング反応効率を達成し、これまでにない高品質の長

いオリゴ DNAを合成できるようになりました。この技術は、DNAマイクロアレイにおいて、低発現遺伝子の検出能力の向上、定量 PCRとの高い相関、DNAコピー数解析の精度向上など、高い評価をうけています。

この技術をベースに、100merを超す長いオリゴをマイクロアレイ上で合成した後、アレイからオリゴを切り離すことで、数万種類の高品質 DNAオリゴのライブラリを作製する手法を開発しました。このライブラリを活用す

るのが SureSelectターゲットエンリッチメントシステムです。

デザイン済みのカタログ、自由なデザインのカスタム

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SureSelectのデザインとシーケンス例

SureSelectのライブラリデザインとキット製造

③ 120merの cRNAベイトによりキャプチャされたDNA断片のシーケンスリード数です。

② ターゲット領域に対して120merのオリゴ（ベイト）が自動的にタイリングデザインで設計されます。

① シーケンスしたいターゲット領域を決定します。 GeneSymbolや GenbankIDなどのリストでも OKです。 （この例ではエクソン）

カタログ製品 カスタム製品・Human All Exon キット・Human Chromosome X キット

※詳細情報は次ページへ

対応生物種　ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ニワトリ、　線虫、ショウジョウバエ、出芽酵母、分裂酵母、　アラビドプシス　　※その他の生物種は独自デザインのベイトでライブラリ作成可能

キャプチャ領域　約 1Mb（推奨）　~　約 6.6Mb　　　　シーケンスリード長とタイリングデザインにより異なります。

カタログ製品のオーダーまたは eArray によるカスタムライブラリキットのデザイン

eArray Web Portal

DNAオリゴを切り離す 約 55,000種類の 120 merビオチン化 cRNAベイトが 1本のチューブに入ったキットとして出荷

ビオチン化 cRNAに転写約 55,000種類の 120 mer のDNAオリゴを１枚のアレイ

上に製造

ヒト全エクソンを１チューブでキャプチャ

100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%

0%

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

Perce

ntag

e of T

arge

ted B

ases

Cov

ered

NA10831 All Exon Sequence Coverage

Number of Sequenced Bases(Gb)

2.1 4.2 6.2 8.2

1 2 3 4 5 6 7 8

at least 1 readat least 5 readsat least 10 readsat least 20 readsat least 30 reads

Percentage reads in targeted regionsPercentage reads in regions ±100bpPercentage reads in regions ±200bp

4

Human All Exonキット

イルミナ Genome Analyzerシングルチューブキャプチャ　2x76bpシーケンス

【仕様】• ターゲット領域：38 Mb（ヒトゲノムの 1.22 %）• ターゲットエクソン数：~180,000（CCDS database） >700 miRNAs（miRBase v13） >300 non-coding RNAを含む• 120-mer の cRNAベイトによる高いキャプチャ効率• 1x タイリングデザイン / 1チューブ• 少量の gDNAで実験可能 >実験スタート時に必要な gDNA 3µg >ハイブリダイゼーションに必要なアダプタ付き DNA 500ng

典型的な結果>70% on target>75% on target ±100bp

　アジレント社は、ヒト全エクソンを溶液中で一度にキャプチャする画期的な技術を、世界ではじめて製品化しました。

この技術のポイントは、高品質の 120merの長い DNAオリゴを、マイクロアレイを使って製造することです。さらに、DNA-DNAハイブリダイゼーションよりも熱安定性の高い RNA-DNAハイブリダイゼーションを行うため、合成したDNAをアレイから切り出し、ビオチン化された cRNAに逆転写します。これにより、少量の gDNAサンプルを用いて、比類のない高いハイブリ効率でキャプチャを行うことを実現しました。必要な gDNA量はわずか 3 µg、この量は、最終的にハイブリダイゼーションに必要なアダプタ付き DNA 500 ngを調製するのに十分な量です。　次世代シーケンサのラン数、コスト、解析時間などを劇的に削減し、これからの次世代シーケンサの使い方を大きく

変えていく技術です。

120merの cRNAベイトが高いキャプチャ効率の決め手

1 Quad 　 2 Quads

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%1 2 3 4 5 6

イルミナ GA　 ペアエンド

100000

80000

60000

40000

20000

0

High

Qua

lity R

eads

25000

20000

15000

10000

5000

0

イルミナ GA　シングルエンド

100.00%

90.00%

80.00%

70.00%

60.00%

50.00%

40.00%

30.00%

20.00%

10.00%

0.00%

Percentage reads in targeted regionsPercentage reads in regions ±100bpPercentage reads in regions ±200bp

Non-reference bases Non-reference basesReference bases Reference bases

at least 1 readat least 5 readsat least 10 readsat least 20 readsat least 30 readsat least 40 reads

Perce

ntag

e of T

arge

ted B

ases

Cov

ered

5

Applied Biosystems SOLiDシングルチューブキャプチャ 50bpシーケンス

Human Chromosome Xキット

典型的な結果>~60% on target>~80% on target ±100bp

SureSelectのテストランのためのキットですが、ヒト X染色体のエクソンにフォーカスした シーケンスにも使用できます。

SureSelectは 120merのロングオリゴの使用により、SNPによるバイアスがほとんどありません。ターゲット領域の SNP解析を目的としたゲノムリシーケンシングに最適です。

SureSelectは 120merのロングオリゴの使用により、5bp程度のサイズの In-Delの影響をうけずにキャプチャすることができます。CGH/CNVアレイなどで絞り込んだ領域の、より細かいゲノム構造変異の解析に最適 です。左図はメンケス病関連遺伝子 ATP7Aの exon4における 5bpの欠失をとらえた例です。

SNPをバイアスなくキャプチャ

5bp欠失の影響なくキャプチャ

QCステップで確認しながら進む実験フロー

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SureSelect実験プロトコル

SureSelect実験プロトコルの特長

QCステップ

バイオアナライザDNA1000 assay 断片化 DNAのサイズ確認

バイオアナライザDNA1000 assay アダプタ付きDNAライブラリのサイズ確認と 定量

・わかりやすいプロトコル特別な技術やスキルを必要としません。

・3ステップの QCで、確認しながら実験を進められます。

・自動化によるハイスループット化が可能　（自動化製品は開発中）

バイオアナライザ 高感度 DNA assayによるキャプチャ後の DNAのサイズ分布の確認と定量

バイオアナライザDNA1000 assay高感度 DNA assayキャプチャされたDNAのサイズ確認と定量

gDNAを Covarisで目的サイズに断片化

アダプタ付きDNA断片

溶液中で 24時間ハイブリダイゼーション

ビオチン化 cRNAベイトライブラリ

ストレプトアビジン磁性ビーズ

キャプチャされた DNAだけを回収、濃縮

シーケンシング

製品サポート情報 /日本語資料を随時アップデート

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SureSelect日本語プロトコル

SureSelect最新技術情報

SureSelectテクノロジーを用いた論文

Sure Select 概要human All Exon キット登場！X染色体キット（イルミナペアエンド、SOLiDフラグメント対応）ベイト設計ガイド（遺伝子名リストでも作れます）

実験に必要なものリスト、eArrayのベイト設計ガイド、SureSelect　和文プロトコルは下記のアジレント社ゲノミクス日本語WEBサイトからダウンロードできます。

（プロトコルはお客様専用サポートサイトになります）

http://Agilentgenomics.jp

最新のデータ、英文プロトコル、論文や

Webcastは、下記のアジレント社英語WEBサイトにてご覧いただくことができます。

文献リストWebcast配信中

http//www.opengenomics.com/

Title : Solution Hybrid Selection with Ultra-Long Oligonucleotides for Massively Parallel Targeted Sequencing. Journal : Nature Biotechnology. 2009 Feb;27(2):182-9. Epub 2009 Feb 1.○ SureSelectの基本技術を開発したMIT Broad Instituteが、その技術の概要と基本的性能を紹介した論文です。

Title : Targeted capture and massively parallel sequencing　of 12 human exomesJournal : Nature. 2009 Oct; 461:272-6. ○ SureSelectのアレイキャプチャ法を用いて、12名のエクソン領域を詳細解析した例です。現在、ヒトエクソンキャプチャは溶液でのキャプチャ（ターゲットエンリッチメントシステム）を行う Human All Exonキットとして製品化されました。

Title : Enrichment of sequencing targets from the human genome by solution hybridizationJournal : Genome Biology 2009, 10:R116○加齢に関連する遺伝子を中心に 3.9Mbの領域をターゲットをキャプチャして SNP解析を行い、99%以上の正確さで

SNP検出を行った例です。

Title : Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts

Journal : Genome Biology 2009, 10:R115○ SureSelectの技術を転写産物のキャプチャに応用した例です。SNP、スプライシング、融合遺伝子の検出効率が、キャプチャによる目的転写産物濃縮により大幅に向上しています。

"In-solution" SureSelect - Science Webinar配信中http//www.sciencemag.org/webinar/

G ENOM I C SA T G T G A T C C T T C T G A C

［お問い合わせ窓口］

アジレント・テクノロジー株式会社本社　〒 192-8510 東京都八王子市高倉町 9-1TEL. 0120-477-111/FAX. 0120-565-154 www.agilent.com/chem/jp

©Agilent Technologies.Inc.2009Printed in Japan, Dec. 9, 2009本資料に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

販売店

SureSelect製品一覧（2009年 冬時点）

イルミナ Genome Analyzer SOLiDTM

ベイトライブラリデザイン タイリング シングルエンド ペアエンド フラグメント

Human All Exon x1 － ○75bp以上 ○

Human X-chr exon x2 ○ ○ ○

カスタム x2–x5 ○ ○ ○

カスタム x1 ○75bp以上

○75bp以上 －

※その他の開発中の製品に関しましては、弊社までお問い合わせください。