studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity …digilib.batan.go.id/e-prosiding/file...

6
322 ISSN 0216 - 3128 Mukh Syaifudill, dkk. STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY (LOH) PADA MENCIT p53KO Mukh Syaifudin P3KRBiN, BATAN, JI. Cillere Pasar JlIm'al PO BOX 7043 JKSKL Jakarla Rajamaniekam Baskar dan Taisei Nomura f)eparllllelll of RadialiOlI Biology alld Medical Gellelics, Graduale School of Medicille, Osaka UlliversilY, Yamada-aka 2-2-B4 Suiw-shi, Osaka, Japall ABSTRAK STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY (LOH) PADA MENCIT p53KO. Gell pellekall Illmor pS3 lelah melljadi perhatiall /llama para pelle/ili gellelika karella frekllellSi m/llasillya .mllgat lillggi (lebih dari 50%) pada berbagai jellis 11111101' mWllIsia. Ullwk mellgelalZlli perallall gell pS3 dalalll proses pelllbelllllkall 11111101' (lumorigellesis), lelah dilelili jellis dall pe1'sellwse Wlllor yallg Il'ljadi sl'cara SIIOIlIWI saw pl'rt/bahall 1II0iekull'mya pada mellcil yallg kekllrallg(/II gell pS3 (pS3 -/- knockout). Sellllw lIIellcil null (pS3 ) lIIali disebabkwI karella Ieukelllia awu .mrkoma sebelulII berwllllr 12 Imlatl dall palillg batlyak disl'babkwI lilllfosilik lellkl'lIIia pada 11111111' muda (3-5 bulall), sedallgkall lIIellcil +~ +/+ heterozygote (pS3 ) dall wild type (pS3 ) lIIa.fillg-lIIasilig dapal ber/ahall hidup salllpai lebih dari 30 dall 40 blliall. Sl'paro dari III1'IlCil heterozygote lIIellderila sarkoma (o.fleo.mrkollla, rhabdomiosark(J//w, hl'lIIallgiollla), datI bl'bl'rapa dial//arallya lIIellderiw IUlllor part/-part/ dall IWli, dall leukelllia yallg frekul'lIsillya rl'//(lah lillllJIII pada akhir lIIa.\"(/ hidllpllya. Pada IIIl'lIcil wild type, jarallg dilelllukwl lellkelllia dall .\"(/rkoma. !Jari 54 1III/IlIr dari IIIl'lIcil heterozygote, 12 (22,2'7c) diallwrwlya III I'll IIIljllkkw I hilallgllya aIel pS3 wild type (LOll) dall salll IIIl1/((si fllllgsiollal dill'lIIl1kall I'ada exoll 6 gell pS3. f)ari pl'lll'liliatl illi dikl'wlllli balm'a gl'lI pS3 b1'1111'1,(//lpl'lIIillg dalallllllellcegah wl/lOrigelle.l·is. ABSRACT STUU}' OF TUMORIGENESIS AND LOSS OF IIETEROZ}'GOSIT}' (LOH) IN p53KO MICE. Th,' pS3 IUlllor supprl'J.wr gl'lll' has rl'cl'lllly recl'iI'l'd much ll/ll'I//iOIl of gellelic researcher becallsl' of ils high IIII1WlilJl1 raIl' (11101'1' Ihall 50%) ill a wide variely of hlllllall IUlllors. To swdy Ihe fllllClioll of pS3 gelle ill WI/WI' del'elopmelll (Illmorigellesis), Ihl' 1.1'1'1' alld percl'llwgl' of spolllalleoll.I·ly occllrrl'd 1IIIIIlIr.l· as 11'1'1/ as ils lIIoll'cular ch(/IIgl's were examilled ill pS3 gelle-deficielll mice (pS3 kllocko/ll). All of Ihl' lIull lIIice (p53.f.) were death because of Il'ukl'lIIia or sarCOllla 011Ihe age of 12 mOlllhs or lower, alld prl'do/llill(/IIl/v dill' /(I 1\'/Ilplwcylic Il'lIkelllia all Ihl' carlier age (3-5 1IIOIlIhs). \\'hile hl'lero::.ygoll' (pS3'/') alld wild 1.1'1'1' (pS3·1.) micl' 11'1'/'1' sll/'l'il'l'C1 IIlllil Ihl' age of abol'l' 30 alld 40 11101//11.\', rl'speclil'ely. /-/alf I~f Ihl' hl'll'ro::.vgOll' lIIice .wffl'I'l'd .l'llrt.'OIl/(/S (osleo.\"(/rcolllas, rhabdolllyosarcolllas, helllallgiomas), al/(l Oil sOllie of Ihelll developed 111111/11'.1' ill Iile II/llg (//1(1liver; (/lid also a lower illcidellce of leukelllia [//(/1 occurred allhe elld of Iheir life. 111 Ihe wild Iype lIIice, leukemia allli sarCOllla.l· were rarely oh.ferved. Amollg 54 1111110/'.1' from hell'ro::,ygOlI' lIIicl', 12 (22.2%) slwwed loss of Ihl' wild Iype pS3 aI/ell' (LO/-/) alld 0111' ji/llcliOlwl 1IZ1l/aliOlI was fOlllld ill exoll 6 of Ihe (153 gelle. Frolll Ihis research, il '.I' kllOWIi Ih(l/ pS3 gl'lIe has all illlporlwlI role ill prel'elllillg 1IIIII(lrigl'/lesi.I·. PENDAHULUAN S el normal I1lcll1punyai scjull1lah Il1ckanisll1c intrinsik yang mclibatkan "gatekeeper" ll10kkular untuk mcnghindarkan diri dari (1cll1hclahan yang lak tcrkontrol ill. PCll10cnlukan dan pcrkcll10ang hiakan lumor dicirikan olch pCll1hclahan scl yang tidak lcrkontrol dan hal ini tcrjadi jika protcin khusus yang mcngatur pcmhclahan scl mcngalami pcrubahan fungsi gcn, cksprcsi gcn atau hilang fungsi dan cksprcsinya 121. Pada kankcr manusia, salah satu gcn penckan tumor yang bcrhubungan crat dcngan pcngcndalian siklus scl adalah /153. Gcn ini dapal mcnginduksi groll'lli a/'/'esl dan atau kcmatian scl (apoplosis) sClclah DNA tcrkcna suatu mutagcn 1.11. Dcngan dcmikian gcn p53 mcmpunyai fungsi yang vilal dalam mclindungi scl manusia dari kankcr dimana mutan gcn ini ditcmukan pada lcbih dari 500/<. kankcr manusia P·6J• Banyak sludi tclah dilakukan unluk mcngctahui scjauh mana penman gcn p53 dalam I11cngontrol scl dan salah salunya dcngan I11cnggunakan hcwan pcreobaan scpcni mcncit p53KO. Dcngan mcnggunakan lcknik gel/I' wrgelil/g, gcncrasi baru mcneit dcngan dua Ill/II aiel gerl/l IiI/I' p53 (IIOI/lo::.ygole) lumouh normal tctapi Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Casar IImu Pengetahuan dan Teknologl Nuklir P3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

Upload: dangdiep

Post on 13-May-2018

221 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Lingkungan/P3TM-Juli... · studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity (loh) pada

322 ISSN 0216 - 3128 Mukh Syaifudill, dkk.

STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY(LOH) PADA MENCIT p53KO

Mukh SyaifudinP3KRBiN, BATAN, JI. Cillere Pasar JlIm'al PO BOX 7043 JKSKL Jakarla

Rajamaniekam Baskar dan Taisei Nomuraf)eparllllelll of RadialiOlI Biology alld Medical Gellelics, Graduale School of Medicille,

Osaka UlliversilY, Yamada-aka 2-2-B4 Suiw-shi, Osaka, Japall

ABSTRAK

STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY (LOH) PADA MENCITp53KO. Gell pellekall Illmor pS3 lelah melljadi perhatiall /llama para pelle/ili gellelika karella frekllellSim/llasillya .mllgat lillggi (lebih dari 50%) pada berbagai jellis 11111101'mWllIsia. Ullwk mellgelalZlli perallall

gell pS3 dalalll proses pelllbelllllkall 11111101'(lumorigellesis), lelah dilelili jellis dall pe1'sellwse Wlllor yallgIl'ljadi sl'cara SIIOIlIWI saw pl'rt/bahall 1II0iekull'mya pada mellcil yallg kekllrallg(/II gell pS3 (pS3

-/-knockout). Sellllw lIIellcil null (pS3 ) lIIali disebabkwI karella Ieukelllia awu .mrkoma sebelulII berwllllr 12

Imlatl dall palillg batlyak disl'babkwI lilllfosilik lellkl'lIIia pada 11111111'muda (3-5 bulall), sedallgkall lIIellcil+~ +/+

heterozygote (pS3 ) dall wild type (pS3 ) lIIa.fillg-lIIasilig dapal ber/ahall hidup salllpai lebih dari 30

dall 40 blliall. Sl'paro dari III1'IlCil heterozygote lIIellderila sarkoma (o.fleo.mrkollla, rhabdomiosark(J//w,

hl'lIIallgiollla), datI bl'bl'rapa dial//arallya lIIellderiw IUlllor part/-part/ dall IWli, dall leukelllia yallgfrekul'lIsillya rl'//(lah lillllJIII pada akhir lIIa.\"(/ hidllpllya. Pada IIIl'lIcil wild type, jarallg dilelllukwl lellkelllia

dall .\"(/rkoma. !Jari 54 1III/IlIr dari IIIl'lIcil heterozygote, 12 (22,2'7c) diallwrwlya IIII'll IIIljllkkw I hilallgllya aIelpS3 wild type (LOll) dall salll IIIl1/((si fllllgsiollal dill'lIIl1kall I'ada exoll 6 gell pS3. f)ari pl'lll'liliatl illidikl'wlllli balm'a gl'lI pS3 b1'1111'1,(//lpl'lIIillg dalallllllellcegah wl/lOrigelle.l·is.

ABSRACT

STUU}' OF TUMORIGENESIS AND LOSS OF IIETEROZ}'GOSIT}' (LOH) IN p53KO MICE. Th,' pS3IUlllor supprl'J.wr gl'lll' has rl'cl'lllly recl'iI'l'd much ll/ll'I//iOIl of gellelic researcher becallsl' of ils highIIII1WlilJl1 raIl' (11101'1'Ihall 50%) ill a wide variely of hlllllall IUlllors. To swdy Ihe fllllClioll of pS3 gelle illWI/WI' del'elopmelll (Illmorigellesis), Ihl' 1.1'1'1'alld percl'llwgl' of spolllalleoll.I·ly occllrrl'd 1IIIIIlIr.l· as 11'1'1/as ils

lIIoll'cular ch(/IIgl's were examilled ill pS3 gelle-deficielll mice (pS3 kllocko/ll). All of Ihl' lIull lIIice (p53.f.)were death because of Il'ukl'lIIia or sarCOllla 011Ihe age of 12 mOlllhs or lower, alld prl'do/llill(/IIl/v dill' /(I1\'/Ilplwcylic Il'lIkelllia all Ihl' carlier age (3-5 1IIOIlIhs). \\'hile hl'lero::.ygoll' (pS3'/') alld wild 1.1'1'1'(pS3·1.)

micl' 11'1'/'1'sll/'l'il'l'C1 IIlllil Ihl' age of abol'l' 30 alld 40 11101//11.\',rl'speclil'ely. /-/alf I~f Ihl' hl'll'ro::.vgOll' lIIice

.wffl'I'l'd .l'llrt.'OIl/(/S (osleo.\"(/rcolllas, rhabdolllyosarcolllas, helllallgiomas), al/(l Oil sOllie of Ihelll developed111111/11'.1'ill Iile II/llg (//1(1liver; (/lid also a lower illcidellce of leukelllia [//(/1 occurred allhe elld of Iheir life. 111

Ihe wild Iype lIIice, leukemia allli sarCOllla.l· were rarely oh.ferved. Amollg 54 1111110/'.1'from hell'ro::,ygOlI' lIIicl',12 (22.2%) slwwed loss of Ihl' wild Iype pS3 aI/ell' (LO/-/) alld 0111'ji/llcliOlwl 1IZ1l/aliOlI was fOlllld ill exoll 6

of Ihe (153 gelle. Frolll Ihis research, il '.I' kllOWIi Ih(l/ pS3 gl'lIe has all illlporlwlI role ill prel'elllillg1IIIII(lrigl'/lesi.I·.

PENDAHULUAN

S el normal I1lcll1punyai scjull1lah Il1ckanisll1cintrinsik yang mclibatkan "gatekeeper"

ll10kkular untuk mcnghindarkan diri dari

(1cll1hclahan yang lak tcrkontrol ill. PCll10cnlukan

dan pcrkcll10ang hiakan lumor dicirikan olch

pCll1hclahan scl yang tidak lcrkontrol dan hal ini

tcrjadi jika protcin khusus yang mcngatur

pcmhclahan scl mcngalami pcrubahan fungsi gcn,

cksprcsi gcn atau hilang fungsi dan cksprcsinya 121.

Pada kankcr manusia, salah satu gcn penckan tumor

yang bcrhubungan crat dcngan pcngcndalian siklusscl adalah /153. Gcn ini dapal mcnginduksi groll'lli

a/'/'esl dan atau kcmatian scl (apoplosis) sClclah

DNA tcrkcna suatu mutagcn 1.11. Dcngan dcmikian

gcn p53 mcmpunyai fungsi yang vilal dalammclindungi scl manusia dari kankcr dimana mutan

gcn ini ditcmukan pada lcbih dari 500/<. kankcrmanusia P·6J•

Banyak sludi tclah dilakukan unluk

mcngctahui scjauh mana penman gcn p53 dalam

I11cngontrol scl dan salah salunya dcngan

I11cnggunakan hcwan pcreobaan scpcni mcncit

p53KO. Dcngan mcnggunakan lcknik gel/I'

wrgelil/g, gcncrasi baru mcneit dcngan dua Ill/II aiel

gerl/l IiI/I' p53 (IIOI/lo::.ygole) lumouh normal tctapi

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Casar IImu Pengetahuan dan Teknologl NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

Page 2: STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Lingkungan/P3TM-Juli... · studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity (loh) pada

Mukll Syaifudin,dkk. ISSN 0216 - 3128 323

sangat mudah menderita tumor pada umur muda.Sedangkan mencit dengan hanya satu aIel(heterozygote) juga mudah menderita tumor tetapiwaktu timbulnya tidak secepat homozygote [7].Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajaritumorigenesis spontan yang meliputi jenis danfrekuensi munculnya tumor serta perubahanmolekulemya pada mencit kekurangan p53 (p53knockout, p53KO).

TEORI

Karsinogenesis diduga merupakan prosesakumulasi perubahan genetik dan epigenetik yangmenyebabkan perubahan kontrol molekulerperkembang biakan sel. Perubahan genetik tersebutdapat berupa aktivasi proto-onkogen dan atauinaktivasi gen penekan tumor yang dapat memicutumorigenesis dan mernacu progresinya. Genpenekan tumor seperti p53 berfungsimempertahankan homeostasis jaringan dengan caramengontrol pembelahan selular, diferensiasi dankernatian sel terprogram (apoptosis) [7]. Proteinp53 juga terlibat dalam transkripsi gen, sintesis danperbaikan DNA dan plastisitas genomik.Phospoprotein p53 IDl banyak ditemukan(berakumulasi) pada sel rnanusia dan mencit yangmengalami transformasi [6,8].

Keterlibatan p53 dalam merespon kerusakanDNA menunjukkan bahwa ketidak stabilan genetik

disebabkan karena gagalnya sel dalammemperpanjang siklus pada fase G I setelah DNA

mengalami kerusakan. Jika p53 tidak berfungsinormal rnaka kerusakan DNA ini akan terus ada

disebabkan karena tidak cukup waktu untuk prosesperbaikan berlangsung sebelum replikasi DNA

pada fase-S [8]. Penelitian yang dilakukan olehDonehower dkk [9] membuktikan bahwa introduksi

p53 wild type ke dalam cell lines yang telahkehilangan fungsi p53 endogen dapat menyebabkan

growth arrest atau menginduksi proses kernatian selatau apoptosis. Lee dkk. [10] juga telah berhasil

membuat cell lines dari mencit transgenik yangmembawa klon genomik dari mutan p53. Ekspresi

yang tinggi mutan gen p53 ini ditemukan padaberbagai macam jaringan osteosarkorna,adenokarsinoma, kanker paru-paru, dan limporna.Bertambahnya kejadian tumor pada mencit ini

diduga disebabkan karena efek negatif dominanprotein transgenik yang tak berfungsi secara aktif

sehingga menghambat fungsi protein p53 wild typeendogen [11].

BAHAN DAN TAT A KERJA

Hewan percobaan.

Mencit kekurangan satu aIel gen p53(C57BU6-p53+/-) diperoleh dari sumbangan Prof.M. Katsuki dari Universitas Tokyo Jepang [12].Mencit dikembang biakkan dengan kawin silangdan dipelihara di ruang bebas kurnan (SpecificPathogen Free), Institute of Experimental Animal,Fakultas Kedokteran, Universitas Osaka, Jepang,dilengkapi dengan penerangan dan rnakanan sertaminurnan secukupnya.

Penentuan genotype.

DNA diekstrak dari ekor mencit

menggunakan QIAmp DNA Mini Kit (QIAGENInc., Valencia, CA). Genotype-nya dicek denganpolymerase chain reaction (PCR) (Geneamp PCRSystem 9700, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)dan menggunakan vektor primer spesifik danprimer p53 exon 6 dan 7. Primer-primer gen p53adalah 5' -TIGCTCTI AGGTCTGGCCCCT -3'

(atas) dan 5'-TAGGGAGGTCAAATAAGC-AG-3'(bawah) untuk exon 6; 5'­TGCCACAGGTCTCCCCAAGG-3' (atas) dan 5'·AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA-3' (bawah)untuk exon 7.

Pengamatan tumor.

Mencit dicek setiap hari dan dibiarkan hidupsampai kernatiannya atau dibunuh jika kondisinyamelemah kemudian diotopsi untuk mengarnatitumor yang timbul secara spontan. Jaringan tumordan normal disimpan beku pada -80°C sebelumdipergunakan untuk analisis molekuler. Tumor danlesi patologik di-flX-kan dalam 10% larutan buferformalin dan dilakukan pengujian histologi untukdiagnosa dengan mikroskop.

LOB da" a"a/isis mutasi gen p53.

DNA diekstraksi dari spesimen beku danloss of heterozygocity (LOH) gen p53 diuji denganPCR. DNA diamplifikasi dengan menggunakanprimer-primer spesifik untuk gen p53 exon 6,dan 7.Amplifikasi PCR aIel p53 knockout menggunakanprimer vektor spesifik dipergunakan sebagaikontrol. Di samping itu LOH ditentukanberdasarkan signaUband produk PCR padaelektroforesis gel agarose. Signal sangat lemah atautidak ada signal pada produk PCR dari aiel wildtype yang terbentuk diklasifikasikan sebagai LOHdan dibandingkan dengan signal standard primerspesilik p53 knockout.

Prosiding Pertemuan dan Presentasilimiah Penelitlan Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologl NukllrP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

Page 3: STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Lingkungan/P3TM-Juli... · studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity (loh) pada

324 ISSN 0216 - 3128 Muklz Syaifudil/, dkk.

Ada tidaknya mutasi gen ditentukan dengan

metode Cold-SSCP dengan prosedur seperti

ditinjau oleh Hongyo dkk [I3J• Band-band pada gelSSCP yang menunjukkan perubahan mobilitas

dieuplik dan diamplifikasi dengan PCR 25 cycleuntuk memper-banyak band-band mutasi. Allele

mutan dimurnikan dengan QIAquiek PCR

purification kit (QIAGEN). Direct sequencing duaarah dilakukan dengan metode dideoxy chaintermination menggunakan Big Dye Terminatorcycle sequencing kit (Perkin-Elmer, Foster City,CA) dan DNA sequencer otomatis (ABI PRISM

310 Genetic Analyzer, Perkin-Elmer).

Allalisis Statistik.

Analisis statistik dilakukan dengan SPSS

Statistic System (SPSS Inc., Chicago, IL).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil penelitian menunjukkan adanya

pcrbcdaan yang bcsar dan nyata pada daya tahan

hid up antara meneit null, heterozygote dan wildtype dan meneit tanpa atau kekurangan gen p53sangat mudah menderita tumor spontan. DalamTabel 1 terlihat bahwa meneit null menderita

leukemia (84,6%) dan sarkoma (13,5%) danmengalami kematian sebelum berumur 12 bulandimana meneit null mati disebabkan karena

limfositik leukemia pada umur 3-5 bulan. Meneit

heterozygote dan wild type mengalami leukemia

dengan insiden yang rendah (masing-masing 8%

dan 12,5 %) dan sebagian besar dapat bertahanhidup sampai lebih dari 30 dan 40 bulan. Meneit

heterozygote menderita berbagai jenis tumor

(69,3%) terutama padajaringan konektifpada umurlebih tua yaitu osteosm:koma (22,7%), sarkoma lain'

(21,6%), kanker (9, I %), dan neoplasma sel

retikulum (4,5%). Meneit heterozygote seeara jelas

menunjukkan kepekaannya terhadap tumor yangterjadi spontan. Meneit wild type selain menderita

leukemia juga neoplasma pada sel retikulum (25%)yang juga sering ditemukan pada meneit strainC57BL/6.

Tabcl 1. Persentase mencit yang menderita beberapa jenis till/lOr spontan serta umurmencitnull (p53-/-). heterozygote (p53 +/-) dan wild type (p53 +/+).

Null (104 ekor) Heterozygote (88 ekor)Wild type (16 ekor)88 Leukemia (84,6%)

7 Leukemia (8,0%)2 Leukemia (12,5%)14 Sarkoma (13.5%)

20 Osteosarkoma (22.7%)4 Neoplasma sel reticulum (25%))9 Sarkoma lain (21.6%) 8 Kanker (9.1 %)4 Neoplasma sel reticulum (4.5'7c)Umur: <12 bulan

Umur : >30 bulanUmur : >40 bulan

Hasil penclitian yang menunjukkan

prosentase kejadian tumor ini mirip dengan hasil

pcnelitian Harvey, M. [7J dkk yang mcnunjukkan

bahwa limpoma ga!1as paling banyak ditcmukanpada meneit null scdangkan ostcosarkoma dan

sarkoma jaringan lunak domil-lan pada meneit

heterozygote. Penyebab perbedaan ini masih belum

jclas. Hal ini memuneulkan bcberapa spekulasi

antara lain bahwa tingginya frckucnsi limpoma

pad a homozygote disebabkan tidak berf ungsinya

kcjadian-kcjadian fisiologik yang penting pada scl

precursor limfoid. Sel-sel pra-B dan T mengalami

rearrangement DNA sceara terprogram masing­

masing pada gen immunoglobulin dan gen reseptor

scl- T. Gcn p53 mcrupakan mcdiator penting

checkpoint siklus sel (G I arrest) setclah DNA

tcrluka. Sel yang kekurangan p53 dan sel limfoid

normal menghasilkan jumlah DNA aberrant yang

sama tetapi resistensi sel kckurangan p53 terhadap

apoptosis mcnambah daya tahan hidup precursorlimfoid mcskipun dengan rearrangement tidak

normal PI. Ini didukung olch hasil penelitian yang

mcnunjukkan bahwa scl timosit dari p53homozygote bersifat rcsistan terhadap apoptosis

sctclah radiasi dan hasilnya adalah bertambahnyainsidcn tumor limfoid.

Dari hasil di atas dapat diketahui betapa

pcntingnya penman gen p53 dalam

mcmpertahankan kcstabilan genomik ataumempcrtahankan homeostasis jaringan dengan eara

mengontrol pembclahan selular, difcrensiasi dankematian scl tcrprogram (apoptosis). SualU buktimcnunjukkan bahwa ternyata pad a meneit tanpa

p2 /. yang merupakan keturunan (downstream) p53dan dipcrlukan untuk mcmpcrpanjang fasc-G I.

tidak dapat mcmpcrparah keganasan spontan pada

mcneit kckurangan p53. Oleh karcna ilU ketidak

stabilan genetik yang bcrhubungan dcngan mutasi

p53 diduga discbabkan olch proses selular sclain

pcrpanjangan siklus scl. Salah satunya adalah

bahwa scl dcngan mutasi p53 tidak memperbcsar

kerusakan kromosom tctapi eenderung bcrtahan

Proslding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Vogyakarta, 8 Juli 2003

Page 4: STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Lingkungan/P3TM-Juli... · studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity (loh) pada

Mukh Syaifudin,dkk. ISSN 0216 - 3128 325

hidup atau tetap membelah meskipun kromosomnyarusak. Hipotesis ini didukung oleh kenyataan bahwap53 berperan dalam mekanisme apoptosis ataupengeblokan G I yang irreversible pada beberapasel yang DNA-nya terluka. Kemungkinan lainnyabahwa ketidak stabilan genetik yang disebabkanoleh mutasi p53 diakibatkan oleh fungsi p53 yangbelum diketahui [12].

Pada penelitian ini juga diketahuibahwa daya tahan hidup mencit relatiflebih panjang dibandingkan dengan hasilpcnelitian lain [7,14]. Dalam penelitian inimencit null dan heterozygote masing­masing dapat bertahan hidup sampai 12dan 30 bulan sedangkan mencit padapenelitian oleh Harvey dkk. [7] masing­masing dapat bertahan hidup sampai 10dan 20 bulan. Perbedaan ini mungkindisebabkan karena hewan dipelihara diruang bebas steril, akan tetapi spektrumtumor yang timbul tidak berbeda denganpenelitian sebelumnya [7].

Hasil analisis status aiel ~~?a tumor yangterjadi spontan dari mencit p53 menunjukkanbahwa dari 54 sampel, 12 (22,2%) diantaranya

menunjukkan LOH, sementara tidak ada LOH pada37 jaringan normal. LOH tersebut ditemukan pada5 dari 8 (62,5%) leukemia dan limpoma ganas, 3

dari 13 (23,1%) osteosarkoma, 2 dari 2 (100%)fibrosarkoma, 1 dari 3 (33,3%) adenokarsinomakelenjar susu, dan 1 dari 1 (100%) neuroblastoma.

Gambar 1 menunjukkan hasil analisis LOH pada54 sampel tumor. Diantara 42 tumor sisanya yang

tidak menunjukkan LOH, hanya satu mutasi padakodon 205 (TAI TAb.) yang menyebabkan

substitusi tirosin (Tyr) oleh kodon Stop pada exon6 dari neoplasm sel retikulum. Hasil analisis mutasi

dengan Cold-SSCP yang menunjukkan perubahanmobilitas band aiel mutan disajikan dalam Gambar1. Mutasi pada gen p53 yang paling banyak adalah

mutasi titik pada satu aIel diikuti oleh hilangnyaaIel yang lain. Yang lebih rendah frekuensinyaadalah hilang atau terjadi perubahanJrearrangement

kedua aiel atau retensi aIel jenis ganas (wild).

Sebagai contoh pada karsinoma usus dimana gen

p53 mengalami mutasi lebih dari 75%, sedangkanpada tumor lain mutasinya rendah. Hal inimenunjukkan bahwa proses pembentukan suatu

tumor tidak selalu melalui mutasi p53 [1].

123WT

Gambar 1. Hasil analisis LOH (kiri) dan SSCP(kanan) yang menunjukkan perubahanmobilitas band dari gen p53 exon 6dan terdeteksi adanya mutasi titikpada sampel nomoI' 2 (WT adalah wildtype).

Dengan menggunakan analisis Southernblot, Harvey dkk. [7] menemukan 18 LOH dari 33(55%) tumor dan tidak ada LOH pada 15 sampellainya. Sedangkan Purdie dkk [15] menemukan 5LOH dari 9 (56%) sampel, dan Jack dkk [16]menemukan 9 LOH dari 12 (75%) sampel tumor.Dengan menggunakan berbagai macam zat kimiayang bersifat karsinogen seperti dimetilnitrosamin(DMN) [7],· p-cresidine, benzene atauphelophthalein [17], dan radiasi pengion [1],mencit ini sangat bermanfaat untuk mempelajariproses karsinogenesis in vivo suatu senyawakarsinogen. Dari hasil-hasil tersebut diketahui

bahwa frekuensi loss of heterozygosity (LOH) yangdiakibatkan masing-masing karsinogen berbedasatu dengan lainnya dan sangat tergantung padajenis karsinogen dan jaringan tumor.

KESIMPULAN

Mencit yang kekurangan satu atau keduaaIel gen p53 sangat mudah menderita tumor secara

spontan terutama leukemia pada mencit null denganumur dibawah 12 bulan dan osteosarkoma padaheterozygote dengan umur sampai 30 bulan. Separodari mencit heterozygo~"menderita sarkoma, dan

separo yahg_Iain menderita tumor paru-paru danhati, dan leukemia yang frekuensinya rendah dan

terjadi pada akhir masa hidupnya. Sedangkan padamencit wild type, jarang ditemukan leukemia dan

sarkoma. Dari 54 tumor dari mencit heterozygote,

12 (22,2%) diantaranya menunjukkan LOH dan

ditemukan satu mutasi fungsional pada exon 6 gen

p53. Dari penelitian ini diketahui bahwa gen p53

berperan penting dalam mencegah tumorigenesis.

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImlah Penelitlan Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologl NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

Page 5: STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Lingkungan/P3TM-Juli... · studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity (loh) pada

326 ISSN 0216 - 3128 Milk" Syaiflldill, dkk.

DAFTAR PUSTAKA

1. KEMP, CJ., WHELDON, T., and BALMAIN,A., P53-deficient mice are extremelysusceptible to radiation-induced tumorigenesis,Nat. Gellet. 8 (1994) 66-69.

2. PONDER, B., Cancer: gene losses in humantumours, Nature 335 (1988), 400-402.

3. LEVINE, A.J., p53, the cellular gatekeeper forgrowth and division, Cell 88 (1997) 323-331.

4. GREENBLA IT, M.S., HOLLSTEIN, M., andHARRIS, c.c., Mutation in the p53 tumorsuppressor gene : clues to cancer etiology andmolecular pathogenesis, Cancer Res. 54

(1994) 4855-4878.

5. HARRIS, c.c., p53 tumor suppressor gene:from the basic research laboratory to the clinic

an abridged historical perspective,Carcillogellesis 17 (1996) 1187-1198.

6. FIN LA Y, C.A., HINDS, P.W. and LEVINE,

A.J., The p53 proto-oncogene can act as asuppressor of transformation, Cell 57 (1989)1083-1093.

7. HARVEY, M., MCARTHUR, MJ.,MONTGOMERY, C.A., BUTEL, J.S.,BRADLEY, and DONEHOWER, L.A.,

Spontaneous and carcinogen inducedtumorigenesis in p53-deficient mice, Nat.

Gellet. 5 (1993) 225-229.

8. LEHMAN, T.A., REDDEL, R., PFEIFER,A.M.A., SPILLARE, E., KAIGHN, E.,WESTON, A., GERWIN, B.I. and HARRIS,c.c., Oncogenes and tumor-suppressor genes,Ell\'. Health. Persp. 93 (1991) 133-144.

9. DONEHOWER, L.A., HARVEY, M.,SLAGLE, B.L., MCARTHUR, M.J.,MONTGOMERY, C.A. Jr., BUTEL, J.,and BRADLEY, A., Mice deficient for

fJ53 are developmentally nonnal butsusceptible to spontaneous tumors, Na/ure

356 (1992) 215-221.

10.LEE, lM. and BERNSTEIN, A., p53mutations increased resistance to ionizingradiation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993),5742-5746.

11.MURNANE, J.P., Role of induced genetic

instability in the mutagenic effects ofchemicals and radiation, Mutation Res. 367

(1996)11-23.

12.GONDO, Y., NAKAMURA, K., NAKAO, K.,SASAOKA, T., ITO, K.I., KIMURA, M., and

KA TSUKI, M., Gene replacement of the p53

gene with the lacZ gene in mouse embryonicstem cells and mice by using two steps ofhomologous recombination, Biochem. Biophys.

Res. COl1lmun. 202 (2) (1994) 830-837.

13.HONGYO, T. BUZARD, G. S., CALVERT,R. l, and WEGHROST, C. M., 'Cold SSCP :A simple, rapid, and non-radioactive methodfor optimized single-strand conformationpolymorphism analyses. Nucleic. Acid Res., 21

(1993) 3637-3642.

I4.VENKATACHALAM, S., SHI, Y.P., JONES,S.N., VOGEL, H., BRADLEY, A., PINKLE,D., and DONEHOWER, L.A., Retention ofwild type p53 in tumors from p53

heterozygous mice: reduction of p53 dosagecan promote cancer promotion, EMBO 1. 17(16) (1998) 4657-4667.

I 5.PURDIE, C.A. dkk. Tumour incidence,spectrum and ploidy in mice with largedeletion in the p53 gene. Oncogene 9 (1994)603-609.

16.JACKS, T. dkk. Tumour spectrum analysis inp53-mutant mice. Current BioI. 4 (1994) 1-7.

17.FRENCH, J.E., LACKS, G.D., TREMPUS, c.,DUNNICK, lK., FOLEY, l, MAHLER, J.,TICE, R.R. and TENNAT, R.W. Loss ofheterozygosity frequency at the Trp53 locus inp53-deficient (+/-) mouse tumors IS

carcinogen-and tissue-dependent. Laboratoryof Environmental Mutagenesis andCarcinogenesis, Research Triangle Park, NC27709, USA ..

TANYAJAWAB

M. Yazid

Gen P-53 apakah dapat diaplikasikan untukterapi kanker

Apakah gen dapat diisolasi dan tranplantasiuntuk mendapatkan Fl yang ideal.

M. Syaifudin

Bisa diaplikasikan karena hasil sturli

dellgall hell'all percobaall lIIellulljukkall

ball\lYl pelllberiall P-53 lIIalllpu

lIIellghalllbat tUl/lor.

P-53 dapat diiso/asi tetapi lI/ltuk

lIIelldapatkall F I yang ideal sejauh illibellllll diketahui tetapi lIIUlIgkill ada ideIIIltuk itu.

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

Page 6: STUDI TUMORIGENESIS DAN LOSS OF HETEROZYGOSITY …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Lingkungan/P3TM-Juli... · studi tumorigenesis dan loss of heterozygosity (loh) pada

Mllkh Syaiflldill,dkk. ISSN 0216 - 3128 327

Poppi Intan T.

Apakah keberadaan gen P53 yang lengkap(sepasang) atau tidak lengkap ada kaitannyadengan kecenderungan seseorang untukterkena resiko kanker/tumor ? mohon

penjelasan.

M. Syaifudin

Ada kaitan an tara gen P53 dankecenderungan terkena kanker karena genP53 adalah pellekan tumor dimanaterbukti mencit dengan P53 lengkap (+/+)lebih kecil prosentase tumornya dari padalIlencit dengan saW P53 (+/-) dan mencittanpa P53.

Dwi Wahini

P53 diberikan setelah terkena kanker stadium

berapa ?

P53 mencegah kanker atau menghambat ataubisa mengobati kanker ?

P53 sampai waktu berapa lama bisamengurangi kanker ?

M. Syaifudin

Sejauh yang diketahui. semua stadiumdapat diberikan terapi gen P53

P53 dapat menghambat dan mengobatibahkan mencegah karena P53 berfungsilIlencegah siklus sel yang tidak terkontroldengan menginduksi "growth arrest" danatau apoptesis (kematian sel).

Seperti hasil penelitian ini bahwa P53mampu memperpanjang umur mencitsampai >30 bulan untuk heterozygot (+/-)dan > 40 bulan untuk "wild type".

Suhariyono

Wild type dan heterozygot ini apa ?

Apa wild type ini identik dengan manusia yangbanyak gerak.

M. Syaifudin

Wild type adalah genotype dimana keduaaiel P53 berada dalam sel. Heterozygoteadalah genotype dimana hanya 1 aieldalalll sel

Tidak identik karena istilah "wild type"hanya digunakan untuk genotype.

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImlah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologl NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Jull 2003