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VIIIndice
CAPITOLO 1 Struttura degli acidi nucleici ed espressione genica
1.1 DNA, RNA e polipeptidi 2 L’informazione genetica fluisce quasi esclusivamente
in una direzione: DNA → RNA → polipeptide 2
Gli acidi nucleici e i polipeptidi sono sequenze lineari di semplici unità ripetute 3
Acidi nucleici 3Polipeptidi 3
Il tipo di legame chimico determina la stabilità e la funzione della molecola 5
BOX 1.1 L’IMPORTANZA DEL LEGAME IDROGENO NEGLI ACIDI NUCLEICI E NELLE PROTEINE 7
1.2 Struttura degli acidi nucleici e replicazione del DNA 7
Struttura del DNA e dell’RNA 7
La replicazione è semi-conservativa e semi-discontinua 10
Le DNA polimerasi a volte partecipano alla riparazione e alla ricombinazione del DNA 10
BOX 1.2 PRINCIPALI CLASSI DI PROTEINE COINVOLTE NELLA REPLICAZIONE DEL DNA 11
Molti virus hanno genomi a RNA 12
1.3 La trascrizione dell’RNA e l’espressione genica 14
La maggior parte dei geni è espressa per dar origine a polipeptidi 15
Le tre RNA polimerasi eucariotiche trascrivono diversi tipi di geni per gli RNA 16
1.4 La maturazione dell’RNA 17
Le regioni non necessarie sono rimosse dal trascritto primario 17
Alle estremità della maggior parte dei trascritti prodotti dall’RNA polimerasi II sono aggiunti specifici nucleotidi 19
Formazione del cappuccio al 5’ 19Poliadenilazione al 3’ 20
I trascritti degli rRNA e dei tRNA vanno incontro ad un ampio processamento 21
1.5 Traduzione, processamento post-traduzionale e struttura delle proteine 22
Gli RNA messaggeri sono decodificati a dare specifici polipeptidi 22
Il codice genetico è degenerato e non completamente universale 24
Processamento post-traduzionale: modificazioni chimiche di aminoacidi e taglio dei polipeptidi 25
Aggiunta di carboidrati 25Aggiunta di gruppi lipidici 26Il taglio post-traduzionale 26L’a-elica 28
Il foglietto b pieghettato 28La curva b 29Strutture più complesse 29
La complessa relazione tra sequenza aminoacidica e struttura proteica 27
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 30
CAPITOLO 2Struttura e funzione del cromosoma
2.1 La ploidia e il ciclo cellulare 32
2.2 Mitosi e meiosi 34
La mitosi è il tipo normale di divisione cellulare 34
La meiosi è una forma specializzata di divisione cellulare che produce spermatozoi e ovuli 35
Assortimento indipendente 36
Ricombinazione 37L’appaiamento X-Y 38
La mitosi e la meiosi hanno importanti somiglianze e differenze 39
2.3 Struttura e funzione dei cromosomi 39
Il DNA cromosomico è ripiegato in modo gerarchico 40
La cromatina interfasica varia nel grado di compattazione 41
Ogni cromosoma ha il suo territorio specifico nel nucleo interfasico 42
I centromeri svolgono un ruolo centrale nei movimenti dei cromosomi ma si sono evoluti in modi molto diversi in diversi organismi 42
BOX 2.1 COMPONENTI DEL FUSO MITOTICO 43
La replicazione dei cromosomi nei mammiferi è basata sull’uso flessibile di molteplici origini di replicazione 44
I telomeri hanno strutture specializzate per preservare le estremità dei cromosomi lineari 45
Struttura, funzione ed evoluzione dei telomeri 45La telomerasi e il problema della replicazione delle estremità dei cromosomi 46
2.4 Lo studio dei cromosomi umani 48
L’analisi dei cromosomi è più facile in mitosi che in meiosi 48
I cromosomi vengono identificati per la loro dimensione e il tipo di bandeggio 49
Bandeggio cromosomico 49Referto delle analisi citogenetiche 51
La citogenetica molecolare localizza sui cromosomi specifiche sequenza di DNA 51
BOX 2.2 NOMENCLATURA DEI CROMOSOMI UMANI 51
Ibridazione cromosomica fluorescente in situ (FISH) 52Chromosome painting e cariotipo molecolare 53
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L’ibridazione genomica comparativa (CGH) 54
2.5 Anomalie cromosomiche 55
Le anomalie numeriche dei cromosomi implicano la perdita o l’acquisizionedi interi cromosomi 56
Poliploidia 56Aneuplodia 57Mixoploidia 57Conseguenze cliniche 57
Molte anomalie nella struttura dei cromosomi derivano da errori nella riparazione o nella ricombinazione 59
Diversi fattori contribuiscono alle conseguenze cliniche delle anomalie strutturali dei cromosomi 60
Una scorretta origine parentale dei cromosomi può determinare uno sviluppo anormale o malattie 62
• Conclusioni 63
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 64
CAPITOLO 3I geni nelle famiglie e nelle popolazioni
BOX 3.1 NOMENCLATURA DEI GENI E DEGLI ALLELI
NELL’UOMO 66
3.1 Eredità monogenica e multifattoriale 66
BOX 3.2 DATABASE DEI CARATTERI MENDELIANI E DELLE MALATTIE NELL’UOMO 67
3.2 Modelli di alberi genealogici mendeliani 68
Esistono cinque tipi base di alberi genealogici di tipo mendeliano 68
Inattivazione del cromosoma X 69
BOX 3.3 RIASSUNTO DEI TIPI DI EREDITÀ 71
Mosaicismo dovuto all’inattivazione dell’X 71Il cromosoma Y è povero di geni 72I geni della regione pseudoautosomica 73Malattie dovute a mutazioni del DNA mitocondriale 73
È difficile stabilire con precisione il tipo di eredità in base a un unico albero genealogico 74
Il rapporto giusto: il problema della distorsione nel rilevamento 75
BOX 3.4 CALCOLO E CORREZIONE DEL RAPPORTO DI SEGREGAZIONE PER UN CARATTERE RECESSIVO 76La relazione tra i caratteri mendeliani e le sequenze geniche 76Eterogeneità del locus 77Eterogeneità clinica 78
3.3 Complicazioni degli alberi genealogici mendeliani semplici 78
Una condizione recessiva comune può dare un albero genealogico di tipo dominante 78
Una condizione dominante non si manifesta 79Penetranza legata all’età in malattie a insorgenza tardiva 80
Molte condizioni hanno espressività variabile 80Anticipazione 81Imprinting 82
La letalità maschile può complicare gli alberi per caratteri legati al sesso 82
L’inbreeding complica l’interpretazione degli alberi 83
Nuove mutazioni e il mosaicismo complicano l’interpretazione degli alberi 83
Mosaici 84Chimere 85
3.4 La genetica dei caratteri multifattoriali: la teoria della soglia poligenica 86
Agli inizi del XX secolo ci fu una controversia tra i fautori dell’eredità mendeliana e di quella quantitativa 86
La teoria poligenica spiega la determinazione genetica dei caratteri quantitativi 87
La regressione sulla media 88Gli assunti nascosti 89
L’ereditabilità misura la proporzione della variabilità totale di un carattere che dipende da differenze genetiche 89
Ereditabilità fraintesa 90
Il modello soglia estende la teoria poligenica ai caratteri dicotomici 90
La teoria della soglia e la stima del rischio di ricorrenza 91
La consulenza nelle condizioni non mendeliane è basata su un rischio empirico 91
3.5 I fattori che influenzano le frequenze alleliche 92
Un esperimento virtuale: estrarre alleli dal pool genico 93La legge di Hardy-Weinberg collega le frequenze alleliche alle frequenze genotipiche 93La legge di Hardy-Weinberg nella consulenza genetica 93
BOX 3.5 LE RELAZIONI TRA FREQUENZE ALLELICHE E GENOTIPICHEIN UNA POPOLAZIONE ALL’EQUILIBRIO DI HARDY-WEINBERG 93
Inincrocio (inbreeding) 94
BOX 3.6 GLI EFFETTI DELL’ININCROCIO (inbreeding) 95
Altre cause di scostamento dalle relazioni di Hardy-Weinberg 96
Le frequenze alleliche possono variare nel tempo 97Stima dei tassi di mutazione 97Il vantaggio dell’eterozigote 98
BOX 3.7 SELEZIONE A FAVORE DELL’ETEROZIGOTE NEL CASO DELLA FIBROSI CISTICA 98
• Conclusioni 99
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 99
CAPITOLO 4Cellule e comunicazione cellula-cellula
4.1 Struttura e diversità cellulare 102
I procarioti e gli eucarioti rappresentano una suddivisione fondamentale tra le forme di vita cellulare 102
BOX 4.1 ORGANIZZAZIONE INTRACELLULARE DELLE CELLULE ANIMALI 103
La straordinaria diversità delle cellule nel corpo 105
Le cellule germinali sono specializzate per la funzione riproduttiva 105
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Il contenuto di DNA può variare nelle cellule di un singolo organismo multicellulare 107
4.2 Adesione cellulare e formazione dei tessuti 108
Le giunzioni cellulari regolano il contatto tra le cellule 109Giunzioni strette 109Giunzioni cellulari di ancoraggio 109Giunzioni cellulari comunicanti 110
La matrice extracellulare regola il comportamento cellulare e serve da impalcatura per sostenere i tessuti 111
Tipi cellulari specializzati sono organizzati in tessuti 111Epitelio 112Tessuto connettivo 112Tessuto muscolare 113Tessuto nervoso 113
4.3 Principi della segnalazione cellulare 114
Le molecole segnale si legano a recettori specifici nelle cellule riceventi, inducendo un cambiamento del comportamento cellulare 114
BOX 4.2 STRUTTURA DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE 116
Alcune molecole segnale si legano a recettori intracellulari che attivano direttamente i geni bersaglio 117
La segnalazione attraverso recettori sulla superficie cellulare spesso implica una cascata di chinasi 117
Le vie di trasduzione del segnale usano spesso delle piccole molecole segnale come intermediari intracellulari 118
Il segnale sinaptico è una forma specializzata di segnalazione cellulare che non richiede l’attivazione di fattori di trascrizione 120
4.4 Proliferazione cellulare, senescenza e morte cellulare programmata 121
La maggior parte delle cellule negli animali adulti non si divide, ma alcuni tessuti e cellule si rinnovano rapidamente 121
I mitogeni promuovono la proliferazione cellulare superando i meccanismi che frenano la progressione del ciclo cellulare in G1 122
I limiti della proliferazione cellulare e il concetto di senescenza cellulare 124
Un gran numero di cellule umane è programmato in modo naturale per morire 124
L’importanza della morte cellulare programmata 125
L’apoptosi viene effettuata dalle caspasi in risposta a segnali di morte o a un prolungato stress cellulare 126
Vie estrinseche: segnalazione attraverso recettori di morte sulla superficie cellulare 127Vie intrinseche: risposte intracellulari a stress cellulari 127
4.5 Cellule staminali e differenziamento 128
La specializzazione cellulare implica una serie di decisioni gerarchiche guidate 128
Le cellule staminali sono delle rare cellule progenitrici che si autorinnovano 129
Cellule staminali tissutali consentono di reintegrare tessuti adulti 130
Nicchie di cellule staminali 131Rinnovamento versus differenziamento delle cellule staminali 132
Le cellule staminali embrionali e le cellule germinali embrionali sono pluripotenti 132
Origine delle cellule staminali embrionali coltivate 132
BOX 4.3 DIVISIONE CELLULARE ASIMMETRICA 133
Test di pluripotenza 134Cellule germinali embrionali 134
4.6 Cellule del sistema immunitario: la funzione attraverso la diversità 135
Il sistema immunitario innato fornisce una risposta rapida basata su una modalità generale di riconoscimento dei patogeni 136
Il sistema immunitario adattativo attiva risposte immunitarie specifiche potenziate dalle cellule della memoria 138
L’immunità umorale dipende dalle attività di anticorpi solubili 139
Nell’immunità mediata da cellule, le cellule T riconoscono cellule che contengono frammenti di proteine estranee 141
BOX 4.4 IL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITÀ, LE PROTEINE MHC E LA PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE 142
Attivazione delle cellule T 144
BOX 4.5 AUTOIMMUNITÀ 145
Le peculiari organizzazione ed espressione dei geni per le Ig e i TCR 145
Ulteriori meccanismi di ricombinazione e mutazione contribuiscono alla diversità dei recettori nelle cellule B, ma non nelle cellule T 148
La monospecificità delle Ig e dei TCR è determinata da esclusione allelica e da esclusione della catena leggera 148
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 149
CAPITOLO 5Le basi genetiche dello sviluppo 5.1 Uno sguardo generale sullo sviluppo 152
Modelli animali dello sviluppo 153
5.2 Specializzazione cellulare durante lo sviluppo 154
Le cellule si specializzano attraverso una serie irreversibile di decisioni gerarchiche 155
La scelta del destino cellulare spesso dipende dalla posizione delle cellule 156
Talvolta il destino cellulare è specificato dal tipo cellulare (lineage) più che dalla posizione 157
5.3 Formazione dello schema corporeo durante lo sviluppo 158
La formazione del piano corporeo dipende dalla specificazione degli assi e dalla polarizzazione 159
La formazione dell’architettura corporea dipende spesso da gradienti di molecole segnale 160
BOX 5.1 SPECIFICAZIONE DEGLI ASSI E DELLA POLARITÀ NELL’EMBRIONE PRECOCE DI MAMMIFERO 160
Le mutazioni omeotiche rivelano le basi molecolari dell’identità posizionale 162
5.4 Morfogenesi 164
La morfogenesi può essere guidata da cambiamenti di forma e di dimensione delle cellule 164
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I principali cambiamenti morfogenetici nell’embrione sono il risultato di cambiamenti di affinità cellula-cellula 165
La proliferazione cellulare e l’apoptosi sono importanti meccanismi morfogenetici 165
5.5 Lo sviluppo precoce dell’embrione umano: dalla fecondazione alla gastrulazione 167
Durante la fecondazione l’uovo viene attivato per formare un nuovo individuo 167
Lo zigote si divide in tante cellule più piccole 168
Le cellule uovo dei mammiferi sono fra le più piccole del regno animale e le loro divisioni sono peculiari sotto vari aspetti 169
Solo una piccola frazione delle cellule dell’embrione precoce contribuirà, nei mammiferi, a formare l’organismo maturo 170
BOX 5.2 LE MEMBRANE ExTRAEMBRIONALI E LA PLACENTA 170BOX 5.3 I GEMELLI 171
Impianto 171
La gastrulazione è un processo dinamico attraverso il quale le cellule dell’epiblasto danno origine ai tre foglietti embrionali 172
5.6 Lo sviluppo del sistema nervoso 176
Il mesoderma assiale induce l’ectoderma soprastante a svilupparsi nel sistema nervoso 176
BOX 5.4 LA STRAORDINARIA VERSATILITÀ DELLA CRESTA NEURALE DEI VERTEBRATI 177
La formazione di strutture nel tubo neurale coinvolge l’espressione coordinata di geni lungo due assi 178
Il differenziamento neuronale richiede l’attività combinatoria di fattori trascrizionali 179
5.7 Cellule germinali e determinazione del sesso nei mammiferi 180
Nei mammiferi le cellule primordiali germinali vengono prodotte precocemente nell’embrione e migrano nelle gonadi in via di sviluppo 180
La determinazione del sesso coinvolge informazioni sia intrinseche sia posizionali 180
5.8 Conservazione dei processi di sviluppo 182
Molte malattie nell’uomo sono il risultato di anomalie nei processi di sviluppo 182
I processi di sviluppo sono spesso altamente conservati, ma alcuni presentano notevoli differenze fra specie 182
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 184
CAPITOLO 6Amplificazione del DNA: clonare il DNA con sistemi cellulari o la PCR
Clonaggio di DNA utilizzando un sistema cellulare 187La reazione a catena della polimerasi (PCR) 187
6.1 Principi di clonaggio in sistemi cellulari 187
BOX 6.1 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE E SISTEMI DI MODIFICAZIONE-RESTRIZIONE 188
I frammenti di DNA d’interesse vengono uniti alle molecole vettore mediante endonucleasi di restrizione e DNA ligasi 189
Il clonaggio del DNA in cellule batteriche sfrutta vettori che si replicano attraverso origini di replicazioni extracromosomiche 191
Il clonaggio in cellule batteriche fa uso di plasmidi e batteriofagi geneticamente modificati 192
La trasformazione costituisce la tappa chiave nel frazionamento del DNA per il clonaggio in sistemi cellulari 194
Il DNA ricombinante può essere purificato selettivamente, dopo selezione e amplificazione dei cloni cellulari con il frammento di DNA desiderato 195
6.2 Come clonare grossi frammenti di DNA e sistemi di clonaggio per produrre DNA a singolo filamento 196
I primi vettori di clonaggio per grossi frammenti di DNA sono stati costruiti sfruttando le caratteristiche del fago l 197
Grossi frammenti di DNA possono essere clonati in cellule batteriche usando repliconi extracromosomici a basso numero di copie 198
Cromosomi batterici artificiali (BAC) e fosmidi 198Vettori e cromosomi artificiali disegnati sul fago P1 199
Gli YAC, cromosomi artificiali di lievito (yeast artificial chromosome), permettono il clonaggio di megabasi di DNA 199
Produzione di DNA a singolo filamento per il sequenziamento e la mutagenesi sito-specifica 200
I vettori M13 201Vettori fagemidi 201
6.3 Sistemi di clonaggio progettati per l’espressione genica 203
Si possono produrre grandi quantità di proteine usando vettori di espressione in cellule batteriche 203
La tecnica del phage display espone le proteine eterologhe sulla superficie di particelle fagiche 205
L’espressione di geni di origine eucariotica è più fedele nelle cellule eucariotiche 206
Espressione transitoria in cellule d’insetto tramite l’uso di baculovirus 207Espressione transitoria in cellule di mammifero 207Espressione stabile in cellule di mammifero 208
6.4 La reazione a catena della polimerasi: clonare il DNA in vitro 209
La PCR permette di amplificare una molecola di DNA specifica presente in piccolissima quantità all’interno di una popolazione complessa 210
La natura ciclica della PCR amplifica il DNA in modo esponenziale 210
L’amplificazione selettiva del DNA bersaglio dipende dall’elevata specificità delle sequenze primer 211
La tecnica della PCR come metodo di clonaggio ha dei limiti, dati dalla modesta dimensione dei frammenti amplificabili e dovuti alla bassa resa del prodotto 212
BOX 6.2 ALCUNI COMUNI METODI DI PCR 213 Per specifiche applicazioni della PCR è stata sviluppata
un’ampia gamma di approcci 214PCR allele specifica 214Amplificazioni multiple e metodo della PCR su genoma totale 214Mutagenesi via PCR 215
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Real time PCR (qPCR, PCR quantitativa) 217
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 217
CAPITOLO 7Ibridazione di acidi nucleici: principi e applicazioni
7.1 Principi dell’ibridazione con acidi nucleici 220
Nei saggi di ibridazione, una popolazione di molecole note di acido nucleico è utilizzata per vagliare una popolazione di acidi nucleici poco caratterizzati 220
BOX 7.1 VOCABOLARIO PER L’IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI 221
Gli eteroduplex tra sonda e bersaglio sono rilevabili più agevolmente dopo immobilizzazione su un supporto solido 221
La denaturazione e l’appaiamento sono condizionati dalla temperatura, dall’ambiente chimico e dall’estensione dei ponti idrogeno 222
Condizioni stringenti di ibridazione aumentano la specificità della formazione di molecole a doppio filamento 224
La cinetica della riassociazione del DNA dipende anche dalla sua concentrazione 224
7.2 Marcatura di acidi nucleici e oligonucleotidi 226
A partire da substrati a DNA, a RNA o oligonucleotidici, possono essere preparate differenti classi di sonde 226
Le sonde di acido nucleico lunghe sono generalmente prodotte mediante incorporazione di nucleotidi marcati nel corso della sintesi di un filamento di DNA 227
Marcatura del DNA mediante nick translation 227Marcatura del DNA mediante random priming 228Marcatura per sintesi di un filamento mediante PCR 228Marcatura di RNA 228
I radioisotopi possono essere utilizzati per marcare gli acidi nucleici, ma sono pericolosi e hanno una emivita breve 229
Nella marcatura non isotopica degli acidi nucleici sono comunemente utilizzati i fluorofori 229
BOX 7.2 AUTORADIOGRAFIA 230BOX 7.3 MARCATURA CON ELEMENTI FLUORESCENTI DI ACIDI NUCLEICI 231
7.3 Ibridazione su acidi nucleici bersaglio immobilizzati 233
L’ibridazione dot-blot permette screening rapidi e utilizza spesso sonde oligonucleotidiche allele-specifiche 233
Le ibridazioni mediante Southern e northern blot rilevano DNA e RNA frazionati in base al peso molecolare 234
Ibridazione mediante Southern blot 234Ibridazione per northern blot 234
BOX 7.4 ELETTROFORESI DEGLI ACIDI NUCLEICI 234
In un saggio di ibridazione in situ, un campione di DNA o RNA è immobilizzato all’interno di preparati cromosomici o cellulari 235
Ibridazione in situ su cromosomi 236Ibridazione in situ su tessuto 236
I saggi di ibridazione possono essere utilizzati per saggiare colonie batteriche contenenti DNA ricombinante 237
7.4 Saggi di ibridazione basati su microarray 238
L’ibridazione su microarray consente di effettuare saggi di ibridazione in parallelo utilizzando migliaia di sonde differenti immobilizzate 238
I microarray basati su oligonucleotidi ad alta densità forniscono strumenti estremamente potenti per l’analisi di campioni complessi di RNA o DNA 239
I microarray a oligonucleotidi di Affymetrix 240I microarray a oligonucleotidi di Illumina 240
L’ibridazione su microarray è utilizzata principalmente per definire profili trascrizionali o analizzare variazioni a carico del DNA 240
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 242
CAPITOLO 8Analisi della struttura e della funzione di geni e genomi
8.1 Le genoteche di DNA 244
Le genoteche di DNA genomico comprendono copie frammentate di tutte le molecole di DNA di una cellula 244
Le genoteche di cDNA comprendono le copie di DNA delle diverse molecole di RNA di una cellula 245
Le genoteche di cDNA, per essere utili, devono essere saggiate in modo appropriato e propagate 246
Come saggiare una genoteca 246L’amplificazione e la propagazione di una genoteca 246
8.2 Il sequenziamento del DNA 247
Il metodo di sequenziamento del DNA con dideossinucleotidi prevede la sintesi enzimatica del DNA utilizzando dei terminatori base-specifici dell’allungamento della catena 248
L’automazione del sequenziamento del DNA con dideossinucleotidi ne ha aumentato l’efficienza 249
Il pirosequenziamento iterativo registra la sequenza del DNA mentre esso viene sintetizzato 250
Il sequenziamento in parallelo su larga scala del DNA permette il sequenziamento simultaneo di un gran numero di frammenti di DNA diversi 251
Il sequenziamento in parallelo su larga scala (MPS) di DNA amplificato 251Il sequenziamento di singole molecole 252
I metodi di cattura del DNA basati sui microarray consentono un risequenziamento efficiente 255
8.3 L’anali della struttura dei genomi e i progetti genomici 256
Per il primo sequenziamento dei genomi complessi servono delle mappe di riferimento 258
L’ordine lineare dei cloni di DNA genomico in un contig (contiguo) corrisponde alle loro posizioni subcromosomiche originali 259
BOX 8.1 LE MAPPE DI RIFERIMENTO SI BASANO SU MARCATORI DI DNA E SU COnTig DI CLONI 259
Il Progetto Genoma Umano è stata un’impresa internazionale e il primo grande progetto biologico 261
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Le prime mappe genetiche umane avevano una risoluzione bassa e furono costruite principalmente con marcatori di DNA anonimi 262
Le mappe fisiche del genoma umano: da mappe di marcatori a mappe di contig di cloni genomici 263
La fase finale del sequenziamento dello Human Genome Project fu una corsa al fotofinish 265
Box 8.2 LE PRINCIPALI TAPPE NELLA MAPPATURA E NEL SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA UMANO 266
Sono stati condotti progetti genomici anche per un certo numero di organismi modello 268
Potenti banche dati genomiche e browser aiutano a immagazzinare e ad analizzare i dati genomici 269
Sono stati progettati vari programmi per predire e annotare i geni all’interno delle sequenze genomiche 270
BOX 8.3 LA RICERCA DI OMOLOGIE DI SEQUENZA 272
Ottenere stime accurate del numero dei geni umani è sorprendentemente difficile 273
BOX 8.4 LA GENE ONTOLOGY E IL CONSORZIO GO 273
8.4 Le analisi di espressione genica di base 274
I principi dei saggi di espressione genica 274
I metodi basati sull’ibridazione molecolare permettono saggi semiquantitativi e a elevata risoluzione dei trascritti di singoli geni 275
I metodi per determinare la dimensione e l’abbondanza dei trascritti basati sull’ibridazione molecolare 276L’ibridazione di tessuti in situ 277
I metodi di PCR quantitativa sono ampiamente usati per i saggi di espressione 277
BOX 8.5 I METODI DI RILEVAMENTO USATI NELLA PCR QUANTITATIVA (REAL TIME PCR, PCR IN TEMPO REALE) 278
Per seguire le proteine espresse da singoli geni si possono utilizzare anticorpi specifici 279
BOX 8.6 LA PRODUZIONE DI ANTICORPI 279
L’espressione delle proteine nelle cellule in coltura è spesso analizzata usando diversi tipi di microscopia a fluorescenza 281
8.5 Analisi in parallelo a elevata processività dell’espressione genica 282
I microarray di DNA e di oligonucleotidi permettono di determinare il profilo trascrizionale rapidamente e globalmente 282
BOX 8.7 L’ANALISI DEI DATI DI ESPRESSIONE DEI MICROARRAY 283
L’approccio moderno allo studio dei profili di espressione genica globale sfrutta sempre più il sequenziamento per quantificare i trascritti 285
L’espressione globale delle proteine è spesso rilevata mediante elettroforesi bidimensionale su gel e spettrometria di massa 286
L’elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide (2D-PAGE) 287La spettrometria di massa 288
BOX 8.8 LA SPETTROMETRIA DI MASSA NELLA PROTEOMICA 289
Le analisi comparative dell’espressione proteica hanno molte applicazioni 290
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 291
CAPITOLO 9Organizzazione del genoma umano
9.1 L’organizzazione generale del genoma umano 295
Il genoma mitocondriale è compatto e denso di informazione genetica 295
La replicazione del DNA mitocondriale 295I geni mitocondriali e la loro trascrizione 296Il codice genetico mitocondriale 297
Il genoma nucleare umano consiste di 24 molecole di DNA cromosomico molto diverse 298
BOX 9.1 LA METILAZIONE DEL DNA NEGLI ANIMALI E LE ISOLE DI CPG NEI VERTEBRATI 300
Il genoma umano contiene almeno 26 000 geni, ma il numero esatto è difficile da determinare 301
I geni umani non sono distribuiti in modo uniforme tra ed entro i cromosomi 301
La duplicazione di segmenti di DNA ha prodotto variazioni nel numero di copie e famiglie geniche 302
I meccanismi di duplicazione genica 302
9.2 I geni che codificano proteine 304
I geni umani che codificano proteine mostrano una grande variabilità per dimensione e organizzazione interna 304
Variazione della dimensione 304Sequenze ripetute all’interno del DNA codificante 304
Proteine diverse possono essere specificate da unità di trascrizione sovrapposte 305
I geni sovrapposti e i geni all’interno di geni 305Geni trascritti in modo divergente oppure cotrascritti da un promotore comune 307
I geni umani che codificano proteine spesso appartengono a famiglie di geni che possono essere raggruppati o dispersi su numerosi cromosomi 308
Classi diverse di famiglie geniche possono essere riconosciute in base alla similarità di sequenza e di struttura dei prodotti proteici 310
Gli eventi di duplicazione genica che danno origine a famiglie multigeniche creano anche pseudogeni e frammenti genici 311
BOX 9.2 LE ORIGINI, LA PREVALENZA E LA FUNZIONALITÀ DEGLI PSEUDOGENI 311
9.3 I geni per RNA 315
BOX 9.3 L’IPOTESI DI UN MONDO A RNA 315BOX 9.4 REVISIONE DEL CONCETTO DI GENE NELL’ERA POST-GENOMICA 316
Oltre 1000 geni umani codificano un rRNA o un tRNA, principalmente all’interno di grandi cluster genici 318
I geni dell’RNA ribosomale 318I geni per l’RNA transfer, o di trasferimento 320
BOX 9.5 LA SPECIFICITÀ DELL’ANTICODONE DEI TRNA CITOPLASMATICI DEGLI EUCARIOTI 321
Famiglie di geni dispersi producono vari piccoli RNA nucleari che facilitano l’espressione genica generale 322
I geni per i piccoli RNA nucleari (snRNA) dello spliceosoma 322I geni per i piccoli RNA nucleari che non appartengono allo spliceosoma 322
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I geni per i piccoli RNA nucleolari (snoRNA) 323I geni per gli snoRNA dei corpi di Cajal 324
Circa 1000 microRNA umani diversi regolano serie complesse di geni bersaglio mediante appaiamento ai trascritti 324
BOX 9.6 L’INTERFERENZA DELL’RNA COME MECCANISMO DI DIFESA CELLULARE 325
Molte migliaia di diversi piRNA e siRNA endogeni sopprimono la trasposizione e regolano l’espressione genica 326
L’RNA che interagisce con la proteina piwi 327I siRNA endogeni 328
Oltre 3000 geni umani sintetizzano una gran varietà di RNA di regolazione di dimensioni medio-grandi 329
9.4 DNA altamente ripetuto: eterocromatina e ripetizioni di trasposoni 331
L’eterocromatina costitutiva è in larga misura definita da lunghe serie di ripetizioni in tandem di DNA a elevato numero di copie 331
Le ripetizioni derivate dai trasposoni costituiscono oltre il 40% del genoma umano e si sono formate per la maggior parte attraverso intermedi a RNA 333
I trasposoni LTR umani 334I fossili dei trasposoni a DNA umani 334
Alcuni elementi LINE-1 umani sono trasposoni attivi e consentono la trasposizione di altri tipi di sequenze di DNA 334
Le ripetizioni Alu sono gli elementi più numerosi del DNA umano e si originano come copie dell’RNA 7SL 335
• Conclusioni 336
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 337
CAPITOLO 10Organismi modello, genomica comparata ed evoluzione
10.1 Organismi modello 340
Gli organismi modello unicellulari servono a comprendere la biologia cellulare di base e i microorganismi patogeni 340
BOX 10.1 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI ORGANISMI MODELLO UNICELLULARI 342
Alcuni invertebrati modello consentono un’analisi genetica su vasta scala in modo economico e talvolta servono da sistemi modello per le malattie 343
BOX 10.2 CARATTERISTICHE DEI DUE PRINCIPALI MODELLI ANIMALI DEGLI INVERTEBRATI 344
Pesci, anfibi e uccelli servono egregiamente come organismi modello per lo studio dello sviluppo dei vertebrati 345
BOX 10.3 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI MODELLI DEI VERTEBRATI 346
I modelli nei mammiferi presentano svantaggi a causa di limitazioni pratiche e di considerazioni etiche 347
L’uomo rappresenta l’organismo modello finale e presto probabilmente lo sarà 348
10.2 Genomica comparata 349
BOX 10.4 I PRINCIPALI MECCANISMI CHE CONTROLLANO LA VARIAZIONE DELLE FREQUENZE ALLELICHE 350
I vincoli evolutivi e il mantenimento della funzione da parte della selezione purificante 351
Sequenze a evoluzione rapida e selezione positiva 351
BOX 10.5 L’EVOLUZIONE DELLE SEQUENZE CODIFICANTI SAGGIATA MEDIANTE IL RAPPORTO Ka/Ks 352
Esistono molti software per l’allineamento automatico delle sequenze 352
La genomica comparata aiuta a confermare geni predetti e a identificare nuovi geni 353
La genomica comparata rivela che nei mammiferi è presente una quantità sorprendentemente elevata di DNA funzionale non codificante 355
La genomica comparata è stata particolarmente importante per identificare sequenze regolatrici 355
10.3 L’evoluzione dei geni e dei genomi 357
L’aumento della complessità dei geni è dovuto alla duplicazione e al rimescolamento degli esoni 358
La duplicazione degli esoni 358Il rimescolamento degli esoni 359
La duplicazione genica può permettere di aumentare il dosaggio genico, ma la sua importanza principale sta nel consentire una complessità funzionale 360
La superfamiglia delle globine dimostra la divergenza nelle funzioni e nella regolazione dopo una duplicazione genica 361
Nei vertebrati, dopo la divisione dai tunicati, sono avvenuti due o tre eventi importanti di duplicazione del genoma 363
Durante l’evoluzione del genoma dei mammiferi sono avvenuti importanti riarrangiamenti cromosomici 364
Quando i cromosomi sessuali sono eteromorfi, quello più piccolo è limitato a uno dei due sessi, possiede pochi geni e non presenta quasi ricombinazione 366
Le regioni pseudoautosomiche si sono evolute molto rapidamente 367
I cromosomi del sesso nell’uomo si sono evoluti dopo la comparsa di un locus per la determinazione del sesso su uno degli autosomi, facendolo divergere dal cromosoma omologo corrispondente 368
L’elevato numero di geni del cromosoma Y espressi nei testicoli è mantenuto principalmente dalla conversione genica intracromosomica 370
L’inattivazione del cromosoma X si è sviluppata come risposta alla perdita di geni dal cromosoma Y 372
10.4 La posizione dell’uomo nell’albero della vita 372
BOX 10.6 GLOSSARIO DEI GRUPPI FILOGENETICI DEI METAZOI E DEI TERMINI USATI PIÙ COMUNI 373
La filogenetica molecolare si basa sull’allineamento delle sequenze per ricostruire gli alberi evolutivi 374
Esistono molti modi per costruire gli alberi evolutivi e la loro affidabilità può essere verificata con metodi statistici 374
Il paradosso del valore G: la complessità di un organismo non ha una relazione semplice con
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il numero dei geni codificanti proteine che possiede 377
La notevole espansione di famiglie geniche in alcune linee evolutive è spesso dovuta a geni “ambientali” 378
Nei metazoi complessi le sequenze di tipo regolativo e altre sequenze non codificanti del DNA si sono espanse in modo significativo 380
Mutazioni nelle sequenze regolatrici in cis portano a variazioni dell’espressione genica che sono alla base delle differenze morfologiche 380
Gli esoni e le sequenze regolatrici in cis tipici di una linea evolutiva si possono originare a partire da elementi trasponibili 382
L’espansione delle famiglie geniche e la perdita o l’inattivazione di geni sono avvenuti di recente nella linea evolutiva dell’uomo, ma i geni uomo-specifici sono molto rari 384
La genomica comparata e gli studi sul fenotipo cercano di identificare sequenze di DNA importanti per l’uomo 386
• Conclusioni 389
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 390
CAPITOLO 11Espressione genica nell’uomo
11.1 I promotori e il trascitto primario 395
La trascrizione a opera della RNA polimerasi II è un processo a tappe successive 395
Definizione del promotore minimo (core promoter) e del sito d’inizio della trascrizione 396
BOX 11.1 TECNICHE PER IDENTIFICARE IL SITO D’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE 396
Assemblaggio dell’apparato di base della trascrizione 397Allungamento del trascritto 398Terminazione della trascrizione 398
Molte altre proteine modulano l’attività dell’apparato di base della trascrizione 398
Proteine di legame al DNA sequenza-specifiche possono legarsi vicino al promotore o in punti più lontani 399
Co-attivatori e co-repressori influenzano i promotori senza legarsi al DNA 401
11.2 Conformazione della cromatina: metilazione del DNA e codice istonico 402
BOX 11.2 NOMENCLATURA PER LE MODIFICAZIONI DEGLI ISTONI 402
Le modificazioni degli istoni nei nucleosomi possono costituire un codice istonico 403
Cromatina aperta e chiusa 403
BOX 11.3 TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CONFORMAZIONE DELLA CROMATINA 404
Complessi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti 406
La metilazione del DNA è importante nel controllo dell’espressione genica 408
BOX 11.4 MODIFICAZIONE DEL DNA CON BISOLFITO 409
Proteine che si legano a metil-CpG 409La metilazione del DNA durante lo sviluppo 410
Gli stati della cromatina sono mantenuti da parecchi meccanismi che interagiscono tra loro 411
Il ruolo della proteina HP1 412Un ruolo per piccole molecole di RNA 412Un ruolo per la localizzazione nucleare 413Non una sola causa prima? 413
Il progetto ENCODE cerca di dare una visione globale della trascrizione e del suo controllo 413
La trascrizione è di gran lunga più estesa di quanto immaginato in precedenza 415La previsione dei siti d’inizio della trascrizione 415
11.3 Memoria epigenetica e imprinting 416
La memoria epigenetica dipende dalla metilazione del DNA e forse dai gruppi di proteine polycomb e trithorax 416
L’inattivazione dell’X: un cambiamento epigenetico trasmissibile da una cellula alla cellula figlia, ma non da un genitore al figlio 417
L’inizio dell’inattivazione dell’X: il ruolo di XIST 418La fuga dall’inattivazione dell’X 419
A livello dei loci imprinted, l’espressione dipende dall’origine parentale 419
Le sindromi di Prader-Willi e di Angelman sono classici esempi di imprinting nell’uomo 420
A proposito dell’imprinting sorgono due domande: come avviene e perché avviene? 422
Le paramutazioni sono un tipo di cambiamento epigenetico transgenerazionale 423
Di alcuni geni è espresso solo un allele, ma indipendentemente dall’origine parentale 423
11.4 Un gene-più di una proteina 424
Molti geni hanno più di un promotore 425
Mediante uno splicing alternativo un trascritto primario può codificare isoforme multiple di una proteina 426
Un editing dell’RNA può cambiare la sequenza dell’mRNA dopo la trascrizione 427
11.5 Controllo dell’espressione genica a livello della traduzione 428
Ulteriori controlli regolano quando e dove un mRNA viene tradotto 429
La scoperta di molti piccoli RNA che regolano l’espressione genica ha determinato un cambiamento paradigmatico nella biologia cellulare 429
I microRNA come regolatori della traduzione 430I microRNA e i tumori 431Alcuni problemi irrisolti 431
• Conclusioni 432
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 433
CAPITOLO 12Studiare la funzione genica nell’era post-genomica
12.1 Lo studio della funzione genica: una panoramica 436
La funzione genica si può studiare a molti livelli diversi 437Studi di espressione genica 437
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Inattivazione genica e inibizione dell’espressione genica 437Definire i profili molecolari dei prodotti genici 438
Le analisi a livello genomico hanno il fine di integrare le analisi della funzione genica 438
12.2 Approcci bioinformatici per studiare la funzione dei geni 440
Le ricerche di omologia di sequenza possono fornire indizi preziosi sulla funzione dei geni 440
La ricerca in banche dati spesso è condotta con un modello di una sequenza evolutivamente conservata 441
BOX 12.1 LA BIOINFORMATICA PUò SVOLGERE UN RUOLO CRUCIALE NEL CHIARIRE LA FUNZIONE DEI GENI: L’ESEMPIO DEL GENE niPbL 442
Il confronto con domini e motivi proteici ben documentati può fornire indizi aggiuntivi sulla funzione del gene 442
12.3 Lo studio della funzione genica mediante inattivazione o modificazione selettiva 444
Indizi sul funzionamento di un gene si possono inferire da diversi tipi di manipolazioni genetiche 444
L’interferenza dell’RNA è il metodo principale per valutare la funzione di un gene nelle cellule di mammifero in coltura 446
Analisi globali di siRNA forniscono un approccio a livello di sistemi per studiare la funzione genica nelle cellule 448
L’inattivazione dei geni nella linea germinale fornisce le informazioni più dettagliate sulla funzione genica 449
12.4 Proteomica, interazioni proteina-proteina e interazioni proteine-DNA 451
La proteomica si occupa principalmente di identificare e caratterizzare le proteine a livello biochimico e funzionale 451
Gli studi su larga scala delle interazioni proteina-proteina cercano di definire reti proteiche funzionali 452
Il saggio del doppio ibrido di lievito si basa sulla ricostruzione di un fattore trascrizionale funzionante 452
Per selezionare i partner proteici di una proteina di interesse è ampiamente usata la spettrometria di massa con purificazione per affinità 454
Le interazioni proteina-proteina identificate sono spesso validate mediante co-immunoprecipitazione o saggi di pull-down 456
L’interattoma proteico apre un passaggio importante verso la biologia dei sistemi 456
Definire le interazioni tra acidi nucleici e proteine è fondamentale per capire la funzione dei geni 458
Mappare le interazioni proteina-DNA in vitro 459La mappatura delle interazioni tra proteine e DNA in vivo 460
• Conclusioni 461
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 462
CAPITOLO 13La variabilità genetica umana e le sue conseguenze’
13.1 Tipologia delle variazioni presenti tra i genomi umani 464
I polimorfismi di un singolo nucleotide (single nucleotide polymorphism, SNP) sono le variazioni genetiche numericamente più abbondanti 464
BOX 13.1 POLIMORFISMO E MUTAZIONE: TERMINI CON DIVERSI SIGNIFICATI 465BOX 13.2 NOMENCLATURA USATA PER DESCRIVERE VARIAZIONI DEL DNA E DELLE PROTEINE 465
Sia le sequenze intersperse, sia quelle ripetute in tandem possono mostrare polimorfismi 467
I polimorfismi dovuti a sequenze ripetute in tandem: il cavallo di battaglia per studi familiari e forensi 467
I cambiamenti su grande scala del numero di copie sono sorprendentemente frequenti nel genoma umano 468
13.2 I danni al DNA e i meccanismi di riparazione 471
Il DNA contenuto nelle cellule richiede una cura costante per riparare i danni e correggere gli errori 471
Gli effetti dei danni al DNA 473
La replicazione del DNA, la trascrizione, la ricombinazione e la riparazione del DNA utilizzano complessi multiproteici con componenti condivise 474
BOX 13.3 MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEI DANNI AL DNA NELLE CELLULE UMANE 475
I difetti nella riparazione del DNA sono la causa di molte malattie umane 476
I gruppi di complementazione 476
13.3 Varianti patogeniche del DNA 477
Capire se un cambiamento della sequenza del DNA è patogenico può essere difficile 477
Cambiamenti di un singolo nucleotide e altre piccole modificazioni sono una tipologia comune di cambiamenti patogenici 478
Mutazioni missenso 478Mutazioni nonsenso 480Cambiamenti che colpiscono il processamento del trascritto primario 481Mutazioni frameshift 482Cambiamenti che modificano il livello di espressione genica 483Cambiamenti sinonimi (silenti) patogenici 485
Le variazioni nelle corte sequenze ripetute in tandem a volte possono essere patogeniche 485
Mutazioni dinamiche: una classe speciale di varianti microsatellitari patogeniche 486BOX 13.4 MALATTIE CAUSATE DALL’ANORMALE AGGREGAZIONE DI PROTEINE 488
Le variazioni che alterano il dosaggio di uno o più geni possono essere patogeniche 489
13.4 Patologia molecolare: comprendere l’effetto delle variazioni 492
Una delle più grandi distinzioni della patologia molecolare è quella tra cambiamenti che determinano una perdita di funzione (loss-of-function) o un’acquisizione di funzione (gain-of-function) 493
L’eterogeneità allelica è una caratteristica frequente nei fenotipi causati da perdita di funzione 493
Mutazioni con perdita di funzione producono fenotipi dominanti se vi è aploinsufficienza 494
Quando il prodotto di un gene mutato interferisce con la funzione genica del prodotto normale si osservano effetti di dominanza negativa 496
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Le mutazioni con acquisizione di funzione spesso influenzano il modo con cui un gene o il suo prodotto reagiscono ai segnali di regolazione 498
Malattie provocate dall’acquisizione di funzione di un recettore ormonale associato a una proteina G 499
Non sempre l’omogeneità allelica è dovuta a una acquisizione di funzione 499
Perdite di funzione e acquisizioni di funzione nello stesso gene producono fenotipi differenti 499
13.5 Alla ricerca delle correlazioni genotipo-fenotipo 501
L’effetto fenotipico delle mutazioni con perdita di funzione dipende dal livello residuo della funzione genica 502
La correlazione genotipo-fenotipo è particolarmente labile nel caso di malattie dovute a mutazioni mitocondriali 503
La variabilità entro famiglia è dovuta alla presenza di geni modificatori o agli effetti del caso 504
• Conclusioni 505
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 506
CAPITOLO 14La mappatura genetica di caratteri mendeliani
14.1 Il ruolo della ricombinazione nella mappatura genetica 510
I ricombinanti vengono identificati mediante l’analisi di coppie di marcatori nei genitori e nella loro progenie 510
BOX 14.1 RICOMBINAZIONE E CONVERSIONE GENICA 511
La frequenza di ricombinazione è una misura della distanza genetica tra due loci 512
Per quanto grande possa essere la distanza tra due loci, le frequenze di ricombinazione non sono mai maggiori di 0,5 513
Le funzioni di mappatura definiscono la relazione che esiste tra frequenza di ricombinazione e distanza genetica 513
Il conteggio dei chiasmi fornisce una stima della lunghezza totale della mappa 515
Gli eventi di ricombinazione non sono distribuiti casualmente lungo i cromosomi: le distanze genetiche lungo la mappa non corrispondono alle distanze fisiche 515
14.2 Mappatura di un locus malattia 518
La mappatura delle malattie umane è basata sui marcatori molecolari 518
L’analisi di linkage richiede meiosi informative 519
I marcatori adeguati devono essere distribuiti lungo tutto il genoma 520
Nelle analisi di linkage generalmente si usano microsatelliti e SNP marcati con fluorocromi 520
14.3 La mappatura a due punti 521
Il conteggio dei ricombinanti nei pedigree non è sempre semplice 521
Il modo migliore di analizzare alberi genealogici complessi per identificare la concatenazione
tra caratteri mendeliani è l’analisi computerizzata del lod score 522
Box 14.2 COME SI CALCOLA IL LOD SCORE 523
I valori di lod score di +3 e –2 fissano i criteri per determinare l’esistenza di linkage o per escluderlo (per un singolo test) 524
Box 14.3 calcolo Bayesiano del valore soglia del linkage 524
Nelle analisi dell’intero genoma è necessario usare una soglia di significatività adeguata 526
14.4 La mappatura a più punti 526
Le famiglie CEPH sono state usate per la costruzione di mappe di riferimento 527
La mappatura a più punti consente di individuare un locus malattia all’interno di una mappa di riferimento di marcatori 528
14.5 La mappatura fine che utilizza alberi genealogici allargati e aplotipi ancestrali 529
La mappatura per autozigosi consente di mappare efficientemente malattie recessive in famiglie allargate 529
L’identificazione di tratti cromosomici ancestrali condivisi permette una mappatura genetica ad alta risoluzione 530
14.6 Difficoltà legate all’analisi standard del lod score 533
Errori di genotipizzazione e diagnosi sbagliate possono generare falsi ricombinanti 533
Difficoltà di calcolo riducono il numero dei pedigree che possono essere analizzati 534
L’eterogeneità del locus costituisce sempre un’insidia per la mappatura genica nell’uomo 535
La mappatura basata sugli alberi genealogici ha una risoluzione limitata 535
I caratteri con eredità non mendeliana non possono essere mappati con i metodi descritti in questo capitolo 535
• Conclusioni 536
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 538
CAPITOLO 15Mappatura di geni che conferiscono suscettibilità a malattie complesse
15.1 Studi familiari di malattie complesse 540
Il rapporto di rischio (l) è una misura della familiarità 541
La condivisione dello stesso ambiente familiare è una spiegazione alternativa alla familiarità 541
Gli studi sui gemelli hanno molti limiti 542Gemelli monozigotici separati 543
Gli studi sulle adozioni sono il metodo migliore per discriminare tra fattori genetici e ambientali 543
15.2 Analisi della segregazione 544
L’analisi di segregazioni complesse consente di stimare la più probabile combinazione di fattori genetici utilizzando dati provenienti da più famiglie 544
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15.3 L’analisi di linkage dei caratteri complessi 546
L’analisi standard del lod score solitamente non è indicata per lo studio di caratteri non mendeliani 546
Famiglie quasi mendeliane 547
I metodi non parametrici di analisi non richiedono un modello genetico 547
Identità per discendenza versus identità per stato 547Analisi di fratelli affetti 548
L’analisi di linkage di caratteri complessi ha alcuni punti deboli 549
Le soglie di significatività 549Colpi fortunati 550Un esempio: l’analisi di linkage della schizofrenia 550
15.4 Studi di associazione e linkage disequilibrium 551
Le associazioni possono avere molte cause 553
L’associazione è molto diversa dal linkage, ad eccezione di quando la famiglia e la popolazione coincidono 554
Gli studi di associazione dipendono dal linkage disequilibrium 554La dimensione dei tratti cromosomici ancestrali condivisi 555Lo studio del linkage disequilibrium 556Box 15.1 MISURE DEL LinKage disequiLibrium 557
Il progetto HapMap è lo studio più completo sul linkage disequilibrium nel genoma umano 557
Box 15.2 RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEL LinKage disequiLibrium 558
L’impiego di tag-SNP (SNP etichetta) 560
15.5 Gli studi di associazione in pratica 560
Gli studi iniziali avevano alcuni punti deboli sistematici 561
I test del disequilibrio di trasmissione evitano i problemi legati a controlli adeguati 562
Box 15.3 IL TEST DEL DISEQUILIBRIO DI TRASMISSIONE 562
Gli studi di associazione possono essere più potenti di quelli di linkage nell’identificare alleli deboli di suscettibilità 563
Negli studi di associazione i disegni sperimentali caso-controllo sono una valida alternativa a quelli TDT 563
Box 15.4 DIMENSIONE DEL CAMPIONE NECESSARIA PER IDENTIFICARE UN LOCUS DI SUSCETTIBILITÀ IN UNA SCANSIONE DELL’INTERO GENOMA 564
Particolari popolazioni possono offrire vantaggi negli studi di associazione 565
Una nuova generazione di studi di associazione sull’intero genoma (GWA) ha finalmente rotto l’impasse esistente nella ricerca sulle malattie complesse 565
La dimensione del rischio relativo 56715.6 I limiti degli studi di associazione 568
L’ipotesi “malattia comune-variante comune” prevede che i fattori di suscettibilità abbiano origini antiche 568
L’ipotesi “mutazione-selezione” suggerisce che la maggior parte della suscettibilità a malattie sia dovuta a un’eterogenea serie di mutazioni recenti 569
Un quadro completo della suscettibilità genetica richiederà il contributo sia dell’ipotesi “malattia comune -variante comune” sia dell’ipotesi “mutazione-selezione” 571
• Conclusioni 572
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 573
CAPITOLO 16L’identificazione dei geni e dei fattori di suscettibilità alla base delle malattie umane
16.1 Il clonaggio posizionale 577
Il clonaggio posizionale identifica un gene-malattia sulla base della sua posizione cromosomica approssimativa 578
Il primo passaggio nel clonaggio posizionale consiste nel definire la regione candidata nel modo più preciso possibile 578
Il secondo passaggio consiste nello stabilire una lista di geni nella regione candidata 579
Il terzo passaggio consiste nello stabilire un ordine di priorità fra i geni candidati, prima di ricercarne le eventuali mutazioni 580
Espressione appropriata 580Funzione appropriata 581Omologie e relazioni funzionali 581
Il modello murino ha un ruolo speciale nell’identificazione di geni-malattia umani 582
BOX 16.1 MAPPATURA DEI GENI MURINI 582
16.2 L’importanza dei pazienti con anomalie cromosomiche 583
Pazienti con riarrangiamenti cromosomici bilanciati e un fenotipo non spiegabile costituiscono un indizio prezioso per la ricerca 583
BOX 16.2 INDIZI DELLA PRESENZA DI ANOMALIE CROMOSOMICHE 584
Le traslocazioni del cromosoma X con un autosoma costituiscono un caso particolare 585
Riarrangiamenti che al microscopio sembrano bilanciati non sempre lo sono a livello molecolare 586
L’ibridazione genomica comparativa permette la ricerca sistematica di microdelezioni e microduplicazioni 586
Gli effetti a distanza sono il vero problema nell’identificazione dei geni-malattia 588
16.3 Strategie indipendenti dalla posizione per identificare geni-malattia 589
Un gene-malattia può essere identificato se si conosce il suo prodotto proteico 589
Un gene-malattia può essere identificato attraverso la sua funzione o le interazioni del suo prodotto 590
Un gene-malattia può essere identificato attraverso un modello animale, anche in assenza di informazioni posizionali 591
Un gene-malattia può essere identificato attraverso particolari caratteristiche della sua sequenza di DNA 592
16.4 Validazione dei geni candidati identificati con approccio posizionale 593
Per le malattie a trasmissione mendeliana, un gene candidato viene normalmente passato al vaglio alla ricerca di mutazioni in un pannello di pazienti non imparentati 593
Cambiamenti epigenetici possono causare una malattia senza alterare la sequenza del DNA 594
Il gene alla base della malattia può non essere così ovvio 595
L’eterogeneità del locus è una regola più che un’eccezione 596
Spesso sono necessari studi ulteriori per convalidare
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l’identificazione del gene-malattia 597
16.5 Identificazione di varianti causali attraverso studi di associazione 597
L’identificazione della varianti causali non è semplice 598
Le varianti causali vengono identificate da un approccio combinato di studi statistici e funzionali 599
L’analisi funzionale di SNP all’interno di sequenze senza funzione apparente è particolarmente difficile 600
Calpaina 10 e diabete di tipo II 600La regione cromosomica 8q24 e la suscettibilità al tumore della prostata 601
16.6 Otto esempi di identificazione di geni-malattia 602
Caso-studio 1: la distrofia muscolare di Duchenne 602
Caso-studio 2: la fibrosi cistica 604
Caso-studio 3: la sindrome brachio-oto-renale 605
Caso-studio 4: la deficienza multipla di solfatasi 606
Caso-studio 5: la persistenza della lattasi intestinale 607
Caso-studio 6: la sindrome CHARGE 609
Caso-studio 7: il tumore al seno 610
Caso-studio 8: il morbo di Crohn 612
16.7 L’identificazione dei geni-malattia ha funzionato? 616
La maggior parte delle varianti che causano le malattie a trasmissione mendeliana è stata identificata 616
Gli studi di associazione su scala genomica hanno avuto molto successo, ma resta difficile identificare le varianti che hanno un reale ruolo funzionale 617
Sono stati raggiunti risultati clinicamente utili solo per poche malattie complesse 617
La malattia di Alzheimer 618Degenerazione maculare legata all’età (ARMD, age related macular degeneration 618Eczema (dermatite atopica 619
Il problema dell’ereditabilità nascosta 619
• Conclusioni 620
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 621
CAPITOLO 17Genetica del cancro
17.1 L’evoluzione del cancro 625
BOX 17.1 DUE MODALITÀ PER RENDERE PIÙ PROBABILE UNA SERIE DI MUTAZIONI SUCCESSIVE 626
17.2 Gli oncogeni 627
Gli oncogeni agiscono nelle vie di segnalazione della crescita 628
L’attivazione di un oncogene implica un acquisto di funzione 629Attivazione mediante amplificazione 629Attivazione da mutazioni puntiformi 630Attivazione mediante traslocazioni che creano un nuovo gene chimerico 631Attivazione mediante traslocazioni in regioni cromatiniche trascrizionalmente attive 632
L’attivazione di un oncogene risulta tumorigenica solamente in circostanze particolari 633
17.3 I geni oncorepressori 633
Lo studio del retinoblastoma ha fornito un paradigma per la comprensione dei geni oncosoppressori 634
Alcuni geni oncosoppressori mostrano variazioni rispetto al paradigma dei due eventi 635
La perdita di eterozigosi è stata ampiamente utilizzata come marcatore per localizzare i geni oncosoppressori 637
I geni oncosoppressori sono spesso silenziati epigeneticamente mediante metilazione 638
17.4 La regolazione difettosa del ciclo cellulare nel cancro 638
Tre geni oncosoppressori principali controllano gli eventi cellulari nella fase G1 640
pRb: un regolatore cruciale della progressione attraverso la fase G1 640p53: il guardiano del genoma 641CDKN2A: un singolo gene codificante due proteine regolatrici 641
17.5 L’instabilità del genoma 642
Per indagare le alterazioni cromosomiche nelle cellule tumorali si utilizzano diversi approcci sperimentali 643
Tre meccanismi principali sono responsabili dell’instabilità cromosomica e delle anomalie del cariotipo 643
I telomeri sono essenziali per la stabilità cromosomica 644
I danni al DNA inviano un segnale a p53, che avvia una risposta protettiva 645
ATM: il rilevatore iniziale del danno 645La nibrina e il complesso MRN 646CHEK2: una chinasi mediatrice 646Il ruolo di BRCA1/2 646p53 alla riscossa 647
I difetti nei meccanismi di riparazione sono alla base di numerose malattie genetiche associate al cancro 647
L’instabilità dei microsatelliti è stata scoperta in seguito alle ricerche sui tumori familiari del colon 648
17.6 Una visione genomica del cancro 650
Le analisi citogenetiche e l’ibridazione su microarray consentono una visione su scala genomica delle alterazioni strutturali 650
Le nuove tecniche di sequenziamento permettono di rilevare cambiamenti della sequenza nucleotidica su scala genomica 650
Ulteriori tecniche forniscono una visione su scala genomica delle alterazioni epigenetiche nei tumori 651
L’indagine dell’espressione genica su scala genomica viene utilizzata per generare modelli di espressione 652
17.7 Lo studio dell’evoluzione a più stadi del cancro 654
La microevoluzione del tumore al colon-retto è particolarmente ben documentata 654
17.8 L’integrazione dei dati: il cancro come un problema di biologia cellulare 656
La tumorigenesi dovrebbe essere concepita in termini di pathway, non di singoli geni 657
I tumori maligni devono acquisire la capacità di stimolare l’angiogenesi e la metastatizzazione 658
La biologia dei sistemi consentirà di arrivare a una visione unificata dello sviluppo tumorale 659
• Conclusioni 660
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LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 661
CAPITOLO 18Test genetici
18.1 Che cosa analizzare e perché 665
Per l’analisi genetica possono essere usati molti tipi diversi di campioni 665
RNA o DNA? 666
Saggi funzionali 667
18.2 Scansione di un gene alla ricerca di mutazioni 667
La scansione di un gene alla ricerca di mutazioni normalmente viene fatta mediante sequenziamento 667
Per analizzare rapidamente un gene alla ricerca di possibili mutazioni sono state usate diverse tecniche 668
Metodi basati sull’identificazione di mismatch o eteroduplex 669Metodi basati sull’analisi della conformazione dei singoli filamenti 670Metodi basati sulla traduzione: il test delle proteine tronche 671
I microarray consentono con una sola operazione la scansione di un gene alla ricerca praticamente di qualsiasi mutazione 671
La metilazione del DNA può essere messa in evidenza mediante molti metodi 672
Le varianti non classificate rappresentano un problema rilevante 673
18.3 Ricerca di uno specifico cambiamento di sequenza 674
Ricerca della presenza o assenza di un sito di restrizione 674Ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici 676Amplificazione allele-specifica mediante PCR 676Saggio di ligazione degli oligonucleotidi 677Minisequenziamento mediante primer extension 677Pirosequenziamento 677Genotipizzazione mediante spettrometria di massa 679Genotipizzazione massiva di SNP in parallelo basata su microarray 679
18.4 Alcuni test speciali 681
L’analisi di delezioni e duplicazioni di un intero esone richiede delle tecniche speciali 681
Il test di amplificazione multiplex con sonde ligazione-dipendente (MLPA) 682Delezioni del gene della distrofina nei maschi 683Non maternità apparente in una famiglia in cui segrega una delezione 684
Nei test prenatali per aneuploidie cromosomiche viene usata una PCR quantitativa 684
Alcune malattie da espansione di triplette richiedono dei test speciali 685
Per alcune malattie l’analisi delle mutazioni deve tener conto della variabilità geografica 686
Il test per malattie con un’elevata eterogeneità di locus rappresenta una sfida 688
18.5 Gene tracking 689
Il gene tracking implica tre passaggi logici 689BOX 18.1 LA LOGICA DEL gene TraCKing 690
La ricombinazione pone un serio limite alla precisione del gene tracking 691
Il calcolo del rischio nel gene tracking 691BOX 18.2 L’USO DEL TEOREMA DI BAYES PER COMBINARE LE PROBABILITÀ 692
I problemi particolari relativi alla distrofia muscolare di Duchenne 693
18.6 Determinazione del profilo di DNA (DNA profiling) 693
Per il profiling è stata usata una grande varietà di differenti polimorfismi del DNA 694
Uso di sonde minisatelliti per il fingerprinting del DNA 694L’uso di marcatori microsatelliti per il DNA profiling 695Polimorfismi del cromosoma Y e mitocondriali 696
Il DNA profiling è utilizzato per escludere o stabilire una paternità 696
Il DNA profiling può essere utilizzato per identificare l’origine di campioni clinici 696
Il DNA profiling può essere usato per determinare il tipo di gemellarità 697
Il DNA profiling ha rivoluzionato le indagini forensi ma solleva problemi relativi alle libertà civili 697
Problemi tecnici 697Problemi giudiziari 698BOX 18.3 L’ERRORE ACCUSATORIO 699
Problemi etici e politici 700
Conclusioni 701
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 703
CAPITOLO 19Farmacogenetica, medicina personalizzata e screening delle popolazioni
19.1 Valutazione dei test clinici 706
BOX 19.1 LO SCHEMA ACCE PER LA VALUTAZIONE DEI TEST 706
La validità analitica di un test è misura della sua accuratezza 707BOX 19.2 MISURA DELLA VALIDITÀ ANALITICA DI UN TEST 707
La validità clinica di un test è misurata dalla bontà della previsione riguardante una condizione clinica 707
I test devono essere valutati anche per l’utilità clinica e l’accettabilità sotto l’aspetto etico 708
BOX 19.3 MISURE DEL RISCHIO RELATIVO 709
19.2 Farmacogenetica e farmacogenomica 710
Molte differenze a livello genetico hanno effetto sul metabolismo dei farmaci 711
I citocromi P450 sono responsabili di gran parte del metabolismo di Fase 1 dei farmaci 711
CYP2D6 712Altri enzimi P450 713
Un’altra variante di un enzima di Fase 1 causa problemi in chirurgia 714
Le reazioni di coniugazione della Fase 2 producono derivati
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idrosolubili dei farmaci, che vengono escreti 714Acetilatori lenti e veloci 714La glucuronosiltransferasi UGT1A1 715Le glutatione-S-transferasi GSTM1 e GSTT1 715Tiopurina metiltransferasi 716
La variabilità genetica del bersaglio può avere effetto sulla farmacodinamica 716
Variabilità dei recettori beta-adrenergici 716Variabilità dell’enzima convertitore dell’angiotensina 716Variabilità del recettore HT2RA della serotonina 717Ipertermia maligna e il recettore per la rianodina 718
19.3 Medicina personalizzata: prescrivere il farmaco migliore 718
La difficoltà di mettere in pratica la teoria senza una genotipizzazione del paziente 718
Gli effetti dei farmaci sono spesso poligenici 718Warfarina 719
Le industrie farmaceutiche non hanno finora avuto grossi incentivi per promuovere una medicina personalizzata 720
Stadi nello sviluppo di un farmaco 720
Alcuni farmaci sono progettati o venduti su licenza per il trattamento di pazienti con genotipi specifici 721
Il trastuzumab per il tumore alla mammella con amplificazione di HER2 722Il gefitinib per il tumore al polmone e altri tumori in presenza di mutazioni EGFR 722
Il profilo di espressione dei tumori può portare a un trattamento personalizzato 723
Un approccio alternativo: la medicina depersonalizzata e la polipillola 724
19.4 La medicina personalizzata: studi sulla suscettibilità a malattie complesse 725
I ricercatori riescono finalmente a identificare i fattori genetici di suscettibilità 725
I fattori individuali sono quasi sempre poco rilevanti 726
Anche se un test singolo non fornisce una previsione accurata, una batteria di test potrebbe riuscirci 727
Rimane molto da capire circa la validità clinica dei test di suscettibilità 729
Il rischio per il diabete di tipo 2: lo studio Framingham e uno studio sugli Scandinavi 729Rischio di tumore alla mammella: lo studio del gruppo Pharoah 729Il rischio di tumore alla prostata: lo studio del gruppo di Zheng 731Le prove di un’utilità clinica dei test per la suscettibilità mancano quasi completamente 732
19.5 Lo screening di popolazione 733
I test di screening non sono test diagnostici 734
Lo screening prenatale per la sindrome di Down stabilisce una soglia arbitraria per il test diagnostico 734
I test di screening devono rispondere a determinati criteri per essere accettati 735
Che cosa si vuole ottenere con uno screening? 736Sensibilità e specificità 736Scelta dei soggetti per lo screening 738
Una linea guida etica per lo screening 738Alcune persone temono che i programmi
di screening prenatale possano portare all’ostracismo delle persone affette 739Alcune persone temono che permettere alle persone con malattie genetiche di condurre una vita normale avrà conseguenze negative sulle generazioni successive 739
19.5 Il nuovo paradigma: prevedere e prevenire? 740
Conclusioni 742
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 743
CAPITOLO 20Manipolazione genica di animali per lo studio di modelli di malattia e di funzione genica
20.1 Una panoramica sugli organismi modello 746
Una vasta gamma di specie viene usata come animali modello 746
La maggior parte degli animali modello è generata con la manipolazione genetica 747
Gli animali modello permettono di studiare diversi fenotipi 748
20.2 Generazione di animali transgenici 749
Gli animali transgenici possiedono il DNA esogeno nella linea germinale 750
La microiniezione nel pronucleo è uno dei metodi più usati per generare animali transgenici 750
I transgeni possono essere inseriti nella linea germinale anche attraverso le cellule germinali stesse o utilizzando le cellule staminali embrionali 751
Trasferimento genico in gameti e in cellule precursori delle cellule germinali 752Trasferimento genico in cellule embrionali pluripotenti dell’embrione precoce o in cellule staminali coltivate 752Trasferimento genico in cellule somatiche (clonazione animale) 753
Il trasferimento nucleare è stato utilizzato per produrre animali domestici geneticamente modificati 753
Promotori esogeni possono fornire un modo comodo per regolare l’espressione dei transgeni 754
Espressione del transgene regolata dal sistema inducibile della tetraciclina 754Espressione del transgene regolata dal sistema inducibile da tamoxifene 755
L’espressione del transgene può essere influenzata dalla posizione e dalla struttura del locus in cui è inserito 756
20.3 Modificazioni specifiche del genoma e inattivazione genica in vivo 756
L’isolamento delle linee cellulari pluripotenti ES: una pietra miliare nella genetica dei mammiferi 757
Il gene targeting permette la produzione di animali con una specifica mutazione in tutte le cellule 757
Differenti approcci di gene targeting generano alleli null o con sottili variazioni funzionali 759
Gene knock-out (inattivazione genica) 759Gene knock-in (inserimento di un gene reporter) 759Generazione di mutanti puntiformi 760
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Negli animali, i sistemi microbici di ricombinazione sito-specifica, permettono l’inattivazione condizionale di un gene e l’ingegneria cromosomica 761
Inattivazione genica condizionale 762Ingegneria cromosomica 763
Una tecnica alternativa per eseguire gene targeting fa uso di nucleasi zinc finger 763
Il knock-down di un gene a livello dell’RNA implica la degradazione del suo trascritto o l’inibizione della sua traduzione 765
Knock-down di un gene in vivo mediante RNA interference (interferenza dell’RNA) 766Inattivazione genica mediante oligonucleotidi morfolino antisenso 766
20.4 Mutagenesi casuale e analisi di mutanti su larga scala 767
Mutagenesi casuale mediante sostanze chimiche che aggiungono un gruppo etile alle basi 768
La mutagenesi inserzionale sulle cellule ES sfrutta transgeni privi di promotore come “trappole per geni” 768
I trasposoni causano l’inattivazione genica integrandosi in modo casuale nel genoma 769
Mutagenesi inserzionale con il trasposone Sleeping Beauty 770Trasposizione mediata dall’elemento piggyBac 770
Il Consorzio Internazionale Topi Knock-out ha lo scopo di ottenere mutanti per inattivazione genica di tutti i geni murini 771
Box 20.1 IL BACkGROUND GENETICO DEL TOPO E IL RUOLO DEI GENI MODIFICATORI 771
20.5 Animali geneticamente modificati come modelli di malattia per studiare la funzione genica 772
Gli animali geneticamente modificati hanno ampliato la nostra conoscenza della funzione genica 772
Creare modelli animali di malattie umane 773
Le mutazioni per perdita di funzione (loss of function) possono essere studiate inattivando selettivamente il gene ortologo di topo 773
Alleli null 774Alleli umanizzati 774Mutanti leaky (deboli) e ipomorfi 774Box 20.2 MODELLI DI TOPO PER MALATTIE RECESSIVE: L’ESEMPIO DELLA FIBROSI CISTICA 775
Esprimendo il transgene d’interesse mutato si ottengono modelli di mutazioni con acquisto di funzione (gain of function) 776
La creazione di un modello animale di anomalie cromosomiche è una sfida 778
Modelli murini di tumori umani sono difficili da ottenere 780Topi knock-out per ottenere un modello di perdita di funzione di un oncosoppressore 780Box 20.3 LA DIFFICOLTÀ DI RIPRODURRE FENOTIPI UMANI NEL TOPO 781
Topi transgenici come modello per l’attivazione di un oncogene 782Modelli di tumori a insorgenza sporadica 782
L’umanizzazione dei modelli murini per superare alcune delle differenze che rendono il topo un modello imperfetto 782
Lo sviluppo di nuove tecniche genetiche sta aumentando i modelli di malattia che si possono studiare 782
Conclusioni 785
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 786
CAPITOLO 21Approcci genetici alla cura delle malattie
21.1 Trattamento della malattia genetica versus trattamento genetico della malattia 790
Le terapie sono più avanzate nel caso delle malattie genetiche con una base biochimica nota 790
Per il trattamento genetico di una malattia si può intervenire a diversi livelli 791
21.2 Approcci genetici al trattamento delle malattie basati su farmaci, proteine ricombinanti e vaccini 792
Le industrie farmaceutiche hanno investito ingenti somme di denaro nella genomica per cercare di identificare nuove molecole bersaglio 792
BOX 21.1 BERSAGLI FARMACOLOGICI E SCREENING FARMACOLOGICI DI PICCOLE MOLECOLE 793
Le proteine di interesse terapeutico possono essere prodotte attraverso la loro espressione in microrganismi, linee cellulari di mammifero o in animali transgenici 794
L’ingegneria genetica ha prodotto nuovi anticorpi a uso terapeutico 796
Gli aptameri sono scelti in modo da legare proteine bersaglio specifiche e inibirne la funzione 798
L’ingegneria genetica ha permesso di migliorare la funzione dei vaccini 800
Vaccini antitumorali 800
21.3 Principi e applicazioni della terapia cellulare 801
Le terapie basate su cellule staminali promettono di trasformare il potenziale dei trapianti 801
Le cellule staminali embrionali 801BOX 21.2 PRODUZIONE E VALIDAZIONE DI LINEE CELLULARI STAMINALI EMBRIONALI 802
Cellule staminali da tessuto adulto 802Difficoltà pratiche della terapia cellulare basata su cellule staminali 802Terapia cellulare eterologa e autologa 803
La riprogrammazione nucleare offre nuove possibilità terapeutiche e nuovi modelli delle malattie umane 804
BOX 21.3 INDUZIONE SPERIMENTALE DELLA RIPROGRAMMAZIONE NUCLEARE IN CELLULE DI MAMMIFERO 804BOX 21.4 PROBLEMI ETICI DELLA CLONAZIONE RIPRODUTTIVA UMANA 806
Pluripotenza indotta in cellule somatiche 806BOX 21.5 ALCUNE PIETRE MILIARI NELLA RIPROGRAMMAZIONE NUCLEARE DI CELLULE DI MAMMIFERO 807
Transdifferenziamento 809
La terapia basata su cellule staminali può funzionare ma è ancora in una fase esplorativa 809
21.4 Principi di terapia genica e sistemi di trasfezione genica nei mammiferi 811
BOX 21.6 PROBLEMI ETICI DELLA TERAPIA GENICA
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DELLE CELLULE GERMINALI 811BOX 21.7 I PROBLEMI ETICI DEI “BAMBINI SU MISURA” 812
I geni possono essere trasferiti nelle cellule del paziente, in coltura o direttamente nel suo corpo 814
L’integrazione di geni terapeutici in cromosomi ospiti ha indubbi vantaggi ma suscita preoccupazioni per la sicurezza 815
I vettori virali offrono un’espressione forte e spesso a lungo termine del transgene, ma molti di essi presentano problemi di sicurezza 816
Vettori retrovirali 817Vettori virali basati su adenovirus e su virus adeno-associati (AAV) 819Altri vettori virali 820
I sistemi di trasferimento genico non virali sono più sicuri, ma il trasferimento genico è meno efficiente e spesso l’espressione dei transgeni è relativamente debole 820
Trasferimento di acido nucleico nudo per iniezione diretta o con bombardamento di particelle 821Trasferimento genico mediato da lipidi 821Nanoparticelle compatte di DNA 822
21.5 RNA e oligonucleotidi terapeutici e riparazione del DNA a fini terapeutici 822
Gli RNA e gli oligonucleotidi terapeutici sono spesso progettati per inattivare in modo selettivo l’allele mutante 822
Ribozimi terapeutici 824
siRNA terapeutici 824Gli oligonucleotidi antisenso possono indurre il salto di un esone (exon skipping) per superare una mutazione dannosa 824
Il gene targeting basato su nucleasi a dita di zinco (zinc finger) può riparare una specifica mutazione patogenica o inattivare in modo specifico un gene bersaglio 825
21.6 La terapia genica in pratica 827
BOX 21.8 SUCCESSI E INSUCCESSI NELLA PRATICA DELLA TERAPIA GENICA 827
Il primo successo della terapia genica riguarda malattie genetiche recessive del sangue 828
La terapia genica per molte altre malattie monogeniche ha avuto in generale scarso successo 830
La terapia genica dei tumori spesso comporta l’uccisione selettiva delle cellule tumorali, ma il tumore può ricrescere grazie alla proliferazione delle cellule che sopravvivono 831
Sono state perseguite molte strategie di terapia genica contro l’HIV, ma il progresso verso una terapia efficace è molto lento 832
Conclusioni 833
LeT Ture d I APPrOfOndImenTO 835
GLOSSArIOInduCe AnAL IT ICO