MEDIUM DAN STERILISASI

1. KOMPETENSI UMUM

Agar kita mengetahui cara pembuatan medium baik sintetik maupun non sintetik.

1. KOMPETENSI KHUSUS

Agar praktikan dapat mengetahui dan memahami cara pembuatan medium Nutrien Agar (NA) Sintetik, Potato Dekstrosa Agar (PDA) Sintetik dan Non Sintetik, Potato Dekstrosa Broth (PDB) Non Sintetik, dan Tauge Ekstrak Agar (TEA) Non Sintetik.

1. PRINSIP

Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) Sintetik, Potato Dekstrosa Agar (PDA) Sintetik dan Non Sintetik, Potato Dekstrosa Broth (PDB) Non Sintetik, dan Tauge Ekstrak Agar (TEA) Non Sintetik. Dengan cara menimbang, mencampur, memanaskan, menyaring serta sterilisasi media pada suhu 1210 C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

I. KAJIAN TEORI

A. Sterilisasi

Steril (suci hama) artinya bebas dari segala mikroba baik pathogen maupun tidak. Tindakan untuk membuat suatu benda menjadi steril disebut sterilisasi (Entjang, 2003).

Beberapa cara untuk mensterilkan medium(Dwidjoseputro,1990) :

a. Dalam abad 18 orang mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut selama beberapa jam. Dengan jalan ini maka matilah semua benih kehidupan.

b. Tyndalisasi. Metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap untuk beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari, selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetative, mak medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan sekali lagi. Dengan jalan demikian ini diperolehlah medium yang steril dan lagi pula, zat-zat organic yang terkandung didalamnya tidak mengalami banyak perubahan.

c. Dengan autoklaf, yaitu serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Medium yang akan disterilkan di tempatkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit. Setelah pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka, dan temperature akan terus menerus naik sampai 121oC. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan ada sebesar 15 lbs (pounds)/inch2 = 1 atm/cm2. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit itu dimulai semenjak thermometer pada autoklaf menunjuk 121oC. Setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan dengan demikian akan kita saksikan, bahwa suhu mulai turun sedikit demi sedikit, demikian pula manometer. Autoklaf tidak boleh dibuka sekonyong-konyong. Jika diperbuat demikian, maka isi botol yang ada di dalam autoklaf akan meluap kemana-mana. Baiklah kita menunggu sampai manometer menunjukan 0, barulah autoklaf kita buka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit.

d. Dengan penyaringan (filtrasi). Medium disaring dengan saringan porselin atau dengan tanah diatom. Dengan jalan ini, maka zat-zat organic tidak akan mengalami penguraian sama sekali. Hanya saying, virus tak dapat terpisah dengan penyaringan semacam ini. Oleh karena itu, sehabis penyaringan, medium masih perlu dipanasi dalam autoklaf, meskipun tidak selama 15 menit dengan temperature 121oC. penyaringan dapat dilakukan juga dengan saringan yang dibuat dari asbes. Saringan ini lebih murah dan lebih mudah penggunaanya daripada saringan porselin. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselin terlalu mahal untuk dibuang dan terlalu sulit untuk dibersihkan.

Filter udara mempunyai efisiensi tinggi untuk menyaring udara yang mengandung partikel, contohnya filter HEPA (high efficiency particulate air) sehingga memungkinkan udara bersih dialirkan ke dalam ruangan tertutup. Filter HEPA banyak digunakan pada ruangan aseptis (Laminar airflow bench) untuk mencegah kontaminasi mikroorganisme pada are-area isolasi dan untuk mencegah penyebaran infeksi (Radji, 2011).

e. Pensterilan gelas-gelas, gelas, botol, pipa, pipet yang sudah bersih tidak disterilkan di dalam autoklaf, karena barang-barang terrsebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari gelas dimasukkan ke dalam oven kering selama 2-3 jam pada temperature 160-170oC. kapas masih dapat bertahan dalam oven krering selama waktu dan temperature seperti diatas. Alat-alat yang belum bersih dan belum kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering.

B. Medium

Media perbenihan adalah media nutrisi yang disiapkan untuk menumbuhkan bakteri di dalam skal laboratorium, beberapa bakteri dapat tumbuh dengan baik pada setiap media perbenihan, sedangkan yang lain membutuhkan media khusus. Media perbenihan harus dapat menyediakan energy yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Media harus mengandung sumber C, N, S, P dan factor pertumbuhan organik (Radji, 2011).

Berdasarkan pada macam bahan yang digunakan media yang digunakan untuk mengembangbiakkan mikroorganisme ada 3 macam yaitu media alam, media semi sintetik, dan media sintetik. Di media alam, komposisi zat gizi tidak dapat diketahui dengan pasti setiap waktu karena komposisinya berubah-ubah bergantung pada bahan asalnya seperti kentang dsb. Dalam media semi sintetik selain bahan alam digunakan zat kimia dan komposisinya diketahui dengan tepat, contoh Potato Dextrose Agar. Sedangkan pada media sintetik, semua kandungan nutrisinya diketahui dengan tepat, misalnya agar-agar czapek (Gunawan, 2008).

Di laboratorium,mikroorganisme tumbuh di media yang sintetis :(1) dikenal Media sintetis terdiri dari jumlah dikenal gizi tertentu (2) Media yang kompleks terdiri dari nutrisi komposisi cukup terkenal yang bervariasi dalam komposisi dari batch ke batch. Media diagnostik (1)media selektif jika mereka mendorong pertumbuhan beberapa organisme dan menghambat pertumbuhan orang lain (2) Media diferensial jika mereka membiarkan berbagai jenis coloni di piring sama harus dibedakan dari satu sama lain atau (Media) pengayaan. jika mereka memberikan nutrisi yang mendorong pertumbuhan dari organisme tertentu (Jacquelyn, 1999).

Jenis-Jenis media pertumbuhan bakteri (Radji, 2011) :

1. Medium cair yang biasa dipakai ialah kaldu yang disiapkan. Pepton ialah protein yang terdapat dalam daging, air susu, kedelai dan putih telur. Medium kemudian ditentukan pHnya 6,8-7, jadi sedikit asam atau netral. Keadaan demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu tersebut disaring untuk kemudian dimasukkan kedalam botol dan tabung reaksi, setelah itu disumbat dengan kapas, kemudian dapat di masukkan ke dalam autoklaf (Dwidjoseputro,1990).

2. Medium padat, suatu penemuan yang baik sekali ialah medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium itu disterilkan, dan kemudian dibiarkan dingin, makan kita peroleh medium padat. Agar-agar baru mencair pada suhu 95oC. agar-agar ialah sekedar zat pengental dan bukan zat makanan bagi bakteri, gelatin sebaliknya dapat diencerkan oleh enzim-enzim bakteri (Dwidjoseputro,1990).

3. Media sintetik, media ini digunakan untuk bakteri kemoheterotrof. Organisme yang membutuhhkan banyak factor pertumbuhan disebut fastidious, mis Lactobacillus. Bakteri ini kadang kala digunakan untuk menentukan kadar vitamin tertentu dalam sebuah bahan.

4. Media kompleks, media perbenihan ini biasanya digunakan secara rutin dalam di laboratorium, media ini mengandung nutrisis tinggi, yang terdiri atas ekstrak ragi, ekstrak daging atau tumbuhan atau protein sederhana dari sumber lain. Protein merupakan sumber energy bagi bakteri, yaitu dengan mengubah protein menjadi asam amino dengan menggunakan enzim atau asam sehingga dapat dicerna oleh bakteri. Media kompleks yang berbentuk cairan disebut nutrient broth, sedangkan yang ditambahkan agar disebut nutrient agar.

5. Media anaerob, penanaman bakteri anaerob harus menggunakan media special yang dikenal dengan reducing media. Media ini mengandung nattrium tioglikolat. Di dalam tabung reaksi berisis media anerob, ada bagian yang mengandung oksigen da nada bagian yang tidak mengandung oksigen, yaitu pada dasar tabung. Sebelum digunakan, media ini dipanaskan terlebih dahulu perlahan-lahan untuk menghilangkan oksigen yang terserap.

6. Media biakan khusus, banyak bakteri tidak dapat tumbuh dalam media buatan laboratorium, sebagai contoh, Mycobacterium leprae, sampai sekarang bakteri ini masih ditumbuhkan di dalam binatang armadillo, yang memiliki suhu tubuh cukup rendah sehingga cocok untuk pertumbuhannya.

7. Media selektif dan diferensial, media selektif dan diferensial digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya bakteri spesifik yang berhubungan dengan penyakit atau sanitasi yang buruk. Media selektif dirancang untuk menekan pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan dan mendukung pertumbuhan bakteri yang diinginkan. Contoh bismust sulfite agar untuk menumbuhkan salmonella. Media diferensial memudahkan pembedaan koloni bakteri yang diinginkan dari koloni lain yang tumbuh pada lempeng media yang sama, contoh agar darah untuk mengidentifikasi spesies bakteri yang menghancurkan sedl darah merah (streptococcus pyogenes) yang menyebabkan infeksi saluran nafas.

8. Media pengayaan, media yang digunakan untuk pengayaan biakan bakteri biasanya dalam bentuk media cair. Media ini hamper sama dengan media selektif tetapi dirancang untuk memperbanyak tipe bakteri yang diinginkan sehingga dapat dideteksi. Media ini juga digunakan untuk mendukung pertumbuhan bakteri tertentu di dalam biakan campuran.

Dalam mempelajari bakteri diperlukan perbenihan bakteri guna kepentingan (Entjang,2003) :

a. Untuk mencarii bakteri penyebab suatu penyakit

b. Untuk mencari obat yanag dapat mengobati penyakit yang disebabkan oleh suatu bakteri

c. Dengan biakan murni, dapat dipelajari sifat-sifat bakteri lebih mendalam dalam setiap jenis bakteri.

d. Dalam industry, beberapa bakteri diperbanyak dengan jalan menumbuhkan pada berbenihan, misalnya pembuatan antibiotic.

II. METODE KERJA

a. Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah : Autoklaf, Batang pengaduk, Botol semprot, Corong, Erlenmeyer, Gelas kimia, Kompor ,Pisau, Sendok tanduk, dan Timbangan analitik.

b. Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah : Agar, Aluminium foil, Aquadest, Dekstrosa(Gulaku), Ekstrak beef, Karet gelang, Kain saring, Kertas timbang, Potato, Sukrosa, Tissu, dan Touge.

c. Cara Kerja

1. NA / Nutrien Agar Sintetik

Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang extra beef 0,75 gr, pepton 1,25 gr, agar 2 gr, dan dextrose 2,5 gr. Dimasukkan kedalam Erlenmeyer kemudian dilarutkan sedikit demi sedikit dengan aquadest dan diaddkan hingga 250 ml. Dipanaskan hingga larut dan homogeny selama 15 menit. Dinginkan sebentar. Diamati medium sebelum disterilkan. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Diamati perubahan yang terjadi pada medium. Disimpan dalam kulkas(lemari pendingin).

2. PDA / Potato Dekstrosa Agar Sintetik

Ditimbang PDA sebanyak 9,75 gram kemudian masukkan kedalam erlenmeyer 250 ml dan dilarutkan dengan air, dan dipanaskan selama 5 menit, kemudian dicukupkan hingga 250 ml setelah itu tutup mulut erlenmeyer dengan kapas dan sterilkan menggunakan autoklaf selama 15 20 menit. Setelah steril lerekkan simpan dalam kulkas penyimpanan medium.

3. PDB / Potato Dekstrosa Broth Non Sintetik

Ditimbang Potato sebanyak 50, ditimbang dextrosa sebanyak ,5gram, kemudian masukkan potato kedalam gelas kimia 500 ml dan dan tambahkan air sebanyak 250 ml, dan dipanaskan selama 20 menit , setelah dipanaskan disaring disaring dan hasil saringan dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan dengan dextrosa sebanyak 2,5 gram di aduk hingga homogen, setelah itu tutup mulut erlenmeyer dengan kapas dan sterilkan menggunakan autoklaf selama 15 20 menit. Setelah steril letakkan simpan dalam kulkas penyimpanan medium.

4. PDA / Potato Dekstrosa Agar Non Sintetik

Ditimbang Potato sebanyak 50, ditimbang dextrosa sebanyak 2,5 gram,ditimbang agar sebanyak 5 gram, kemudian masukkan potato kedalam gelas kimia 500 ml dan dan tambahkan air sebanyak 250 ml, dan dipanaskan selama 20 menit , setelah dipanaskan disaring disaring dan hasil saringan dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan dengan dextrosa sebanyak 2,5 gram dan agar sebanyak 5 gram, di aduk hingga homogen, setelah itu tutup mulut erlenmeyer dengan kapas dan sterilkan menggunakan autoklaf selama 15 20 menit. Setelah steril letakkan simpan dalam kulkas penyimpanan medium.

5. TEA / Tauge Ekstrak Agar Non Sintetik

Ditimbang tauge sebanyak 12,5, ditimbang sukrosa sebanyak 7,5 gram, ditimbang agar sebanyak 2,5 gram kemudian masukkan tauge kedalam gelas kimia 500 ml dan dan tambahkan air sebanyak 250 ml, dan dipanaskan selama 20 menit , setelah dipanaskan disaring disaring dan hasil saringan dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan dengan sukrosa sebanyak , ditambahkan agar sebanyak di aduk hingga homogen, setelah itu tutup mulut erlenmeyer dengan kapas dan sterilkan menggunakan autoklaf selama 15 20 menit. Setelah steril lerekkan simpan dalam kulkas penyimpanan medium.

III. HASIL PRAKTIKUM

a. Data Pengamatan

Nama Medium

Konsistensi/Warna

Jenis medium

Kegunaan

NA

(Nutrient Agar)

Padat

/Coklat

Sintetik

Untuk pertumbuhan bakteri

NB

(Nutrient Broth)

Cair

/Coklat

Sintetik

Untuk pertumbuhan bakteri

PDA

(Potato Dextrose Agar

Padat

/Kuning

SIntetik

dan

non sintetik

Untuk pertumbuhan Jamur

PDB

(Potato Dextrose Broth)

Cair

/Kuning

Non

sintetik

Untuk pertumbuhan Jamur

TEA

(Tauge Ekstrak Agar)

Padat

/Kuning

Non

sintetik

Untuk pertumbuhan Jamur dan mikroba

b. Foto Pengamatan

1. Medium NA Sintetik

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

Keterangan : medium sintetik NA setelah sterilisasi

Fungsi : bahan untuk pengembangbiakan bakteri

2. Medium PDA Sintetik

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

Keterangan : medium PDA sintetik setelah sterilisasi

Fungsi : bahan untuk pengembangbiakan jamur

3. Medium PDB Non sintetik

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

Keterangan: medium PDB sintetik setelah sterilisasi

Fungsi : medium atau bahan untuk pengembangan jamur

4. Medium PDA Non Sintetik

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

Keterangan : medium PDA Non sintetik setelah sterilisasi

Fungsi : medium atau bahan untuk perkembangbiakan jamur

5. Medium TEA Non Sintetik

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA

Keterangan : medium TEA Non sintetik setelah sterilisasi

Fungsi : medium atau bahan untuk perkembangbiakan bakteri maupun jamur

VII. PEMBAHASAN

Sterilisasi merupakan suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan - bahan dari segala bentuk kehidupan mikroorganisme. Sterilisasi dengan uap air bertekanan digunakan untuk sterilisasi medium. Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya, Medium harus dapat menyediakan energy yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Media harus mengandung sumber C, N, S, P dan factor pertumbuhan organic, mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik.Dalam praktikum ini, kita akan membuat medium agar nutrisi (Nutrient Agar).

Untuk pembuatan agar nutrient dengan cara konvensional adalah menambahkan komponen (agar 5g, pepton 1,25g, ekstrak daging 0,75 g, dekstrosa 2,5g) ditambahkan pada 250 ml aquades dalam Erlenmeyer 250 ml, dicampur dengan diaduk dan dipanaskan di waterbath. Setelah larut, ditutup kertas dan diikat lalu disterilkan dengan dimasukkan autoklaf selama 15 menit pada 15 psi dengan suhu 1210C. lalu dimasukkan ke dalam lemari medium.

Tujuan pemanasan dan pengadukan adalah untuk mempercepat homogenisasi NA dengan aquadest, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dengan aquades. Setelah dipanaskan sampai kira-kira larutan menjadi homogen yang ditandai dengan warna yang merata. Kemudian larutan yang terdapat di dalam erlenmeyer dimasukan kedalam autoclave dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas yang dilapisi dengan kertas diluarnya.Tujuan dari penutupan ini dimaksudkan agar meminimalkan kontaminasi. Tujuan dari penyimpanan medium di kulkas adalah agar medianya tidak rusak.

Adapun kegunaan dari medium NA(nutrient agar) adalah untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.

IV. KESIMPULAN

a. Sterilisasi medium NA (nutrient agar) dilakukan di autoclave pada suhu 121oC, tekanan 15 lbs selama 15 menit (sterilisasi tekanan uap tinggi).

b. Komposisi NA (nutrient agar) terdiri atas eksrak beef, pepton, dekstrosa dan agar.

c. Medium yang telah disterilkan tidak ditumbuhi oleh mikroba karena kontaminan telah hilang setelah sterilisasi.

V. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2015. Penuntun Analisis MIkrobiologi Farmasi. UMI, Makassar.

Black, G, Jacquelyn, 1999. Microbiology, 4th Edition. Upper saddle river, New jersey;United States of America.

Dwidjoseputro, D. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit djambatan; Malang

Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi. PT. Citra Aditya Bakti, Bandung.

Gunawan, W, Agustin. 2008. Usaha Pembibitan Jamur. PT. Penebar Swadaya; Bogor

Radji, Maksum. 2011. Buku Ajar Mikrobiologi. Penerbit buku kedokteran EGC; Jakarta.

VI. LAMPIRAN

a. Skema Kerja

Pembuatan NA(Nutrient Agar)

Ditimbang setiap bahan

Erlenmeyer 250 ml

Ditambahkan aquadest hingga 250 ml, diaduk

Ditutup dengan kapas

Dipanaskan di waterbath

Ditutup kertas dan diikat karet

Disterilisasi di autoklaf suhu 121oC selama 15 menit

b. Perhitungan

Untuk NA (Nutrient Agar) 250 ml

Ekstrak beef=

Pepton =

Agar =

Dekstrosa =

c. Pembuatan Bahan

d. Uraian Sampel

e. Uraian mikroorganisme

RINI ANDRIANIMUH. IRHAM BAHKTIAR, S.Farm

15020130032