stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru ( egfr )
DESCRIPTION
Stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru ( EGFR ). Véghová B., Berkyová A., Kostelecká L. Ústav Patologie I.LF UK a VFN, Praha. Receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR). Stanovení EGFR : → možnost moderní metody léčby nádorů na molekulární úrovni: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Stanovení exprese receptoru Stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru epidermálního růstového faktoru ( EGFR )( EGFR )
Véghová B., Berkyová A., Kostelecká L.Véghová B., Berkyová A., Kostelecká L.
Ústav Patologie I.LF UK a VFN, Praha
Receptor epidermálního růstového Receptor epidermálního růstového faktoru faktoru (EGFR)(EGFR)
Stanovení EGFR :Stanovení EGFR :
→ → možnost moderní metody léčby nádorů na možnost moderní metody léčby nádorů na molekulární úrovni:molekulární úrovni:
vazba upravené protilátky a antigenu nádorové vazba upravené protilátky a antigenu nádorové buňky zabrání jejímu dalšímu růstu, vede k apoptózebuňky zabrání jejímu dalšímu růstu, vede k apoptóze
Léčebné využití :Léčebné využití :
karcinom plickarcinom plic
karcinom prsukarcinom prsu
karcinom tlustého střevakarcinom tlustého střeva
Využití EGFRVyužití EGFR v léčbě kolorektálního karcinomu v léčbě kolorektálního karcinomu
V léčbě kolorektálního karcinomu se jeví jako V léčbě kolorektálního karcinomu se jeví jako nejslibnější zablokování části receptoru pro nejslibnější zablokování části receptoru pro epidermální růstový faktor EGFR pomocí epidermální růstový faktor EGFR pomocí monoklonální protilátky monoklonální protilátky CetuximabCetuximab
Skupina EGFR bývá označována 1-4Skupina EGFR bývá označována 1-4
Prvním popsaným receptorem této skupiny byl Prvním popsaným receptorem této skupiny byl receptor pro epidermální růstový faktor receptor pro epidermální růstový faktor označovaný jako označovaný jako EGFREGFR (HER-1, erbB-1). Dalšími (HER-1, erbB-1). Dalšími receptory jsou HER2/neu nebo erbB-2, HER-3 a receptory jsou HER2/neu nebo erbB-2, HER-3 a HER-4.HER-4.
Set EGFR pharmDx Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)(DakoCytomation)
Set obsahuje :Set obsahuje :
primární protilátkuprimární protilátku proteinázu Kproteinázu K blok peroxidázyblok peroxidázy negativní kontrolunegativní kontrolu labbeled polymer HRPlabbeled polymer HRP DAB + chromogen, DAB + substrátový pufrDAB + chromogen, DAB + substrátový pufr promývací pufrpromývací pufr kontrolní podložní skla obsahující dvě linie kontrolní podložní skla obsahující dvě linie
lidských buněk s hodnotami intenzity zabarvení 2 lidských buněk s hodnotami intenzity zabarvení 2 + a 0+ a 0
Set EGFR pharmDx Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)(DakoCytomation)
Všechna dodaná činidla jsou připravena speciálně Všechna dodaná činidla jsou připravena speciálně pro použití s tímto testem, aby odpovídal pro použití s tímto testem, aby odpovídal uvedené specifikaciuvedené specifikaci→ → nelze tedy používat žádné jinénelze tedy používat žádné jiné
Jsou také optimálně naředěna a jejich další Jsou také optimálně naředěna a jejich další naředění může způsobit ztrátu zabarvení naředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenuantigenu
Použití:Použití: vzorky fixované běžným způsobem a zalité vzorky fixované běžným způsobem a zalité v parafínuv parafínu
Cena:Cena: 38 335,- Kč bez DPH 38 335,- Kč bez DPH / / 35 vyšetření35 vyšetření
Set EGFR pharmDx Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)(DakoCytomation)
Set uchováváme při teplotě + 4° až + 6°CSet uchováváme při teplotě + 4° až + 6°C
Před prováděním metody musíme všechna činidla Před prováděním metody musíme všechna činidla vyvážit na pokojovou teplotu, při které probíhá inkubacevyvážit na pokojovou teplotu, při které probíhá inkubace
Zpracováváme současně tři podložní skla:Zpracováváme současně tři podložní skla:vyšetřovaný vzorek s primární protilátkouvyšetřovaný vzorek s primární protilátkounegativní kontrolanegativní kontrolapositivní kontrolapositivní kontrola
Tkáňové řezy by měly být co nejtenčí, nejlépe na sklech Tkáňové řezy by měly být co nejtenčí, nejlépe na sklech se speciální úpravou: se speciální úpravou: silan, poly-L-lysin, skla s nábojemsilan, poly-L-lysin, skla s nábojem
..
Provedení reakce EGFRProvedení reakce EGFR
DeparafinaceDeparafinace Odhalení antigenních struktur proteinázou KOdhalení antigenních struktur proteinázou K
proteolytický enzymproteolytický enzym Blokování endogenní peroxidázyBlokování endogenní peroxidázy
3% peroxid vodíku3% peroxid vodíku Primární protilátkaPrimární protilátka
myší monoklonální anti-lidský EGFR, klon 2-myší monoklonální anti-lidský EGFR, klon 2-18C918C9
Sekundární protilátkaSekundární protilátkaznačený polymer HRPznačený polymer HRP
Mezi těmito jednotlivými kroky důkladně Mezi těmito jednotlivými kroky důkladně oplachujeme skla v promývacím pufruoplachujeme skla v promývacím pufru
Dokončení reakce EGFRDokončení reakce EGFR
Vizualizace roztokem chromogenu DAB+Vizualizace roztokem chromogenu DAB+
Dobarvení jader hematoxylinemDobarvení jader hematoxylinem
OdvodněníOdvodnění
ZamontováníZamontování
Kontrola kvality provedené reakce :Kontrola kvality provedené reakce :positivní kontrolapositivní kontrola
negativní kontrolanegativní kontrola
Hodnocení reakceHodnocení reakce
Kvalitativní zhodnocení :Kvalitativní zhodnocení :00 žádná pozitivitažádná pozitivita1+1+ pozitivita - slabápozitivita - slabá2+2+ pozitivita - středně silná pozitivita - středně silná 3+3+ pozitivita - silná pozitivita - silná
Lokalita zbarvení :Lokalita zbarvení :buněčná membránabuněčná membránacytoplazmacytoplazmamembrána i cytoplazmamembrána i cytoplazma
Hodnocení pozitivní reakceHodnocení pozitivní reakce
Heterogenní barvení :Heterogenní barvení :
různá intenzita barvení různá intenzita barvení v jednom nádoru v jednom nádoru (0 až 3+)(0 až 3+)
zbarvení různých zbarvení různých strukturstruktur membránmembrán cytoplazmycytoplazmy nebo obounebo obou
Homogenní Homogenní barvení :barvení :
zbarvení stejné zbarvení stejné intenzityintenzity
zbarvení jen jedné zbarvení jen jedné strukturystruktury
EGFR proteinEGFR proteinje exprimován v řadě normálních je exprimován v řadě normálních
tkánítkání
CYTOPLAZMA :CYTOPLAZMA :
kůžekůže tonzilytonzily plíceplíce endometriumendometrium
nadledvinynadledviny
BUNĚČNÁ MEMBRÁNA BUNĚČNÁ MEMBRÁNA ::
kůžekůže tonzilytonzily plíceplíce endometriumendometrium
jícenjícen pankreaspankreas játra (hepatocyty)játra (hepatocyty) děložní čípekděložní čípek prostataprostata
Vnitřní kontrola exprese EGFRVnitřní kontrola exprese EGFR
Pozitivní vnitřní kontrola u primárního Pozitivní vnitřní kontrola u primárního tumoru:tumoru:
– normální povrchové epitelie sliznice +/- slabá normální povrchové epitelie sliznice +/- slabá pozitivitapozitivita
– perineurální fibroblastyperineurální fibroblasty
Pozitivní vnitřní kontrola u metastáz v Pozitivní vnitřní kontrola u metastáz v játrech:játrech:– hepatocytyhepatocyty
Znázornění nespecifického pozadíZnázornění nespecifického pozadí
Difuzní nespecifické zabarvení tkáňových elementůDifuzní nespecifické zabarvení tkáňových elementů
Příčina - různé faktoryPříčina - různé faktory
BIOLOGICKÁ AKTIVITA TKÁNÍBIOLOGICKÁ AKTIVITA TKÁNÍpseudoperoxidázová reakce erytrocytůpseudoperoxidázová reakce erytrocytůendogenní peroxidázová reakce endogenní peroxidázová reakce
granulocytůgranulocytů
TECHNOLOGIE PROCESUTECHNOLOGIE PROCESUchybná fixace tkáněchybná fixace tkáněinkompletní deparafinizaceinkompletní deparafinizacepoužití jiného pufrupoužití jiného pufruvyschnutí tkáně během barvenívyschnutí tkáně během barvení
Interpretační artefaktyInterpretační artefakty
Nepřiměřené proteolytické natráveníNepřiměřené proteolytické natrávení zhmoždění tkánězhmoždění tkáně okrajový artefakt (zbarvení jen na periferii vzorku)okrajový artefakt (zbarvení jen na periferii vzorku) retrakční artefakt (retrakce stromatu kolem retrakční artefakt (retrakce stromatu kolem
nádorových buněk)nádorových buněk) termální artefakty (při odběru tkáně) - problém u termální artefakty (při odběru tkáně) - problém u
endobiopsiíendobiopsií nehodnotitelné oblasti nádoru nehodnotitelné oblasti nádoru
nekrotické buňkynekrotické buňky
izolované jen jednotlivé nádorové buňkyizolované jen jednotlivé nádorové buňky
špatně ukrojený nebo napnutý řezšpatně ukrojený nebo napnutý řez
Indikace k vyšetření exprese EGFRIndikace k vyšetření exprese EGFR
Karcinom tlustého střeva Karcinom tlustého střeva metastazující i po standartní metastazující i po standartní chemoterapiichemoterapii
Při pozitivní expresi EGFR léčba ERBITUXEM (Cetuximab) Při pozitivní expresi EGFR léčba ERBITUXEM (Cetuximab) – – vyžadují Zdravotní pojišťovnyvyžadují Zdravotní pojišťovny
Spádově vyšetření provádíme pro :Spádově vyšetření provádíme pro : PrahuPrahu Středočeský krajStředočeský kraj Severočeský krajSeveročeský kraj
Vyšetření prováděná v našem Vyšetření prováděná v našem ústavuústavu
20042004 15 případů 15 případů ( od zavedení ( od zavedení metody )metody )
20052005 61 případů 61 případů2006 2006 67 případů 67 případů20072007 47 případů 47 případů ( za první pololetí )( za první pololetí )
Díky archivaci parafinových bloků můžeme Díky archivaci parafinových bloků můžeme vyšetřit i více než 10 let staré primární vyšetřit i více než 10 let staré primární adenokarcinomy tlustého střeva nebo adenokarcinomy tlustého střeva nebo jejich metastázy (zejm. uzlinové, jaterní).jejich metastázy (zejm. uzlinové, jaterní).