1

SORTIRANJE PROTEINA U ĆELIJAMA EUKARIOTA –

KRETANJE PROTEINA KROZ MEMBRANE I ORGANELE

Tipična ćelija sisara sadrži oko 10 000 različitih proteina, dok tipična ćelija kvasca sadrži

oko 5 000. Najveći broj ovih proteina se sintetiše u citoplazmi, gde mnogi od njih i ostaju.

Međutim, čak jedna polovina različitih vrsta sintetisanih proteina se dostavlja do određenih

organela u ćeliji ili do površine ćelije. Na primer, mnogi receptori za hormone ili proteini

transporteri moraju biti dostavljeni do plazma membrane, neki enzimi rastvorljivi u vodi, kao što

su DNK i RNK polimeraze, moraju biti transportovani u nukleus, dok komponente vanćelijskog

matriksa, digestivni enzimi i polipeptidni signalni molekuli moraju biti usmereni do površine ćelije

kako bi bili sekretovani. Dakle, svi proteini sintetisani u jednoj ćeliji moraju stići do svoje

odgovarajuće lokacije kako bi ćelija normalno funkcionisala. U suprotenom, greške vode do

različitih bolesti.

Mehanizam kojim ćelija transportuje novosintetisane proteine do odgovarajućih

lokalizacija u ćeliji ili van ćelije naziva se sortiranje ili targetiranje proteina. Krajnje lokalizacije

za sortirane proteine su određene organele, plazma membrana ili okolina ćelije. Proces

sortiranja proteina je baziran na informaciji sadržanoj u samoj aminokiselinskoj sekvenci

proteina, poznatoj kao signalna sekvenca.

Sortiranje proteina obuhvata dva opšta procesa. Jedan proces podrazumeva targetiranje

proteina do membrana organela, dešava se neposredno po završetku translacije, i poznat je

kao nesekretorni put sortiranja proteina (slika 1, desno). Proteini koji imaju signalne

sekvence specifične za određene organele importuju se u mitohondrije, hloroplaste,

peroksizome ili nukleus. Targetiranje membranskih proteina dovodi do njihove insercije u

membranu, dok tragetiranje proteina rastvorljivih u vodi dovodi do translokacije celog proteina

kroz memebranu u vodenu unutrašnjost organele. Proteini mitohondrija i hloroplasta obično

prolaze kroz njihove spoljašnje i unutrašnje memebrane i ulaze u matriks, odnosno stromu.

Proteini koji se sortiraju u druge subkompartmente ovih organela podležu dodatnim koracima

sortiranja. Nuklearni proteini ulaze i izlaze iz nukleusa kroz pore nuklearnog ovoja.

Drugi opšti proces sortiranja proteina poznat je kao sekretorni put sortiranja proteina

(slika 1, levo), koji se dešava ili tokom translacije ili neposredno po njenom završetku. Ovaj

proces počinje usmeravanjem rastućeg ili novosintetisanog polipeptida ka endoplazmatičnom

retikulumu (ER–u), tako da se svi proteini koji ulaze u sekretorni put inicijalno usmeravaju na

membrane ER. Proteini koji ulaze u ovaj put sortiranja su solubilni i membranski proteini ER-a,

proteini lumena Goldži kompleksa i lizozima, integralni proteini membrana ovih organela i

plazma membrane, kao i proteini koje ćelija sekretuje. Kompleks ribozom-rastući polipeptid

usmerava se ka hrapavom ER pomoću signalne sekvence za ER i translocira se u lumen ER. U

lumenu ER-a, protein zauzima nativnu konformaciju delovanjem proteina koji katalizuju

savijanje proteina, a nalaze se u lumenu ER-a. Ceo proces se precizno kontroliše, i samo ako je

2

savijanje proteina ispravno i ako subjedinice multisubjediničnih proteina asembliraju, protein

može biti transportovan iz ER-a u druge organele, kao što su Goldži kompleks ili lizozom, do

plazma membrane ili sekretovan van ćelije. U lumenu ER-a proteini podležu posttraslacionoj

glikozilaciji, stabilizaciji strukture formiranjem disulfidnih veza i specifičnim proteolitičkim

sečenjima. Proteini čija je krajnja destinacija Goldži kompleks, lizozom, plazma membrana ili

proteini koji se skretuju van ćelije, transportuju se pomoću malih membranskih vezikula koje

nastaju pupljenjem membrane jedne organele, a zatim fuzionišu sa membranom druge

organele.

Slika 1. Pregled glavnih puteva za sortiranje proteina u eukariotskoj ćeliji: proteini koji nemaju nikakvu signalnu sekvencu oslobađaju se u citoplazmu, gde i ostaju. Proteini sa signalnim sekvencama, u zavisnosti od svoje krajnje destinacije podležu sekrteornom ili nesekretornom putu sortiranja proteina.

Kako se određeni protein usmerava ka membrani tačno određene organele u ćeliji i kako

relativno veliki proteini prolaze kroz membrane bez narušavanja njene strukture? Sa malim

razlikama, isti osnovni mehanizam vodi sortiranje proteina ka različitim organelama. Informacija

za usmeravanje nekog proteina ka tačno određenoj organeli sadržana je u aminokiselinskoj

sekvenci (primarnoj strukturi) proteina, odnosno signalnoj sekvenci. Ona je poznata i pod

3

nazivima signalni peptid ili sekvenca za targetiranje, i upravo ona omogućava transportnoj

mašineriji ćelije da ispravno lokalizuje neki protein.

Svaka organela sadrži set receptornih proteina za signalne sekvence koji vezuju

tačno određene signalne sekvence, što obezbeđuje da informacija sadržana u signalnoj

sekvenci u potpunosti određuje specifičnost sortiranja proteina. Kada protein sa određenom

signalnom sekvencom stupi u interkaciju sa odgovarajućim receptorom na površini organele,

proteinski lanac se premešta u kanal za translokaciju, koji proteinskom lancu omogućava da

prođe kroz membranu. Jednosmerni transport proteina kroz membrane se obično postiže

povezivanjem procesa translokacije proteina sa energetski favorizovanim procesima, kao što je

na primer hidroliza ATP-a. Naki proteini se, zatim, dalje sortiraju kako bi stigli do

subkompartmenta određenih organela, korišćenjem drugih signalnih sekvenci i odgovarajućih

receptora. Signalne sekvence se obično uklanjaju iz zrelog proteina delovanjem specifičnih

proteaza u toku ili neoposredno nakon prolaza proteina kroz membranu (translokacije).

Putevi soritanja proteina u različite organele se međusobno razlikuju po signalnim

sekvencama, receptorima za signalne sekvence, strukturi kanala za translokaciju i po izvoru

energije koji obezbeđuje jednosmernu translokaciju proteina kroz memrane. Na primer, signalne

sekvence mogu biti predstavljene kontinuiranim nizovima aminokiselina, kada su najčešće

dugačke 13 do 136 hidrofobnih i baznih aminokiselina. Uglavnom se nalaze na N-kraju proteina,

ali i u unutrašnjosti proteina ili na C-krajevima. Neki signali za sortiranje su predstavljeni

nizovima aminokiselina koji su međusobno odvojeni u primarnoj sekvenci proteina (eng. signal

patch), i koji se tek savijanjem proteina postavljaju u međusobnu blizinu formirajući signal za

sortiranje. Translokacija proteina može biti kotranslaciona ili posttranslaciona, dok kanal za

translokaciju može biti takav da dozvoljava prolaz nesavijenom proteinu ili proteinu sa već

formiranim proteinskim domenima.

Slika 2. Tipovi signalnih sekvenci: signalna sekvenca može biti predstavljena kontinuiranim i diskontinuiranim nizovima aminokiselina u proteinu.

Najveći doprinos izučavanju soritiranja proteina i translokacije proteina kroz membrane

dao je Ginter Blobel. Serijom svojih eksprimenata koje je započeo ranih sedamdesetih godina

prošlog veka razjasnio je načine precizne lokalizacije proteina u ćeliji. Za svoja istraživanja

4

1999. godine nagrađen je Nobelovom nagradom. On je signalne sekvence za sortiranje proteina

opisao kao poštanske brojeve za ciljne organele.

1. SEKRETORNI PUT SORTIRANJA PROTEINA

Sve ćelije sekretuju razne proteine, na primer proteine vanćelijskog matriksa, dok su

neki tipovi ćelija specijalizovani za sekreciju velikih količina proteina. Tako, acinarne ćelije

pankreasa sintetišu velike količine nekoliko digestivnih enzima. Eukariotske ćelije koriste isti

osnovni meanizam da bi sintetisale i sortirale proteine u lumen i membarne ER, Goldži

kompleksa i lizozoma, u plazma membranu ili sekretovale proteine van ćelije. Osnovni

mehanizam sekretornog puta obuvata tri koraka: 1) sintezu proteina i tanslokaciju kroz

membranu ER-a, 2) savijanje proteina i posttranslacione kovalentne modifikacije proteina u

lumenu ER-a, i 3) transport proteina do Goldži kompleksa, lizozoma, plazma membrane ili van

ćelije kroz pupljenje i fuziju transportnih membranskih vezikula.

Transport proteina sekretornog puta u lumen ER-a počinje još tokom njihove sinteze, što

je poznato kao kotranslaciona translokacija (slika 3). Neki proteini kvasca se prvo kompletno

sintetišu i zatim translociru u lumen ER-a, kada govorimo o posttranslacionoj translokaciji (slika

4).

1.1. Kotranslaciona translokacija proteina kroz membranu endoplazmatičnog retikuluma

Sinteza proteina koji se sekretuju, integralnih proteina plazma membrane i proteina čije

su krajnje lokalizacije u ER, Goldži kompleksu ili lizozomu počiinje na citosolnim ribozomima,

Signalna sekvenca za ER usmerava kompleks ribozom-rastući polipeptid ka membrani,

formirajući hrapavi ER, i inicira translokaciju rastućeg polipeptidnog lanca kroz membranu ER-a.

Signalna sekvenca za ER na rastućem polipeptidu sastoji se od 16 do 30

aminokiselinskih ostataka, najčešće lociranih na N-kraju. Kod razlčitih proteina signalna

sekvenca za ER ima kontinuirani niz od 6 do 12 hidrofonih aminokiselina, okruženih sa jednom

ili nizom pozitivno naelektrisanih aminokisleina. Hidrofobni ostaci formiraju vezivno mesto za

interkaciju sa mašinerijom odgovornom za usmeravanje proteina ka membrani ER-a, dok su

pozitivno naelektrisane aminokiseline, kod membranskih proteina, važne za orijentaciju proteina

u membrani. Kod velikog broja proteina sekretornog puta, signalna sekvenca se seče još dok

sinteza proteina traje, tako da ona nije prisutna u zrelom proteinu.

Dve ključne komponente kotranslacione translokacije koje usmeravaju kompleks

ribozom-rastući polipeptid ka membrani ER-a su partikula za prepoznavanje signala (eng.

signal-recognition particle, SRP) i receptor za SRP, lociran u membrani ER-a.

SRP prepoznaje i prolazno se vezuje za signalnu sekvencu za ER na rastućem

polipeptidu i za veliku subjedinicu ribozoma, formirajući veliki kompleks koji se usmerava ka

membrani ER-a (slika 3-2) i vezuje za receptor za SRP (slika 3-3). SRP je ribonukleoproteinska

partikula izgrađena iz 7SL RNK, dužine oko 300 nukleotida, i 6 polipeptidnih lanaca. Polipeptidni

lanac P54 se svojim hidrofobnim regionom vezuje za signalnu sekvencu za ER, dok ostale

5

subjedinice ili stupaju u interakciju sa ribozomom ili su neophodne za translokaciju proteina kroz

membranu ER-a.

Receptor za SRP je integralni protein membrane ER-a izgrađen iz dve subjedinice, α i β.

Interakcija kompleksa SRP-ribozom-rastući polipeptid sa receptorom za SRP se pojačava

vezivanjem po jednog molekula GTP-a za subjedinicu P54 SRP-a i subjedinicu α receptora za

SRP (slika 3-3). Kada ove subjedinice vežu GTP dolazi do njihvog spajanja u pseudosimetrični

heterodimer. Nijedna od ove dve subjedinice sama za sebe nema kompletno aktivno mesto za

hidrolizu GTP-a, ali se njihvom interkacijom formiraju dva kompletna aktivna mesta.

Hidroliza vezanog GTP-a dovodi do deasmbliranja SRP-a i receptora za SRP i, na još

nepoznati način, posreduje u inserciji rastućeg proteina u kompleks za translokaciju (slika 3-4).

Nakon disocijacije SRP i receptor za SRP otpuštaju GDP, SRP se vraća u citoplazmu (slika 3), i

oba proteina su spremna da iniciraju usmeravanje novog kompleksa ribozom-rastući polipeptid

na membranu ER-a.

SRP i receptor za SRP ne samo da posreduju u interakciji kompleksa ribozom-rastući

polipeptid sa membranom ER-a, već i stimulišu elongaciju i terminaciju translacije rastućeg

polipeptida, s obzirom da je pokazano da je asocijacija ribozoma sa membranom ER-a

neophodna za sintezu proteina sekretornog puta, a da prisutvo SRP-a u odsustvu membrana

ER-a usporava elongaciju ovih proteina.

Slika 3. Kotranslaciona translokacija tokom sekretotnog puta sortiranja proteina. Objašnjenje u tekstu.

Ribozom vezan za kompleks za translokaciju nastavlja translaciju, a nesavijeni rastući

polipeptid ulazi u lumen ER-a korišćenjem energije oslobođene tokom translacije, bez utroška

dodatne energije (slika 3-4).

6

Kompleks za translokaciju ili translokon je integralni protein membrane ER-a, koji

formira kanal za prolaz rastućeg polipeptida u lumen ER-a. Translokon sisara je kompleks

Sec61, izgrađen iz subjedinica α, β i γ. Subjedinca α sadrži 10 α-heliksa koji prolaze kroz

membranu ER-a i formiraju centalni kanal kroz koji prolazi rastući polipeptid. Suženje na sredini

kanala je obloženo hidrofobnim izoleucinskim ostacima. Kompleks Sec61 poseduje i kratki

helijačni polipeptid koji može zatvoriti centralni kanal. On podleže konformacionim promenama

tokom tranlokacije proteina. Kada rastući polipeptid uđe u translokon, helijačni polipeptid ima

takvu konformaciju da je kanal otvoren, što dozvoljava translokaciju. Na ovaj način reguliše se

premeabilnost membrane ER-a: kada translokacije nema centralni kanal je zatvoren, a otvara

se tokom aktivne translokacije (slika 3-4).

Tokom translokacije rastući polipeptid direktno iz kanala za izlaz polipeptida u velikoj

subjedinici ribozoma ulazi u centralni kanal translokona, čime se onemogućava kontakt

rastućeg polipeptida sa citoplazmom i sprečava savijanje proteina, odnosno obezbeđuje da

nesavijeni polipeptid stigne u lumen ER-a.

Kako N-kraj rastućeg polipeptida ulazi u lumen ER-a, signalnu sekvencu prepoznaje i

seče signalna peptidaza. Signalna peptidaza je integralni protein membrane ER-a, asocirana

sa translokonom (slika 3-5), koja prepoznaje sekvencu sa C-strane signalne sekvence i seče

tačno određenu papitdnu vezu rastućeg polipeptida u lumenu ER-a. Translokacija rastućeg

polipeptida se nastavlja kako se on sintetiše, a translokon ostaje otvoren dok se translacija

nezavrši i celi novosintetisani polipeptid ne uđe u lumen ER-a.

1.2. Posttranslaciona translokacija sekretornih proteina kroz membranu endoplazmatičnog retikuluma

Kod većine eukariota proteini sekretornog puta ulaze u ER kotranslacionom

translokacijom. Kod kvasca, neki proteini ulaze u ER nakon završene translacije, što je

označeno kao posttranslaciona translokacija. Kao i kod kotranslacione translokacije protein

prolazi kroz membranu ER-a kroz translokon Sec61. Međutim, u proces nisu uključeni SRP i

receptor za SRP, tako da je kod posttranslacione translokacije direktna interakcija između

translokona i signalne sekvence kompletno sintetisanog proteina dovoljana za targetiranje u ER.

Jednosmerna translokacija je obezbeđena dodatnim proteinskim kompleksom Sec63 i

proteinom BiP, koji je član familije molekularnih šaperona Hsp70. Tetramerni kompleks Sec63 je

integralni protein membrane ER-a, koji se nalazi u blizini translokona, dok se BiP nalazi u

lumenu ER-a. Kao i drugi članovi familije šaperona Hsp70, BiP ima domen za vezivanje ATP-a i

vezuje se za i stabilizuje nesavijene ili parcijalno savijene polipeptidne lance.

Kada N-kraj kompletno sintetisanog protena uđe u lumen ER-a, signalna peptidaza seče

signalnu sekvencu, kao i kod kotranslacione translokacije (slika 4-1). Interkacija kompleksa

BiP-ATP sa luminalnim delom kompleksa Sec63 dovodi do hidrolize ATP-a praćene

konformacionom promenom BiP, koja je takva da olakšava njegovo vezivanje za polipeptidni

lanac koji ulazi u lumen ER-a (slika 4-2). S obzirom da je Sec63 lociran u blizini translokona,

BiP se aktivira na mestima gde polipeptid ulazi u lumen ER-a. U odsustvu BiP, nesavijeni

polipeptid se kreće u oba smera (ka lumenu ER-a i nazad ka citoplazmi) (slika 4-1). Ovakvo

7

nasumično kretanje retko za rezultat ima ulazak celog polipeptida u lumen ER-a. Vezivanjem

kompleksa BiP-ADP za deo polipeptida koji se našao u lumenu ER-a obezbeđuje jednosmernu

posttranslacionu translokaciju. Kako se translokacija proteina nastavlja, novi kompleksi

BiP-ADP se sukcesivno vezuju za njega, omogućavajući ulaz kompletnog polipeptida u lumen

ER-a za samo nekoliko sekundi (slike 4-3 i 4-4). Nešto sporije, proteini BiP menjaju vezani ADP

sa ATP-om, dovodeći do oslobađanja polipeptida koji se dalje savija u nativnu konformaciju

(slike 4-5 i 4-6). Reciklirani kompleks BiP-ATP je spreman za novu interakciju sa Sec63.

Funkcija proteina BiP je važan primer kako se hemijska energija olobođena hidrolizoma

ATP-a koristi za mehaničko kretanje proteina kroz membrane.

BiP i kompleks Sec63 učestvuju i u kotranslacionoj translokaciji, ali su detalji vezani za

njihovu funkciju u ovom procesu manje poznati. Smatra se da deluju u ranoj fazi procesa, kao

što je pridržavanje signalne sekvence u centralnom kanalu translokona.

Slika 4. Posttranslaciona translokacija tokom sekretotnog puta sortiranja proteina. Objašnjenje u tekstu.

8

1.3. Insercija proteina u membranu endoplazmatičnog retikuluma

Svi integralni proteini različitih membrana (membranski proteini) u ćeliji odlikuju se

jedinstvenom toplogijom u odnosu na membranu. Topologija membranskog proteina

podrazumeva koliko puta određeni protein prolazi kroz membranu i kakva je orijentacija

transmembranskih segmenata (slika 5). Ključni elementi proteina koji određuju njegovu

topologiju su sami aminokiselinski nizovi koji prolaze kroz membranu (transmembranski

segmenti). Oni se obično sastoje iz α-heliksa dugog 20 do 25 hidrofobnih aminokiselina, koje

omogućavaju energetski favorizovanu interakciju sa hidrofobnom unutrašnjosti fosfolipidnih

membrana.

Integralni proteini membrana ER-a, Goldži kompleksa, lizozoma i plazma membrana

sintetišu se na hrapavom ER-u i odmah se inseriraju u membranu u jednistvenoj toplogiji, koju

zadržavaju tokom sekretornog puta soritranja proteina, kako bi stigli do svog krajnjeg odredišta.

Isti segmenti membranskih proteina orijentisani su ka ili suprotno citosolu kao i kada protein

stigne do svog krajnjeg odredišta, što znači da se finalna orijentacija membranskih protena

uspostavlja još tokom sinteze na membrani hrapavog ER-a. Proces insercije proteina u

membranu ER-a predstavlja modifikaciju osnovnog mehanizma koji se koristi za translokaciju

solubilnih proteina kroz membranu ER-a tokom sekretornog puta sortiranja proteina. Ključnu

ulogu imaju topogenične sekvece – sekvence koje određuju inserciju i orijentaciju proteina u

membrani ER-a. Neke topogenične sekvence, kada se insercija u membranu završi,

predstavljaju transmembranske regione proteina.

Slika 5. Topološki tipovi membranskih proteina. Objašnjenje u tekstu.

Najveći broj membranskih proteina spada u jedan od četri topološka tipa (slika 5).

Proteini topoloških tipova I, II i III sadrže jedan transmmbranski α-helijačni region (eng.

single-pass proteins). Proteini tipa I poseduju N-terminalnu signalnu sekvncu za ER koja se

seče. Njihvo hidrofilni N-kraj je orijentisan ka luminalnoj (egzoplazmatičnoj) strani membrane, a

hidrofilni C-kraj ka citoplazmatičnoj strani. Proteini tipa II ne sadrže signalnu sekvncu koja se

seče, njihovi N-krajevi su orijantisani ka citoplazmatičnoj strani, a C-krajevi ka egzoplazmatičnoj.

9

Proteini tipa III imaju istu orijentaciju kao proteini tipa I, ali ne sadrže signalnu sekvncu koja se

seče. Različite toplogije ovih tipova proteina su posledica različitih mehanizama za

uspostavljanje orijentacije transmembranskih regiona. Proteini tipa IV sadrže dva ili više

transmembranska segmenta (eng. multipass proteins). Poseban topološki tip su proteini koji ne

sadrže hidrofobni transmembranski region, već su za membranu usidreni pomoću specifičnog

fofolipidnog sidra, koji je sastavni deo membrane (slika 9).

Pozicioniranje proteina tipa I zahteva dve vrste topogeničnih sekvenci: N-terminalnu

signalnu sekvencu za ER i sidro sekvencu za zaustavljanje transfera (eng. stop-transfer

anchor sequence, STA). Nakon što kompleks ribozom-rastući polipeptid asocira sa

translokonom u membrani ER-a, dolazi do sečenja N-terminalne signalne sekvence (slika 6-1),

na isti način kao i kod solublnih proteina skeretornog puta sortiranja proteina. Elongacija i

translokacija rastućeg polipeptida se nastavlja dok sekvenca STA ne bude sintisana i smeštena

u kanalu translokona, gde ona zaustavlja translokaciju rastućeg polipepitda (slike 6-2 i 6-3).

Sekvenca STA se pomera bočno u odnosu na translokon, prolazeći između subjedinica

translokona, što dovodi do usidravanja rastućeg polipeptida u membranu (slika 6-4). Smatra se

da je stuktura translokona Sec61 takva on može da se otvori kao školjka, omogućavajući

hibrfobnom transmembranskom segmentu (sekvenci STA) da se pomoeri bočno u odnosu na

subjedinice translokona. Kako se sinteza proteina nastavlja, lanac se istiskuje u citoplazmu kroz

mali kanal između ribozoma i translokona (slika 6-5). Kada se završi translacija, ribozomske

subjedinice dicociraju u citoplazmu, ostavljajući proten usidren u membrani (slika 6-6).

Slika 6. Insercija i orijentacija proteina tipa I. Objašnjenje u tekstu.

Pozicioniranje proteina tipa II zahteva samo jednu vrstu unutrašnje topogenične

sekvence, nazvane signalna sidro sekvenca (eng. signal anchor sequence, SA), koja

istovremeno predstavlja signalnu sekvencu za ER i služi za usidravanje proteina u membranu.

Nakon sinteze sekvence SA u citoplazmi, SRP se vezuje za kompleks ribozom-rastući

polipeptid i usmerava ga ka membrani ER-a. Ovo je slično usmeravanju solubilnih proteina

sekretornog puta, sa razlikom da signalana sekvenca nije na N-kraju i da se ne seče. Rastući

10

polipeptid se orijentiše u translokonu tako da se njegov N-kraj usmerava ka citoplazmi (slika

7a-1). Ovakva orijentacija posredovana je pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostacima

koji se nalaze sa N-strane sekvence SA i koji teže da ostanu sa citoplazmatične strane

memebrane. Kako teče elongacija polipeptidnog lanca, on ulazi u lumen ER-a, sekvenca SA se

pomora bočno u odnosu na translokon i usidrava rastući polipeptid u membranu (slika 7a-2).

Kada se završi sinteza polipeptida, njegov C-kraj se oslobađa u lumen ER-a, a ribozomske

subjedinice disociraju i oslobađaju se u citoplazmu.

Slika 7. Insercija i orijentacija proteina tipa II (a) i tipa III (b). Objašnjenje u tekstu.

Pozicioniranje prtoeina tipa III je slično pozicioniranju proteina tipa II i zahteva prisustvo

samo unutrašnje sekvence SA. Razlika u odnosu na proteine tipa II je u lokaciji pozitivno

naelektrisanih aminokisleina, koje se u ovom slučaju nalaze sa C-strane sekvence SA i

uslovljavaju da se budući transmembranski segment proteina, odnosno sekvenca SA, orijentiše

u translokonu tako da je njen C-kraj usmeran ka citoplazmi, a N-kraj ka lumenu ER-a (slika

7b-1). Elongacija C-kraja rastućeg plipeptida se zavšava u citoplazmi (slika 7b-2).

Prethodno je spomenuto nekoliko tipova topogeničnih sekvenci: N-terminalna signalna

sekvnca za ER, unutrašnja sidro sekvenca za zaustavljanje transfera i unutrašnja signalna sidro

sekvenca. Sekvenca STA imaju dvostruku funkciju: da zaustavi prolaz polipeptidnog lanca kroz

translokon i da omogući premeštanje rastu’eg polipetida iz translokona u membranu, kako bi

postala transmembranski segment, odnosno kako bi usidrila protein za membranu. Sekvenca

SA, takođe, ima dvostruku funkciju: služi kao signalna sekvenca za ER i kao sekvenca za

usidravanje proteina u membranu. Sekvence SA se svojim N- ili C-krajem graniče sa pozitivno

naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, koji na još nepoznat način, određuju orijentaciju

sekvence SA kroz membranu i time da li ili ne ostatak proteina koji se sintetiše ulazi u lumen

ER-a ili ne. Kraj sekvence SA koji se graniči sa pozitivnim aminokisleinskim ostacima uvek je

orijentisan ka citoplazmi.

11

Membranski proteini koji jednom prolaze kroz membranu sadrže jednu ili dve

topogenične skevence (slika 8). Tako, proteini tipa I imaju N-terminalnu signalnu sekvencu i

sekvencu STA, dok proteini tipa II i III imaju jednu sekvencu SA. Razlike u orijentaciji proteina

tipa II i III zavise sa koje strane sekvnce SA se nalaze pozitivno nalelektrisane aminokiseline.

Kod proteina tipa II, one se nalaze sa N-strane sekvence SA (SA-II), tako da se njihov N-kraj

nalazi u citoplazmi, dok se kod proteina tipa III nalaze sa C-strane sekvence SA (SA-III) i kod

njih se C-kraj nalazi u citosolu.

Slika 8. Topogenične sekvence u različitim toploškim tipovima membranskih proteina. Objašnjenje u tekstu.

Proteini sa većim brojem transmembranskih segmenata, kao i proteini tipa II i III, nemaju

signalnu sekvencu za ER koja se seče. Kod ovih proteina svaki α-helijačni segment može

funkcionisati kao unutrašnja topogenična sekvenca, u zavisnosti od njene lokalizacije i od

prisustva pozitivno nalelektrisanih aminokiselinskih ostataka: može usmeravati protein ka

membrani ER-a, usidriti protein za membranu ER-a ili zaustaviti prolaz proteina kroz translokon.

U zavisnosti da li se N-kraj ovih proteina nalazi u citoplami ili lumenu ER-a, oni se dele u dva

tipa. Orijentacija N-kraja ovih proteina je određena topogeničnom sekvencom koja je najbliža

N-kraju. Tako, proteini tipa IV-A, čiji se N-kraj nalazi u citosolu, sadrže sekvence SA-II koje se

naizmenično smanjuju sa sekvencama STA (slika 8). Proteini tipa IV-B, čiji se N-kraj nalazi u

lumenu ER-a, prvo imaju sekvencu SA-III, iza koje se naizmenično smenjuju sekvence SA-II i

STA. Ukoliko proteina tipa IV imaj paran broj transmembranskih segmnata, njihova oba kraja će

biti orijentisana sa iste strane membrane, a ako imaju neparan sa surprotnih strana membrane.

Neki proteini čija je krajnja destinacija površina ćelije, incijalno se sintetišu i usidravaju

kao proteini tipa I, a zatim se seku i njihov deo koji se nalazi u lumenu ER-a se vezuje za

12

fosfolipidno sidro u membrani – glikozilfosfatidilinozitol (GPI) (slika 9). Kratku aminokisleinsku

sekvencu u luminalnom delu proteina, a blizu transmembranskog regiona, prepoznaje enzim

transamidaza, locirana u membrani ER-a. Transamidaza istovremeno seče luminalni deo

proteina i novoformiranu karboksilnu grupu oslobođenog proteina vezuje za amino grupu već

sintetisanog membranskog sidra (GPI).

Slika 9. Topogenične sekvence u različitim toploškim tipovima membranskih proteina. Objašnjenje u tekstu.

1.4. Modifikacije, savijanje i kontrola kvaliteta proteina u endoplazmatičnom retikulumu

U lumenu ER-a protein biva pokriven molekularnim šaperonima kako bi se zaštitio od

visoke koncentracije drugih proteina i dobio vreme da zauzme pravilnu konformaciju.

Subjedinice multimernog proteina, takođe, asembliraju u lumenu ER-a. Disulfidne veze se

formiraju u mnogim proteinima koje ćelija sekretuje i u egzoplazmatičnim domenima

membranskih proteina ER-a. Protein disulfid izomeraza, prisutna u lumenu ER-a, katalizuje

formiranje i rearanžiranje disulfidnih veza. Mnogi proteini u lumenu ER-a podležu

posttranslacionoj glikozilaciji. Bočni oligosaharidni lanci mogu pomagati pravilno savijanje

glikoproteina, štititi zreli protein od proteolize, učestvovati u adheziji među ćelijama ili

funkcionisati kao antigeni.

Kada zauzme odgovarajuću konformaciju i pretrpi posttranslacione modifikacije neki

proteini se transportuju u Goldži kompleks i dalje “putuje” u odgovarajuće organele ili do plazma

membrane. Samo pravilno savijeni proteini i proteinske subjedinice asemblirane u

multisubjedinične komplekse se transportuju iz ER- u Goldži kompleks. Pogrešno savijeni

proteini i neasmblirane subjedince multiproteinskih kompleksa u ER-u obično se transportuju

nazad u citoplazmu, gde se degraduju ubikvitin-proteazomiskim sistemom.