sondas genicas trabajo.doc

8/9/2019 sondas GENICAS trabajo.doc

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Facultad de Medicina

SONDAS GÉNICASCOMERCIALES

DOCENTE:

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CURSO:

ESTUDIANTE:


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INTRODUCCIÓN

Desde hace muchos años los investigadores habían utilizado el código genético para

determinar la secuencia de ADN que codifica la serie de aminoácidos que componen

parte de la proteína de la hemoglobina. ero no tenían medios para realizar un e!amen

aislado del ADN indicador de entre el restante ADN de los "##.### genes de una célula

humana$ para poder saber si el gen era normal o no.

osteriormente$ después de varios estudios se utilizaron fragmentos de ADN clonadoscon secuencias que se igualan con una secuencia de ADN del gen ob%eto de interés &por

e%emplo$ el gen de la hemoglobina' llamadas sondas génicas$ ( ho( en día se le está

dando mucha importancia al estudio de enfermedades genéticas$ (a que estas producen

un efecto devastador a nivel mundial$ afectando las poblaciones humanas$ por ello la

producción de sondas génicas$ que permiten la detección temprana de estas

enfermedades$ es importante en el ámbito medico ( científico$ (a que permiten realizar

diagnósticos más e!actos e incluso diagnósticos predictivos de estas enfermedades$ para

de este modo estudiarlas ( tratarlas.

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OBJETIVOS

Dar información *til para aumentar el conocimiento de

nuestros compañeros acerca del tema +ondas ,énicas

-rindar puntos claros acerca del concepto$ importancia$

detección de las sondas ,énicas

+aber la utilidad que tienen las +ondas ,énicas

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SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

/uchos métodos de análisis de ADN implican el uso de sondas de ácidos nucleicos ( el proceso de hibridación

Sonda0na sonda genética consiste en un fragmento de ADN complementario a la secuenciaque se busca ( a la que se unirá de manera específica. 1a unión al ADN$ puededetectarse marcando la sonda con 2etiquetas químicas2

3l uso de 45 ( de sondas moleculares que reconozcan secuencias de ADN asociadas aenfermedades genéticas$ permite detectar al gen involucrado$ en cantidades ínfimas

material genético obtenido de te%ido de adultos o de embriones de humanos ( animales.

0na sola sonda puede reconocer su homólogo *nico entre millones. 1a sonda precisa enun mínimo de )# nucleótidos.

6écnicas de la biología molecular resultan ser importantes herramientas7

8 identificación de individuos ( sus productos8 detección ( diagnostico de enfermedades tanto genéticas como infecciosa8 selección de individuos portadores de un genotipo especifico como progenitores

en programas de me%oramiento genético

1a información genética de un organismo dado está contenida en el ADN &ácidodeso!irribonucleico' que se ubica en el n*cleo de cada célula de este organismo.or su parte$ un nucleótido está formado por una az*car$ un grupo fosfato ( una decuatro diferentes bases nitrogenadas. 3stas bases son representadas de manera simpleutilizando la inicial en ma(*scula de su nombre$ de modo que7A7 Adenina67 6imina,7 ,uanina47 4itosina.

Aunque todos los organismos de una misma especie tienen características comunes$ los

genes que codifican para esas características ( la naturaleza misma de la característicano son idénticas en todos los individuos$ pues en millones de años de evolución se hanido produciendo pequeños cambios en los genes que codifican para característicasindividuales$ los que han sido heredados a las generaciones siguientes.

Sondas de ácidos nucleicos1as sondas de ácidos nucleicos son secuencias de ADN o de A5N que se han marcado$

radiactivamente o no$ ( que se pueden utilizar para detectar fragmentos de ADN o de

A5N con homología de secuencia. 1as sondas de ácidos nucleicos son generalmente

sondas de ADN. ueden proceder de m*ltiples fuentes inclu(endo secuencias de ADN

genómico aleatorias$ secuencia de ADNc$ genes específicos ( secuencias de

oligonucleótidos obtenidos mediante síntesis basada en la secuencia de proteínas. 0na

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sonda de ADN puede marcarse de diferentes maneras$ (a sea mediante nucleótidos

marcados con ) o sistemas no radiactivos de marcado$ como los nucleótidos

biotinilados que se introducen en las moléculas de ADN. 1os sitios donde las sondas de

ADN marcadas radiactivamente hibridan con las secuencias de ADN complementariossobre un filtro de celulosa se pueden localizar mediante autorradiografías mientras que

el marcador con biotina se puede detectar por su elevada afinidad a la estreptavidina.

i!"idaci#n de los ácidos nucleicos1a hibridación con los ácidos nucleicos implica la mezcla de ADN de diferentes

orígenes que han sido desnaturalizados por calor o tratamiento con álcalis para

separarlos en hebras *nicas ( permitir el empare%amiento de las bases complementarias

de las secuencias homólogas en las condiciones adecuadas. +i una de las fuentes de

ADN se ha marcado de alguna manera$ es decir$ si se trata de una sonda de ADN$

pueden identificarse secuencias específicas. 1os dos métodos principales de hibridación

de los ácidos nucleicos son el +outhern blot ( el Nothern blot.

i!"idaci#n $o" sondas1as sondas son segmentos de ADN o A5N que han sido marcados con enzimas$sustratos antigénicos$ quimioluminiscencia o radioisópotos$ los que se pueden unir conuna alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico.

3!isten varias condiciones que afectan el proceso de unión o hibridación entre la sonda( el segmento blanco$ como7

8 6emperatura8 concentración de sal

8 p: de la reacción.

Indicaciones $a"a el uso de sondas en el la!o"a%o"io1as sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de unamuestra clínica &e!pectoración$ orina$ etcétera' o para confirmar la identificación de uncultivo que por otros métodos tarda varios días &1egionella pneumophila$ 4hlam(diatrachomatis$ etc'.

Además$ las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ para evaluar la respuestadel huésped a un agente infecciosos en particular ( también para determinar la e!tensiónde la infección mediante el estudio de muestras de te%idos de varios órganos.

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TECNOLOG&AS GENÉTICAS1os científicos han desarrollado una serie de técnicas bioquímicas ( genéticas mediantelas cuales el ADN puede ser separado ( transferido de una célula a otra. Algunos de esosmétodos de laboratorio a(udan a los investigadores a estudiar las propiedades de losgenes en la naturaleza &permiten$ por e%emplo$ comparar los ADN de diferentesanimales para establecer distancias evolutivas'.


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pequeños los que corren más rápido en el gel. 1os fragmentos de ADN del gel se

desnaturalizan a continuación con álcalis$ convirtiéndose en fragmentos de hebra

simple. 0na copia ?permanentemente@ de estos fragmentos se transfieren a un filtro de

nitrocelulosa que se une al ADN monocatenario marcado radiactivamente con ) quehibridará con el fragmento de ADN homólogo del +outhern blot$ el cual a su vez puede

ser detectado mediante autorradiografía.

Secan%e de Sou%'e"n(ara encontrar una mutación de un gen determinado en una muestra de ADN loscientíficos usan una sonda de ADN$ un tramo de ADN de un solo filamento quecoincide con parte del gen ( se une a un átomo radioactivo.

1a sonda de un solo filamento busca ( se une al gen. 1as señales radioactivas de lasonda aparecen después en la radiografía$ mostrando dónde se empare%an la sonda ( el

gen.

No"%'e"n !lo%3l Northern blot difiere del +outhern blot en que utiliza A5N mensa%ero como ácidonucleico diana en el mismo procedimiento. 3l A5Nm es mu( inestable debido a las

ribonucleasas celulares intrínsecas. 3l uso de inhibidores de ribonucleasas permite el

aislamiento del A5N mensa%ero que$ si se corre en un gel electroforético$ se puede

transferir a un filtro. :ibridando el blot con una sonda de ADN marcada

radiactivamente se puede determinar el tamaño ( la cantidad del transcrito de

mensa%ero$ denominándose a esta técnica Northern blot. 3n una alteración génica en la

que no se han identificado mutaciones en la secuencia codificante$ una alteración en el

tamaño del transcrito sugiera la posibilidad de una mutación en una región nocodificante del gen$ como la zona de unión intróne!ón. 3l Northern blot puede

utilizarse también para demostrar un modelo de e!presión diferente de un determinado

gen en diferentes te%idos o en diferentes estadios del desarrollo.

i!"idi)aci#n con sondas1os recientes avances en el campo de la biología molecular ( el conocimiento cada vezma(or de los virus que causan infecciones importantes en la comunidad$ han hecho

posible que en el momento se disponga de fragmentos de ADN del material genómicoespecífico ( altamente conservado de un determinado virus que se utiliza como sonda.

8 ara estudios de A5N se requieren te%idos frescos congelados rápidamente connitrógeno líquido ( para estudios de ADN se pueden emplear tanto te%idosfi%ados como congelados.

8 1as sondas preparadas a partir del ADN o A5N específico se pueden purificar por clonación o copia en un plásmido del ADN o del ADNc &complementario'obtenido de transcripciones de A5N. 0tilizando el plásmido como vector (

bacterias como huéspedes$ es posible producir sondas genéticas en grandescantidades.

8 1os fragmentos de ADN o A5N &sondas' se someten a un análisis dehibridización &o apareamiento con el complementario que se encuentra en el

material que se va a probar'= éste se puede hacer (a sea con ADN o A5N tisular

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en solución$ directamente en te%idos o células por hibridización in situ$ o se puede efectuar sobre ADN o A5N transferidos en membranas de nitrocelulosa a partir de una electroforesis en gel de agarosa.

1a sensibilidad de las sondas depende de la cantidad de material genético para lahibridización ( su especificidad depende de la calidad de la sonda.

0na de las principales limitaciones de esta técnica se ve cuando e!iste una ba%a cantidadde ADN o A5N ( éste no se descubre. /uchas de estas pruebas tienen una sensibilidadque les permite descubrir "#;"#> moléculas o aun "#"#9 moléculas= sin embargo$esto puede ser insuficiente en muchas situaciones clínicas.

Sondas *+nicas co,e"ciales

8 1a caracterización de genes que codifican caracteres cuantitativos con

importancia económica o de genes causantes de enfermedades congénitas hallegado a tener mucha importancia.

8 or su parte las enfermedades genéticas$ aunque menos diseminadas$ producenun resultado similar$ afectando poblaciones humanas ( animales.

Ca"ac%e"-s%icas

8 4onsiste en un fragmento de ADN complementario a la secuencia que se busca (a la que se unirá de manera específica.

8 3stas etiquetas pueden ser moléculas marcadas con radiactividad o moléculas portadoras de átomos fluorescentes que pueden ser detectadas por autorradiografía la primera o con detectores de fluorescencia las segundas

8 3l diagnóstico implica un entendimiento de la causa ($ si es posible$ unconocimiento de los factores contribu(entes significativos que influ(an en laaparición de la enfermedad.

8 1a identificación de los agentes causales o etiológicos de la enfermedad es hechamediante la aplicación de métodos científicos de investigación.

DEMOSTRACIÓN DEL AGENTE

ueden ser7

8 Altamente sensitivos.

8 Adicionalmente utilizados para una demostración definitiva de que unorganismo pertenece a una especie particular

Se $ueden da" a %"a.+s de

• Antígenos7 son sustancias moleculares comple%as ( los anticuerpos específicos Cormados para ellos$ reconocen figuras particulares conocidas como determinadores de

antígenos o epítopos.

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• 3pítopos7 son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula que sonreconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un 645

específico.Anticuerpos7 1a 5.4. son más comunes para los anticuerpos policlonales que para losanticuerpos monoclonales

/RUEBAS DE DETECCIÓN USANDO ANTICUER/OS

8 Enmunofluorescencia ( 3lisa$ se usa para la detección de antígenos virales en la preparación de diagnósticos.

8 3l anticuerpo fluorescente es usado para detectar antígenos en los te%idos.8 31E+A$ es usado para detectar antígenos en fluidos o e!tractos crudos de te%idos.8 6odos los organismos vivientes poseen ADN e!cepto los virus q poseen A5N.8 +.,. es un pequeño segmento de bases de ADN$ el cual se combinara con un

filamento homologo de ADN.8 1a +.,. puede ser altamente sensible ( mu( especifica.8 3l microorganismo de ADN puede ser detectado en las secciones de te%ido

fi%adas con un proceso llamado hibridizacion in situ.

SONDAS DE ADN 0 ARN

8 ara identificar cada fragmento no es necesario determinar la secuencia total desus bases los métodos mas usados para identificar un ADN o un A5N

8 1as sondas de ADN son mu( *tiles para fines diagnósticos8 Cragmento de cadena simple de ADN o A5N de varios cientos o miles de

nucleótidos de longitud$ que permite poner de manifiesto la presencia de unasecuencia complementaria en una muestra biológica

8 1a :ibridación del ADN por una sonda de ADN se llama técnica de +outhern-lot. 1as sondas génicas permiten encontrar un determinado trozo de ADN deunas pocas bases pares en una cadena de > ! "#F bases pares. ( ello lo consiguegracias al marca%e con )

8 4uando el uso de una sonda génica$ marcada con un producto fluorescente$ sehace sobre una célula$ a la técnica se la denomina 2fluorescence in situh(bridization2 &CE+:'.

8 3l A5N mensa%ero$ procedente del ADN$ puede volver a reconstituirse en ADNmediante la enzima transcriptasa inversa$ ( ser clonado en una bacteria. 3steADN no tiene intrones$ es decir$ equivale a los a!ones del ADN de la célula. +e

le denomina ADN complementario &ADNc'$ siendo utilizado para actuar comosonda génica.

MARCADORES MOLECULARES

8 3stas técnicas utilizan los fundamentos de la técnica de 45 ( las más usadasinclu(en polimorfismos en el largo de fragmentos de restricción &5C1'$n*mero variable de secuencias nucleotídicas repetidas en tandem &GN65'$

polimorfismos conformacionales de hebra simple &++4'$ electroforesis en geldenaturante en gradiente &D,,3'$ amplificación al azar de ADN polimórfico&5AD' ( por *ltimo$ los métodos que usan el polimorfismo de secuenciasnucleotídicas cortas repetidas en tandem como son los microsatélites

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Es%a iden%i1icaci#n $e",i%e2

8 +eleccionar los progenitores en un programa de me%oramiento genético

8 Edentificar el gen &o grupos de ellos' que codifican para la característica aseleccionar$ pero cu(o genotipo es difícil de visualizar a simple vista.8 Determinar a qué variedad genética pertenece un individuo$ estimar su pool

genético ( determinar su origen.

Elec%"o1o"esis en *el de *"adien%e desna%u"ali)an%e

i!"idaci#n in si%u 1luo"escen%e 34IS5

CE+: &del ingles fluorescent in situ h(bridization' es una herramienta tecnológica

relativamente nueva que combina la citogenética convencional con la genética

molecular que se basa en la capacidad *nica de una hebra sencilla de ADN$ por e%emplo$una sonda para unirse o hibridar con su secuencia complementaria donde quiera que

ésta esté localizada en la e!tensión metafasica aunque con menos frecuencia que otros

métodos usados para el análisis cromosómico$ CE+: puede también usarse para estudiar

cromosomas durante la interfase$ periodo de descanso entre las divisiones celulares de

aquí que este área de estudio se denomine interface citogenética.

3n esta técnica la sonda de ADN se con%uga con nucleótidos modificados$ los cuales$

después de hibridar con la muestra problema$ permiten que la región en la cual ha

ocurrido la hibridación se pueda visualizar con luz ultravioleta. 3sta técnica CE+: tiene

ahora una amplia difusión para diagnósticos clínicos$ (a que sus resultados se obtienen

rápidamente.

Di1e"en%es %i$os de sondas 4IS

Sondas cen%"o,+"icas4onsisten en secuencias repetitivas de ADN a nivel centromérico en un cromosoma

específico. +e utilizan en diagnostico prenatal para una detección rápida de aneuploidías

&trisomia "$ "$ )"' usando células en interfase obtenidas de las vellosidades

coriónicas.

Sondas unilocus

+on específicas para un locus particular. +e utilizan con é!ito en la identificación demin*sculas deleciones ( duplicaciones submicroscópicas. 3n grupo de trastornos

conocidos como síndromes por microdeleciones

/in%a" c"o,oso,as4onsiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en particular.

4uando esta mezcla de sondas se usa en una hibridación$ el cromosoma entero floorece$

por lo que decimos que esta ?pintado@. intar cromosomas es mu( *til para caracterizar

reordenamientos comple%os$ tales como translocaciones sutiles ( para identificar el

origen de material adicional de un cromosoma$ como pequeños marcadores de

supernumerarios o anillos.

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/in%a" a la in.e"sa3n este procedimiento una porción de material cromosómico no identificado$ pequeños

marcadores supernumerarios o anillos$ se usa para pintar por hibridación una metafase

normal. 3l cromosoma no identificado se obtiene por separación de células activadas por fluorescencia$ el cual es amplificado utilizando la reacción en cadena de la

polimerasa &45' para preparar dicha pintura. 3l origen del segmento no identificado se

obtiene mediante la identificación del cromosoma sobre el cual se hibrida.

Detección a nivel de reacciones inmunológicasHay numerosos marcadores en los antígenos de los eritrocitos

SONDEOS GÉNICOS EN 6MBITOS CL&NICOS

Ca"ac%e"-s%icas2

8 3l ,: nos acerca a un nuevo tipo de práctica clínica$ la que se ha dado enllamar /edicina ,enómica ( redictiva.8 Determinación de anomalías genéticas.8 5evolución Del diagnóstico ( el pronóstico

/osi!ilidades de dia*n#s%ico *en+%ico

8 +ondeo prenatal8 Amniocentésis8 3!tracción de vellosidades coriónicas &transcervical o transabdominal '.8 3!tracción ( purificación de sangre periférica materna muestras de células

fetales.

8 +ondeo neonatal7 Cenilcetonuria$ :ipotiroidismo congénito$ ,alactosemia$Anemia falciforme$ 6a(+achs.

ESTUDIOS EN EL LABORATORIO

8 Antes7 pruebas se reducían al cariotipo.8 :erramientas de la Engeniería ,enética ( con la información del ,:.8


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CONCLUSIONES

1as sondas génicas tienen una gran importancia para el diagnostico temprano (

la predicción de la aparición de diferentes enfermedades génicas.

3l A5N mensa%ero puede ser usado como una sonda génica.

1as sondas génicas una vez unidas a sus homólogos de ADN pueden ser

detectadas mediante autorradiografias o detectores de fluorescencia.

3l diagnostico predictivo de enfermedades génicas puede causar un gran

impacto emocional sobre el paciente$ es por ello que es importante considerar

esto antes de informarlo sobre su enfermedad.

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BIBLIOGRA4IA

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