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SNPs e suas aplicações
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCENTRO DE BIOTECNOLOGIADISCIPLINA DE GENÔMICA II
Karine BegniniDoutoranda em Biotecnologia
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CONCEITO
Variação genômica mais abundante
1 a cada 300 nucleotídeos 10 milhões no genoma humano
Ocorrência NATURAL
90% das variações genômicas são SNPs
MUTANTE ou MUTAÇÃO
X X
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Posições de base única no DNA genômico, em que ocorrem diferenças nos ALELOS de um mesmo gene, em indivíduos normais de uma população.
1%
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CONCEITO
Mutações pontuais (INSERÇÃO/DELEÇÃO) não são SNPs!
cSNP: bases variantes que ocorrem no cDNA (RNA)
Podem ocorrer em qualquer parte do genoma, mas são mais frequentes em regiões não codificantes
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CLASSIFICAÇÃO
NÚMERO DE ALELOS
• Bi/Di-alélicos dois alelos diferentes*
• Tri-alélicos três alelos diferentes
• Tetra-alélicos quatro alelos diferentes
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CLASSIFICAÇÃO
TIPO DE BASE
• Transição substituição de uma purina por outra purina (C-T) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (G-A)
• Transversão substituição de uma purina por uma pirimidina (C-A) (C-G) (T-A) (T-G)
2/3 de todos os SNPs são C-T
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EFEITOS NA TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO
POLIMORFISMO SINÔNIMO OU SILENCIOSO
Substituição do nucleotídeo resulta em um códon que codifica o MESMO aminoácido (e portanto proteínas IGUAIS)
POLIMORFISMO NÃO SINÔNIMO
Substituição resulta em um novo códon (proteínas ALTERADAS)
alteração no códon modifica o aminoácido
alteração no códon resulta em um stop códon
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DNA SNP T para A
Códon no RNAGAU para GUU
AminoácidoAspartato para Valina
Mudança na proteína
Aspartato Valina
mRNA
C T
G A U G U U
GAU GUU
C AA A
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IMPORTÂNCIA
“Combustível” que dirige a evolução
Resposta a tratamentos médicos
Suscetibilidade a doenças
MEDICINA PREVENTIVA
MEDICINA INDIVIDUALIZADA
Somente ~15% dos SNPs são comuns aos demais primatas
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APLICAÇÕES
MEDICINA INDIVIDUALIZADA
Câncer
Doenças Cardiovasculares
Doenças Degenerativas
Diabetes
Problemas Reprodutivos
MARCADORES BIOLÓGICOS
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APLICAÇÕES
MEDICINA DE POPULAÇÕES
Marcadores genéticos de regiões associadas a doenças/características relacionadas a populações específicas
AGROPECUÁRIA
Marcadores genéticos pra doenças
Reprodução e Produtividade
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APLICAÇÕES
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TRABALHOS GPO
Arg72Pro SNP da p53:
CCC PROLINA
CGC ARGININA
Pro/Pro
Pro/Arg
Arg/Arg
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PROLINA
ARGININA • sem histórico câncer• baixo peso ao nascer• indivíduos pele branca
• indivíduos pele negra• histórico familiar câncer
Arg72Pro SNP da p53:
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TRABALHOS GPO
Arg72Pro SNP da p53:
CCC PROLINA
CGC ARGININA
Pro/Pro
Pro/Arg
Arg/Arg
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PRO/ARG
ARG/ARG• baixa associação com aborto
• alta associação com aborto
Arg72Pro SNP da p53:
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APLICAÇÕES
TRABALHOS GPO
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MÉTODOS DE DETECÇÃO
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FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
SEQUENCIAMENTO
• Seqüenciamento Sanger, seqüenciamento de segunda geração (Roche 454, Solexa-Illumina; Solid; Pirosequenciamento)
• Vantagem: avaliação de muitos SNPs ao mesmo tempo
• Desvantagem: custo elevado; interpretação errônea dados.
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PCR RFLP
O fragmento de gene contendo o SNP de interesse é amplificado com primers específicos por PCR, purificado e submetido a um tratamento
com uma enzima de restrição (digestão) que reconheça apenas um dos alelos. Posteriormente, os fragmentos são separados por eletroforese
para diferenciação dos alelos por tamanho.
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digestão digestão –– AciIAciI ou ou SfcISfcI
sanguesangue DNADNA PCRPCR eletroforeseeletroforese ananáálise em gellise em gel
eletroforeseeletroforese
360C
2hClivagem ezimática Clivagem ezimática
BstU BstU II
sanguesangue DNADNA PCRPCR eletroforeseeletroforese ananáálise em gel lise em gel
eletroforeseeletroforese
de agarose de agarose
ananáálise em gellise em gelananáálise em gel lise em gel de agarose de agarose
FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
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Tabela 1 – Seqüências dos primers para a detecção do polimorfismo do códon 72 no éxon 4
Tabela 2 – Fragmentos do polimorfismo do códon 72 obtidos com a RFLP e seus respectivos
genótipos
Fragmentos
(pb)
Genótipos
Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg
199 Sim Sim Não
113 Não Sim Sim
86 Não Sim Sim
PCR RFLP Arg72Pro SNP da p53:
Pro/Pro Pro/ArgArg/Arg
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• Vantagens:
1.não requer equipamentos avançados2. simples
PCR RFLP
• Desvantagens:
1.Extremamente laboriosa2.Um único SNP por vez3.Existência de enzima de restrição que diferencie os dois alelos
Pro/Pro Pro/ArgArg/Arg
FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
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FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
Hibridização – real time PCR
Sonda Taqman®: detecta sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados por PCR.
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FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
Hibridização – real time PCR
• Vantagens:
1.Extremamente precisa e rápida2.Análise de muito SNPs por reação
• Desvantagens:
1.Bastante cara2.Necessita equipamentos mais complexos3.Sonda específica pra cada SNP
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FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
Outras técnicas
Microarranjos de DNA
Espectometria de massa
Microssatélites
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BANCOS DE BANCOS DE DADOSDADOS
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FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
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FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO
FUNCIONALIDADE