Kolektiv autorů: Miroslav Pospíšil a Richard Novák

Šlechtění lesních dřevin -

izoenzymy

ČZU - Fakulta lesnická a environmentální

Co jsou enzymy?Co jsou enzymy?

● Jedná se o jednoduché či složené bílkoviny ( proteiny ).● Jejich hlavní funkcí je katalýza chemické

přeměny v živých rostlinných a živočišných buňkách.

● Přičemž určují povahu i rychlost chemických reakcí a vytvářejí tak v živých organismech harmonickou souhru chemických funkcí.

● V současné době je známo více než 2000 různých druhů enzymů.

Struktura enzymůStruktura enzymů

● aminokyseliny – záporně nebo kladně nabité, příp. neutrální

● primární struktura – sekvence aminokyselin, určena geneticky

● sekundární a tercierní struktura (tvar molekuly) – ovlivněna velikostí molekuly, nábojem a stupněm hydrofility

– udržována S-S můstky, H-můstky, iontovými a hydrofobními interakcemi

● kvartérní struktura – složení z více podjednotek, monomer až tetramer apod.

Podle reakcí, které ovlivňují svou katalytickou činnostíPodle reakcí, které ovlivňují svou katalytickou činností

●Oxidoreduktasy - reakce při níž je jedna látka oxidována a druhá redukována ●Transfery - reakce při níž je přenášena skupina obsahující uhlík, dusík, fosfor

nebo síru z jednoho substrátu na jiný. ● Hydrolasy - katalyzují hydrolitické štěpení substrátu. ● Lyasy - štěpí vazbu C-C, C-O, C-N ● Isomerasy - přestavby skupin uvnitř molekuly (geometrické struktury) ● Lygasy - dochází ke spojení dvou molekul substrátu za současného využití

energie ATP či jiných zdrojů

Klasifikace enzymůKlasifikace enzymů

Co jsou izoenzymy? Co jsou izoenzymy?

● Polymorfní molekulární formy enzymů

● Enzymy se stejnou funkcí v metabolismu, katalyzující stejnou reakci.

● Lišící se (primární) strukturou.

● Tvorba izoenzymů je geneticky podmíněna.

● Závislé na stádiu ontogeneze.

Způsoby zkoumání izoenzymůZpůsoby zkoumání izoenzymů

a) Extrakcí b) Elektroforézou – separací (odlišnou

pohyblivostí jednotlivých izoenzymů v elektrickém poli)

c) Detekcí - zaznamenávání proteinů na zaznamenávání proteinů na substrátu gelusubstrátu gelu

a) Extrakce

Zdroje získání:

● z čerstvého materiálu (např. pupen)

● pomocí homogenizace s extrakčním pufrem

● centrifugací ( k získání čisté vrstvy DNA )

● supernatant můžeme zmrazit na ( –70 °C ) a uchovat

b) Metoda elektroforézyb) Metoda elektroforézy

● rozdělení molekul podle jejich pohyblivosti v elektrickém poli.

● dochází k pohybu molekul k anodě, která je zde kladně nabitá

● rychlost pohybu závisí na: ● velikosti a tvaru molekuly. ● náboji molekuly.

● je velmi citlivá – rozeznává i stejné molekuly lišící se pouze o jednotkový náboj, který je patrný na elektroforetickém zařízení a zymogramu.

● vertikální – na polyakrylamidovém gelu

● horizontální – na škrobovém gelu

c) Detekcec) Detekce

● v případě, že na gelu není nic vidět. Potom je možno nespecificky obarvit všechny proteiny.

● enzymovou aktivitu lze zaznamenat např. specifickým barvením, které je založené na reakci, kterou enzym katalyzuje.

● různé typy detekce proteinů:● produkt je barevný – v místě enzymu se objeví

barevný pruh

● substrát je barevný – v místě enzymu gel ztratí svoji barvu, odbarví se.

Příklady detekce enzymuPříklady detekce enzymu

LAP SOD

Na gelu je patrné:Na gelu je patrné:● zymogram – obrazec proužků na gelu

● proužky izoenzymů – zóny enzymatické aktivity (patterny)

● předpoklady interpretace:● rozdílná pohyblivost odráží rozdíly v DNA

(rozdíl je dědičný)

● komigrující ( jdoucí přímo pospolu ) proužky jsou homologní

● kodominantní exprese● odlišíme homozygoty od heterozygotů

● znalost kvartérní struktury enzymů ( tvar molekuly, která ovlivňuje rychlost enzymu v elektroforezním poli ).

Vyhodnocení a interpretace izoenzymových dat

Prosté porovnání pattern proužků● naprosto shodná – identifikace klonů

A B B C D E D

Alelická interpretace izoenzymů1. zjistit počet lokusů

• různé lokusy – izoenzymy např. z různých složek buňky (cytosol, chloroplast apod.)

2. zjistit počet alel v lokusu• kodominance• tvarová struktura• ploidie organismu

allozymy

izoenzymy

izoenzymy – katalyzují stejnou reakci

allozymy – produkty (alely) jednoho genu

Výhody analýzy izoenzymů● rychlá metoda – možno analyzovat mnoho

individuí najednou

● levná technika (n. v porovnání s DNA technikami)

● srovnatelná data mezi různými studiemi

● snadná interpretace výsledků

● nižší nutná kvalifikovanost, než u gen.markerů

● malá mutační rychlost (výhoda oproti např. mikrosatelitům)+ 10-7 /lokus*rok

Nevýhody

● potřeba čerstvého materiálu● omezená variabilita – málo alel v lokusu –

často jen 2-4● s porovnaním gen. markerů (přes 2000):

málo izoenzymů(40) a jen 20 je jich dostupných na levných postupech

● variabilita v kodující části genomu – podléhá selekčnímu tlaku, a proto jsou lokusy často monomorfní

Možnosti využití izoenzymůMožnosti využití izoenzymů

● identifikace klonů● porovnání pattern (sloupce) na zymogramu

● populační úroveň - populační genetika ( určující především pro genetickou charakteristiku populace) …

● certifikace a identifikace vzorků semen● studium genetické efektivnosti semenných

plantáží● pomůcka v selekci ekonomicky důležitých znaků● Teoretické: -fylogenetické vztahy

● vhodná metoda maximálně na druhové úrovni -stanovení genetické variability a

charakteru sprášení přirozených a šlechtitelských populací

Použité materiályPoužité materiály

LiteraturaLiteratura

● Fér (2005): Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin

Internetové odkazyInternetové odkazy

http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/

www.etext.czu.cz/www.etext.czu.cz/