skrining fitokimia dan uji aktivitas antioksidan … · skrining fitokimia dan uji aktivitas...

i

SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

EKSTRAK METANOL DAUN SIRIH LENGKUNG ( Piper aduncum L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Clementia Nova

NIM : 128114048

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

PERSEMBAHAN

Dear God,

Thank you for creating such a magical piece Known as a “smile”. It’s

indescribable, the feeling when someone smiles at you sincerely, and their eyes

sparkle as they do so. No matter how close, no matter how much of a stranger, a

sincere smile just melts the heart.

Dear God,

Thank you for creating another magical piece known as a “cry”. The feeling of

seeing someone cry warms my heart, because it simply shows how fragile and

connected we all are. And, the feeling when it my selfcry, it brings relief and

appreciation to life.

Dear God,

I enjoy talking to You

-Dian Rikasari-

Karya ini saya persembahkan:

Untuk Tuhan Yesus Kristus, karena penyertaannya sepanjang hidupku

Untuk Orang Tua yang selaluaku hormati dan cintai

Untuk Keluarga Bituk yang selalu melengkapi hidupku

Untuk KeluargaTiyap yang selalu mendoakan setiap langkahku

Untuk Sahabat yang selalu memberi dukungan dan menyemangatiku

Dan yang terakhir untuk orang-orang yang membantuku dalam mengerjakan

skripsi ini.


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan yang Maha Esa atas berkat, kasih dan

kesempatan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul

“SKRINING FITOKIMIA DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

EKSTRAK METANOL DAUN SIRIH LENGKUNG ( Piper aduncum L.)”.

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata

Satu Farmasi (S. Farm) program studi fakultas farmasi Universitas Sanata

Dharma, Yogyakarta.

Dalam proses pengerjaan skripsi ini, penulis mendapat bimbingan,

dukungan, kritik, dan saran dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin

mengucapkan terima kasih sedalam-dalamnya kepada:

1. Terima kasih kepada Tuhan Yesus yang sudah memberikan penulis

kesehatan, inspirasi dalam menulis, menjaga dan melindungi penulis serta

mendampingi penulis dalam keadaan apapun.

2. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogayakarta.

3. Dr. Yustina Sri Hartini M.Si., Aptselaku Dosen pembimbing yang telah

memberi bimbingan, dukungan, saran, dan meluangkan waktu untuk

berdiskusi bersama Penulis dalam proses pembuatan skripsi ini.

4. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan masukan, kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

5. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan

masukan, kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

6. Agustina Setyawati, M.Si., Apt selaku Kepala Penanggung Jawab

Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan izin penggunaan laboratorium kepada penulis.

7. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Sanata Dharma,

KhususnyaPak Wagiran, Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Sigit, Mas Agung,

dan Pak Ketul atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.

8. Rekan-rekan penelitian tim Piper, Maria Indah Rosari, Agata Herny,

Violeta Jesmile, dan Dewi Kamara terima atas bantuan, kerjasama,


viii


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL.................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI….................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ………………. v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... vi

PRAKATA …………………………………............................................ viii

DAFTAR ISI................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL......................................................................................... X

DAFTAR GAMBAR.................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xii

INTISARI..................................................................................................... xiv

ABSTRACT.................................................................................................. xv

PENDAHULUAN….................................................................................... 1

METODE PENELITIAN.............................................................................. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................... 7

KESIMPULAN DAN SARAN………......................................................... 15

DAFTAR PUSTAKA…............................................................................... 16

LAMPIRAN…………………...................................................................... 21


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol daun sirih

lengkung…………………………………………………

7

Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanol

daun sirih lengkung……………………………………..

11

Tabel III. Perhitungan persen inhibisi berdasarkan absorbansi hari

ke-6……………………………………………………..

13

Tabel IV. Aktivitas antikosidan sampel dengan metode

thibarbituric acidm (TBA)………………………………

14


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Reaksi Uji Mayer………………………………………….. 8

Gambar 2. Reaksi antara Tanin dan FeCl3…………………………….. 8

Gambar 3. Reaksi Hidrolisis Saponin dengan air……………………... 9

Gambar 4. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol…..… 11

Gambar 5. Grafik rata-rata absorbansi control negatif, positif, dan

sampel………………………………………………………

12


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat determinasi……………………….………………... 21

Lampiran 2. Gambar daun sirih lengkung…………………………….. 22

Lampiran 3. Hasil skrining Fitokimia daun sirih lengkung..………...... 22

Lampiran 4. Gambar hasil skrining fitokimia daun sirih lengkung....… 23

Lampiran 5. Penetapan kadar air serbuk daun sirih lengkung….……... 25

Lampiran 6. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total

dengan metode Folin-Ciocalteu………………………….

26

Lampiran 7. Perhitungan rendemen ekstrak…………………………... 26

Lampiran 8. Data penimbangan untuk penetapan kandungan ekstrak

metanol………………………………………………….

27

Lampiran 9. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan ekstrak

metanol untuk penetapan kandungan fenolik…………

27

Lampiran 10. Hasil optimasi operating time untuk penetapan

kandungan fenolik total…………………………………..

28

Lampiran 11. Optimasi Panjang Gelombang Maksimal untuk

Penetapan Kandungan Fenolik Total…………………….

30

Lampiran 12. Hasil Pengukuran Kurva Baku untuk Penetapan

Kandungan Fenolik Total………………………………...

31

Lampiran 13. Perhitungan Kandungan Fenolik Total Ekstrak Metanol... 31

Lampiran 14. Data Penimbangan Optimasi Metode Uji Aktivitas

Antioksidan FTC…………………………………………

32

Lampiran 15. Hasil optimasi operating time Uji Aktivitas Antioksidan


xiii

FTC………………………………………………………. 32


Metode FTC…………………………………………….

33

Lampiran 17. Hasil optimasi panjang gelombang uji aktivitas

antioksidan metode FTC……………………………….

33

Lampiran 18. Data penimbangan uji aktivitas antioksidan metode FTC

– TBA…………………………………………………….

34

Lampiran 19. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan metode FTC... 34

Lampiran 20. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan

metode TBA……………………………………………...

36

Lampiran 21. Data PSPP FTC………………………………………….. 38

Lampiran 22. Data PSPP TBA…………………………………………. 39


xiv

INTISARI

Munculnya berbagai penyakit degeneratif akibat peroksidasi lipid dapat

dicegah dengan antioksidan. Tumbuhan dapat dimanfaatkan sebagai salah satu

sumber antioksidan alami karena kandungan senyawa metabolit sekundernya,

salah satunya adalah sirih lengkung.Sirih lengkung (Piper aduncum L.) termasuk

dalam famili Piperaceae yang diketahui memiliki potensi besar sebagai

antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa

metabolit sekunder dan aktivitas antioksidan ekstrak metanol khususnya senyawa

fenolik yang terdapat pada daun sirih lengkung.Senyawa fenolik sebagai

antioksidan alami mampu mengurangi laju reaksi peroksidasi lipid.Skrining

fitokimia dilakukan dengan uji tabung dan kandungan fenolik total diuji dengan

menggunakan metode Folin-Ciocalteau didasarkan pada reduksi asam

fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Aktivitas

antioksidan diuji menggunakan metode FTC (ferric thiocyanate), dimana metode

FTC mengukur jumlah hasil peroksida pada tahap awal dari oksidasi lemak

dengan ferrous chloride dan hasilnya akan dikonfirmasi dengan metode TBA

(thiobarbituric acid). Hasil penelitian menunjukkan bahwa daun sirih lengkung

mengandung senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, polifenol, tanin

steroid dan terpenoid. Kadar fenolik total ektrak metanol daun sirih lengkung

sebesar 150,167± 58,323 mg ekivalen asam galat (GAE) per gram ektrak metanol

daun sirih lengkung. Aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun sirih lengkung

yang diukur dengan metode FTC dan TBA berturut – turut menunjukkan persen

inhibisi peroksidasi lipid sebesar 6,794 ± 2,211 % dan 91,908 ± 3,721%.

Kata kunci : Piper aduncum L., skrining fitokimia, fenolik total, antioksidan,

Folin-Ciocalteau,Ferric Thiocyanate (FTC), Thiobarbituric Acid (TBA).


xv

ABSTRACT

The emergence of various degenerative diseases was a result of lipid

peroxidation which could be prevented with antioxidants. Plants can be used as a

source of natural antioxidants for the content of secondary metabolites, one of

which is the spiked pepper leaves. Spiked pepper leave (Piper aduncum L.) was

categorized as Piperaceae family which were known having major potential as an

antioxidant. This study aimed to determine the chemical content and antioxidant

activity of methanol extract especially phenolic compounds contained in spiked

pepper leaves. Phenolic compounds as natural antioxidants could reduce the rate

of lipid peroxidation reaction.Phytochemical screening is done with test tubes and

total phenolic content was tested using a method based on the Folin-Ciocalteau

fosfotungstat acid reduction in alkaline solution becomes blue fosfotungstat.The

antioxidant activity was tested using the method of FTC (ferric thiocyanate), the

results would be confirmed by the method of TBA (thiobarbituric acid). The

results showed that spiked pepper leave compounds containing alkaloids,

flavonoids, saponins, polyphenols, tannins steroids and terpenoids. Total phenolic

content of methanol extract of betel leaf arch of 150,167 ± 58,323 mg gallic acid

equivalents per g of the methanol extract. The antioxidant activity andmethanol

extract of betel leaf arch as measured by the FTC and TBA methods respectively -

showed the percent inhibition of lipid peroxidation were 6,794 ± 2,211% and

91,908 ± 3,721%

Keywords: Piper aduncum L. , screening phytochemicals, antioxidants, Folin-

Ciocalteu, FTC-TBA


1

PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan suatu senyawa molekul yang memiliki elektron

yang tidak berpasangan, tidak stabil dan cepat bereaksi dengan senyawa lain

(seperti DNA, asam lemak tak jenuh) sehingga membentuk lebih banyak radikal

bebas secara berantai. Molekul target yang paling rentan terhadap serangan

radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh (PUFA – Poly Unsaturated Fatty

Acids). Jaringan lipid yang dirusak oleh senyawa radikal bebas akan membentuk

peroksida yang memicu munculnya berbagai penyakit degeneratif (Lamid, A.,

1995; Winarsi, 2007; Parida dan Dhal, 2011). Senyawa yang mampu mengurangi

peroksida lemak adalah antioksida, karena memiliki peran sebagai pemberi

elektron atau reduktan, dimana senyawa ini akan memberikan satu atau lebih

elektron kepada radikal bebas sehingga akan membentuk molekul normal kembali

dan menghentikan berbagai kerusakan yang ditimbulkan (Sasikumar, et al., 2009;

Thitilertdecha et al., 2010).

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat melindungi kerusakan

sel karena mampu menetralkan radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan

atom hydrogen ke atom yang tidak memiliki pasangan elektron (Muhtadi,2014).

Dalam konsentrasi rendah, antioksidan secara signifikan mampu menghambat

reaksi oksidasi (Cadenas dan Packer, 2002).Namun, antioksidan alami lebih

banyak diminati dibandingkan antioksidan sintetik, karena antioksidan sintetik

seperti butylated hydroxytoluene (BHT) diketahui dapat meningkatkan terjadinya

efek karsinogenik (Umemura et al., 2001).

Tanaman herbal merupakan merupakan salah satu sumber antioksidan

alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker dan

penuaan dini. Salah satu senyawa metabolit sekunder dalam tanaman yang

diketahui berfungsi sebagai antioksidan adalah senyawa fenol. Hal ini karena

kemampuannya meniadakan radikal – radikal bebas dan radikal peroksida

sehingga efektif dalam menghambat oksidasi lipida (Kinsella et al, 1993).

Senyawa fenolik mampu bertindak sebagai antioksidan dengan memutuskan

ikatan rantai radikal bebas secara langsung dan menangkap berbagai spesies


2

reaktif seperti radikal superoksida, hidroksil dan peroksil serta asam hipoklorit

(Nurmi, A., 2008).

Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan potensi besar

sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson, et al. dalam Nahak dan Sahu,

2011). Piper aduncum L. atau sirih lengkung merupakan salah satu tanaman

dalam famili piperaceae. Menurut Parmar et al., (1997) kandungan metabolit

sekunder yang terdapat dalam Piperaceae adalah fenolik, flavonoid, alkaloid dan

terpenoid. Namun, sejauh penelitian peneliti terhadap senyawa aktif pada sirih

lengkung belum diketahui. Oleh karena itu pada penelitian ini, peneliti melakukan

skrining fitokimia dengan metode uji tabung. Hasil penelitian yang dilakukan

Yerwanto Ilang,dkk (2014) menunjukan bahwa ekstrak etanol ranting sirih

lengkung memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50 sebesar

59,838 µg/mg.

Dalam penelitian ini metode yang digunakan adalah metode Folin-

Ciocalteu (FC) dan untuk uji aktivitas antioksidan adalah metode Ferric

Thiocyanate (FTC) – Thiobarbituric Acid (TBA). Prinsip dari metode Folin-

Ciocalteaun adalah terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru yang dapat

diukur pada panjang gelombang 765 nm. Metode FTC digunakan untuk mengukur

jumlah peroksida awal dari peroksida lemak sedangkan metode TBA untuk

mengukur radikal bebas yang dihasilkan setelah peroksida lemak yang dimana

peroksida lemak merupakan akumulasi produk pada jaringan tubuh manusia

sebagai penyebab utama dari disfungsi seluler pada tubuh (Aqil, Ahmad and

Mehmood, 2006).

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan pelarut metanol karena, etanol

merupakan pelarut yang dapat melarutkan beberapa kandungan metabolit

sekunder seperti alkaloid, terpenoid, tanin, flavonoid dan polifenol. Selain itu

metanol dapat menghambat reaksi oksidasi polifenol yang menyebabkan oksidasi

fenolat dan kemudahannya saat penguapan di evaporator (Tiwari et al., 2011).

Sehingga, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kandungan

senyawa kimia dan aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam ekstrak daun

sirih lengkung.


3

METODE PENELITIAN

BAHAN

Bahan yang digunakan meliputi daun sirih lengkung segar (dari kebun obat

“Merapi Farma”) yang dideterminasi di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan

Bawah Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, akuades, metanol p.a (Merck),

etil-asetat p.a (Merck), asam galat p.a (Sigma), natrium karbonat 1 M teknis,

etanol (Merck), asam linoleat (Sigma), buffer fosfat 0.02 M (pH 7.0), etanol p.a

99,6 %, etanol 75%, asam linoleat 2,5%, ammonium thiocyanate 30% (Merck),

ferrous chloride 0.02 M p.a dalam HCl teknis (Merck), asam tiobarbiturat

(Merck), reagen Folin Ciocalteau (Merck), BHT ( butylated hydroxyl toluene) p.a

(Sigma), asam trikloroasetat (Merck).

ALAT

Peralatan yang digunakan: neraca analitik ( Scalec SBC 22, BP 160P),

spektrofotometer UV-Vis (Prekin Elmer Lamda 20), Oven, alat penyerbuk, alat

pengayak, centrifuge, Vaccum Rotary Evaporator (Janke & Kunkel), timbangan

elektrik BP 160 readability 0.10 mg, waterbath (labo-tech, Heraeus), micropipet

200-1000 μL ; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), orbital shaker, corong Buchner,

pompa vakum, vortex (Janke & Kunkel), dan alat-alat gelas (Pyrex-Germany dan

Iwaki).

CARA KERJA

A. Pembuatan Simplisia Daun Sirih Lengkung

Daun sirih lengkung segar yang diperoleh dari kebun obat“MERAPI

FARMA” daerah kaliurang KM 21,5. Determinasi daun sirih lengkung

dilakukan di Laboratorium Biologi UGM. Daun sirih lengkung dicuci dengan

air bersih yang mengalir sambil dibersihkan dari kotoran yang melekat dan

kemudian ditiriskan. Pencucian daun dilakukan sebanyak tiga kali, agar daun

bersih dari pengotor. Setelah itu daun di letakkan diatas kertas puti dan

diangin- anginkan, kemudian dirajang menggunakan pisau berbahan “stainless

steel” dengan lebar irisan kurang lebih 1 cm. Kemudian, dikeringkan

menggunakan oven pada suhu 600C. Daun yang telah kering selanjutnya


4

disortasi kering, dengan cara dipisahkan kembali dari pengotor yang ikut serta

dalam proses pengeringan. Daun yang sudah kering ditunjukan dengan

mudahnya daun hancur saat diremas. Daun kemudian diserbuk dan di ayak

dengan ayakan dengan no merh 50, kemudian dilakukan uji kadar air dan

perhitungan rendemen ekstrak.

B. Skrining Fitokimia

a. Uji alkaloid.

Ekstrak sebanyak 10 mg ditambahkan 5 mL amonia 25%, lalu

ditambahkan 20 mL kloroform. Campuran disaring sehingga diperoleh lapisan

air dan lapisan pelarut organik. Lapisan air ditambahkan 2 tetes pereaksi

dargendorff atau pereaksi mayer. Jika terbentuk warna orange dengan pereaksi

dargendorff atau terbentuk endapan putih dengan penambahan pereaksi Mayer

berarti ekstrak mengandung alkaloid (Farnsworth, 1966).

b. Uji flavonoid

Sejumlah sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil

alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume yang

sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Reaksi positif

ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada

lapisan amil alkohol (Harborne ,1987).

c. Uji Saponin

Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil

akan terus terlihat selama 5 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes

HCl 2 N menunjukkan adanya saponin (Harborne, 1987).

d. Uji polifenol

Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70 %. Larutan yang

dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3

5%. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau

biru (Harborne, 1987).


5

e. Uji tanin

Dua gram serbuk simplisia dilarutkan dengan air lalu direaksikan dengan

larutan besi (III) klorida 10%, jika terjadi warna biru tua atau hitam kehijauan

menunjukkan adanya tanin (Harborne, 1987).

f. Triterpenoid dan steroid

Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi

yang kering lalu ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat

pekat. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah

untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau (Harborne, 1987).

C. Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Lengkung

Serbuk simplisia sebanyak 10 gram serbuk diektraksi maserasi

menggunakan 100 mL metanol teknis selama 2x24 jam dengan menggunakan

orbital shaker. Setelah 2x24 jam dimaserasi, filtrat disaring menggunakan

corong Buchner dan ampasnya dimaserasi dengan metanol teknis selama 24

jam kemudian disaring. Proses remaserasi dihentikan bila diperoleh filtrate

yang bening, yang berarti sebagian besar senyawa yang larut dalam metanol

telah terekstrak. Pelarut pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan

menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 60oC dan dipekatkan

dengan menggunakan waterbath (T= 60o

C), untuk diperoleh ekstrak kental

kemudian dihitung rendemennya.

D. Analisis Kadar Senyawa Fenolik Total

Penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin Ciocalteu

menurut Rami et all. (2013) yaitu larutan ekstrak metanol diambil 0.5 mL dari

konsentrasi 200 μg/mL dan ditambahkan 2 mL reagen Folin Ciocalteu,

didiamkan selama 5 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan 4 mL

Na2CO3 (Natrium Karbonat) 1 M dan inkubasi 30 menit. Absorbansi diukur

pada = 735 nm dengan spektrofotometer. Hasil dinyatakan dalam mg

ekivalen asam galat per gram ekstrak ± SD. Standar kurva yang digunakan

adalah asam galat dengan konsentrasi 40, 50, 60, 70, 80 μg/mL. Rumus

perhitungan : T = C.V/M


6

Keterangan

T = kandungan fenolik total (mg/g); C= konsentrasi hasil perhitungan dari

absorbansi yang didapat (mg/ml); V= volume senyawa uji (ml); M= massa

senyawa uji (mg).

E. Analisis Aktivitas Antioksidan Metode FTC-TBA (Ferric Thiocyanate –

Thiobarbituric Acid)

Metode FTC-TBA mengacu pada Aqil, et al (2006). Ekstrak metanol dan

standar BHT sebanyak 4 mg, dilarutkan dalam 4 ml etanol absolut dan

ditambahkan 4.1 ml asam linoleat 2.5%, 8.0 ml buffer fosfat 0.05 M (pH 7), dan

3.9 mL akuades. Kemudian diinkubasi dalam oven pada suhu 400C (Larutan A).

Kemudian, diambil 0.1 ml larutan ke dalam larutan yang telah berisi 9.7 mL

etanol 75% dan 0.1 mL ammonium tiosianat 30% (Larutan B). Selanjutnya, 5

menit setelah penambahan 0.1 mL ferrous choride 0.05 M dalam 3.5% HCl,

absorbansi warna merah diukur pada = 488,5 nm. Pengukuran dilakukan setiap

24 jam sampai 1 hari setelah absorbansi kontrol negatif maksimum. Larutan tanpa

sampel sebagai kontrol negatif.

Selanjutnya, larutan A sampel pada hari pengukuran terakhir diambil

sebanyak 1 mL dan ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 20% dan 2 mL asam 2-

tiobarbiturat 0.67%. Campuran tersebut dipanaskan dalam waterbath pada suhu

950C selama 10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30

menit. Absorbansi supernatant tersebut diukur pada = 532 nm. Rumus

perhitungan persen inhibisi :

%Inhibisi = (A0 – A1/A0)x 100%

Keterangan

A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif; A1 = absorbansi maksimum sampel.

Dari nilai rata-rata persen inhibisi ± SD dilakukan uji distribusi

menggunakan metode deskriptif.Analisis T-test untuk data terdistribusi normal,

atau analisis Kruskall-Wallis untuk data tidak terdistribusi normal, dengan taraf

kepercayaan 95%.


7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Skrining fitokimia merupakan analisis kualitatif terhadap senyawa-

senyawa metabolit sekunder.Suatu ekstrak dari bahan alam terdiri atas berbagai

macam metabolit sekunder yangberperan dalam aktivitas biologinya. Senyawa-

senyawa tersebut dapat diidentifikasi dengan pereaksi-pereaksi yang mampu

memberikan ciri khas dari setiap golongan dari metabolit sekunder

(Harborne,1987). Skrining fitokimia pada penelitian ini untuk mengetahui

senyawa kimia yang terdapat didalam ekstrak metanol daun sirih lengkung.

Tabel 1.Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol daun sirih lengkung

Dalam skrining fitokimia, prinsip yang digunakan pada uji alkaloid yaitu

reaksi pengendapan yang terjadi karena adanya penggantian logam. Atom

nitrogen yang memiliki pasangan elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk

membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion logam (McMurry dan Fay,

2004). Hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya

endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kalium-alkaloid

yang diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+ dari

kalium tetraiodomerkurat (II) (pereaksi Mayer) membentuk kompleks kalium

alkaloid yang mengendap. Perkiraan yang terjadi ditunjukkan pada Gambar 1.

Metabolit Sekunder Hasil Keterangan

Alkaloid + terbentuk endapan putih

Flavonoid + terbentuk endapan kuning dibagian tengah tabung

Saponin + terbentuk busa setinggi 1-10 cm

Polifenol + terbentuk endapan putih pada dasar tabung

Tanin + terbentuk warna hitam kehijauan pada tabung uji

dibanding kontrol

Steroid dan

Terpenoid +

terbentuk warna merah kecoklatan pada lapisan bawah

dan warna hijau pekat pada lapisan atas


8

Gambar 1. Reaksi Uji Mayer (McMurry and Fay, 2004)

Flavonoid, fenolik dan tanin merupakan senyawa - senyawa fenol yang

memiliki gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik. Kemampuan

flavonoid sangat potensi untuk antioksidan karena struktur melekul dan posisi dari

gugus hidroksilnya (Rajanandh and Kavitha, 2010). Pada ekstrak metanol

daunsirih lengkung positif mengandung flavonoid dengan adanya terbentuk

endapan warna kuning pada sampel yang direaksikan dengan larutan tembaga

asetat. Hal ini dikarenakan flavonoid memiliki cincin benzene yang memiliki

gugus hidroksi.

Pengujian tanin dilakukan dengan melakukan penambahan FeCl3 yang

bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada tanin. Fungsi FeCl3

adalah menghidrolisis golongan tanin sehingga akan menghasilkan perubahan

warna biru kehitaman dan tanin terkondensasi yang menghasilkan warna hijau

kehitaman (Sangi dkk., 2008).

Gambar 2. Reaksi antara tanin dan FeCl3 (Sangi dkk., 2008)


9

Pada pengujian saponin, saponin mengandung gugus glikosil yang

berperan sebagai gugus polar serta gugus steroid dan triterpenoid yang berfungsi

sebagai gugus nonpolar akan bersifat aktif permukaan sehingga saat dikocok

dengan air saponin dapat membentuk misel, dimana struktur polar akan

menghadap ke luar sedangkan gugus nonpolar akan menghadap ke dalam. Pada

kondisi ini akan terbentuk saponin berbentuk seperti busa (Sangi dkk., 2008).

Reaksi hidroksil saponin dengan air seperti pada gambar 4.

Gambar 3. Reaksi hidrolisis saponin dengan air (Sangi dkk., 2008)

Identifikasi terpenoid dan steroid pada ekstrak metanol daun sirih

lengkung memberikan hasil positif dengan terbentuknya cincin coklat pada pada

batas antara kloroform dan H2SO4, selain itu ketika ditambahkan 2 mL asam sulfat

terlihat warna hijau menjadi warna hijau pekat. Perubahan warna ini disebabkan

adanya oksidasi pada golongan senyawa terpenoid/steroid melalui pembentukan

ikatan rangkap terkonjugasi. Prinsip reaksi dalam uji terpenoid adalah kondensasi

atau pelepasan H2O dan penggabungan karbokation dan menyebabkan adisi

elektrofilik diikuti dengan pelepasan hidrogen. Gugus hidrogen beserta

elektronnya dilepas sehingga mengalami perpanjangan konjugasi yang

memperlihatkan adanya cincin coklat (Siadi K., 2012).

Senyawa fenolik merupakan penangkal radikal oksigen yang baik dikarenakan

potensi reduksi elektron dari radikal fenolik lebih rendah dari pada potensi reduksi

electron dari radikal oksigen (Grace,2005; Bors,et al., 1990). Senyawa ini

merupakan senyawa yang paling banyak terkandung dalam tumbuhan. Senyawa

ini dapat bertindak sebagai antioksidan untuk mencegah penyakit jantung,

mengurangi peradangan, menurunkan kejadian kanker dan diabetes, serta


10

mengurangi tingkat mutagenesis pada sel (Khoddami, et al, 2013). Estimasi

kandungan fenolik total tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi

Folin-Ciocalteu.Prinsip metode Folin-Ciocalteu didasarkan pada transfer elektron

dalam medium alkali dari senyawa fenolik ke dalam kompleks asam

fosfomolibdat/fosfotungstat untuk membentuk kompleks biru yang dapat

dideteksi secara spektroskopis pada panjang gelombang sekitar 760 nm

(Singleton, et al., 1999).

Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku

asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar kurva baku karena asam galat

merupakan turunan dari asam hidrobenzoat yang tergolong asam fenol sederhana.

Kandungan fenol asam organik ini juga bersifat murni dan stabil (lee, et al.,

2003). Pembuatan kurva baku asam galat dilakukan sebanyak tiga replikasi dan

untuk menentukan kandungan fenolik total digunakan persamaan dengan nilai r

terbaik. Nilai r menunjukkan nilai linearitas yaitu korelasi antara konsentrasi dan

absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai r = 1 atau

mendekati 1) maka korelasi juga semakin baik.

Berdasarkan ketiga persamaan regresi yang telah didapat (lampiran 9),

persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah

persamaan regresi linier replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974 dengan

linearitas r = 0,9924. Koofisien korelasi yang baik dilihat dari kesetaraan antara

penambahan konsentrasi asam galat dan penambahan absorbansi. Absorbansi

sampel yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam persamaan tersebut untuk

memperoleh nilai kandungan fenolik total sampel. Hasil perhitungan

menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih lengkung memiliki nilai

kandungan fenolik total sebesar 184.533 ± 4.244 mg ekivalen asam galat per gram

sampel.


11

Table 2.Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanol daun sirih

lengkung

Konsentrasi Absorbansi Kandungan

Fenolik Total

Rata-rata ±

SD %CV

Replikasi 1 200 μg/ml 0.346 185.8 184.533 ±

4.244 % Replikasi 2 200 μg/ml 0.349 188

Replikasi 3 200 μg/ml 0.338 179.8

Adapun prinsip dasar kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang

cepat dengan menggunakan alkali seperti natrium karbonat, dimana absorbansi

yang terbentuk akibat fosfotungstat biru sebanding dengan jumlah senyawa

fenolik yang terdapat dalam sampel (Cicco dan Latanzio, 2011 ; Cindric et al.,

2011). Reaksi yang terjadi sebagai berikut:

Gambar 4. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol

(Sumber: Hardiana et al., 2012)

Pada penetapan kandungan fenolik total ektrak metanol daun sirih

lengkung, larutan menunjukan warna biru setelah ditambahkan reagen Folin-

ciocalteu dan larutan Na2CO3. Hal ini menunjukan bahwa terdapat senyawa

fenolik yang terkandung didalam ekstrak metanol daun sirih lengkung.

Setelah menentukan kandungan fenolik total, kemudian dilakukan

pengujian aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun sirih lengkung. Uji

antioksidan dilakukan dengan metode FTC - TBA dengan mekanisme asam

lionoleat. Metode FTC dan TBA merupakan metode pengukuran aktivitas

antioksidan berdasarkan kemampuannya dalam menghambat reaksi peroksidasi

lipid. Sebelum dilakukan replikasi, dilakukan orientasi untuk mengetahui profil

absorbansi percobaan. Profil absorbansi percobaan digunakan untuk mengetahui


12

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

1 2 3 4 5 6 7

Ab

sorb

ansi

Hari Ke-

kontrol positif

kontrol negatif

sampel

kapan terjadinya absorbansi maksimal dan penurunannya. Asam lemak yang

digunakan pada percobaan ini adalah asam linoleat dan senyawa standar yang

digunakan adalah BHT sedangkan kontrol adalah emulsi asam lemak tanpa

mengunakan senyawa antioksidan. Metode FTC digunakan untuk mengukur

jumlah peroksida pada tahap awal peroksida lipid dan metode TBA untuk

mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksida lipid dan mengukur

radikal bebasyang ada setelah oksidasi peroksida (Aqil,et al., 2006;

Rezaeizadeh,et al., 2011).

Metode FTC digunakan untuk menentukan tingkat hidroperoksida lipid

dalam suatu sistem biologis. Pada metode ini, asam linoleat digunakan sebagai

sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk selama oksidasi asam linoleat akan

bereaksi dengan Fe2+

untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian akan bereaksi

dengan thiocyanate untuk membentuk kompleks warna merah.

Gambar 5. Grafik rata-rata absorbansi kontrol negatif, positif dan sampel

Pembacaan terjadinya proses peroksidasi lipid dapat dilakukan sampai

kontrol negatif menunjukkan nilai absorbansi maksimum dan pada penelitian ini,

absorbansi maksimum kontrol negatif diperoleh pada hari keenam, seperti yang

tergambar dalam profil absorbansi (gambar 3). Nilai absorbansi menunjukkan

jumlah radikal peroksida yang terbentuk selama proses oksidasi. Antioksidan

dapat menghambat oksidasi asam linoleat yang ditandai dengan penurunan kadar

oksidan hidroperoksida yang terbentuk dibandingkan kontrol. Penurunan kadar

hidroperoksida berbanding lurus terhadap absorbansi dari senyawa Fe(SCN)3

dalam larutan uji (Arif et al., 2014). Hal ini berarti, profil kenaikan absorbansi


13

tidak hanya digunakan untuk mengetahui kapan terjadinya absorbansi maksimal

dan penurunan reaksi peroksidasi lipid, tetapi juga menunjukkan bahwa ekstrak

metanol daun sirih lengkung positif memiliki aktivitas antioksidan atau

kemampuan dalam menghambat radikal peroksida yang ditandai dengan

absorbansi yang berada di bawah absorbansi kontrol negatif. Profil rata-rata

absorbansi baik kontrol maupun sampel uji menunjukkan absorbansi tertinggi

terjadi pada hari keenam, yang menunjukkan pembentukan peroksida terus terjadi

hingga hari keenam. Kemudian absorbansi turun pada hari ketujuh yang

menyiratkan bahwa mulai terjadi dekomposisi peroksida, dimana peroksida yang

terbentuk akan berikatan dengan senyawa radikal lainnya hingga membentuk

senyawa baru yang lebih stabil dan menyebabkan jumlah peroksida mulai

menurun (Pane, 2013).

Tabel 3. Perhitungan % inhibisi berdasarkan absorbansi hari ke-6

Kontrol positif

Absorbansi % inhibisi

Rata-rata ± SD %

inhibisi

Replikasi 1 1,952 10.990

10.306 ± 0.734 Replikasi 2 1,965 10.397

Replikasi 3 1,955 9.530

Sampel

Replikasi 1 2,100 4.241

6.794 ± 2.211 Replikasi 2 2,016 8.071

Replikasi 3 2,016 8.071

Hari keenam inkubasi didapatkan rata - rata absorbansi tertinggi FTC

untuk kontrol negatif, kontrol positif dan sampel adalah sebesar 2.193; 1.957;

1.976. Persentase penghambatan ekstrak pada hari dimana absorbansi mencapai

absorbansi tertinggi menunjukkan besarnya penghambatan terhadap jumlah

maksimal peroksida yang terbentuk. Besarnya penghambatan kontrol positif

(BHT) dan sampel terhadap peroksida yang terbentuk sebesar 10.306 ± 0.734 dan

6.794 ± 2.211. Hal ini menunjukan aktivitas penghambatan lipid maksimum oleh

BHT lebih tinggi daripada ekstrak metanol daun sirih lengkung. Dari hasil

perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak methanol daun sirih lengkung kurang


14

mampu menghambat peroksidasi lemak yang terbentuk dibandingkan BHT yang

merupakan antioksidan sintetis. Meskipun demikian ekstrak metanol daun sirih

lengkung tetap memiliki aktivitas antioksidan yang ditunjukkan dengan nilai

absorbansi yang lebih kecil dibandingkan kontrol negatif.

Setelah pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan

penegasan dengan menggunakan metode TBA untuk mengukur nilai MDA, yang

merupakan produk oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap pertama

peroksidasi lipid. Pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas

yang ada setelah oksidasi peroksida. Pada tahap kedua peroksidasi lipid, asam

linoleat yang sudah banyak terbentuk menjadi radikal terdekomposisi menjadi

senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu MDA (malondialdehid).

Secara teoritis, senyawa tiga karbon malondialdehid (MDA) adalah produk

dekomposisi utama karbonil pada proses autooksidasi dari lipid tak jenuh (Tokur

et al., 2006). Tujuan dilakukannya pengukuran antioksidan dengan metode ini

untuk mengetahui banyaknya senyawa MDA yang terbentuk, dimana senyawa ini

merupakan turunan senyawa peroksida yang terbentuk pada tahap kedua reaksi

peroksida lemak. MDA digunakan sebagai biomarker untuk mengetahui tahap

akhir proksidasi lipid. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan dengan

spektrofotometer dari reaksi MDA dengan asam 2-tiobarbiturat yang berwarna

merah muda pada panjang gelombang 532 nm (Moon and Shibamoto, 2009).

Pada hari ketujuh jumlah peroksida yang terbentuk sudah menurun

ditunjukkan dengan menurunnya nilai absorbansi kontrol positif. Hal ini

disebabkan karena sudah mulai terbentuknya MDA dari asam linoleat sehingga

pengukuran TBA dilakukan pada hari kedelapan.

Tabel 3. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA

Sampel Absorbansi Persen Inhibisi *

Kontrol (-) 1.001 ± 0.004 0

BHT 0.168 ± 0.009 83.217 ± 0.88

Ektrak metanol daun

sirih lengkung 0.060 ± 0.001

91.908 ± 3.721

Catatan: *Data diwakili Rata-rata ± SD. Hasil replikasi tiga kali.


15

Tabel diatas menunjukkan bahwa nilai absorbansi persen inhibisi ekstrak

metanol daun sirih lengkung terhadap MDA lebih besar daripada kontrol positif

(BHT) dengan nilai persen inhibisi ekstrak metanol daun sirih lengkung sebesar

91.908 ± 3.721%, sementara nilai persen inhibisi BHT sebesar 83.217 ± 0.88 %.

Secara statistik, nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna

(p<0,05). Hal ini menunjukan bahwa pada tahap kedua peroksida lipid, aktivitas

penghambatan MDA oleh ekstrak metanol daun sirih lengkung lebih besar

dibandingkan penghambatan peroksida pada tahap pertama peroksida lipid,

aktivitas penghabatan radikal bebas lebih besar dibandingkan tahap pertama.

KESIMPULAN DAN SARAN

Ekstrak metanol daun sirih lengkung (Piper aduncum L.) mengandung

senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, saponin, polifenol, tanin,

steroid dan terpenoid. Kandungan senyawa fenolik total ekstrak metanol dari daun

sirih lengkung sebesar 184.533 ± 4.244 mg ekivalen asam galat per g ekstrak

metanol. Aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun sirih lengkung yang

dinyatakan dalam %inhibisi dengan metode FTC sebesar 6.794 ± 2.211% dan

dengan metode TBA sebesar 91.908 ± 3.721%.

Perlunya dilakukan penelitian lanjutan untuk melihat korelasi jumlah

kandungan fenolik total terhadap kemampuan penghambatan radikal bebas yang

terbentuk dari reaksi peroksidasi lipid.


16

DAFTAR PUSTAKA

Aqil, F., Ahmad, I.,and Mehmood, Z, 2006, Antioxidant and Free Radical

Scavenging Properties of Twelve Traditionaly Used Indian Medicinal

Plants, Turk J Biol, Vol 30, pp. 177 – 183.

Arcana, Jatava, S., Paul, R., and Tiwari, A., 2011, A Rich Source of Natural

Immuno –Modulator , International Journal Of Pharmacology, 7 : 198-

205.

Arif D.Y., Jose, C., dan Teruna, H.Y., 2014, Total Fenolik, Flavanoid serta

Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana, Diklorometan dan Metanol

Amaranthus spinosus L EM5-Bawang Putih, JOM FMIPA, 1(2): 359-369.

Artini, P. E. U. D., Astuti, K. W., Warditiani, N. K., 2003, Uji Fitokimia Ekstrak

Etil Asetat Rimpang Bangle ( Zingiber purpureum Roxb.), Jurnal Farmasi

Udayana, Indonesia.

Bors, W., Heller, W., Michel, C. & Saran, M., 1990, Flavonoids as Antioxidants:

Determination of Radical-Scanvenging Effeciencies, Methods Enzymol,

Vol.186, pp. 343-355.

Cadenas, E., and Packer, L., 2002, Handbook of Antioxidant, Second Edition,

USA, MarcellDekker Ich,pp. 4.

Cicco, N., dan Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate

Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination

of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A

Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal.

Chem., pp. 840-845.

Cindric, I.J., Kunstic, M., Zeiner, M., Stingeder, G., dan Rusak, G., 2011, Sample

Preparation Methods for the Determination of the Antioxidative Capacity

of Apple Juices, Croat. Chem. Acta, 84(3), pp. 435-438.

Departemen Kesehatan RI, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, Jakarta:

Diktorat Jendral POM-Depkes RI, hal. 549-553.

Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta, pp. 695.


17

Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia,

Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 7, 410.

Donson, C.D., Dyer, L. A., Searcy, J., Wright, Z., and Letoumeau, D.K., 2000,

Cenocladamide: A Diydropyridone Alkaloid from Piper Cenocladum,

Phytochemistry, Vo. 53, pp. 51-54.

Fang YZ.,Yang S., Wu G., 2002, Free Radicals, Antioxidants, and Nutrition,

Nutrition 18:872– 879.

Farnworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plant, J.

Pharm. Sci P. 55.

Gandjar, I.B., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, hal. 220-251, 353-365.

Grace, S.C., 2005, Phenolics as Antioxidants in Antioxidants and Reactive

Oxygen Species in Plants (ed. Smirnoff, N.), Blackwell Publishing,

Oxford, UK, pp. 141 – 168.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, 49-51, Bandung, ITB Press.

Hardiana, R., Rudiyansyah, dan Zaharah, T.A., 2012, Aktivitas Antioksidan

Senyawa Golongan Fenol dari Beberapa Jenis Tumbuhan Famili

Malvaceae, JKK, 1(1): 8-13.

Khoddami, A., Wilkes, M.A., dan Roberts, T.H., 2013, Techniques for Analysis

of Plant Phenolic Compounds, Molecules, 18: pp. 2328-2375.

Kikuzaki, H., and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger

Constituents, Journal of Food Science, Vol. 58, No. 6, pp. 1407-1410.

Kinsella, J,E., Frankel, E., German, B. and Kanmer, J., 1993. Possible Mekanisme

for the Protective role of Antioxidants in Wine and Plants Foods, J Food

technology. 4: 5 – 89.

Kusumanto, 2014, Uji Aktivitas Antioksidan MenggunakanMetode Deoksiribosa

dan Penetapan Kandungan Fenolik Total pada Fraksi Etil Asetat Ekstrak

Etanol Buah Jambu Mete (Annacardium occidentale L.), Skripsi,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


18

Lamid, A., 1995, Vitamin E sebagai Antioksidan, Media Litbangkes, Vol. V, No.

01, hal. 14-16.

Lee, K.W., Kim, Y.J., Lee, H.J., dan Lee, C.Y., 2003, Cocoa Has More Phenolic

Phytochemicals and A Higher Antioxidant Capacity Than Teas and Red

Wine, J. Agric. Food Chem., 51., pp. 7292-7295.

MCMurry, J dan Fay, R.C., 2004.Chemisty 4th

Edition. New Jersey : Prentice Hall.

Moon, JK,. Shibamoto, T. 2009. Antioxidant Assays for Plant and Food

Components. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57: 1655-1666.

Muhtadi, Hidayati A. L., Suhendi. A., Haryoto., Sudjono.T.A.,2014, Pengujian

Daya Antioksidan Dari Beberapa Ekstrak Kulit Buah Asli Indonesia

Dengan Metode FTC, Simposium Nasional RAPI XIII - 2014 FT UMS,

ISSN 1412-9612.

Nurhayati, K. Siadi dan Harjono.2012. Pengaruh Konsentrasi Natrium Benzoat

dan Lama Penyimpanan Pada Kadar Fenolat Total Pasta Tomat. UNS,

Semarang. Hal 1-5.

Nurmi, A., 2008, Antioxidants Studeis on Selected Lamiaceae Herbs In Vitro and

In Humans, Yliopistopaino, University Print, Helsinki, Finland, 33.

Pane, E.R., 2013, Uji Aktivitas Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Metanol Kulit

Pisang Raja (Musa paradisiaca Sapientum), Valensi, 3(2): 76-81.

Parida, R., dan Dhal, Y., 2011, A Study on The Micro-Propagation and

Antioxidant Activity of Piper longum ( An Important Medicinal Plant ),

Journal of Medicinal Plants Research, 5(32): 6691-6994.

Parmar, V.S., Jain, S.C., Bisht, K.S., Jain, R., Taneja, P., Jha, A., Tyagi, O.D.,

Prasad, A.K., Wengel, J., Olsen, C.E., dan Boll, P.M., 1997,

Phytochemistry of The Genus Piper, Phytochemistry, 46(4): 597-673.

Rajanandh, M.G., Kavitha, J., 2010. Quantitative Estimation of Bsitosterol, Total

Phenolic and Flavonoid Compounds in The Leaves of Moringa oleifera.

Int. J. Pharm Tech Res. 2, 1409-1414.

Rami, E., Sipai, S., dan Patel, I., 2013, Studies on Qualitative and Quantitative

Phytochemical Analysis of Piper Longum Linn., International Journal of

Pharma and Bio Scienes, 4(3): pp. 1381-1388.


19

Rezaeizadeh, A., Zuki, A.B.Z., M., Abdollahi, Goh, Y.M., Noordin, M.M.,

Hamid, M., dan Azmi, T.I., 2011, Determination of Antioxidant Activity

in Methanolic and Cloroformic Extracts of Momordica charantia, African

Journal of Biotechnology, 10(24): 4932-4940.

Sangi, M., M.R.J. Runtuwene., H.E.I. Simbala., V.M. A. Making.2008. Analisis

Fitokimia Tumbuhan Obat di kabupaten Minanghasa Utara. Chem. Prog.

1(1): 47-53.

Santanu, S., Upal, K.M., Dilip, K.P., Sambit,. P. and Sourabh, J.,2010,

Antioxidant potential of crude exstract and different fractions of enthydra

fluctuans Lour, Iranian Journal of Pharmaceutical Research 9 (1) : 75-82.

Sasikumar, J.M., Maheshu, V., dan Jayadev, R., 2009, In Vitro Antioxidant

Activity of Methanolic Extracts of Berberis Tinctoria Lesch. Root and

Root Bark, India Journal of Herbal Medicine and Toxicology, 3(2), pp.

53-58.

Singleton VL, Orthofer R, Lamuela- Raventos RM. Analysis of total phenols and

other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu

Reagent. Methods in Enzymology, 1999. p.152-178.

Subarnas A., 2001, Komponen Aktif Antioksidan Dalam Bahan Alam, Seminar

Nasional dan Lokakarya. Pemahaman Konsep Radikal Bebas dan Peranan

Antioksidan dalam Meningkatkan Kesehatan Menuju Indonesia Sehat

2010. Pusat penelitian kesehatan. Bandung : Lembaga Penelitian

Universitas Padjadjaran.

Svehla, G., 1990, Vogel Buku Teks Analisa Kuantitatif Anorganik. Edisi V.

Jakarta: Kalman Media Pustaka. Hal: 300 – 303.

Setyowati, E.P., Jenie, U.A., Sudarsono, Kardono, B., Rahmat, R., dan Meiyanto,

E., 2007, Isolasi Senyawa Sitotoksik Spons Kaliapsis, Majalah Farmasi

Indonesia, 18(4): 183-189.

Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J.D., dan Rakariyatham, N.,

2010, Identification of Major Phenolic Compound from Nephelium

lappaceum L. and Their Antioxidant Activities, Molecules, 15, pp. 1453-

1465.


20

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical

Screening and Extraction : A Review, Internasionale Pharmaceutica

Sciencia, Vol. 1, India, pp. 98-106.

Umemura, T., Kodama, Y., Hioki, K., Inoue, T., Nomura, T., dan Kurokawa, Y.,

2001, Butylhydroxytoluene (BHT) Increases Susceptibility of Transgenic

rasH2 Mice to Lung Carcinogenesis, Journal of Cancer Research and

Clinical Oncology, Volume 127, Issue 10, pp. 583-590.

Vemerris dan Nicholson, 2006, Phenolic Compound Biochemistry, Springer,

USA, pp. 1-2.

Wang, L. and Weller, C. L., 2006, Recent Advances in Extraction of

Nutraceuticals from Plants, Trends in Food Science & Thechnology 17,

300-312.

Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami & Radikal Bebas : Potensi dan Aplikasinya

dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, hal. 13-15, 17, 20, 49-60.

Yerwanto, I., Syelvia, L. K., Rudi, K., Fauzy, R., dan Partomuan, S., Uji Aktivitas

Antioksidan Dan Toksisitas Ekstrak N-heksan Dan Etil Asetat Ranting

Sirih Lengkung (Piperaduncum L.), Prosiding Seminar Nasional Kimia

2014. HKI-Kaltim.


21

Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman


22

Lampiran 2. Gambaran daun Sirih Lengkung ( Piper aduncum L.)

Lampiran 3. Hasil skrining Fitokimia daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.)

Metabolit Sekunder Hasil Ciri khas larutan

Alkaloid + terbentuk endapan putih

flavonoid + terbentuk endapan kuning dibagian tengah tabung

Saponin + terbentuk busa setinggi 1-10 cm

polifenol + terbentuk endapan putih pada dasar tabung

Tanin + terbentuk warna hitam kehijauan pada tabung uji

dibanding kontrol

Steroid dan terpenoid + terbentuk warna merah kecoklatan pada lapisan bawah

dan warna hijau pekat pada lapisan atas


23

Lampiran 4. Gambar Hasil skrining Fitokimia daun sirih lengkung ( Piper

aduncum L.)

1. Pemeriksaan Alkaloid dengan pereaksi Mayer

Foto Uji tabung pemeriksaan alkaloid dengan pereaksi mayer

Keterangan gambar :

Blangko mayer : HCl + pereaksi Mayer

Sampel : ekstrak + HCl + pereaksi Mayer terdapat endapan putih

2. Pemeriksaan flavonoid dengan pereaksi tembaga asetat

Keterangan

Blangko : larutan ekstrak

Larutan Uji : ekstrak + tembaga

asetat

Blangko Larutan Uji

blangko Sampel


24

3. Pemeriksaan Tanin dan Polifenol dengan FeCl3 dan Gelatin

Keterangan :

Tabung 1 : larutan ektrak metanol

Tabung 2 : larutan ekstrak metanol dan FeCl3 10%

Tabung 3 : larutan ekstrak metanol dan gelatin 1%

4. Pemeriksaan Saponin

keterangan :

Tabung : larutan ekstrak metanol dengan penetesan

HCl 2 N

5. Pemeriksaan Terpenoid dan Streroid

Keterangan :

Blangko : larutan ektrak

metanol

Larutan Uji : larutan ekstrak

metanol, kloroform

dan H2SO4

Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3

Larutan Uji Blangko


25

Lampiran 5. Penetepan kadar air serbuk daun sirih lengkung ( Piper

aduncum L.)

Penetapan kadar air dilakukan menggunakan alat moisture balance dengan

metode Gravimetri. Pemanasan serbuk daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.)

dilakukan pada suhu 110ºC dalam waktu 15 menit.

Hasil penetapan kadar air serbuk daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.)

Bobot Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Sebelum pemanasan 5,042 g 5,022 g 5,016 g

Sesudah pemanasan 4,588 g 4,563 g 4,553 g

Kadar air 0,454 g 0,459 g 0,463 g

Rata-rata kadar air 0,458 g

= 9,004 %

= 9,139%

= 9,031%

= 9,058 %

Kadar air serbuk yang dipersyaratkan adalah kurang dari 10%. Kadar air serbuk

daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.) sebesar 9,058 %, sehingga memenuhi

persyaratan.


26

Lampiran 6. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan

metode Folin-Ciocalteau

Keterangan:

A = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin - Ciocalteau + Na2CO3)

B = Kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin - Ciocalteau + Na2CO3)

C = Sampel (ekstrak metanol daun sirih lengkung + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3)

Lampiran 7. Perhitungan rendemen ekstrak

a. Ekstrak metanol daun sirih lengkung ( Piper aduncum L.)

(gram)

Bobot simplisia yang

digunakan 10.00 gram

Bobot wadah 125.2500 gram

Bobot cawan + ekstrak 125.3581 gram

Bobot ekstrak 0.1081 gram

% rendemen ekstrak =

% rendemen ekstrak =

Lampiran 8. Data penimbangan untuk penetapan kandungan ekstak metanol

a. Penimbangan asam galat (larutan stok)

Asam galat untuk operating time

Replikasi 1

(gram)

Replikasi 1

(gram)

Replikasi 1

(gram)

Bobot beker 63.7284 61.4635 62.1535

Bobot beker + isi 63.7385 61.4735 62.1636

Bobot isi 0.0101 0.0100 0.0101


27

Lampiran 9. Data perhitungan konsetrasi asam galat dan ekstrak metanol

untuk penetapa kandungan fenolik total

a. Contoh perhitungan konsentrasi asam galat

Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101 g = 10,1 mg

Konsentrasi larutan induk asam galat =

Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1

Seri 1 :

V1.C1 = V2.C2

0.4 ml x 1010 µg/ml = 10 ml x C2

C2 = 40.4 µg/ml

Seri 3 :

V1. C1 = V2.C2

0.6 ml x 1010 mµ/ml = 10 ml x C2

C2 = 60.6 µg/ml

Seri 5 :

V1. C1 = V2.C2

0.8 ml x 1010 µg/ml = 10 ml x C2

C2 = 80.8 µg/ml

Seri 2 :

V1. C1 = V2.C2

0.5 ml x 1010 µg/ml = 10 µl x C2

C2= 50.5 µg/ml

Seri 4 :

V1. C1 = V2.C2

0.7 ml x 1010 µg/ml = 10 ml x C2

C2 = 70.7 µg/ml

Replikasi 2 konsentrasi

1000 µg/ml

Replikasi 3 konsentrasi

1010 µg/ml

Seri 1 40 40.4

Seri 2 50 50.5

Seri 3 60 60.6

Seri 4 70 70.7

Seri 5 80 80.8


28

Lampiran 10. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan

fenolik total

a. Replikasi 1

OT Absorbansi konsentrasi asam galat pada 750 nm

40 μg/ml 60 μg/ml 80 μg/ml

5 0.341 0.401 0.574

10 0.366 0.482 0.607

15 0.376 0.528 0.626

20 0.382 0.545 0.635

25 0.385 0.549 0.640

30 0.386 0.551 0.640

35 0.386 0.550 0.640

40 0.386 0.551 0.639

45 0.386 0.549 0.639

50 0.386 0.552 0.639

55 0.385 0.533 0.638

60 0.385 0.553 0.638

Pada replikasi 1, OT yang didapat 30 menit.

b. Replikasi 2



5 0.344 0.408 0.581

10 0.368 0.490 0.610

15 0.377 0.532 0.627

20 0.384 0.544 0.636

25 0.386 0.549 0.640

30 0.386 0.548 0.641

35 0.387 0.548 0.640

40 0.386 0.549 0.640

45 0.386 0.549 0.640

50 0.386 0.550 0.639

55 0.385 0.537 0.638

60 0.385 0.546 0.638

Pada replikasi 2, OT yang didapat 25 – 30 Menit.


29

c. Replikasi 3



5 0.345 0.406 0.581

10 0.362 0.487 0.606

15 0.379 0.529 0.633

20 0.387 0.535 0.650

25 0.399 0.538 0.653

30 0.402 0.544 0.664

35 0.404 0.543 0.664

40 0.414 0.543 0.661

45 0.418 0.544 0.659

50 0.420 0.543 0.665

55 0.423 0.544 0.667

60 0.425 0.544 0.665

Pada replikasi 3, OT yang didapat 25 – 30 Menit

Lampiran 11. Optimasi Panjang Gelombang Maksimal untuk Penetapan

Kandungan Fenolik Total

a. Konsentrasi 40 μg/ml


30

b. Konsentrasi 60 μ

c. Konsentrasi 80 μg/ml

Lampiran 12. Hasil Pengukuran Kurva Baku untuk Penetapan Kandungan

Fenolik Total

a. Replikasi 1

Seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan kurva baku

1 40,4 µg/mL 0,349 A = 0,07

B = 0,00718

r = 0,9831

y = 0,00718x + 0,07

2 50,5 µg/mL 0,430

3 60,6 µg/mL 0,499

4 70,7 µg/mL 0,606

5 80,8 µg/mL 0,620

b. Replikasi 2


1 40,0 µg/mL 0,390 A = 0,1264

B = 0,00618

r = 0,9894

y = 0,00618x + 0,1264

2 50,0 µg/mL 0,419

3 60,0 µg/mL 0,484

4 70,0 µg/mL 0,569

5 80,0 µg/mL 0,624


31

c. Replikasi 3


1 40,4 µg/mL 0,369 A = 0,0974

B = 0,00699

r = 0,9924

y = 0,00699x + 0,0974

2 50,5 µg/mL 0,424

3 60,6 µg/mL 0,492

4 70,7 µg/mL 0,587

5 80,8 µg/mL 0,622

Lampiran 13. Perhitungan Kandungan Fenolik Total Ekstrak Metanol

Konsentrasi Absorbansi Kandungan

Fenolik Total

Rata-rata ±

SD %CV

Replikasi 1 200 μg/ml 0.346 185.8 184.533 ±

4.244 % Replikasi 2 200 μg/ml 0.349 188

Replikasi 3 200 μg/ml 0.338 179.8

Contoh perhitungan kandungan fenolik total:

Contoh perhitungan kandungan fenolik total replikasi 1 :

y = 0,00669x + 0,0974

0,346 = 0,00669x + 0,0974

x = 37.159 µg/mL = 0,0372 mg/mL

Bobot ekstrak = 0.0100 gram

Kandungan fenolik total = X = 0.0372 = 185.8 mg

Maka kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 185.8 mg

ekivalen asam galat per gram sampel.

CV =


32

Lampiran 14. Data Penimbangan Optimasi Metode Uji Aktivitas

Antioksidan FTC

a. Penimbangan BHT (kontrol positif)

Bobot gelas beker = 63,0377 gram

Bobot gelas beker + isi = 63,0418 gram

Bobot zat = 0,0041 gram

Lampiran 15. Hasil optimasi operating time Uji Aktivitas Antioksidan FTC

Menit ke Absorbansi pada panjang gelombang 500 nm

Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukurann 3

1 0,985 0,959 0,948

3 0,918 0,907 0,899

5 0,875 0,875 0,874

7 0,864 0,862 0,860

10 0,855 0,853 0,853

Operating time yang didapat adalah 5 menit


metode FTC


Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram)

Bobot gelas beker 61,5081 61,7617 63,6569

Bobot gelas beker +

isi 61,5122 61,7657 63,6609

Bobot zat 0,0041 0,004 0,004

Lampiran 17. Hasil optimasi panjang gelombang uji aktivitas antioksidan

metode FTC

a. Replikasi 1


33

b. Replikasi 2

c. Replikasi 3

Lampiran 18. Data penimbangan uji aktivitas antioksidan metode FTC –

TBA


Bobot gelas beker = 62,4275 gram

Bobot gelas beker + isi = 62,4316 gram

Bobot zat = 0,0041 gram

b. Penimbangan sampel ekstrak metanol daun sirih lenkung

Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram)

Bobot cawan 22,7628 22,7834 23,3523

Bobot cawan + isi 22,7668 22,7874 23,3563

Bobot zat 0,004 0,004 0,004


34

Lampiran 19. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan metode FTC

a. Nilai absorbansi kontrol negative, kontrol positif dan sampel

Hari

ke-

Kontrol (-) Kontrol (+) Sampel

R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3

1 1,604 1,587 1,599 1,457 1,426 1,466 1,251 1,251 1,241

2 1.729 1,716 1,722 1,474 1,495 1,470 1,570 1,567 1,567

3 2.081 2,057 2,065 1,927 1,930 1,939 1,949 1,959 1,979

4 2.135 2,145 2,168 1,933 1,935 1,949 1,994 2,000 2,010

5 2.157 2,194 2,208 1,955 1,942 1,954 2,060 2,005 2,014

6 2.157 2,159 2,263 1,952 1,965 1,955 2,100 2,016 2,016

7 1.959 1,946 1,945 1,749 1,889 1,885 1,918 1,939 1,939

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi kontrol negatif dengan

spektrofotometri UV/Vis maka dapat dismpulkan bahwa pada ke-6 reaksi

peroksidasi lipid telah mencapai batas maksimum.

b. Rata – rata absorbansi kontrol negative, kontrol positif dan sampel

Hari

ke-

Kontrol (-) Kontrol (+) Sampel

Rata-rata ± SD % CV Rata-rata ± SD % CV Rata-rata ± SD % CV

1 1.597 ± 0.009 0,563 % 1.450 ± 0.021 1.448 % 1.568 ± 0.002 0.127 %

2 1.722 ± 0.007 0,406 % 1.480 ± 0.013 0.878 % 1.248 ± 0.006 0.481 %

3 2.068 ± 0.012 0,580 % 1.932 ± 0.006 0.310 % 2.011 ± 0.051 2.536 %

4 2.149 ± 0.017 0,791 % 1.939 ± 0.009 0.464 % 2.044 ± 0.048 2.348 %

5 2.186 ± 0.026 1,189 % 1.950 ± 0.007 0.359 % 2.003 ± 0.008 0.399 %

6 2.193 ± 0.061 0.729 % 1.957 ± 0.007 0.358 % 1.976 ± 0.026 1.316 %

7 1.950 ± 0.006 0.308 % 1.841 ± 0.080 4.345 % 1.932 ± 0.012 0.621 %

% CV =

% CV = = 0,563 %


35

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

1 2 3 4 5 6 7

Ab

sorb

ansi

Hari Ke-

kontrol positif

kontrol negatif

sampel

c. Grafik absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel selama tujuh

hari.

d. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode FTC

Rata – rata absorbansi kontrol negatif hari ke – 6 = 2,193

Hari

ke-

Kontrol + (BHT) (%) Rata-rata ±

SD % CV Replikasi 1 Replikasi

2

Replikasi 3

6 10.990 10.397 9.530 10.306 ±

0.734 7.122

Hari

ke-

Sampel (%) Rata-rata ±

SD % CV Replikasi1 Replikasi

2

Replikasi 3

6 4.241 8.071 8.071 6.794 ±

2.211 32.543

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke- 6:

% inhibisi =

= 4.241 %

% CV = = = 32.543 %

Persen inhibisi = (A0 – A1/A0) x 100%


36

e. Grafik nilai % inhibisi Kontrol Positif dan Sampel

Lampiran 20. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode

TBA

a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel

Kontrol Negatif Kontrol Positif Sampel

R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3

1.000 1.005 0.998 0.178 0.165 0.161 0.059 0.060 0,124

b. Profil absorbansi kontrol negative, kontrol positif dan sampel

Rata – rata ± SD

Kontrol Negatif Kontrol Positif Sampel

1.001 ± 0.004 0.168 ± 0.009 0.060 ± 0.001

c. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA

% inhibisi = (A0 – A1/A0) x 100%

% inhibisi =

= 83.217 %

% CV = = = 4.052 %

0 5 10 15

% Inhibisi

Rata-rata %inhibisi kontrolpositif

Rata-rata %inhibisi sampel


37

Kontrol Positif (BHT)

Absorbansi kontrol

negative

1.001

Absorbansi Replikasi 2 0.165

% inhibisi 83.516

Ekstrak Metanol Daun Sirih Lengkung

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1:

% inhibisi =

= 94.106%

Absorbansi kontrol negatif 1.001


% inhibisi 82.218



% inhibisi 83.916

Rata – rata ± SD % inhibisi

83.217 ± 0.88



% inhibisi 94.106

Absorbansi kontrol negative 1.001


% inhibisi 94.006



% inhibisi 87.612

Rata – rata ± SD % inhibisi

91.908 ± 3.721


38

Lampiran 21. Data PSPP FTC


39

Lampiran 22. Data PSPP TBA


skrining fitokimia dan uji aktivitas antioksidan … · skrining fitokimia dan uji aktivitas...

Documents