sinteza proteinelor la eucariote -...

Sinteza proteinelor

• Este activitatea fundamentala a fiecarei celule din organism

• Ea reprezinta expresia informatiei genetice din ADN si este un fenomen care se desfasoara intr-un singur sens: ADN→ARN→proteine

• Datorita universalitatii sale, acest proces este cunoscut sub denumirea de dogma centrala a biologiei moleculare

Dogma centrala a biologiei

moleculare

• Descrie procesul

format din doua

etape, transcriptia si

translatia prin care

se produce fluxul

informatiei genetice

din ADN genic pana

la proteina nou-

sintetizata.

Fluxul informatiei genetice

• In realitate, fluxul informatiei genetice nu este in

totalitate unidirectional

• Exista secvente de ADN-retrotranspozoni,

care sunt transcrise mai intai in ARN si apoi sub

actiunea unei revers transcriptaze sunt copiate

sub forma de ADNc care se insera aleatoriu in

ADN

• Exemplu de virus ARN care se insera prin

reverstranscriptie in genomul ADN este vs. HIV.

Fluxul informatiei genetice - Etape

• I. Transferul informatiei genetice din ADN-ul cromozomial in citoplasma celulei. Acest transfer este realizat prin sinteza moleculelor de ARN mesager care, conform principiului complementaritatii bazelor azotate, respecta riguros structura primara a ADN-ului;

• II. Formarea nisei polizom unde se asambleaza specific aminoacizii in lanturile polipeptidice(pe baza ARNm,ARNt si ARNr)care duc la edificarea unei proteine ale carei structura si functie sunt specifice fiecarui individ si fiecarei specii;

• III. Materializarea informatiei genetice sub forma de molecule proteice, enzimatice, imunologice;

• IV. Finalizarea caracterelor anatomo-structurale. Realizate ontogenetic, controlate genetic si influentate de factorii de mediu, caracterele morfologice sunt particulare fiecarui individ si fiecarei specii.

Teoria semantica a fluxului informatiei genetice Biopolimerii celulari pot fi clasificati dupa gradul semnificatiei genetice

si participarea la edificarea caracterului(Zuckernandl si Pauling).

• Semantida primara - ADN-ul cromozomial are drept caracteristica dispunerea liniara a informatiei genetice - detine informatia primara a genelor;

• Semantida secundara ARN-ul celular are rolul de mesager intre nucleu si citoplasma - copiaza informatia genetica din ADN, folosita apoi in citoplasma pentru ordonarea aminoacizilor din structura polipeptidului;

• Proteinele, formate din lanturi polipeptidice sunt considerate semantide tertiare;

• Molecule episemantice - Glucidele si lipidele se sintetizeaza sub controlul unor enzime specifice; ele ca produs final nu exprima in totalitate informatia obtinuta din primele trei tipuri de semantide.

CODUL GENETIC

• Intelegerea fluxului de informatie genetica cere cunoasterea modului particular in care sunt codificate mesajele in structura ADN-ului cromozomial;

• Informatia genetica este inregistrata in moleculele acizilor nucleici sub forma unui cod genetic.

• Codul genetic este determinat de ordinea bazelor azotate in structura primara a ADN-ului.

• Orice informatie genetica este reprezentata conventional prin semne – simboluri (A, G, C, T/U);

• Totalitatea semnelor conventionale care servesc la obtinerea unui mesaj genetic reprezinta alfabetul genetic;

CODUL GENETIC – GENERALITATI

4 simboluri(A, G, C, T/U) = 20 aminoacizi?

• Watson si Crick au introdus in 1961 notiunea de codon – unitatea de

functie a codului genetic, format dintr-o succesiune de baze azotate,

necesare pentru codificarea unui aminoacid din structura proteinelor;

• Initial s-a crezut ca unitatea de functie este reprezentata de un singur

nucleotid, adica codonul univoc. Daca codonul ar specifica strict un

aminoacid, numarul codonilor obtinuti ar fi de 4 x 1 = 4, deci ar fi specificati

numai 4 aminoacizi, iar restul de 16 ar ramane nespecificati;

• Acelasi rationament poate fi aplicat si in cazul codonului biunivoc 4 x 4 =

16 codoni, respectiv 16 aminoacizi, admitand faptul ca ordinea bazelor

modifica tipul de aminoacid;

• Nierenberg si Matthaei(1961) au demonstrat ca, dimensional, codonul este

triunivoc, iar fiecare aminoacid este codificat de o tripleta, succesiunea a

trei nucleotide adiacente;

• Prin aceasta asociere numarul combinatiilor posibile este de 4 x 4 x 4 = 64,

care acopera si depaseste numarul aminoacizilor din structura proteinelor.

Descifrarea codului genetic

• Codul genetic a fost descris de catre Robert Holley, Har Gobind Khorana si Marshall Nirenberg in 1965 si a insemnat inceputul erei geneticii moleculare

• Codul a fost descifrat experimental folosind polinucleotide sintetice cu secventa cunoscuta de ARNm si analizand secventa de aminoacizi a proteinei sintetizate artificial

• De exemplu, ARNm sintetic al poliuracilului a produs un polipeptid alcatuit numai din fenilalanina, deci tripleta UUU codifica fenilalanina.

• Premiul Nobel pentru chimie in 1968

CODUL GENETIC

• Structura codului genetic

CARACTERISTICILE CODULUI GENETIC

• Unitatea de functie a codului

genetic este codonul. El este

format din secventa liniara a trei

nucleotide;

• Reprezinta un sistem de

corespondenta intre informatia din

structura ADN-ului si un anumit

aminoacid


• Codul genetic este degenerat. Numarul combinatiilor posibile este 4³ = 64 codoni. Fata de numarul aminoacizilor avem un surplus de 44 de codoni. Dintre aceste triplete, multe participa la codificarea aceluiasi aminoacid.

• De exemplu, leucina este codificata de 6 codoni diferiti: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA si CUG, iar arginina de 6 codoni: CGU, CGC, CGA, CGG, AGA si AGG.

• Acestia sunt codoni sinonimi iar codul genetic este degenerat, adica un aminoacid este specificat de mai multi codoni. Acest aspect se numeste redundanta informationala;

• Desi este un termen peiorativ, caracterul degenerat al codului genetic este un avantaj informational deoarece unele mutatii genice ce produc codoni sinonimi nu modifica proteina codificata de gena(mutatii silentioase sau izo-semantice)

• Aceasta degenerare este un sistem de protectie impotriva efectului mutatiilor.


• Codul genetic inscris in molecula ADN-ului este recunoscut in structura ARN-ului mesager prin complementaritatea bazelor: C » G, G » C, T » A, A » U.

• Codul genetic nu este ambiguu. Un codon dat recunoaste un singur tip de aminoacid.

• Codificarea este inepuizabila. De exemplu, secventa de 10 dezoxiribonucleotide realizeaza 1 milion de combinatii sau fraze diferite, iar dintr-o secventa de 15 dezoxiribonucleotide pot rezulta cateva sute de milioane de combinatii diferite.


• Mesajele au punctuatie. Semnele de punctuatie sunt reprezentate de un codon start sau initiator AUG, si 3 codoni denumiti non-sens(UAA, UAG, UGA) care semnifica oprirea sintezei proteice.

• Codonul initiator AUG(cu care se incepe cadrul deschis de lectura) specifica metionina.

• Codonii stop semnaleaza incheierea sintezei si eliberarea polipeptidului format(prin fixarea unor factori de eliberare).

CARACTERISTICILE CODULUI

GENETIC • Codoni start alternativi pot fi GUG sau

UUG; acestia in mod obisnuit reprezinta

valina si leucina dar in prezenta unor

factori initiatori ai translatiei sunt tradusi

drept metionina si formil-metionina

• Ceilalti 61 de codoni sunt codoni sens

care semnifica cei 20 de aminoacizi.


• Intre codoni nu exista semne de separare

sau virgule. Citirea mesajului se face in flux

continuu pana la codonul terminator. Intre

codoni nu raman dezoxi-ribonucleotide izolate,

neintegrate in componenta unui triplet functional.

• Codul genetic nu accepta suprapunere.

Fiecare codon poseda bazele proprii, care nu

participa in acelasi timp la structurarea altui

codon.


• Codul genetic este universal. Aceeiasi codoni codifica aceiasi aminoacizi la marea majoritate a genelor la animale, plante si micoorganisme, iar semnalele START si STOP sunt universale si ele.

• Exceptii de la universalitate ale codului genetic

• Acestea se refera mai ales la desemnarea unuia sau doi codoni terminatori drept codoni codificatori la nivelul:

• Genelor mitocondriale

• Aminoacizilor nestandardizati

Exceptii de la universalitatea codului genetic-

Mitocondrii • Gene mitocondriale

• La animale si microorganisme codonul UGA codifica triptofan

• Experiment: ARNm mitocondrial impreuna cu celelalte componente ale complexului citozolic de sinteza proteica(aminoacizi, enzime, ARNt, ribozomi) acesta nu va fi translat in proteine, deoarece codonul UGA codifica triptofan si nu oprirea sintezei lantului polipeptidic. Sinteza proteica se opreste acolo unde ar fi trebuit sa fie inserat aa. trp.

• La majoritatea mitocondriilor animale codonul AUA codifica metionina si nu izoleucina;

• Toate vertebratele au mitocondrii ce folosesc codonii AGA(arginina) si AGG(arginina) drept codoni terminatori ai lantului polipeptidic;

• Mitocondriile de drojdie folosesc toti codonii care incep cu CU pentru desemnarea treoninei in locul leucinei(CUU, CUC, CUA, CUG).

Exceptii de la universalitatea codului genetic-Aminoacizii

nestandardizati

• Aminoacizi nestandardizati

• Marea majoritate a proteinelor este asamblata din cei 20 de aminoacizi, chiar daca unii pot fi alterati prin fosforilare uneori;

• Cu toate acestea, au fost identificate doua cazuri in care un aminoacid care nu face parte dintre cei douazeci este inserat printr-un ARNt in lantul polipeptidic:

• Selenocisteina(aa 21) – Acest aminoacid este codificat prin UGA. UGA este utilizat si ca terminator al lantului, dar complexul ribozomal este capabil sa discearna cand trebuie folosit ca selenocisteina, respectiv secventa terminator.

• Aceasta utilizare diferita a codonului a fost semnalata la Archea, eubacteria.

• La om s-au evidentiat 25 de proteine diferite continand seleniu.

• Pirolizina(aa 22) – La cateva specii de Archea si de bacterii acest aminoacid este codificat prin UAG, dar poate actiona ca un codon stop si opreste si sinteza lantului proteic.


• Codul genetic se modifica prin mutatie. Principalele tipuri de mutatii, limitate la un singur cistron constau din: insertia repetitiva, substitutia sau deletia unei baze din structura ADN-ului

• Daca intr-o celula prin mutatie se suprima sau se insera 1-2 nucleotide (sau un alt numar care nu este multiplu de 3) se produce o decalare a cadrului de lectura al genei care duce la aparitia altui codon.

• Toti codonii vor fi diferiti si se va sintetiza o proteina in care toti aminoacizii vor fi diferiti de la locul in care s-a produs mutatia(numita frameshift)

Mutatiile in codul genetic

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/72/Notable_mutations.svg

Mutatiile in codul genetic • Repetitii trinucleotidice

• Boala Huntington: insertii CAG care adauga serii de glutamina

• Ataxia Friedreich: repetitii GAA in primul intron

• Atrofia dentatorubral-pallidoluysiana (DRPLA), produsa prin amplificarea unor secvente CAG ce produce poliglutamina in proteina atrofina-1

• Boala Kennedy, produsa prin amplificarea trinucleotidica a secventei CAG in primul exon al genei receptorului androgenic

• Sindromul X Fragil: insertii CGG pe cromozomul X; practic acestea nu sunt legate de arginina deoarece mutatia este localizata in regiunea 5’ netranslata;

• CTG in distrofia miotrofica ;

• Ataxia spinocerebelara, cu repetitii CAG

Mutatiile in codul genetic

• Mutatii missense

• Anemia Sickle-cell: GAG se transforma in GTG in gena beta a hemoglobinei;

• APC: varianta missense GAC la GTC

• Cancer prostatic: mutatie missense GCC la ACC in gena steroid 5 alfa-reductaza

• Mutatii nonsens:

• β-thalassemia (β-globin gene)

• Boala McArdle’s – glicogenoza prin mutatie nonsens in gena miofosforilazei

• Deletia:

• Fibroza chistica – deletia UUU


• Amplificarea codului genetic

• Din 2001 au fost creati 40 de aminoacizi

de sinteza

• H. Murakami si M. Sisido au emis teoria

codonului format din 4 si 5 baze

• Steven A. Benner a construit al 65-lea

codon functional(in vivo).

SINTEZA DE PROTEINE SI POLIPEPTIDE

poate fi impartita in 2 etape

• Transcriptia informatiei genetice de la ADN catre

moleculele de ARNm;

• Translatia/ Traductia informatiei genetice intr-un

lant polipeptidic.

TRANSCRIPTIA INFORMATIEI GENETICE

Prin asamblarea ribonucleotidelor in structura ARN-m,

respectandu-se principiul complementaritatii bazelor se

reproduce fidel, in negativ, informatia genetica din

segmentul cistronului de ADN.

Transcriptia ARN-m are loc in 3 etape:

• Initierea;

• Elongatia;

• Terminarea.

Diferente între replicare si transcriere

•‡Transcrierea, spre deosebire de replicare,care

angajeaza simultan întregul cromozom, vizeaza

numai anumite portiuni de ADN;

• Transcrierea are loc ori de cite ori este

necesara o anumita proteina, deci nu este un

eveniment unic, spre deosebire de replicare,

care este un eveniment unic în viata celulei.

Cum poate ADN-ul sa codifice informatia cu

privire la sinteza proteinelor?

• Ideea ca ARN-ul actioneaza ca intermediar a fost sugerata de urmatoarele constatari experimentale realizate la eucariote:

• 1.ADN-ul este în principal asociat cu cromozomii si se gaseste în nucleu, în timp ce ribozomii au sediul sintezei proteinelor în citoplasma;

• 2.ARN este sintetizat în nucleu;

• 3.ARN migreaza în citoplasma, unde sunt sintetizate proteinele;

• 4.Cantitatea de ARN este în general direct proportionala cu cantitatea de proteine din celula.

ARN polimeraza

• Sinteza ARN implica existenta unei enzime

• Enzima capabila sa sintetizeze ARN se numeste

ARNpolimeraza(ARNpol), mai exact ARN-

polimeraza-ADN-dependenta;

• ARN-P pentru a functiona necesita:

• 1.ADN dublu catenar

• 2.Cele 4 ribonucleozide 5’-trifosforilate

NTP(ATP, GTP, CTP, UTP)

• 3.Mg2+.

Comparatie ARN-pol si ADN-pol • Asemanari între ARN-polimeraza si ADN-polimeraza

• Sensul sintezei este întotdeauna 5’-3’.

• Necesita o matrita, 4 nucleotide si Mg2+.

• Diferente între ADN-polimeraza si ARN-polimeraza

• Spre deosebire de ADN-pol, ARNpol:

• -nu necesita primer pentru a initia sinteza

• -are o fidelitate mai mica (1 eroare la10.000 baze): face mai multe erori decat ADN-pol (dar eroarea persista doar o generatie de proteine, nu toata viata celulei, ca în cazul ADN-pol)

Tipuri de ARN-polimeraze

• Procariote – Toate cele 3 tipuri de ARN sunt

transcrise de aceeasi ARN-polimeraza

• Eucariote – Fiecare tip de ARN este transcris

de catre un tip diferit de ARN-polimeraza

• ARN-pol I(localizata în nucleol): ARNr 45 S

• ARN-poI II(localizata în nucleoplasma): ARNm,

ARNsn

• ARN-pol III(localizata în nucleoplasma): ARNt si

ARN 5S, ARNsn.

FAZA DE INITIERE A TRANSCRIPTIEI

• Incepe cu o secventa particulara de ADN denumita situs promotor, unde se ataseaza enzima ARN-polimeraza-ADN-dependenta, care initiaza transcriptia;

• ARN-polimeraza sintetizeaza acid nucleic in directia 5’ la 3’, iar citirea matritei de ADN se face in directia 3’ la 5’;

• La acest nivel se gaseste si o subunitate proteica denumita factor sigma, care are rolul de a mentine conformatia de dublu helix necesara recunoasterii situsului promotor;

• In momentul in care complexul ARN-polimeraza/factor sigma recunoaste corect promotorul, factorul sigma se disociaza de ARN polimeraza si enzima incepe sa despiralizeze helixul de ADN, formand o regiune de dezoxiribonucleotide neimperecheate, care serveste drept matrita pentru sinteza ARN-ului.

Initiation

Faza de initiere a transcriptiei

• ARN polimeraza de la E. coli este formata din 6 subunitati polipeptidice:

• 2 subunitati alfa;

• 1 beta;

• 1 beta prim;

• 1 omega

• Subunitatea sigma-asigura legarea specifica a ARN-pol la anumite secvente de ADN numite promotor fata de care creste afinitatea ARN-pol si scade afinitatea enzimei pentru catena non-matrita;

• Primele 5 subunitati sunt strans unite in miezul enzimei

• Enzima miez se poate lega nespecific la ADN;

• Holoenzima ARN polimeraza recunoaste secventa initiala a unei gene, regiunea de start, care este cunoscuta sub denumirea de regiunea promotor;

• Informatia continuta de promotor face enzima ARN polimeraza capabila sa recunoasca precis punctul initial de la care incepe transcriptia;

ARN polimeraza - Rol subunitati

• α-leaga ADN(secvente reglatorii), proteine,

ARN-pol;

• β-catalitic(leaga NTP si formeaza

legaturile fosfatdiesterice;

• β’- leaga ADN;

• σ – recunoaste promotorul;

• Ω – asambleaza ARN-pol.

• Beta si beta prim formeaza impreuna

centrul activ al enzimei.

Structura promotorului

• Este alcatuit din regiunea de recunoastere situata in pozitia -35 pb fata de situsul initial de transcriptie(tss).

• Are structura TTGACA si la nivelul ei se ataseaza ARN polimeraza.

• Aceasta structura se refera la catena superioara care nu va fi transcrisa.

• Polimeraza paraseste secventa -35 si se deplaseaza in aval spre o alta regiune conservata.

• Aceasta este a doua secventa de consens(TATAAT) si este situata in pozitia -10 fata de tss.

• Este denumita PRIBNOW BOX(PB)

Faza de initiere a transcriptiei • Distanta dintre PB si secventa -35 este de aproximativ 16-18b;

• PB este regiunea unde polimeraza se ataseaza ferm de ADN si se considera ca este pozitia in care helixul de ADN se deschide pentru a permite imperecherea de recunoastere intre matrita de ADN si ARNm;

• Atasarea ARN-polimerazei este conditionata de o serie de factori de transcriptie;

• Regiunea deschisa se intinde de la PB pana la cateva pozitii inaintea punctului +1(tss);

• Numai una dintre cele doua catene de ADN este folosita drept matrita, catena numita antisens(3’→5’);

• Se obisnuieste sa se descrie secventa genica de pe catena sens;

• Transcriptul de ARN(5’→3’) va fi complementar ca directie si structura( cu exceptia U care inlocuieste T) cu catena sens;

• Primul nucleotid al transcriptului de ARN este de obicei o purina(A sau G) situata la capatul 5’;

• Aceasta inseamna ca pe catena antisens a secventei de ADN care va fi transcrisa se va gasi la capatul 3’ o pirimidina(T sauC).

Faza de initiere a transcriptiei

• Initierea transcriptiei se incheie odata cu

formarea primei legaturi fosfat diesterice

intre NTP+1 si NTP+2

Complexul de elongare-elementul

cheie al elongarii lantului polinucleotidic

•‡Complexul de elongare cuprinde:

• -ARNpol (enzima miez, fara subunitatea σ)

• -ADN matrita,

• -ARN în crestere

• -topoizomeraza

Faza de elongatie

• In timp ce polimeraza se deplaseaza de-a lungul catenei antisens, pe lantul de ARN sunt adaugate resturi de ribonucleozid monofosfati(AMP, CMP, GMP, sau UMP) la capatul 3’;

• Aceste nucleotide rezulta din clivarea precursorilor ribonucleozid trifosfati(ATP, CTP, GTP si UTP) de o molecula de pirofosfat(PPi);

• Aceasta inseamna ca la capatul 5’ al transcriptului ARN se va gasi un nucleotid initiator diferit, cu un grup trifosfat la 5’;

• Produsul transcriptiei este totdeauna un ARN(ARNt, ARNm, ARNsn);

• Pe masura ce lantul de ARN se elongheaza, enzima despiralizeaza ADN-ul, ataseaza ribonucleozid-monofosfati si elibereaza difosfatul;

Faza de elongatie

Faza de elongatie

• Subunitatea sigma se detaseaza de pe restul enzimei dupa ce s-au format 6-10 legaturi fosfodiesterice de NTP si se poate atasa la un alt complex polimerazic;

• Regiunea deschisa a ADN-ului se extinde pe o portiune de aprox. 15pb, deoarece dublul helix de ADN se reface in spatele enzimei sub actiunea topoizomerazei;

• Fiecare transcript in crestere va avea un capat 3’ liber la care se poate atasa capatul 5’ al unui nou nucleotid

Faza de elongatie

Etapa de terminare a transcriptiei

• Se realizeaza prin doua mecanisme:

• Ro dependent

• Ro independent

• Mecanismul ro dependent

• Ro este o helicaza ATP-dependenta care are rolul de a desface duplexul ADN-ARN;

• ARN-pol intalneste o zona bogata in GC si incetineste transcrierea;

• Proteina ro ajunge ARN-pol si disociaza ARN de ADN.

Etapa de terminare a transcriptiei • Mecanismul ro independent:

• Situsurile ter sunt bogate in secvente palindromice GC cu structura simetrica in oglinda urmate de regiuni bogate in secvente AT(aprox. 6-8 resturi A) pe catena codificatoare);

• Secventa inversata, prin transcriere, genereaza un ARN in ac de par(prin formarea unei regiuni dicatenare), care se termina cu numeroase secvente uridilice(complementare cozii poli-A);

• ARN-pol se opreste cand ajunge la un situs ter;

• Pauza permite ARN sa formeze un ac de par;

• Acul de par cu coada poli-U distruge legaturile spatiale intre ARN si ARN-pol;

• Complexul de elongare este astfel disociat si elongarea se termina

TERMINATOR SEQUENCE

Transcriptia la eucariote

• Diferita fata de procariote

• Eucariotele au 3 ARN-polimeraze diferite, in

vreme ce procariotele au decat una

• Eucariotele nu sintetizeaza ARNm policistronic;

• ARNm eucariot este prelucrat inainte de a fi

utilizat pentru sinteza proteinelor.


• ARN polimeraza I (nucleol) – ARNr 20S

si ARNr 50S;);

• ARN polimeraza II sintetizeaza ARNm

codificat in toate genele structurale si

ARNsn;

• ARN polimeraza III - ARNt, ARNsn si

ARNr 5S


• Cele trei polimeraze nu sunt capabile sa recunoasca si sa se lege de secvente specifice din promotori;

• Ele au nevoie de factorii de transcriptie, de care depind in totalitate;

• FT sunt proteine care recunosc specific secventele promotorilor si initiaza transcriptia;

• Majoritatea promotorilor care interactioneaza cu ARN polimeraza II contin o secventa conservata numita caseta HOGNESS( TATA box).

Transcriptia la eucariote-structura

promotorului

• Este localizat in pozitia -25pb in amonte fata de tss(+1) si are secventa de consens 5’-TATAAA-3’;

• Este inconjurat de secvente GC;

• Factorii de transcriptie care se leaga in vecinatatea casetei TATA se atasaza pe rand;

• Primul care se atasaza este TF IID, cunoscut sub denumirea de proteina TATA deoarece recunoaste secventa TATA;

• Dupa atasarea TF IID este permisa atasarea TF A, TF B, ARN-polimeraza si TF IIE


• Secventa TATA determina situsul exact pentru initierea transcriptiei, dar nu este singurul;

• Alte doua secvente sunt caseta CAAT si caseta GC. Acestea au rol in modificarea expresiei genice prin controlul transcriptiei;

• I.CAAT box are secventa de consens GGCCAATCT si este localizata in pozitia -80 in amonte fata de +1.

• Mutatiile in CAAT reduc nivelul transcriptiei de la promotor in aval;

• Mutatiile in TATA box reduc partial activitatea transcriptionala, dar altereaza major situsul initial de transcriptie.


• II.GC box cuprinde 2 casete, fiecare cu secventa de consens GGGCGG;

• Una dintre casete este situata in amonte si cealalta in aval fata de caseta CAAT;

• TATA box si CG box interactioneaza cu cativa factori de transcriptie bine definiti;

• CAAT box este recunoscuta de diferite molecule proteice, unele dintre ele facilitand transcriptia;

• Secventele enhancer sunt situsuri de legare pentru o mare varietate de FT. Ele au rolul de a stimula rata transcriptiei.

Maturarea ARNm precursor

• Transcriptele primare de ARN formate sufera un proces de maturare nucleara care fac ARN disponibil si util translatiei

• 2 procese:

• Modificarea extremitatilor ARNm precursor

• cresterea stabilitatii(protectie la actiunea endonucleazelor),

• facilitarea transportului in citoplasma,

• recunoasterea si fixarea la subunitatea 40S a ribozomului

• Procesarea ARNm precursor-Matisarea

Prelucrarea extremitatilor transcriptului primar

• Precoce in transcriptie este adaugat un nucleotid neobisnuit 7-metilguanilat la capatul 5’ al ARN-pm, numit cap(capac, boneta, calota);

• Acesta are rolul de atasare a ribozomilor pentru translatie;

• In momentul in care transcriptia este aproape completa, la capatul 3’ este atasata o serie de 50-250 nucleotide cu adenina, numita coada poli-A;

• La aceasta coada se adauga proteina PABP(polyA binding protein)

• Rolul sau este de a transporta ARN-m in afara nucleului si de a-l stabiliza impotriva degradarii in citoplasma;

• Dupa transcriptia ARN-pm, regiunile non-codante sunt excizate iar regiunile codante sunt unite prin complexe de ribonucleoproteine numite spliceozomi pentru a forma ARN-m matur, care trece apoi in citoplasma pentru a fi translat in proteine.

Procesarea ARNm precursor

Matisarea ARNm

• Termen care semnifica

innadirea a doua capete

• Se descriu urmatoarele

Secvente de semnal

• 5’GT(GU in ARN) –situs

donor

• 3’AG situs acceptor

• Situsul de conexiune sau

de legatura(branch site)

cu nucleotidul A

Matisarea ARNm

• Etape

• 1. Sectionarea jonctiunii exon intron 5’GU

• 2. Atasarea nucleotidului terminal G la nucleotidul A al situsului de bransare(transesterificare) si formarea unei structuri lasou/bucla

• 3. Sectionarea intronului la jonctiunea 3’AG, indepartarea lui si unirea segmentelor de ARN exonic.

• Reactiile sunt mediate printr-un complex ARN-proteine(spliceozomi) format din 5 tipuri de ARNsn(U1,U2,U4,U5,U6) si proteine

Matisarea alternativa

• Ordinea exonilor in ADN si transcriptul primar sunt pastrate in ARNm matur

• Exista, cu toate acestea, o flexibilitate in utilizarea exonilor, in sensul ca in celule diferite vor fi retinuti in ARNm numai o parte din exoni, restul fiind eliminati odata cu intronii – Matisare alternativa

• Aceasta duce la tipuri diferite de ARN din aceeasi gena, deci tipuri diferite de polipeptide

• Aceste proteine pot fi inrudite(izoforme) ca in cazul mielinei sau troponinei C sau complet diferite(de exemplu gena calcitoninei produce in celulele C tiroidiene precursorul calcitoninei iar in creier precursorul unui neuromediator CGRP.

TRANSLATIA/TRADUCTIA INFORMATIEI GENETICE

Elementele implicate in realizarea translatiei sunt:

ARN-r

ARN-t

Aminoacizi

Enzime

Donatorii de energie

Elementele implicate in realizarea translatiei:

ARN-t, aminoacizi

• In timpul translatiei ARN-t specifici fixeaza aminoacizii specifici, ii transfera pe ribozomi si ii insera intr-o pozitie specifica , in functie de mesajul din ARN-m;

• Cuplarea si transportul specific se fac in prezenta ATP-ului si a aminoacil-ARN-t-sintetaza specifica;

• Activarea aminoacidului si transportul sau specific se desfasoara in doua etape:


Etapele activarii aminoacidului

- prima etapa corespunde activarii aminoacidului:

R-CH-COOH + Enzima + ATP = R-CH-CO-O-AMP-E + PP

NH2 NH2

aminoacid aminoacid activat

- in etapa a doua are loc cuplarea aminoacidului activat cu ARN-t:

R-CH-CO-O-AMP-E + ARN-t = R-CH-CO-O-ARN-t + AMP + E

NH2 aminoacil-ARN-t

Aminoacid activation


ARN-t

• Acest proces este efectuat

de catre portiunea

anticodon a moleculelor de

ARN-t complementare cu

secventa de codoni de pe

ARN-m;

• ARN-t este o molecula

tridimensionala cu forma de

frunza de trifoi inversata,

cu lungime de aprox. 70

nucleotide;


ARN-t • La capatul 3’ se poate atasa un

aminoacid specific;

• La capatul opus se gaseste bucla anticodon, care contine o serie de trei baze complementare cu codonul de pe ARN-m, numit capatul de citire;

• Bucla DHU –dihidrouridina –recunoaste si leaga aminoacil-ARNt sintetaza

• Bucla TΨC contine pseudouridina( Ψ )si ribotimina(T) –asigura legarea de subunitatea 50S a ribozomului


ARN-r, ribozomi

• Ribozomii, descrisi de

E. Pallade in 1953,

au un diametru de

150-200 Å, fiind

formati din doua

subunitati inegale,

cuplate intre ele prin

legaturi stabilizate de

ionii de Mg²+;


ARN-r, ribozomi

• La bacterii sunt formati din doua subunitati, diferite prin constanta de sedimentare: marea subunitate are 50S(ARNr 23S, 5S, 34 proteine) iar mica subunitate are constanta 30S(ARNr 16S, 21 tipuri de proteine);

• La om, subunitatile sunt 60S(ARNr 5S, 5,8S, 28S, 46 tipuri de proteine) si 40S(ARNr 18S, 33 tipuri de proteine).

• Fiecare subunitate este constituita din complexe de proteine(40%) si ARN-r(60%);

• Ribozomii au 4 situsuri functionale:

• Pe subunitatea mica situsul de fixare al extremitatii 5’ a ARNm

• Pe subunitatea mare situsul P(peptidil) si A(aminoacil) unde se fixeaza moleculele de ARNt incarcate cu aminoacizi specifici si situsul de iesire E (exit)

• O molecula de ARN-m poate fi explorata de mai multi ribozomi, formand poliribozomul sau polizomul;

• Fixarea ARN-m de ribozomi se face la la subunitatea de 40S.

Polyribosome


FAZA DE INITIERE

• Pentru a initia translatia o unitate

ribozomala de 30 S se leaga la o secventa scurta de ARNm numita situsul de legatura ribozomal;

• Secventa incepe intotdeauna cu semnalul AUG, denumit codon initiator;

• Anticodonul complementar de pe ARN-t va fi UAC si transporta specific numai metionina;

• Aceasta cuplare se realizeaza in prezenta a doi factori de initiere de natura proteica(Fc si Fb);


FAZA DE INITIERE

• Subunitatea ribozomala de 50S se ataseaza apoi la complexul de initiere, iar factorii de initiere se desprind si se formeaza ribozomul de 70S;

• Se formeaza astfel capul de citire, favorizat de un alt factor de initiere Fa, in prezenta unei molecule de GTP;

• Subunitatea mare are doua situsuri alaturate: situsul aminoacil-A si situsul peptidil-P;

• Situsul P este primul ocupat de ARN-t adaptor.


FAZA DE ELONGATIE

• Soseste al doilea ARN-t adaptor, care transporta un aminoacid care care se fixeaza de ribozom in situsul A;

• In prezenta peptidil-transferazei din ribozom se stabileste o legatura peptidica intre cei doi aminoacizi;

• Dupa legarea aminoacizilor, ARN-t initiator paraseste situsul P ribozomal prin situsul de iesire E;

• Ribozomul avanseaza trei baze pe secventa ARN-m;


FAZA DE ELONGATIE

• Prin avansare , al doilea ARN-t trece pe situsul P;

• Situsul A este eliberat prin avansare, cuprinzand codonul urmator din secventa ARN-m;

• Soseste al treilea ARN-t adaptor, care ocupa situsul A;

• Se formeaza o noua legatura peptidica intre aminoacizii 2 si 3, dupa care ARN-t paraseste ribozomul;

• Lantul polipeptidic in crestere strabate un tunel in interiorul subunitatii 50S;


FAZA DE TERMINARE

• Acest proces continua de

nenumarate ori in directia 3’-5’

pana cand ribozomul atinge un

codon stop(UAA, UAG, UGA);

• Factorii eliberatori elibereaza

lantul polipeptidic de pe ARN-t,

iar cele doua subunitati

ribozomale vor fi reciclate;

• In timpul fazei de elongatie

proteina ia o forma functionala

tridimensionala;


• Acest mecanism asigura adaugarea ordonata si repetata a aminoacizilor pana la formarea lantului polipeptidic;

• Legarea aminoacizilor nu se face la intamplare, ci conform ordonarii codonilor din structura ARN-m, care asigura astfel specificitatea structurala si functionala a polipeptidului;

• Sinteza unui polipeptid in celula se desfasoara foarte rapid; de exemplu, pentru constituirea lantului polipeptidic al hemoglobinei cu 150 de aminoacizi este necesar un timp de aprox. 9 minute.

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE

• Mecanismele de reglare au fost studiate cel mai

bine la bacterii.

• Exemplul clasic: Modelul operonului descris de

catre Francois Jacob si Jacques Monod la E.coli

– premiul Nobel 1965.

• Ei au demonstrat experimental si teoretic ca

sinteza proteinelor nu este constanta in timp ci

variaza in functie de necesitatile celulei


• Mecanismele de reglare au la baza actiunea unor enzime si au fost descrise pentru procariote si eucariote;

• Enzimele care intervin in reglarea sintezei proteice pot fi controlate prin 2 mecanisme:

1. Controlul genetic al sintezei enzimei;

2. Controlul activitatii enzimatice(inhibitie de feed-

back)


A). CONTROL GENETIC

• Controlul genetic al sintezei enzimatice se refera la controlul transcriptiei ARN-m necesar pentru sinteza unei enzime;

• Acest control se realizeaza prin intermediul proteinelor reglatoare care se pot atasa la ADN si pot bloca sau amplifica functia ARN-polimerazei;

• Proteinele reglatoare pot functiona ca:

-Represori(control genetic negativ)

- Corepresori(operonul trp);

- Inductori(operonul lac);

-Activatori(control genetic pozitiv).


1). CONTROL GENETIC NEGATIV

• Represorii sunt proteine reglatoare care blocheaza transcriptia ARN-m;

• Represorii se leaga la o portiune de ADN numita operator care se gaseste in aval de promotor;

• Legarea proteinei reglatoare la operator blocheaza trecerea ARN-polimerazei de operator si transcrierea secventei de gene structurale ale enzimei – control genetic negativ;

• Represorii sunt proteine alosterice care au un situs de legare pentru o molecula specifica numita:

- corepresor- care modifica forma proteinei represor astfel incat ea sa se poata cupla cu operatorul si sa blocheze transcriptia;

- inductor- altereaza forma proteinei reglatoare, blocheza cuplarea cu operatorul si permite transcriptia.

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE PRIN

COREPRESOR

Corepresor - modifica forma proteinei

represor astfel incat ea sa se poata cupla

cu operatorul si sa blocheze transcriptia

Este produsul final al sintezei proteice


COREPRESOR

Operonul represibil in absenta corepresorului

(operon Trp)

• Pasul 1: Gena reglatoare

codifica o proteina

represoare inactiva;

• Pasul 2: Proteina

represor inactivata nu se

poate lega de regiunea

operator a operonului;

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE PRIN COREPRESOR

Un operon represibil in absenta corepresorului (operon

Trp)

• Pasul 3: deoarece proteina represor inactiva nu este capabila sa se ataseze de regiunea operator, ARN polimeraza (enzima responsabila pentru transcrierea genei) este capabila acum sa se lege de regiunea promotor a operonului;

• Pasul 4: ARN polimeraza este capabila acum sa transcrie cele 5 gene ce codifica enzima in ARNm;

• Pasul 5: prin transcrierea acestor gene sunt sintetizate cele 5 enzime necesare bacteriei pentru sinteza aminoacidului triptofan.

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE PRIN COREPRESOR

Un operon represibil in prezenta unui

corepresor(operon Trp)

• Pasul 1: Gena reglatoare codifica o proteina represor inactiva;

• Pasul 2: Daca corepresorul triptofan este prezent, el se leaga de proteina represor inactiva;

• Pasul 3: Legarea corepresorului produce activarea proteinei represor inactive;

• Pasul 4: Proteina represor activata se leaga apoi la regiunea operator a operonului;


COREPRESOR

Un operon represibil in prezenta unui corepresor

(operonul Trp) • Pasul 5: Odata cu legarea

proteinei represor active la regiunea operatoare, ARN polimeraza (enzima responsabila pentru transcrierea genelor) nu mai este capabila sa se lege la regiunea promotoare a operonului;

• Pasul 6: Daca ARN polimeraza nu se mai leaga la regiunea promotoare, cele 5 gene enzimatice nu vor mai fi transcrise in ARNm;

• Pasul 7: In lipsa transcriptiei celor 5 gene, cele 5 enzime necesare pentru ca bacteria sa sintetizeze aminoacidul triptofan nu mai sunt sintetizate.


INDUCTOR

Inductor- altereaza forma proteinei

reglatoare, blocheza cuplarea cu

operatorul si permite transcriptia

Este substanta care trebuie metabolizata

The lactose (lac) operon

• Operonul lac este

necesar pentru

transportul si

metabolizarea

lactozei la E.coli

http://www.dartmouth.edu/%7Ecbbc/courses/movies/LacOperon.html

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE PRIN INDUCTOR

Un operon inductibil in absenta inductorului (operonul

lactoza)

• Pasul 1: Gena reglatoare

codifica o proteina

represor activa;

• Pasul 2: Proteina

represor se leaga apoi la

regiunea operator a

operonului;


Un operon inductibil in absenta inductorului (operonul

Lac)

• Pasul 3: ARN polimeraza nu se poate lega de regiunea promotor a operonului cind proteina represor activa este legata de regiunea operator;

• Pasul 4: Daca ARN polimeraza nu se leaga la regiunea promotor genele celor 3 enzime (Z, Y si A) nu sunt transcrise in ARNm;

• Pasul 5: In lipsa transcriptiei celor 3 gene enzimatice, cele 3 enzime necesare pentru utilizarea lactozei de catre bacterie nu sunt sintetizate.


Un operon inductibil in prezenta inductorului (operonul

Lac)

• Pasul 1: Gena reglatoare codifica o proteina represor activa;

• Pasul 2: Lactoza, molecula inductoare se leaga de proteina represor activa;

• Pasul 3: Legarea inductorului inactiveaza proteina represor;

• Pasul 4: Proteina represor inactiva nu se mai poate lega la regiunea operatoare a operonului;


Un operon inductibil in prezenta inductorului(operonul

Lac)

• Pasul 5: Deoarece proteina represor inactiva nu este capabila sa se lege la regiunea operatoare, ARN polimeraza va fi din nou capabila sa se lege la regiunea promotor a operonului;

• Pasul 6: ARN polimeraza este acum capabila sa transcrie cele 3 gene enzimatice (Z, Y si A) in ARNm;

• Pasul 7: Odata cu transcrierea acestor gene sunt sintetizate cele 3 enzime necesare bacteriei pentru a utiliza lactoza.


2). CONTROL GENETIC POZITIV

• Activatorii sunt proteine reglatoare care promoveaza sau initiaza transcriptia;

• Activatorii controleaza gene care au un promotor la care ARN-polimeraza nu se poate atasa;

• Activatorul este o proteina allosterica care se poate lega de situsul activator de legatura;

• ARN-polimeraza nu se va putea lega de promotor si nu va putea transcrie genele;

• Legarea unei proteine inductor la activator ii va modifica forma si aceasta se va atasa la situsul activator de legatura;

• ARN-polimeraza se leaga de promotor si initiaza transcriptia – control genetic pozitiv.


CONTROL GENETIC POZITIV

O proteina activatoare in absenta inductorului • Gena reglatoare produce o

proteina activatoare inactiva;

• Proteina activatoare nu se poate lega de situsul de legare activator;

• ARN polimeraza nu se poate lega la promotor;

• Gena X nu se transcrie iar enzima nu se sintetizeaza.


O proteina activatoare in prezenta inductorului – pasul

1

• Gena reglatoare produce o proteina activatoare inactiva;

• Inductorul se leaga la activator;

• Legarea inductorului produce modificarea formei activatorului;

• Activatorul se poate lega la situsul activator de reglare.

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE O proteina activatoare in prezenta inductorului – pas 2

• Legarea activatorului

evidentiaza situsul de legare al ARN polimerazei la promotor;

• ARN polimeraza se leaga la promotor si este capabila sa transcrie gena X in ARN-m;

• Sinteza enzimei.


B). CONTROLUL ACTIVITATII ENZIMATICE

(Inhibitie prin feed-back)

• Inhibitie non-competitiva;

• Inhibitie competitiva.

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE Inhibitia noncompetitiva prin enzime allosterice

• Produsul final (inhibitor) al caii metabolice se combina cu situsul allosteric al enzimei, aceasta altereaza situsul activ al enzimei astfel incit ea nu se mai poate lega la substratul initial al caii;

• Aceasta blocheaza sinteza produsului final.

REGLAREA SINTEZEI PROTEICE Inhibitia competitiva a activitatii enzimatice

• Produsul final (inhibitor) al caii metabolice se leaga la situsul activ al primei enzime a caii;

• Ca rezultat enzima nu se mai poate lega la substratul initiator al caii metabolice.

Exista diferente majore intre reglarea

sintezei la eucariote si procariote

• Eucariotele au histone si cromozomii sunt stans infasurati in cromatina, iar procariotele au proteine legate direct de ADN care se poate exprima mult mai usor;

• Procariotele nu au introni iar fiecare gena are propria sa regiune reglatoare;

• Eucariotele folosesc factori de transcriptie si regiuni promotoare pentru reglarea controlata a fiecarei gene;

• Eucariotele au introni; ca urmare se produce procesarea ARNm, care este folosit mai ales in reglarea expresiei genice la eucariote.

Reglarea expresiei genice se produce la mai

multe niveluri

• CONTROL TRANSCRIPTIONAL

• CONTROL POSTTRANSCRIPTIONAL

CONTROL TRANSCRIPTIONAL • Punctul primar de control este reglarea

activitatii ARN-polimerazei II

• Activitatea ei este controlata de:

• Elemente cis-reglatoare

• Factori de transcriptie transreglatori

• Controlul la distanta al expresiei genice prin enhancers sau silencers

• Reglare ca raspuns la semnalele extracelulare –liganzi

• Selectarea promotorilor pentru gene care au mai multi promotori

CONTROL POSTTRANSCRIPTIONAL

• Sunt mecanisme secundare care

controleaza expresia genica dupa

transcriptie.

• Acestea cuprind:

• Controlul procesarii ARN;

• Controlul translational;

• Controlul degradarii mRNA;

• Controlul activitatii proteice;

I. Controlul procesarii ARN

• Este limitat la eucariote si determina cum

si cand este splitat sau procesat

transcriptul primar pentru a forma ARNm;

• De exemplu, unele transcripturi de ARN

produc diferite tipuri de ARNm din

aceeasi gena, in diferite tipuri de celule

numai prin folosirea selectiva a

intronilor-matisare alternativa

II. Controlul translational

• Determina care ARNm va fi translat in

proteine si cand;

• De exemplu, translatia poate fi inhibata

de ARNm cuplat cu diferite proteine

specifice sau stimulata de secvente

nucleotidice speciale de la capatul ARNm,

care faciliteaza cuplarea ribozomilor.

II.Controlul translational • Se realizeaza prin urmatoarele mecanisme:

• Adaugarea secventei cap la extremitatea 5’ a ARNm cu rolul de a-l proteja de actiunea 5’ a exonucleazelor si de atasare a ribozomilor.

• Procesul de splicing

• Adaugarea cozii poli-A(poliadenilare) la capatul3’ actioneaza protector impotriva exonucleazelor si stimuleaza viteza translatiei;

• Procesul de editare al ARNm – este un mecanism evolutiv prin care se modifica structura ARNm in timpul procesului de maturare(modificari nucleozidice, deaminare, editare la virusuri)

III. Controlul degradarii ARNm • Se realizeaza prin stabilizarea sau

destabilizarea selectiva unor tipuri diferite de

ARNm.

• O proteina care este necesara in cantitati mari

pe o perioada lunga de timp are un ARNm

foarte stabil.

• De exemplu, ARNm al β – globinei are un timp

de injumatatire de 10 ore(timp de injumatatire

timpul necesar pentru ca 50% dintr molecule sa

fie degradate).Alte proteine sunt necesare

numai tranzitor si au un ARNm cu timp de

injumatatire de cateva minute.

IV. Controlul activitatii proteice

• Presupune activarea si inactivarea selectiva, modificarea moleculelor proteice specifice dintr-o celula sau un anumit tip de celula, influentand cand si cum actioneaza o proteina.

• De exemplu - unele proteine sunt necesare pentru evenimente legate de dezvoltare si actioneaza numai in anumite celule sau intr-un moment specific al dezvoltarii(HbE, HbF).

• Aceste proteine produc efecte profunde asupra altor celule si trebuie sa fie inactivate imediat dupa ce au actionat, deoarece pot produce anomalii de dezvoltare.

sinteza proteinelor la eucariote -...

Documents