síntesis de un mimético del antígeno tn que incorpora flúor · procedure is the incorporation...

Miguel Alonso de la Peña

Jesús Manuel Peregrina García y Alberto Avenoza Aznar

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química

2014-2015

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora flúor

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora flúor , trabajo fin de gradode Miguel Alonso de la Peña, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García y Alberto Avenoza

Aznar (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJADEPARTAMENTO DE QUÍMICAÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA

Síntesis de un mimético del antígeno

JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA

UNIVERSIDAD DE LA RIOJA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA

Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora flúor

Trabajo Fin de Grado

Miguel Alonso de la Peña

Junio 2015

Tutores: JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA

ALBERTO AVENOZA AZNAR

Síntesis de un mimético del Tn que incorpora flúor

JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA, Catedrático de Química Orgánica del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y

ALBERTO AVENOZA AZNAR, Catedrático de Química Orgánica del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.

HACEN CONSTAR:

Que la memoria "Síntesis de un mimético del antígeno Tn que incorpora flúor" ha sido realizada por Miguel Alonso de la Peña en el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 15 créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo fin de Grado.

Logroño, Junio 2015

Fdo.: Jesús Manuel Peregrina García Fdo.: Alberto Avenoza Aznar

Agradecimientos a: Universidad de la Rioja por haber financiado mi trabajo en el laboratorio y Grupo de investigación en Química Biológica por guiarme en el laboratorio

Índice Abreviaturas

1. Resumen

2. Introducción y objetivos

3. Antecedentes 3.1 Efecto anomérico 3.2 Formación de enlaces O-glicosídicos

4. Discusión de resultados

4.1 Síntesis del glicosil aminoácido 4.2 Caracterización del compuesto final

5. Conclusiones

6. Parte Experimental

Anexo: Espectros de RMN

I

1

4

9

11 17

19

22 29

33

35

59

Abreviaturas I

δ desplazamiento químico µL microlitro ºC grado Celsius 1H RMN resonancia magnética nuclear de protón 13C RMN resonancia magnética nuclear de carbono-13 19F RMN resonancia magnética nuclear de flúor-19 Ac acetilo Ac2O anhídrido trifluoroacético Allyl alilo Boc terc-butoxicarbonilo COSY COrrelated SpectroscopY d doblete dd doblete de dobletes DIEA diisopropiletilamina Fmoc (9H-fluoren-9-il)metil carbamato

g gramo GalNac α-O-D-tri-O-acetil-N-trifluoroacetilgalactosaminil h hora Hz hertz HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation J constante de acoplamiento m multiplete mg miligramo min minuto mL mililitro mmol milimol m/z relación masa/carga M molaridad MeCN acetonitrilo MUC1 mucina 1 ppm partes por millón R alquilo, arilo RMN resonancia magnética nuclear s singlete Ser serina

Abreviaturas II

Suc Succinimida t pseudotriplete, triplete, tiempo tBu terc-butilo Thr treonina TFAA anhídrido de ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano TMS tetrametilsilano

1.- Resumen

Resumen / Abstract 2

Las mucinas son glicoproteínas que en estos últimos años han protagonizado gran número de investigaciones debido a su relación con el cáncer, una de las enfermedades con mayor índice de mortalidad en la actualidad. Las células cancerosas poseen mucinas modificadas que dejan desprotegidos ciertos antígenos que pueden ser reconocidos por los anticuerpos del sistema inmune. La modificación de una mucina llamada mucina 1 (MUC1) presenta en su estructura el antígeno Tn (N-acetilgalactosamina unido a residuos de treonina o serina mediante un enlace α-O-glicosídico). La incorporación del antígeno Tn a epítopos (fragmentos que son reconocidos por el sistema inmune) de la MUC1, juega un papel relevante en el reconocimiento por parte de los anticuerpos anti-MUC1. Es por ello que se está trabajando a nivel mundial sobre la posibilidad de utilizar fragmentos de la MUC1 como vacuna contra algunos tipos de cáncer así como la detección precoz de esta enfermedad. Este trabajo se centra en la síntesis del building block N-Fmoc-Thr(α-O-GalN(COCF3))-O-Allyl, un derivado fluorado del antígeno Tn, mediante una α-O-glicosilación siguiendo una metodología Koenigs-Knorr. Para ello se parte del aminoácido treonina y el carbohidrato galactosa ambos debidamente protegidos. Lo novedoso de este glicoaminoácido es la incorporación de átomos de flúor mediante la formación de una amida del ácido trifluoroacético. La corroboración de la estructura de la estructura se realizó mediante diferentes técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Este aminoácido será incorporado, fuera del ámbito de este estudio, a un epítopo de la MUC1. El objetivo es generar una variante estructural que pueda significar una mayor especificidad ante el reconocimiento de los anticuerpos.

Resumen / Abstract 3

Mucins are glicoproteins which in the last years, have acquired great interest because researchers have found a relationship with cancer, one of the most mortal illnesses in our days. Cancer cells have modified mucins that let visible some antigens which can be recognized by human antibodies. The modification of mucin 1 (MUC1) exhibit a particular antigen called Tn antigen. The presence of the Tn antigen have an essential role in the recognition of MUC1 by anti-MUC1 antibodies. In fact, there are a great interest in the develop of cáncer vacccines related to MUC1. This work is focused on the synthesis of the building block N-Fmoc-Thr(α-O-GalN(COCF3))-O-Allyl, a mimetic of Tn antigen that incorporates fluor atoms. The key step is the reaction called Koenigs-Knorr which allows an α-O-glycosylation. The amino acid threonine and peracetylated galactose, both o them protected, are needed as primary reagents. The novelty of this procedure is the incorporation of the fluor atoms for formation of a trifluoroacetic amide. Corroboration of the structure was performed by different NMR techniques. Out of scope of this work,the glycoamino acid will be incorporated in a MUC1 epitope with the objective of achieving conformational alterations in the protein structure. This fact couldimprove the molecular recognition of this epitope by antibodies.

2.- Introducción y objetivos

Las glicoproteínas están aminoácidos) y residuos de carbohidratos. Estos residuos dotan a estas macromoléculas de una mayovulnerables a la degradación tanto enzimática como química.

Figura 2.1. Estructura 3D de una glicoproteína

(www.rcsb.orgpdb

El enlace entre ambas partes se llama enlace glicosídico, siendo la unión a través de un átomo de oxígeno (Olas principales O-glicoproteínas son las denominadas mucinas, responsables de numerosos procesos biológicos entre los queinflamación y la comunicación intercelular. Dentro de este tipo de glicoproteínas, destaca la mucina humana MUC1. Esta mucina se encuentra presente en la membrana epiteliales y posee glicanos de altocélulas tumorales la MUC1 se encuentra sobreexpresada y glicosilada de

Introducción y objetivos

Las glicoproteínas están constituidas por una parte protéica (cadena de aminoácidos) y residuos de carbohidratos. Estos residuos dotan a estas macromoléculas de una mayor estabilidad proteica, es decir, las hacen menos vulnerables a la degradación tanto enzimática como química.

. Estructura 3D de una glicoproteína del virus del dengue

.rcsb.orgpdbexplore-explore.dostructureId=1OAN.web

mbas partes se llama enlace glicosídico, siendo la unión a

través de un átomo de oxígeno (O-glicosídico) la forma más habitual. Una de glicoproteínas son las denominadas mucinas, responsables de

numerosos procesos biológicos entre los que destacan la respuesta inmune, la inflamación y la comunicación intercelular.

Dentro de este tipo de glicoproteínas, destaca la mucina humana MUC1. Esta mucina se encuentra presente en la membrana de numerosas células

y posee glicanos de alto peso molecular. Sin embargo, en las a MUC1 se encuentra sobreexpresada y glicosilada de

Introducción y objetivos 6

ca (cadena de aminoácidos) y residuos de carbohidratos. Estos residuos dotan a estas

r estabilidad proteica, es decir, las hacen menos

del virus del dengue

structureId=1OAN.web)

mbas partes se llama enlace glicosídico, siendo la unión a glicosídico) la forma más habitual. Una de

glicoproteínas son las denominadas mucinas, responsables de destacan la respuesta inmune, la

Dentro de este tipo de glicoproteínas, destaca la mucina humana MUC1. Esta de numerosas células

argo, en las a MUC1 se encuentra sobreexpresada y glicosilada de


forma deficiente (mal funcionamiento de las glicosil tranferasas). Este hecho dota a la célula tumoral de la capacidad de metástasis. No obstante, la deficiente glicosilación deja expuestos ciertos antígenos (compuestos que desarrollan respuesta inmune) que en células sanas quedan enmascarados por los glicanos de alto peso molecular. Uno de ellos es el antígeno Tn, formado por el carbohidrato GalNAc unido mediante enlace α-O-glicosídico a una serina o una treonina.

Figura 2.3. a) Antígeno Tn, b) Diferencia de las mucinas en células sanas y

tumorales

Este fenómeno ha generado que las mucinas estén siendo consideradas como parte de posibles tratamientos contra el cáncer, más en concreto, como serias candidatas a vacunas contra el cáncer.1

1 a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; b) Dziadek, S.; Kunz, H. The Chem. Rec. 2004, 3, 308-321; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 836-863; d) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.; Olkiewicz, K.; Verbel, D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.; Livingston, P. O.; Scher, H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292-4298; e) Chen, X.; Lee, G. S.; Zettl, A.; Bertozzi, C. R.

MUC1

Antígenos expuestos

Antígenos enmascarados

a) b)


La MUC1 está formada por la repetición de la secuencia de los veinte aminoácidos que se muestran a continuación:

AHGVTSAPDTRPAPGSTAPP Esta secuencia de repetición posee cinco puntos donde es posible la glicosilación (tres Thr y dos Ser) y, con ello, la formación del antígeno Tn. Además, se pueden realizar pequeñas modificaciones estructurales en el antígeno para variar las interacciones a nivel atómico. Ya se han realizado miméticos, por ejemplo, intercambiando el enlace O-glicosídico por un enlace S-glicosídico.2 El objetivo de este Trabajo de Fin de Grado es la síntesis, purificación y caracterización de un nuevo análogo del antígeno Tn. La excepcionalidad de este compuesto es la incorporación de átomos de flúor mediante la formación de una amida del ácido trifluoroacético en vez de la amida del ácido acético.

Figura 2.3. Derivado del antígeno Tn: -Fmoc-Thr(α-O-GalN(COCF3))-O-Allyl

Lo que se pretende es crear un building block variando ligeramente la estructura del antígeno Tn. Además, debe incorporar grupos protectores adecuados que le permitan ser utilizado en síntesis automática de péptidos en fase sólida. De este modo, el grupo amino debe estar protegido como carbamato de Fmoc, el ácido como éster alílico y los hidroxilos del carbohidrato como acetatos. En etapas posteriores al trabajo realizado, se

Angew.Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6111-6116; f) Galonic, D. P.; Gin, D. Y. Nature. 2007, 446, 1000-1007; g) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5021-5034. 2 a) Desiree A. Thayer; Henry N; Yu,M; Carmen Galan; Chi-Huey Wong. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 4596-4599


pretende crear la secuencia de repetición de la MUC1 incorporando esta treonina glicosilada. Con ello se pretende estudiar si la incorporación de átomos de flúor puede llegar a mejorar la unión de la mucina con los anticuerpos mediante posibles interacciones entre partes positivas del anticuerpo y los átomos de flúor, muy electronegativos, de este nuevo análogo del antígeno Tn. El mimético fluorado del antígeno Tn está formado por un derivado del sacárido galactosa y un aminoácido (treonina). Ambas partes deben tratarse antes de realizar el acoplamiento (enlace α-O-glicosídico). La treonina es un producto comercial y barato al ser uno de los veinte aminoácidos naturales que forman las proteínas. Su tratamiento consiste en proteger los grupos amino y carboxilo. Sin embargo, en la parte del carbohidrato hay que sintetizar un intermedio que sea un buen donor glicosídico y que lleve en su estructura un precursor del grupo amino (azida). Esto implica una serie de reacciones intermedias ya que se parte de galactosa peracetilada. Le etapa clave de la síntesis es la formación del enlace α-O-glicosídico. A la hora de generar un enlace glicosídico pueden formarse dos posibles esteroisómeros (α y β) regidos por el efecto anomérico, muy representativo de la química de los carbohidratos. En el siguiente apartado se comentarán tanto el efecto anomérico como las distintas metodologías de formación de enlaces α-O-glicosídicos.

3.- Antecedentes

Antecedentes 12

3.1 Efecto anomérico Los azúcares poseen un centro anomérico (C1). Dependiendo de la disposición de los sustituyentes de este carbono, se diferencian dos estereoisómeros más conocidos como anómeros. Si el sustituyente se encuentra en posición axial se denomina anómero α y si, por el contrario, está en posición ecuatorial se conoce como anómero β.

Figura 3.1. Representación de los distintos tipos de anómeros

Para los azúcares, no se puede generalizar que los compuestos con sustituyentes en ecuatorial sean más estables, es decir, que termodinámicamente estén favorecidos con respecto a los que poseen sustituyentes en axial. Ciertas características estructurales hacen que un anómero se estabilice más respecto al otro, dependiendo del sustituyente de la posición C1. Si se tiene un hemiacetal (R=H), el anómero β está más estabilizado puesto que se crea un enlace de hidrógeno entre uno de los orbitales no enlazantes del oxígeno que forma el ciclo y el hidrógeno del grupo OH. Esto no ocurre para α, ya que al estar el grupo OH en posición axial se encuentra muy alejado de los orbitales no enlazantes.3

Figura 3.2. Enlace de H en un hemiacetal

3 Demchenko, A.V. Synlett, 2003, 1225–1240.

Antecedentes 13

Sin embargo, ocurre todo lo contrario cuando el grupo R es una cadena carbonada (acetal) como ocurre en los enlaces O-glicosídicos.4,5 En este caso, se estabiliza el anómero α. Este fenómeno fue descubierto por Edward y definido por Lemieux como efecto anomérico.6,7 Este fenómeno ocurre por dos motivos:

1) Para sustituyentes en posición ecuatorial, puede haber interacciones

repulsivas entre los electrones no enlazantes del oxígeno del ciclo y los

del oxígeno del sustituyente. Esto no ocurre en la posición axial debido

a la lejanía de estos pares de electrones.

2) El anómero α se estabiliza por hiperconjugación: los orbitales no

enlazantes del oxígeno del anillo ceden densidad electrónica a un

orbital antienlazante del C1 (orientación periplanar)

Figura 3.3. Representación del efecto anomérico

4 Wolfe, S.; Whangbo, M.H.; Mitchell, D.J. Carbohydr. Res., 1979, 69, 1–26. 5 Box, V.G.S. Heterocycles, 1990, 31, 1157–1181. 6 Edward, J.T. Chemistry & Industry, 1955,1102–1104. 7 Lemieux, R.U. Pure Appl. Chem., 1971, 25, 527–548.

Antecedentes 14

3.2 Formación de enlaces O-glicosídicos La reacción de glicosilación convencional tiene un mecanismo SN1. El sustituyente del carbono anomérico es eliminado y el nucleófilo (en este caso un compuesto con un átomo de O como atacante) puede unirse tanto por la posición α como por la β. Sin embargo, hay una cierta estereoselectividad en la que prima α sobre β (efecto anomérico).

O

RO

O

RO

: :

HO RGS

O

RO

O

RO

OR

OR

(mayoritario)

+

Esquema 3.1. Mecanismo de glicosilación convencional

No obstante, esta estereoselectividad se puede perder debido a la presencia de grupos con pares de electrones no enlazantes. El ejemplo más importante es el del grupo acilo. En este caso, el O que forma el doble enlace ataca a la posición α del intermedio catiónico formando un biciclo.

Figura 3.4. Intermedio bicíclico

Este biciclo intermedio se encuentra en equilibrio con el intermedio catiónico. Como consecuencia, la única vía por la que el nucleófilo puede atacar al carbohidrato mientras esté presente el biciclo intermedio es la posición β (la

Antecedentes 15

posición α se encuentra ocupada impedida al formar parte del biciclo). Por esta razón es por lo que el anómero β es el mayoritario. En la mayoría de las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran unidos a los aminoácidos de la cadena peptídica mediante enlaces O-glicosídicos, aunque son frecuentes derivados sintéticos con azufre o incluso carbono. Esta unión es un paso fundamental en la obtención de un glicosilaminoácido. Esta metodología es más eficiente que la glicosilación directa de un péptido o proteína. En este trabajo, se ha sintetizado un building block que presenta un enlace α-O-glicosídico entre el aminoácido treonina y el derivado del carbohidrato galactosa GalN(COCF3). Las metodologías para la formación de este enlace son las mismas que para la formación del enlace α-O-glicosídico con GalNAc. Esto se debe a que la etapa diferenciadora (trifluoroacetilación en vez de acetilación) es posterior a la formación de dicho enlace. Hasta ese momento, los compuestos intermedios son idénticos. En todas las metodologías, el grupo amido se lleva enmascarado ya sea en forma de azida (para evitar la formación del intermedio bicíclico para mecanismos convencionales) o bien en forma de nitro (aceptor para una reacción de Michael) y la treonina se encuentra debidamente protegida. A continuación, se revisan varios métodos que permiten la formación de enlaces O-glicosídicos.

Metodología del tricloroacetimidato

Este método fue desarrollado por Wong y colaboradores.8 Se basa en la utilización de tricloacetimidato como precursor como activador para la glicosilación. Es una metodología de dos pasos en la que se consigue una proporción de anómeros α/β de 2:1 con un rendimiento moderado.

8 Payne, R. C.; Flicht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y.-Y.; Case D.A.; Wong C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 13527-13536.

Antecedentes 16

Esquema 3.5

Metodología de Schmidt

Fue desarrollada por el grupo de Schmidt.9,10 Se basa en la adición tipo Michael (no es SN1) del alcohol de la treonina al 2-nitro-D-galactal en presencia de medio básico (en este caso el grupo protector del amino de la treonina es Boc).

Esquema 3.6

Es una metodología muy versátil puesto que el uso de una base u otra nos permite obtener un anómero u otro en mayor proporción. Si la base es fuerte

9 Das, J.; Smichdt, R.R. Eur. J. Chem. 1998, 1609-1613. 10 Kogan, T.P.; Gatea, F.C.A. Synthesis 1988, 706-707.

Antecedentes 17

(tBuOK) se obtiene el anómero α como mayoritario. En cambio, se puede obtener el anómero β de forma mayoritaria si se utilizan bases tipo amina, como NEt3.

Metodología Koenigs-Knorr

Es uno de los procedimientos más antiguos de glicosilación.11 Está basado en el empleo de haluros de carbohidratos como grupos dadores y un alcohol como aceptor. Liebe y Kunz utilizaron este método para sintetizar un antígeno (GalNAc) asociado a tumores (esquema 3.7).12

Esquema 3.7

Este ha sido el procedimiento escogido para la realización del trabajo puesto que permite el escalado a gramos y es más sencillo. Un ejemplo de la mayor dificultad de la metodología de Schmidt es la reducción posterior de nitro a amino con amalgama de níquel platinado. No obstante, el proceso ha sido ligeramente modificado. Estos cambios han sido la utilización de cloroazidas en lugar de bromoazidas de galactosa y la protección del grupo carboxilo de la treonina con éster alílico.

11 Koenigs, W,; Knorr, E. Chem. Ver. 1901, 34, 957-981. 12 Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.

4.- Discusión de resultados

Discusión de resultados

20

4.1 Síntesis del glicosilaminoácido Este estudio tiene como objetivo la síntesis de un análogo fluorado del antígeno Tn con treonina (Figura 4.1). El antígeno Tn consiste en un aminoácido (serina o treonina) glicosilado con un derivado de la galactosa denominado N-acetil-O-galactosaminil (GalNAc). Lo novedoso de la síntesis es la incorporación de flúor mediante la trifluoroacetilación en vez de la acetilación convencional.

Figura 4.1. Compuesto final: antígeno Tn trifluoroacetilado

Por un lado, se parte del aminoácido treonina (compuesto 1). En primer lugar, se protege el grupo amina con Fmoc, puesto que varios procesos posteriores requieren medio ácido. Para ello, el aminoácido comercial se hace reaccionar con Fmoc-OSuc en medio básico, siguiendo la metodología descrita en la literatura (esquema 4.1).13

Esquema 4.1

13 Cai, H; Huang, Z.-H.;Shi, L.; Zou, P.; Zhao, Y.-F.; Kunz, H.: Li, Y.-M. Eur. J. Org. Chem. 2011, 3685-3689.


21

Para proteger el grupo ácido, se opta por el éster alílico en vez del éster terc-butílico convencional puesto que resiste mejor la agresividad de la etapa final (trifluoroacetilación). Para ello, el compuesto 2 se hace reaccionar con bromuro de alilo. El proceso que se lleva a cabo es una síntesis en dos fases en las que es necesario un surfactante, que en este caso es Aliquat 336.14

Esquema 4.2

Por otro lado, se parte de galactosa peracetilada (compuesto 4). Se consigue bromarla en el C1 por reacción con ácido bromhídrico en diclorometano (esquema 4.3).15

Esquema 4.3

A continuación, la galactosa bromada (compuesto 5) se trata con Zn en presencia de NaH2PO4 y utilizando acetona como disolvente para formar un doble enlace mediante un proceso de eliminación (esquema 4.4).16

14 Goguen, B.N.; Aemissegger, A; Imperiali,B. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 11038-11041 15 Ravindranathan Kartha, K. P.; Jennings, H. J.; J. Carbohydr. Chem. 1990, 9, 777-781. 16 Plattner, C.; Höfner, M.; Sewald, N. Org. Lett. 2011, 13, 545-547.


22

Esquema 4.4

El siguiente paso es la introducción del grupo azida en la posición 2 de la galactosa y de un átomo de cloro en el carbono anomérico (posición 1). Para ello, el compuesto 6 se hace reaccionar con azida de sodio y cloruro de hierro (III) en presencia de peróxido de hidrógeno (esquema 4.5).16

Esquema 4.5

El siguiente paso es la glicosilación del aminoácido. La reacción se lleva mediante un proceso conocido como Koenigs-Knorr (un halosacárido es atacado por un nucleófilo). El grupo OH de la treonina actúa como nucleófilo atacando el C1 del monosacárido. Las sales de plata son añadidas para aumentar la electrofilia del C1 arrancando el Br de esa posición: el AgBr es muy insoluble y desplaza el equilibrio. La reacción es estereoselectiva: se obtiene un producto mayoritario por ataque en α (compuesto requerido) y otro por ataque en β con una proporción de 65/35 favorable al anómero α (esquema 4.6).17 Ambos anómeros fueron separados mediante cromatografía de columna.

17 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron. 1997, 53, 369-390.


23

Esquema 4.6

A continuación, se reduce la azida del compuesto 8α a amina. Para conseguirlo, se hace reaccionar con Zn en presencia de un medio ácido controlando la temperatura (esquema 4.7).

Esquema 4.7


24

Por último, la amina libre del glicoaminoácido se trifluoroacetila. Esto requiere la presencia de una base. Se utiliza DIEA como base puesto que es voluminosa y no demasiado fuerte para impedir la eliminación del grupo protector Fmoc (esquema 4.8). Esta última etapa está pendiente de optimización, con idea de mejorar el rendimiento.

Esquema 4.8


25

4.2 Caracterización del compuesto final A continuación se lleva a cabo la caracterización del análogo del antígeno Tn (compuesto 10). Para ello, se realizaron los correspondientes espectros de RMN de 1H, 13C y 19F. Las bandas han sido asignadas con la ayuda de técnicas bidimensionales (COSY y HSQC). Estos espectros así como las correspondientes ampliaciones aparecen representados en las Figuras 4.2 a 4.8. La comprobación de que el enlace O-glicosídico corresponde a la posición α (axial) se obtiene a partir de la constante de acoplamiento entre H1 y H2. El acoplamiento entre ambos protones no es muy fuerte (J = 2.5 Hz), lo que confirma que se encuentran en una posición espacial tipo cis uno con respecto del otro.

Figura 4.2. Espectro de RMN de 1H


26

Figura 4.3. Espectro de RMN de 13

C

Figura 4.4. Espectro de RMN 1H-

1H (COSY)


27

Figura 4.5. Espectro de RMN

1H-

13C (HSQC)

Figura 4.6. Espectro de RMN de

19F

COCF3


28

Figura 4.7. Ampliaciones del espectro de RMN de

1H

OCOCH3 galactosa

CH2 Fmoc

CH Fmoc

2H6,H5, Hα, Hβ

CH2 Allyl, H2

CH3 thr

1H

1H


29


1H

7.0

4

7.0

7

7.2

6

7.3

1

7.3

3

7.3

5

7.3

9

7.4

1

7.4

2

7.6

1

7.6

3

7.7

7

7.7

8

H1 CH Allyl, NH Fmoc

8 CH Ph Fmoc

=CH2 Allyl, H3, H4

NHCOCF3

1H

1H


30


13C

3 CH3CO

CH3 Thr

CH Fmoc

C5

CH2 Fmoc

Cα C2

C4,C3, C6, Cβ

CH2 Allyl

13C

13C


31


13C

CH Arom Fmoc

CH Arom Fmoc, = CH2 Allyl C1

2 CH Arom Fmoc

CH= Allyl

13C

13C

NCOO, NCOCF3 4 COO 2 C Arom Fmoc

5.- Conclusiones

Conclusiones 34

Se ha llevado a cabo la síntesis de un derivado fluorado del antígeno Tn. Su obtención es similar a la síntesis convencional del antígeno Tn exceptuando el último paso en el que, en vez de utilizar Ac2O para formar la amida, se hace uso de anhídrido trifluoroacético (TFAA). Así se consigue una amida del ácido trifluoroacético.

Por un lado, el aminoácido treonina (Thr) se ha tratado para proteger tanto la amina como el grupo carboxilo. El grupo amino se ha protegido con Fmoc, que aparte de soportar medios ácidos, permite la incorporación de este aminoácido glicosilado en una futura cadena peptídica utilizando la síntesis automática de péptidos en fase sólida. Por otro lado, se parte de galactosa peracetilada para obtener una cloroazida de galactosa (la azida es la precursora del grupo amino). La glicosilación se ha llevado a cabo por una reacción conocida como Koenigs-Knorr y la estructura se ha confirmado gracias a técnicas de RMN, tanto unidmensionales como bidimensionales. Fuera del ámbito del Trabajo de Fin de Grado, se pretende crear un péptido, más en concreto un epítopo de la mucina 1 (MUC1) que incorpore esta treonina glicosilada. Este péptido servirá como base para el estudio de la afinidad a los anticuerpos y, más en concreto, si los átomos de flúor incorporados intervienen positivamente en dicha afinidad.

6.- Parte experimental

Parte experimental 38

Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de 1H y 13C se realizaron en un espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo, con TMS como referencia interna y agua deuterada, con referencia interna del propio disolvente. La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel (Polychrom

SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido fosfomolíbdico en etanol. La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06 mm (230-240 mesh).

Parte experimental

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Fmoc-L-Thr-OH (2)

En un mismo matraz de reacción, se añaden L-treonina (compuesto 1; 10 g, 83.97 mmol), Fmoc-OSuc (42.48 g, 125.9 mmol) e bicarbonato de sodio (21.15 g, 251.8 mmol). Todo ello se disuelve en una mexcla de acetonitrilo/agua (300 mL de proporción 2:1 respectivamente) y se mantiene la mezcla a

temperatura ambiente. La reacción se sigue mediante CCF (hexano/acetato de etilo, 6:4) Cuando finaliza la reacción, la mezcla se adiciona en un embudo de extracción y se lava con acetato de etilo (el producto queda en la fase orgánica puesto que el medio es básico y el ácido se desprotona). Posteriormente, se añade ácido clorhídrico 2 M hasta que el pH sea neutro y se extrae con una mezcla de cloroformo/isopropanol (3:1). La fase orgánica se seca con sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora en rotavapor. Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.13

Fmoc-L-Thr-OAllyl (3)

Esta reacción se realiza mediante una técnica de dos fases. Todos los reactivos se añaden en el mismo matraz pero unos se disuelven en fase orgánica y otros en acuosa. El compuesto 2 (3 g, 13.68 mmol) y el bicarbonato de sodio (1.15 g, 13.68 mmol) se disuelven en agua (75 mL) y el

bromuro de alilo (1.66 g, 13.68 mmol) en diclorometano (75 mL). Es necesario añadir un surfactante que cree micelas: Aliquat-336 (5.529 g, 13.68 mmol) y la mezcla se mantiene a temperatura ambiente. La reacción se sigue mediante CCF (hexano/acetato de etilo, 7:3) Una vez haya finalizado la extracción, se extrae con una mezcla de cloroformo/ isopropanol (3:1), se añade sulfato de sodio anhidro y se filtra. La mezcla se

Parte experimental

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evapora en rotavapor y se purifica mediante columna cromatográfica (hexano/acetato de etilo,7:3). Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.14

α-D-Tetra-O-acetil-1-bromogalactopiranosa (5) En un matraz de fondo redondo se añaden galactosa peracetilada (compuesto 4; 20 g, 51 mmol) y bromuro de hidrógeno al 33% en ácido acético (30 mL). Posteriormente, todo ello se disuelve en 100 mL de diclorometano. La duración de la reacción es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente.

Se sigue la reacción mediante cromatografía de capa fina usando como eluyente una mezcla de hexano/acetato de etilo (6:4). Una vez finalizada, se adiciona lentamente una disolución saturada de bicarbonato de sodio hasta que el crudo se neutralice. Una vez se tenga una mezcla neutra, se trasvasa a un embudo de extracción (importante que no queden restos de ácido puesto que el dióxido de carbono que se forma puede hacer explotar el embudo de extracción). Se extrae con diclorometano o éter. Por último, los restos de agua de la fase orgánica son retenidos mediante la adición de sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora la disolución en un rotavapor. Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.15

3,4,6-Tri-O-acetil-D-galactal (6)

El compuesto 5 se disuelve en acetona (300 ml) y posteriormente se añade cinc activado (40 g, 611.6 mmol)

O

AcO

Br

AcO OAc

AcO

(5)

Parte experimental

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y dihidrogenofosfato de sodio (2 g en sólido y 20 ml de una disolución saturada). La mezcla se deja reaccionar durante 12 h a temperatura ambiente. Se sigue mediante CCF utilizando como eluyente hexano/acetato de etilo (6:4). La señal es de un color negro muy característico. Cuando ha finalizado, se realiza una filtración en tierra de diatomeas y se reduce el volumen hasta aproximadamente 200 mL. A continuación, se añade en un embudo de extracción y se lava con una disolución saturada de cloruro de sodio. Se eliminan los restos de agua con sulfato de sodio anhidro y se filtra. Por último, se purifica el producto mediante columna cromatográfica (hexano/acetato de etilo, 6:4). El producto puro tiene apariencia de aceite. Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.16

α-D-Tri-O-acetil-2-azido-1-cloro-2-desoxigalactopiranosa (7)

En un matraz de fondo esférico se añaden el compuesto 6 (8.3 g, 22 mmol), azida de sodio (4.26 g, 48.48 mmol) y tricloruro de hierro hexahidrato (6.96 g, 17.62 mmol). Como disolvente se utiliza acetonitrilo. A continuación, se adiciona peróxido de hidrógeno al 30% (8 mL) y la mezcla se mantiene a -20 ºC.

La reacción se sigue por CCF (hexano/acetato de etilo 6:4) El crudo de reacción se lava con una disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio, se eliminan los restos de agua con sulfato de sodio anhidro y se evapora la fase orgánica en un rotavapor habiendo antes filtrado. Por último, se lleva a cabo la purificación del producto mediante columna cromatográfica (hexano/acetato de etilo, 6:4). Los datos espectroscópicos coinciden con los descritos en la literatura.16

Parte experimental

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Fmoc-L-Thr(α-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactopiranosil)-OAllyl (8)

En un schlenk se introduce el tamiz molecular de 4 Å (se activa en una mufla durante 6 h) y se le aplica atmósfera de argón. Posteriormente, se adiciona el compuesto 3 (608 mg, 1.594 mmol) disuelto en una mezcla de disolventes secos (diclorometano 10 mL, tolueno 10 mL). Tras 1 h, se añaden las sales de plata: carbonato de plata (572 mg, 2.072 mmol) y perclorato de plata (50 mg, 0.24 mmol). Es importante proteger el schlenk

de la luz (cubierta de papel de aluminio) puesto que el catión Ag+ es fotosensible. Se esperan 30 min y se procede a adicionar el compuesto 7 (780 mg, 2.23 mmol) disuelto en una mezcla de disolventes secos (diclorometano 8 mL, tolueno 5 mL) y se deja reaccionar durante 12 h a temperatura ambiente siguiendo la metodología descrita en la bibliografía.17

La reacción se sigue por CCF (eluyente hexano/acetato de etilo, 6.5:3.5). Un vez haya concluido la reacción, se diluye con diclorometano y se filtra sobre tierra de diatomeas. El disolvente se evapora en un rotavapor y se realiza una columna cromatográfica (eluyente tolueno/acetona, 9:1) con una cadencia de goteo especialmente baja. PF = 51.5 − 53.5 ºC �α �

�� = + 62.7º (c = 1, CHCl�) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.36 (d, 3H, J = 6.0 Hz, CH3 Thr), 2.04 (s, 3H, COCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 2.15 (s, 3H, COCH3), 3.67 (dd, 1H, J = 11.2 Hz, H2), 4.09 (d, J = 6.4 Hz, 2H, CH2 Fmoc), 4.26 - 4.30 (m, 2H, H5, CH Fmoc), 4.34 - 4.48 (m, 4H, Hα, Hβ, 2H6), 4.69 (d, J = 5.7 Hz, 2H, CH2Allyl), 5.05 (d, J = 3.4 Hz, 1H, H1), 5.26 - 5.39 (m, 3H, H3, CH=CH2 Allyl), 5.46 (‘s’, 1H, H4), 5.68 d, J = 9.5 Hz, 1H, NH), 5.88 - 6.00 (m, 1H, CH=CH2 Allyl), 7.32 - 7.38 (m, 2H, Fmoc Arom.), 7.38 - 7.42 (m, 2H, Fmoc Arom.), 7.62 - 7.66 (m, 2H, Fmoc Arom.), 7.76 - 7.78 (m, 2H, Fmoc Arom.).

Parte experimental

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13C RMN (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 18.6 (CH3 Thr), 20.7 (CH3CO), 47.2 (CH Fmoc), 48.2 (C2), 58.0 (Cα), 61.9 (CH2 Fmoc), 66.7 (CH2 Allyl), 67.2 (C5), 67.6 (C4), 67.7 (C6), 68.2 (C3), 77.1 (Cβ), 99.2 (C1), 119.5 (=CH2 allyl), 120.1 (CH Fmoc Arom, =CH2 Allyl), 125.3 (CH Fmoc Arom), 127.3 (CH Fmoc Arom), 127.4 (CH Fmoc Arom), 131.5 (CH= Allyl), 141.4 (CH Fmoc Arom), 144.0 (C Fmoc Arom), 156.9 (NCOO), 169.8 – 170.6 (COO).

Fmoc-L-Thr(α-O-D-tri-O-acetil-2-galactosaminil)-OAllyl (9)

En un matraz se adiciona el compuesto 8 (500 mg, 0.718 mmol) y se disuelve en THF (58 mL) y agua (20 mL). El matraz de reacción se coloca en baño de hielo (0 ºC) y seguidamente se añaden los reactivos bajo agitación: Zn en polvo (1.13 g, 17.27 mmol), disolución acuosa de ácido clorhídrico 33% (1.66 mL) y ácido acético glacial (12.5 mL). Es importante activar previamente el Zn (baño ácido y lavado con éter).

El sistema se deja reaccionar aproximadamente 2 h. La reacción se sigue por CCF (hexano/acetato de etilo, 6:4). El crudo se filtra en tierra de diatomeas y se extrae con disolución saturada de hidrogenocarbonato de sodio. No es necesaria la purificación de este compuesto ya que se utiliza en la siguiente etapa sin realizar columna cromatográfica.

Parte experimental

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Fmoc-L-Thr(α-O-D-tri-O-acetil-N-trifluoroacetilgalactosaminil)-OAllyl (10)

En un matraz de fondo redondo se añade el crudo de reacción del compuesto 9 (340 mg, 0.508 mmol) disuelto en 25 mL de diclorometano. A continuación, se adiciona DIEA (177.89 µL, 1.017 mmol) y se deja la agitando mezcla 45 min. Una vez transcurrido el tiempo, se adiciona TFAA (141 µL, 1.017 mmol). La mezcla se deja reaccionar durante 3 h. La reacción se sigue mediante CCF (hexano/acetato de etilo, 1:1).

El compuesto se purifica por columna cromatográfica (hexano/acetato de etilo, 6:4). El reactivo que no ha reaccionado es muy polar (amina primaria) y se recoge utilizando un eluyente muy polar (acetato de etilo/metanol, 9:1) una vez que el producto ha salido de la columna. PF = 70.5 − 71.9 ºC �α �

�� = + 49.9º (c = 1, CHCl�) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.32 (d, 3H, J = 6.1 Hz, CH3 Thr), 1.96 (s, 3H, COCH3), 2.03 (s, 3H, COCH3), 2.17 (s, 3H, COCH3), 4.11 (m, 2H, CH2 Fmoc), 4.26 (m, H, CH Fmoc), 4.30 - 4.54 (m, 5H, Hα, Hβ, H5, 2H6), 4.54 - 4.67 (m, 3H, CH2 Allyl, H2), 5.01 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H1), 5.16 – 5.45 (m, 4H, H3, H4, CH=CH2), (d, J = 3.4 Hz, 1H, H1), 5.80 - 5.93 (m, 2H, NH Fmoc, CH=CH2), 7.05 (d, J = 9.5 Hz, 1H, NHCOCF3), 7.29 - 7.44 (m, 4H, Fmoc Arom.), 7.58 - 7.65 (m, 2H, Fmoc Arom.), 7.74 - 7.81 (m, 2H, Fmoc Arom.) 13C RMN (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 18.1 (CH3 Thr), 20.7 (CH3CO), 47.2 (CH Fmoc), 48.5 (C2), 58.4 (Cα), 62.1 (CH2 Fmoc), 66.6 (CH2 Allyl), 67.1 – 67.8 (C4, C5 C6), 68.2 (C3), 77.3 (Cβ), 98.91 (C1), 120.1 (CH Fmoc Arom, =CH2 Allyl), 125.2 (CH Fmoc Arom), 127.2 (CH Fmoc Arom), 127.9 (CH Fmoc Arom), 131.0 (CH= Allyl), 141.4 (CH Fmoc Arom), 143.8 (C Fmoc Arom), 156.3 - 158.6 (NCOO, NCOCF3), 170.0 - 171.7 (COO). 19F RMN (282 MHz, CDCl3) δ (ppm): -75.54 (s, 3F, CF3).

Anexo: espectros de RMN

Anexo: espectros de RMN 49

Espectros de RMN (1H, 13C, COSY y HSQC en orden) que corresponden con el compuesto 8.

1H


f1 (

ppm

)

13C

COSY


HSQC

síntesis de un mimético del antígeno tn que incorpora flúor · procedure is the incorporation...

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