síntesis de fluoresceína

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UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO Síntesis de 3’,6’Dihidroxispiro(isobenzofurano- 1(3H),9’-(9H)xanten)-3-ona (Fluoresceína) Villanueva Flores Francisca y González Ríos Jorge Arturo Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guanajuato. [email protected] [email protected] Recibido: 12 de mayo, 2008. El presente trabajo se refiere a la práctica libre del laboratorio de química orgánica, misma que trata acerca de la síntesis del compuesto fluorescente denominado comúnmente fluoresceína, el cual tiene múltiples aplicaciones en medicina oftálmica, investigación en el 1 1

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Page 1: Síntesis de fluoresceína

UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Síntesis de 3’,6’Dihidroxispiro(isobenzofurano-1(3H),9’-(9H)xanten)-3-ona (Fluoresceína)

Villanueva Flores Francisca y González Ríos Jorge ArturoFacultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guanajuato.

[email protected]@hotmail.com

Recibido: 12 de mayo, 2008.

El presente trabajo se refiere a la práctica libre del laboratorio de química orgánica, misma que trata acerca de la síntesis del compuesto fluorescente denominado comúnmente fluoresceína, el cual tiene múltiples aplicaciones en medicina oftálmica, investigación en el área de microbiología, en la utilización de los sistemas pluviales entre otros; esto mediante un mecanismo del tipo SEAr entre dos equivalentes de resorcinol por uno de anhídrido ftálico en medio ácido.

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1.0 Introducción

1.1 Historia

La fluoresceína fue descubierta por el químico profesor y premio Nobel de Química (1905) Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer (1835-1917).

1.2 Descripción

Es un fluoróforo comúnmente usado en microscopía, en un tipo de láser de colorante como la ganancia media, en medicina forense y la serología para detectar manchas de sangre latente, y en la localización de tinte. Fluoresceína tiene una absorción máxima a 494 nm y de emisión máxima de 521 nm (en agua). Por otra parte, fluoresceína tiene un punto isosbestic (igualdad de absorción de todos los valores de pH) a 460 nm. Fluoresceína se sabe también como un color aditivo (D & C Yellow No. 7). La forma de sal disódica de fluoresceína que se conoce como D & C amarillo no. 8. (Véase figura 1).

Figura 1. Estructura 3D de la fluoresceína.

Es hidrosoluble de color amarilla que pertenece al grupo de las xantinas, que produce un color fluorescente verde intenso en soluciones alcalinas (pH mayor a 5). Cuando se expone a la luz, la fluorescencia absorbe ciertas

longitudes de onda y emite luz fluorescente de longitud de onda larga. (Véase figura 2).

Figura 2. Fluoresceína bajo UV iluminación.

Los factores que afectan la fluorescencia incluyen:

a) Concentración de la sustancia;

b) pH de la solución;

c) Presencia de otras sustancias;

d) Longitud de onda de la luz excitante.

A un pH de 8, lafluoresceína alcanza su máxima intensidad.

1.2 Usos

Por ser un pigmento fluorescente, tiene múltiples aplicaciones en serigrafía, microbiología, etc., dado que se utiliza como medio de contraste.

La fluorescencia de esta molécula es muy alta, y se produce la excitación a 494 nm y de emisión a 521.

Tiene un pK a de 6,4 y su equilibrio de ionización da lugar a pH dependiente de la absorción y emisión en el rango de 5 a 9. Por otra parte, la fluorescencia de la vida y protonadas deprotonado formas de fluoresceína son aproximadamente 3 y 4 ns, lo que permite una determinación del pH no de

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intensidad, las mediciones. La vida puede ser recuperada utilizando el tiempo de correlación único fotón o contar con modulación de fase flourimétrica.

1.2.1 Uso en medicina1

La fluoresceína, en forma de fluoresceína sódica, es utilizada en el examen de fluoresceinoangiografía del fondo y de la vasculatura del iris del ojo. (Véase figura 3).

1.2.1.1 Aplicación

La fluoresceína se administra por inyección en la vena cubital2 y el colorante tarda de 10 - 15 segundos en aparecer en los vasos coroideos y retinianos lo que permite detectar anormalidades vasculares del fondo y del iris del ojo. También puede ser administrada por vía oral pero para estudiar otras entidades o en caso de que la persona sujeta al estudio tenga venas escondidas o inaccesibles. En esta condición, la sustancia puede tardar hasta media hora en aparecer en el fondo.

Figura 3. Evaluación estática de la lente inicial por pigmentación con

fluoresceína.

1 El diagnóstico y tratamiento de la anafilaxia - XXI. Reacciones anafilactoides a fluoresceína. J Allergy Clin Immunol 1998; 101: S465-528.

2 Kinsella FP, Mooney DJ (1988). "Anafilaxia siguientes oral angiografía fluoresceínica".. Am. J. Ophthalmol. 106 (6): 745-6.

1.2.1.2 Reacciones secundarias tras la administración3

Tópica, oral, intravenosa y el uso de fluoresceína puede causar reacciones adversas, incluida la náusea, vómito, urticaria, hipotensión aguda, anafilaxia4 y las formas conexas de reacción anafiláctica, paro cardíaco, y muerte súbita. Vía intravenosa tiene la mayoría de reacciones adversas, incluida la muerte súbita, pero esto puede reflejar un mayor uso en lugar de mayor riesgo. Ambos orales y tópicos usos se han notificado a causar anafilaxis, [8] [9], incluyendo un caso de anafilaxia con paro cardíaco (resucitado),5 después de uso tópico en una caída de ojos. Las tasas de reacciones adversas varían de 1% a 6%. Las tasas más altas pueden tener en cuenta poblaciones de estudio que incluyen un mayor porcentaje de las personas con reacciones adversas previas. El riesgo de una reacción adversa es 25 veces mayor si la persona ha tenido una reacción adversa previa. [12] El riesgo puede reducirse con anterioridad (profilácticos) el uso de antihistamínicos6 e inmediata de

3 Noga EJ, Udomkusonsri, P. (2002). "Fluoresceína: una rápida, sensible, Nonlethal Método para detectar úlceras en la piel de pescado". Vet Pathol 39: 726-731 (6). PMID 12450204. Obtenido en 2007 - 07-16.

4 Harrar N, Idali B, Moutaouakkil S, el Belhadji M, Zaghloul K, Amraoui A, Benaguida M (1996). "[Shock anafiláctico causado por la aplicación de fluoresceína en la conjuntiva ocular]" (en francés). Presse Med 25 (32): 1546-7.

5 Gómez-Ulla F, Gutiérrez C, Seoane I (1991). "Severa reacción anafiláctica a fluoresceína administrado por vía oral".. Am. J. Ophthalmol. 112 (1): 94.

6 Kwan AS, Barry C, McAllister IL, Constable I (2006). "Angiográfica y de las reacciones adversas al fármaco a examinar: el Lions Eye experiencia".. Clin. Experimento. Ophthalmol. 34 (1): 33-8.

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gestión de emergencias de cualquier subsiguiente anafilaxia. Una simple prueba puede ayudar a identificar a las personas con mayor riesgo de reacciones adversas

La más común es la reacción adversa náuseas, debido a una diferencia en el pH del cuerpo y el pH de la fluoresceína de sodio, colorante. La náusea es generalmente transitorios y subvenciones rápidamente. La urticaria puede ir desde una pequeña molestia a grave. Una sola dosis de antihistamínicos pueden dar alivio completo. Shock anafiláctico y la posterior parada cardíaca y muerte súbita son muy raros, sino porque se producen en cuestión de minutos, un proveedor de servicios de salud que utiliza fluoresceína debe estar preparado para realizar la reanimación de emergencia.

1.2.1.2.1 Precauciones

Antes de inyectar la sustancia debe hacerse una prueba intradérmica para desechar la posibilidad de alergia a la fluoresceína.7

1.2.2 Indicador ácido-base

Además, la flouresecína también puede emplearse como indicador ácido base, ya que como se mencionó, el color depende del pH. Tal diferencia es más evidente si se analizn los espectros de absorción respectivos en l región del ultravioleta visible (UV-vis). (Véase figura 4, 5 y 6).

7 M Hitosugi, Omura K, Yokoyama T, H Kawato, Motozawa Y, Nagai T, Tokudome S (2004). "Una autopsia caso de shock anafiláctico fatal tras la angiografía fluoresceínica: reporte de un caso".. Med Sci Ley 44 (3): 264-5.

Figura 4. Espectroscopia UV vis de la floresceína en solución básica, neutra y

ácida.8

Figura 5. Espectro en la región del infrarrojo de la fluoresceína.

Figura 6. Espectro en la región del infrarrojo de la sal sódica de

fluoresceína.

Dichos espectros se obtienencuando la molécula en cuestión es irradiada con radiación electromagnética del intervalo que va de 300 a 800 nm.

Los espectros obtenidos son una gráfica de las longitudes de onda que la molécula absorbe, pero el color que observamos es en realidad la combinación de aquellas longitudes de onda que la molécula nos devuelve. La radiación absorbida por la molécula le provoca una transición electrónica, que es un cambio en forma por la molécula

8 Kira, L. A. Enciclopedia de tecnología química, Tomo XI, John Wley & sons, 3ª ed. US, 1978.

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y tamaño de su nube de electrones. Posteriormente la molécula regresa a su estado inicial, o basal, disipando la energía recibida, vibrando, rotando deformándose o emitiendo luz, este último fenómeno permite obtener los espectros de emisión de la molécula.9

1.2.3 Utilización de los sistemas fluviales10

Uno de sus más reconocibles se utiliza en el Río Chicago, donde fluoresceína fue la primera sustancia utilizada para el tinte verde en el río Santa Patrick's Day en 1962. En 1966 los ecologistas obligó a cambiar a un vegetal basada en tinte para proteger a los miles de peces dorados que poblan el río.

Otros usos de fluoresceína incluyen el uso como soluble en agua, colorante añadido a las aguas pluviales en las pruebas de simulación del medio ambiente para ayudar en la localización y análisis de cualquier fugas de agua, y en Australia y Nueva Zelanda como un espíritu metilado tinte.

1.2.4 Investigaciones Biológicas

En biología celular, el isotiocianato de fluoresceína derivado a menudo se utiliza para etiquetar y hacer el seguimiento de las células en la microscopía de fluorescencia aplicaciones (por ejemplo, la citometría de flujo). Adicional moléculas biológicamente activas (como los anticuerpos) también puede ser adjunta a la fluoresceína, lo que permite a los biólogos el objetivo fluoróforo a proteínas específicas o estructuras

9 Lakowics, J. R. 1986. Principles of Fluorescence spectroscopy. New York, Plenum Press, pp 14-18.

10 Sun, WC; Gee, KR; Klaubert, DH; Haugland, RP, de síntesis de Fluoresceins fluorados. Journal of Organic Chemistry 1997, 62, (19), 6469-6475.

dentro de las células. Esta aplicación es común en la levadura pantalla.

Fluoresceína también puede ser conjugado con los trifosfatos nucleósidos e incorporarse a una sonda para la hibridación in situ. Fluoresceína que lleva la etiqueta de sondas, se pueden visualizar mediante FISH, o el blanco de anticuerpos mediante inmunohistoquímica. Esta última es una alternativa a digoxigenina, y los dos se utilizan conjuntamente para el etiquetado dos genes en una muestra

1.3 Derivados

Hay muchos derivados de fluoresceína, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína, a menudo abreviado como FITC.11 FITC es la molécula original fluoresceína funcionalizado con un isotiocianato grupo (-N = C = S), en sustitución de un átomo de hidrógeno en la parte inferior del anillo de la estructura. Este derivado se reactiva hacia aminas grupos sobre las proteínas en las células. A-succinimidyl ester grupo funcional adjunta a la fluoresceína básicos, la creación de NHS-fluoresceína, otra forma común de amina reactiva derivados. (Véase figuras 7 y 8).

Figura 7. Estructura de la NHS-fluoresceína.

11 Fineschi V, G Monasterolo, Rosi R, Turillazzi E (1999). "Fatal choque anafiláctico durante una angiografía fluoresceínica.". Forense Sci. Int. 100 (1-2): 137-42.

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Figura 8. Estructura de la eritrosina, pigmento sanguíneo.

Otros derivados de fluoresceína incluir Oregon Green, Tokio Verde, SNAFL, y carboxynaphthofluorescein. Estos derivados, junto con las nuevas fluors como Alexa 488 y DyLight 488, han sido adaptados a diversos químicos y biológicos aplicaciones en las que mayor fotoestabilidad, las diferentes características espectrales, o diferentes grupos de apego son necesarios.

2.0 Resultados

Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 1.

2.1 Observaciones

Su apariencia fue de un polvo rojo amarillento a rojo-café. Soluble en hidróxidos alcalinos diluidos e insoluble en agua.

3.0 Discución

La fluoresceína se obtiene mediante una sustitución aromática electrofílica del resorcinol sobre el anhídrido ftálico.12

El resorcinol presenta las siguientes estructuras resonantes:

12 Landgrabe, J. A. 1992. Theory and practice in organic laboratory. 4ª ed. USA, Books/Cale. Pp. 489-492.

De donde se observa claramente el sitio para la sustitución aromática electrofílica, donde el resultado final es el rápido equilibrio entre la forma lactoide y cinoide de la fluoresceína:

Posteriormente, al disolverla en una solución de NaOH, la floureceína altera su estructura de tal forma que genera la coloración característica:

Con objeto de mejorar el rendimiento, podría probarse otra ruta sintética, se usa también el resorcinol y el anhídrido ftálico, pero en presencia

Producto Nombre IUPAC Estructura1 3´,6´

Dihidroxispiro [isobenzofuran-1(3H),9´-[9H] xanten]-3-ona.

Masa exp. %Rend.1

p.f teórico p.f exp.1 320°C No determinado

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de ZnCl2 a través de una reacción de Friedel-Crafts.

Un tercer método para sintetizar fluoresceína es usando ácido metanosulfánico como ácido Lewis y como catalizador. Esta ruta tiene un alto rendimiento bajo condiciones leves, que a nivel industrial implica menores costos de producción.

Conclusiones

El porcentaje de rendimiento obtenido no es del todo satisfactorio, por lo que se establecieron nuevas rutas sintéticas en la sección anterior con el objeto de mejorarlo, o quizás es necesario modificar el medio en que reaccionan, ya que la técnica no establecía el medio en que se iba a reflejar y nosotros optamos por el agua, quizás, reflujando en un medio en que ambas sustancias se solubilizen la reacción será más satisfactoria.

Sección experimental:13

El nombre según la IUPAC de la fluoresceína es 3´,6´ Dihidroxispiro[isobenzofuran-1(3H),9´-[9H] xanten]-3-ona. Debe contener no menos de 97,0 por ciento y no más de 102,0 por ciento de C20H12O5, calculado sobre la sustancia anhidra.14

Para la síntesis de la fluoresceína, se molieron en u mortero,

13 Yuichiro Ueno; Jiao, G.-S.; Burgess, K., Preparación de 5 - y 6-carboxifluoresceína. Procedimientos útiles sintéticas de 2004, 31, (15), 2591-2593.

14 Eaton, David C. 1989. Laboratory Investigations in Organic Chemistry. USA, McGraw-Hill, pp.406-412.

1.1 g de resorcinol y 0.75 g de anhídrido ftálico y se colocaron en un matraz redondo de 25 mL y 5 mL de agua destilada y añadieron cuidadosamente 0.25 mL de ácido sulfúrico concentrado. Posteriormente el sistema se sometió a reflujo a temperatura entre 140 y 160º C durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo se observó una masa dura colr café rojizo oscuro. El contenido del matraz se vertió en un vaso de precipitado con 30 mL de agua y 2 mL de HCl al 36-38% y con esta mezcla se enjugó el matraz bola.

La mezcla descrita se calentó por 10 minutos a Baño María hasta desintegrar los trozos de fluoresceína cruda.

Se filtró el sólido y se lavó tres veces con agua helada y se dejó secar.

La prueba de florescencia se efectuó de la siguiente manera:

Primero se prepararon 40 ml de una solución de NaOH con un pH de 8, que es con el cual, la fluoresceína alcanza su máxima coloración, a la solución se le disolvió 0.1 g de floresceína y se sometió a un haz UV usando la onda corta de 370 nm, con ésta se observó una coloración verde fuorescente intensa. Se sugiere efectuar las misma pruebas en agua destilada (pH=7) y medio ácido.

Resorcinol15: Punto de ebullición: 280°C Punto de fusión: 110°C Densidad: 1.28 g/cm3 Solubilidad en agua, g/100 ml: 140 Presión de vapor, Pa a 20°C: 1 Densidad relativa de vapor (aire = 1): 3.8 Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20°C (aire = 1): 1.00 Punto de inflamación: 127°C c.c. Temperatura de autoignición: 607°C Límites de explosividad, % en volumen en el aire: 1.4 ? Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: 0.79-0.93

15 Consultar riesgos en el manipuleo en http://www.mtas.es/insht/ipcsnspn/nspn1033.htm

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Anhídrido ftálico16: Punto de ebullición :285°CPunto de fusión : 133°CPunto de inflamación : 151°CTemperatura de auto ignición : 580°CLímites de explosión (inferior/superior): 1,7 / 10,4 vol. %Presión de vapor: 20 hPa (150°C)Densidad (20/4): 1,53Solubilidad: 6,2 g/l en agua a 20°C

Ácido clorhídrico: Punto de ebullición: - 121.1 °F ( - 85 °C ); Densidad del líquido al punto de ebullición: 74.3 lb / ft3 ( 1190 kg / m3 ):; Presión de vapor: A 70 °F ( 21.1 °C ) 612.1 psia (4220) kpa; Solubilidad en agua: Muy soluble.

Ácido sulfúrico:17 Densidad 1.800 kg/m3; 1.8 g/cm3 Masa 98,08 u Punto de fusión 283 K (10 °C) Punto de ebullición 610 K (337 °C) Solubilidad en agua n/d KPS n/d ΔfH0

gas -735.13 kJ/mol fH0

líquido -814 kJ/mol S0gas, 1 bar

98.78 J·mol-1·K-1 0líquido, 1 bar 9 J·mol-1·K-1

16http://www.panreac.com/new/esp/fds/ESP/X161155.htm

17http://es.wikipedia.org/wiki/Acido_sulf%C3%BArico