serología aplicada
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Senasica
La Serologa aplicada a ladeteccin de bacterias
Biol. Brbara Hernndez MacasLaboratorio de Bacterias
CNRF DGSV
2009
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Serologa
La ciencia que estudia las reacciones, preparaciones y uso del suero sanguneo.
Usos dentro de la fitopatologa: Estudios ecolgicos para determinar el origen, diseminacin y
supervivencia de diferentes patgenos. Identificacin rpida de los fitopatgenos. Deteccin e identificacin de fitopatgenos que se transmiten
por semilla y suelo.
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Las inmunoglobulinas son proteinas que se sintetizan en clulas del tejido linftico de los mamferos.
Los anticuerpos son un grupo de inmunoglobulinas quetienen propiedades y funciones especficasson producidos por antgenos o sustancias extraas al organismo animaly slo reconocen al antgeno que les di orgen.
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Clases de Anticuerpos
80% del total de Ig. Se encuentran en la sangre y pueden atravesar las paredes de los vasos conductores. Protegen contra bacterias, virus y toxinas
10-15% del total de Ig en la sangre. Mas abundantes en secreciones mucosas como saliva, lgrimas,etc
5-10% de Ig en la sangre. No pasa libremente en los tejidos. Aparece temprano en las infecciones. Inicia la cascada de complemento
0.2% del Ig en la sangre. Se halla en las clulas B inmaduras. Probablemente juega un rol en la regulacin
0.002% en la sangre normalmente.Se incrementa en respuestas alrgicas. Su Fc se adhiere a la mayoria de clulas y causa degradacin
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Los Inmunoensayos se basan en anticuerpos.
Los mamferos producen anticuerpos que especficamente se unen a los sitios de reconocimiento ( epitopes o determinante antignico) de las macromolculas como lo son: proteinas, glicoproteinas, lipopolisacaridos, constituyentes de un fitopatgeno (Antgenos)
Cada determinante antignico lo constituyen 8 aminocidos.
Inmunizacin con el antgeno
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Estructura de la Gamma globulina IgG
COOH
Sitio de unin del Anticuerpo
PARATOPE
Fragmento FabFragmento
Fab
Fragmento Fc
COOH COOH
CH2
CH2
CH3
CH3
carbohidrato
Sitio de unindelAntgeno
EPITOPE
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Antgenos
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Anticuerpo Policlonal
Antgeno Colecta de la sangre;se separa el suero
Purificacin delantisuero
Inmunoensayo
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Caractersticas que debemos recordar
1. Los anticuerpos son bivalentes (slo dos lugares de unin con el antgeno) y altamente especficos (regularmente slo reconocen al antgeno que les dio origen)
2. La mayora de los antgenos son multivalentes o polivalentes (varios determinantes antignicos, iguales o diferentes, en su estructura)
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La inmunoprecipitacin es la tcnica que permiti el desarrollo de nuevas tcnicas
inmunolgicas o mtodos que ahora conocemos
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Aadir anticuerpo especfico
Incubar (37C) 1 hr
Inmunoprecipitacin
PRECIPITADO
antgeno
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Precipitacin
Aglutinacin
inmunoaislamiento
Inmunoadsorcin con enzimas conjugadas ( ELISA )
Tiras de flujo lateral (Immunostrip)
Inmunoimpresin
Inmunoflourescencia
Inmunocaptura - Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Tcnicas serolgicasunin de Ag - Ac
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Doble Difusin en gel
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Propiedades de las tcnicas Inmunolgicas
Rpidas Sensibles Especficas Diagnstico de enfermedades Deteccin de patgenos
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ELISA
Tcnica serolgica de inmunoadsorcin con enzimas
conjugadas
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Enzyme
Linked
Immuno
Sorbent
Assay
Tcnica de inmunoadsorcin con enzimas conjugadas
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Materiales
Equipo: micropipetas,potencimetro,lector de placas,incubadora
Muestra vegetal Juego de antisueros Soluciones
amortiguadoras Sustrato Placas de microtitulacin
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ELISA
Indirecta / Directa Directa = el antgeno es detectado directamente por el
conjugado (enzima + anticuerpo) Indirecta = la enzima conjugada detecta primero a un
anticuerpo y no directamente al antgeno.
DAS ELISA (doble anticuerpo) El antgeno queda atrapado entre dos anticuerpos (el de
deteccin y el conjugado)
La reaccin Positiva se observa mediante una reaccin enzimtica con un sustrato cromognico
= cambio de color
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Directa, Doble Ac Sandwich ELISA = DAS
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TAS ELISA - Indirecta(triple antibody sandwich)
Sustratosegundo anticuerpo + Enzima conjugada (tercer Ac)
Antgeno = Fitopatgeno
Sensibilizar - Primer anticuerpo
Reaccin de color
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ELISA indirectaMuestra
Antgeno- BacteriaPrimer anticuerpo
Enzima conjugada Reaccin de color
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LECTURA DE LA PLACA
Reaccin de la placaLector de placas de
microtitulacin
ControlPositivo
Controlnegativo MUESTRA A MUESTRA B MUESTRAS C Blanco
1.689 0. 030 O.055 0. 099 1.999 0.0002
Reaccin positiva: si el valor de la densidad ptica de la muestra es mayor o igual a tres veces la media del testigo negativo
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Propiedades y ventajas
La sensibilidad de esta tcnica es superior a otras pruebas serolgicas, por lo que ha sido extensamente utilizada para la deteccin de patgenos en humanos, animales y plantas.
Es un mtodo confiable y rpido para la deteccin de virus y bacterias fitopatgenos.
Se pueden procesar varias muestras a la vez. Se obtienen resultados cualitativos y cuantitativos.
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Desventajas
Sensibilidad Relativa puede ser menor que otros metodos. Se trabaja con protenas.
La especificidad vara de acuerdo a los productos empleados riesgo de falsos + o falsos
Costo
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Resultados negativos Resultados positivos
Lnea control
Positiva
Muestra A Muestra B
antgeno
Anticuerpos
especficos
Segundo anticuerpo
Deteccin por tiras de flujo lateral
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Vista Seccional de una tira de flujo lateralResultado Positivo
Almohadilla para la muestra
Conjugado -anticuerpo especifico
Membrana de Nitrocellulosa
Complejo Antigeno conjugado-anticuerpo
Formacin del complejo anticuerpo antgeno-enzima
No hay unin del conjugado-con anticuerpo inespecfico
Almohadilla para manejo de la tira
Almohadilla con el Conjugado
Linea de prueba
Linea de control
Muestra vegetal ANTGENO
(patgeno)
Material del envs de la tira
Environlogix, Inc.
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Vista Seccional de una tira de flujo lateralResultado Negativo
Almohadilla de muestra
Conjugado con anticuerpos especificos
Membrana de Nitrocellulosa
conjugado-anticuerpo sin antgeno
No hay formacin del complejo
Almohadilla para manejo de la tira
Almohadilla con el Anticuerpo -
Conjugado
Linea de
prueba
Linea de Control
Muestra vegetal Sana,
sin
antgeno
Backing Material
Environlogix, Inc.
No hay unin del conjugado-con anticuerpo inespecfico
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ELISA vs. Tira de flujo LateralCmm
00.20.40.60.8
11.21.41.61.8
0 1 2 3
Immunostrip Result
BID
- Abs
orba
nce
650
nm
0 = negativo; 1 = deteccin positiva ligera; 2 = positivo
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NCM-ELISA
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Inmunofluorescencia (IF)
Generalmente usada para la identificacin de bacterias y esporas de hongos
El marcador es Fluorescente Los reactivos y pasos a seguir son similares a
los de ELISA Se emplea microscopio epifluorescente
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Ensayo para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
1 Anticuerpo en PBS-Tween
2 Anticuerpo (Alexa Fluor 488, 1:500) en PBS-Tween
Incuba 2 hr, 22C
Lavar 6X, PBS-Tween
Incubar 1 hr, 22 C en obscuridad
Lavar 6X, PBS-Tween
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Microscopa Epifluorescente
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Phakopsora pachyrhizi
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IF = especificidad
P. pachyrhizi
Puccinia graminis
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Inmunocaptura - PCR
Las tcnicas basadas en la deteccin del DNA, son altamente sensibles y la variante immunocaptura PCR (IC-PCR) es todava ms sensible al combinar anticuerpos y PCR.
Bao mara
ELISA: Ac captura + Antgeno