serolo Ške reakcije

43
SEROLOŠKE REAKCIJE INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE Prof.dr IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ

Upload: eagan-becker

Post on 31-Dec-2015

96 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

SEROLO ŠKE REAKCIJE. INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE Prof.dr IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ. DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA. SEROLOŠKE REAKCIJE SU REAKCIJE ANTIGEN (Ag) ANTITELO (At) U USLOVIMA IN VITRO. ANTIGEN + ANTITELO KOMPLEKS koji može da se vidi ili dokaže na drugi način. - PowerPoint PPT Presentation

TRANSCRIPT

Page 1: SEROLO ŠKE REAKCIJE

SEROLOŠKE REAKCIJE

INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE

Prof.dr IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ

Page 2: SEROLO ŠKE REAKCIJE

DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA

• SEROLOŠKE REAKCIJE SU REAKCIJE ANTIGEN (Ag) ANTITELO (At) U USLOVIMA IN VITRO.

• ANTIGEN + ANTITELO KOMPLEKS koji može da se vidi ili dokaže na drugi način

Page 3: SEROLO ŠKE REAKCIJE

DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA

• NA OSNOVU STVORENOG KOMPLEKSA PRIMENOM POZNATOG ANTIGENA MOŽE SE DOKAZATI NEPOZNATO ANTITELO ILI OBRNUTO (primenom poznatog antitela dokazati nepoznati antigen)

Page 4: SEROLO ŠKE REAKCIJE

PRIMENA SEROLOŠKIH REAKCIJA

• U DIJAGNOSTICI U VIRUSOLOGIJI, BAKTERIOLOGIJI, PARAZITOLOGIJI ZA POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE ODNOSNO UTVRĐIVANJE UZROČNIKA BOLESTI

• U TIPIZACIJI KRVNIH GRUPA ERITROCITA I HISTOKOMPATIBILNIH ANTIGENA LEUKOCITA

• ZA DOKAZIVANJE PROTEINA SERUMA, ONKOFETALNIH ANTIGENA, AUTOANTITELA, KOMPONENTI KOMPLEMENTA

Page 5: SEROLO ŠKE REAKCIJE

VRSTE SEROLOŠKIH REAKCIJA

• SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKOG SPECIFITETA Ag su napravljeni od uzročnika bolesti koju dokazujemo

• SEROLOŠKE REAKCIJE SLUČAJNOG SPECIFITETA Ag nisu napravljeni od uzročnika bolesti nego su samo slučajno sa uzročnikom antigenski srodni pa mogu da reaguju sa antitelima nastalim u infekciji tim uzročnikom

Page 6: SEROLO ŠKE REAKCIJE

SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKLOG SPECIFITETA

• IMUNOENZIMSKI TEST ELISA• IMUNOFLUORESCENTNI TEST IFT• RADIOIMUNOESEJ RIA• NEUTRALIZACIONI TEST NT• REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA • REAKCIJA INHIBICIJA

HEMAGLUTINACIJE• AGLUTINACIJA i PRECIPITACIJA

Page 7: SEROLO ŠKE REAKCIJE

SEROLOŠKI TESTOVI KOJI KORISTE OBELEŽENA ANTITELA

• TESTOVI IMUNOFLOURESCENTNE MIKROSKOPIJE (IFT)

• IMUNOENZIMSKI TESTOVI (ELISA)• RADIOIMUNOTESTOVI (RIA)• OVIM TESTOVIMA DOKAZUJU SE KLASE

IMUNOGLOBULINA IgM, IgG, Ig A, IgE zavisno od specifiteta antitela koje je obeleženo enzimom, fluorohromom ili radioaktivnim izotopom

Page 8: SEROLO ŠKE REAKCIJE

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT

• 1.DIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA

• PRIMENJUJE SE ZA DOKAZIVANJE ANTIGENA MIKROORGANIZAMA

• IZVODI SE NA PREDMETNOM STAKLU • POTREBAN JE FLUORESCENTNI

MIKROSKOP KOJI IMA ŽIVINU SIJALICU I SPECIJALNE FILTRE TE EMITUJE UV ZRAKE

Page 9: SEROLO ŠKE REAKCIJE

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT

• 1.DIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA princip testa

• bolesnički uzorak ( u kome dokazujemo Ag ) fiksiran JE na predmetnom staklu + At specifično za Ag obeleženo fluorohromom PRI ISPIRANJU SE NE SPIRA ako je formiran kompleks Ag-At

• Ovako pripremljeni uzorak se MIKROSKOPIRA NA IMUNOFLUORESCENTNOM MIKROSKOPU

Page 10: SEROLO ŠKE REAKCIJE

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT

• UKOLIKO JE U BOLESNIČKOM UZORKU PRISUTAN ANTIGEN SPECIFITETA PRIMENJENIH At obeleženih fluorohromom u preparatu se javlja FLUORESCENCIJA HERPES SIMPLEX VIRUS U ĆELIJAMA

VEZIKULA

POZITIVAN IFT TEST

Page 11: SEROLO ŠKE REAKCIJE

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT

• 2.INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA TEHNIKA (IIFT)

• 2.a IIFT ZA DOKAZIVANJE At

• 2.b IIFT ZA DOKAZIVANJE Ag

Page 12: SEROLO ŠKE REAKCIJE

FTA – Indirektna imunofluorescentna tehnika

• Dokazuju se i Ag i At• Indirektna FTA za Ag• +Ag + At inkubacija, ispiranje• Dodavanje antiAt markiranog

fluorohromom Ag-At-antiAtmark. Inkubacija,ispiranje

• Fluorescentni mikroskop UV zraci• Kompleks Ag-At-Atmark.FLUORESCIRA

Page 13: SEROLO ŠKE REAKCIJE

Pozitivan INDIREKTNI IMUNOFLUORESCENTNI TEST ZA ANTIGEN RSV

Page 14: SEROLO ŠKE REAKCIJE

IMUNOFLUORESCENTNA TEHNIKA ZA DOKAZIVANJE CMV ANTIGENEMIJE

• PREDNOSTI• kvalitet uzorka se

vidi,mora sadržati intaktne virusom inficirane ćelije

• jednostavna priprema preparata i dobijanje rezultata za 1-2h

• NEDOSTACI• subjektivna metoda• obučenost za

mikroskopiranje

Page 15: SEROLO ŠKE REAKCIJE

FTA – Indirektna imunofluorescentna tehnika za Ag NEGATIVAN TEST

• Ø + At( inkubacija,ispiranje)• Dodavanje antiAt markiranog FITC

(inkubacija,ispiranje)• UV zraci fluorescentnog mikroskopa• NEMA FLUORESCENCIJE jer se At

obeležena hluorofromom spiraju

Page 16: SEROLO ŠKE REAKCIJE

PRINCIP INDIREKTNOG IMUNOFLUORESCENTNOG TESTA

PRIMENOM POZNATOG Ag DOKAZUJEMO At TOG SPECIFITETA U SERUMU

Page 17: SEROLO ŠKE REAKCIJE

FTA – Antrikomplementarna imunofluorescentna metoda

• Za dokazivanje Ag

• +Ag + At + C(inkubacija, ispiranje)

• Ag-At-C + antiC3markiran fluorohromom (inkubacija, ispiranje)

• Fluorescentni mikroskop UV :kompleks

Ag-At-C- antiC3markiran FLUORESCIRA

Page 18: SEROLO ŠKE REAKCIJE

ELISA TESTOVI

• Za dokazivanje Ag 1.DIREKTNA SENDVIČ ELISA 2.INHIBICIONA 3.KOMPETITIVNA

• Za dokazivanje At 1.DIREKTNA KOMPETITIVNA 2.INDIREKTNA ELISA

Page 19: SEROLO ŠKE REAKCIJE

SEROLOŠKA DIJAGNOZA

ELISA TEST

ELISA test

Page 20: SEROLO ŠKE REAKCIJE

DIREKTNA SENDVIČ ELISA

• Za dokazivanje Ag Bazenčić obložen At specifičnim za Ag koji se dokazuje

• Dodavanje ispitujućeg uzorka• Dodavanje At specifičnih za traženi Ag

markiranih enzimom (E) (inkubacija, ispiranje)• Dodavanje substrata• KVANTITATIVNA ELISA (intenzitet boje

ukazuje na količinu ag u uzorku)

Page 21: SEROLO ŠKE REAKCIJE

INHIBICIONA ELISA

• Za dokazivanje Ag• Ag (isti kao onaj koji se dokazuje) je vezan za

ploču• Dodaje se ispitujući bolesnički uzorak • Dodaju sa At obeležena E specifična za Ag

koji se dokazuje (inkubacija,ispiranje)• Dodavanje substrata • IZOSTANAK POJAVE BOJE +ELISA

(obeležena antitela imaju veći afinitet vezivanja za antigen iz uzorka)

Page 22: SEROLO ŠKE REAKCIJE

KOMPETITIVNA ELISA

• Za Ag• Bazenčić je obložen At specifiteta Ag koji se

dokazuje• Dodaje se ispitujući uzorak• Dodaje se Ag markiran E (kao ag koji se

dokazuje) (inkubacija,ispiranje)• Dodaje se substrat• IZOSTANAK POJAVE BOJE +ELISA jer Ag iz

uzorka ima veći afinitet vezivanja od obeleženog Ag koji će se sprati

Page 23: SEROLO ŠKE REAKCIJE

ELISA ZA DOKAZIVANJE ANTITELA DIREKTNA KOMPETITIVNA

• BAZENČIĆ PLOČE ZA MIKROTITRACIJU JE OBLOŽEN ANTIGENOM

• DODAJE SE BOLESNIČKI SERUM I ANTITELA SPECIFITETA ANTIGENA OBELEŽENA ENZIMOM

• INKUBACIJA , PA ISPIRANJE I DODAVANJE SUBSTRATA PRISUSTVO BOJE

NEGATIVNA ELISA

NEMA POJAVE BOJE POZITIVNA DIREKTNA KOMPETITIVNA ELISA

At iz ispitujućeg seruma imaju većI afinitet vezivanja za Ag od enzimom obeleženih At

Page 24: SEROLO ŠKE REAKCIJE

PRINCIP INDIREKTNOG ELISA TESTA

Page 25: SEROLO ŠKE REAKCIJE

INDIREKTNA ELISA

• POJAVA BOJE u indirektnom ELISA testu = + ELISA

• INTENZITET BOJE GOVORI O KOLIČINI ANTITELA U SERUMU .TEST MOŽE BITI KVANTITATIVAN

• ENZIMI koji se primenjuju u ELISA TESTU ALKALNA FOSFATAZA

PEROKSIDAZASUPSTRAT koji se primenjuje u ELISA TESTU

ORTOFENILENDIAMIN

Page 26: SEROLO ŠKE REAKCIJE

APARATI ZA ELISA TESTOVE

• ANALYSER IP2 • MIKROPLATE READER

Page 27: SEROLO ŠKE REAKCIJE

INTERPRETACIJA SEROLOŠKIH REZULTATA

IgM i IgG negativni nema infekcije, inkubacija ili prodromalni stadijum

IgM pozitivna IgG negativna

početak infekcije

IgM i IgG pozitivna akutna infekcija

IgM negativna IgG visoko pozitivna

kasna rekonvalescencija

IgM negativna uz nisko pozitivne IgG

ranije preležana bolest

Page 28: SEROLO ŠKE REAKCIJE

KLASIČNI SEROLOŠKI TESTOVI

• NE DOKAZUJU SE ANTITELA PO KLASAMA VEĆ UKUPNI IMUNOGLOBULINI

• REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA RVK• NEUTRALIZACIONI TEST NT• REAKCIJA INHIBICIJA HEMAGLUTINACIJE

RIH• AGLUTINACIJA

• PRECIPITACIJA mogu se dokazati i klase imunoglobulina

Page 29: SEROLO ŠKE REAKCIJE

REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (RVK)

• INAKTIVACIJA KOMPLEMENTA U SERUMU KOJI SE TESTIRA (inkubacijom na 56°C 30 minuta)

• I FAZA At (dvostruka stepenasta razređenja seruma od ¼ do 1/256) + Ag + C (inkubacija 90min /37°C ili 18h/4°C)

Page 30: SEROLO ŠKE REAKCIJE

RVK

• FAZA II• DODAJE SE HEMOLITIČKI SISTEM koji

ima ulogu indikatora ( reakciju Ag A t čini vidljivom) INKUBACIJA 30MIN /37°C

• HEMOLITIČKI SISTEM se sastoji od HEMOLIZINA(INAKTIVISANI SERUM KUNIĆA SA ANTITELIMA PROTIV OVČIJIH ERITROCITA) I OVČIJIH ERITROCITA

Page 31: SEROLO ŠKE REAKCIJE

RVK POZITIVNA

• ISPITUJUĆI SERUM SADRAŽI At SPECIFIČNA ZA PRIMENJENI Ag FAZA I Ag+At+C= Ag-At –C (formira se kompleks Ag At i aktivira se komplement FAZA II Ag-At-C +Hem+OE =OE OSTAJU INTAKTNI

• RVK POZITIVNA HEMOLIZA NEGATIVNA

• OE ovčiji eritrociti/Hem hemolizin

Page 32: SEROLO ŠKE REAKCIJE

RVK NEGATIVNA

• ISPITUJUĆI SERUM NE SADRŽI ANTITELA SPECIFIČNA ZA PRIMENJENI ANTIGEN

• Ag + C= Ag+C ( komplement se ne aktivira u fazi I jer se ne stvara kompleks Ag- At)

• FAZA II Ag+C+Hem+OE = Ag+Hem-OE-C (hemolitički sistem aktivira C)

• LIZA ERITROCITA RVK NEGATIVAN

Page 33: SEROLO ŠKE REAKCIJE

TITAR

• REZULTAT RVK SE IZRAŽAVA U TITROVIMA

• TITAR JE NAJVEĆE RAZREĐENJE ISPITUJUĆEG SERUMA KOJE JOŠ UVEK DAJE POZITIVNU SEROLOŠKU REAKCIJU

Page 34: SEROLO ŠKE REAKCIJE

OČITAVANJE RVK TESTA

• RVK TEST MOŽE DA SE IZVODI U EPRUVETAMA ILI NA PLOČAMA ZA MIKROTITRACIJU

Page 35: SEROLO ŠKE REAKCIJE

NEUTRALIZACIONI TEST (NT)

• 1.ZA IDENTIFIKACIJU IZOLOVANOG VIRUSA - VIRUS NEUTRALIZACIONI TEST

• 2.ZA ODREĐIVANJE TITRA NEUTRALIŠUĆIH ANTITELA U SERUMU SERUM NEUTRALIZACIONI TEST

Page 36: SEROLO ŠKE REAKCIJE

VIRUS NEUTRALIZACIONI TEST princip testa

• UKLANJANJE NESPECIFIČNIH INHIBITORA :30min/56°C

• VIRUSNI IZOLAT (živi virus) dvostruko stepenasto razređen +

• ANTITELA specifična za virus

• Inokuliše se u KULTURU ĆELIJA

• IZOSTANAK CPE POZITIVAN NT

• KONTROLA:VIRUS U kulturi bez At CPE+

Inkubacija 30min/37°C

Page 37: SEROLO ŠKE REAKCIJE

CITOPATOGENI EFEKAT (CPE)

• CPE sve citopatološke promene na ćelijama u kojima se razmnožava virus

• CPE ADENO virusa uvećane,zaokružene ćelije,grupisane u tipične nakupine.

Cpe adeno virus

Page 38: SEROLO ŠKE REAKCIJE

CITOPATOGENI EFEKAT

• RSV sincicijumi i blede eozinofilne inkluzije u citoplazmi

• Javlja se između 3 -7 dana

Page 39: SEROLO ŠKE REAKCIJE

Citopatogeni efekat HSV virusa

CPE

UVEĆANE ĆELIJE SA CITOPLAZMATSKIM GRANULACIJAMA

Javlja se za 5-14 dana

• IZOLACIJA U KULTURI ĆELIJA

CPE HSV na kulturi ćelija

Page 40: SEROLO ŠKE REAKCIJE

SERUM NEUTRALIZACIONI TEST princip testa

• UKLANJANJE NESPECIFIČNIH INHIBITORA U ISPITUJUĆEM SERUMU

• Ag(živi virus) + ISPITUJUĆI SERUM

• KULTURA ĆELIJA (inkubacija na 35°C)

• CPE – NT + CPE + NT –• REZULTATI SE IZRAŽAVAJU U TITROVIMA

(1/10,1/20 I sl.)

Page 41: SEROLO ŠKE REAKCIJE

REAKCIJA INHIBICIJE HEMAGLUTINACIJE princip testa

• 1.INAKTIVACIJA NESPECIFIČNIH INHIBITORA HEMAGLUTINACIJE U SERUMU

• 56°C/30MIN• PERJODATOM,RDE,TRIPSINOM• 2.RAZREĐIVANJE SERUMA• 3.DODAVANJE ANTIGENA

HEMAGLUTININA /INKUBACIJA SOBNA TEMP/45MIN

Page 42: SEROLO ŠKE REAKCIJE

RIH OČITAVANJE

• 4.DODAVANJE ERITROCITA (Er) koji su indikatori reakcije antitela i virusa

• 5.OČITAVANJE RIH

Page 43: SEROLO ŠKE REAKCIJE

Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova

test 1. uzor. 2. uzor. interpretacija

RVK manje od 1/4

1/8 akutna infekcija

RIH 1/40 1/160 akutna infekcija

NT 1/10 1/20 ranija infekcija

RVK 1/32 1/64 ranija infekcija