sequenciamento dna metodos e principios

1SEQSEQENCIAMENTO DE DNA:ENCIAMENTO DE DNA:MMTODOS E PRINCTODOS E PRINCPIOSPIOS

Cristiane Kioko Shimabukuro Dias

Laboratrio de Biologia e Gentica de Peixes - Departamento de Morfologia

Instituto de Biocincias UNESP Botucatu (SP)

Ps-doutorado - FAPESP

E-mail: [email protected]

Seqenciamento de DNA

DEFINIDEFINIOO

Determinar a seqncia de nucleotdeos

2HISTHISTRICORICO

1953 - Watson e Crick

Modelo dupla hlice do DNA



HISTHISTRICORICO

Dcada de 70

3 Maxam e Gilbert - mtodo de degradao qumica

Tratamento com substncias qumicas que cortam a

molcula de DNA em nucleotdeos especficos

Sanger et al. - mtodo enzimtico, dideoxi ou de

trmino da cadeia

Sntese enzimtica de uma fita complementar, cujo

crescimento interrompido pela adio de um

dideoxinucleotdeo

1977 Seqnciamento de DNA

MMTODOS CLTODOS CLSSICOSSSICOS



MMTODO DE DEGRADATODO DE DEGRADAO QUO QUMICAMICA

enzima de restrio X

XX

aquecimento e purificao

4Seqenciamento de DNA

PiperidinaPiperidinalcaliA>C

PiperidinaPiperidinaHidrazina + lcaliC

PiperidinaPiperidinaHidrazinaC+T

PiperidinacidocidoA+G

PiperidinaPiperidinaDimetilsulfatoG

Qumico usado para a

clivagem da fita

Qumico usado para

remoo de bases

Qumico usado para

alterao de bases

Especificidade

de bases






G A+G C+T C


MMTODO ENZIMTODO ENZIMTICOTICO

DNA fita simples

DNA polimerase

primer

Animao


MMTODO ENZIMTODO ENZIMTICOTICO

XX



Mtodos de seqenciamento manual

Mtodo enzimtico mais utilizado, seqenciamento de

genomas, automao

Mtodo de degradao qumica substncias qumicas,

caracterizao de oligonucleotdeos ou no seqenciamento

de estruturas ricas em GC


SEQSEQENCIAMENTO MANUALENCIAMENTO MANUAL


SEQSEQENCIAMENTO AUTOMENCIAMENTO AUTOMTICOTICO


Anos 80 seqenciador semi-automtico

Substituio das tcnicas de deteco por radioatividade pelo

uso de marcadores fluorescentes

Radioistopos danosos sade, dificuldade de automao

Fluorfos sistema de deteco que permite a leitura automtica das

seqncias

Preparao do gel e aplicao das amostras

Utilizao ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente

durante a eletroforese

Corantes fluorescentes reaes no mesmo poo no gel




Seqenciamento em ciclos ou por amplificao linear



animao




Anos 90 - Seqenciadores de capilares

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Seqenciadores automticos avano para a genmica, poucas centenas de pb

Seqenciadores de capilares - duas vezes mais rpidos,

completamente automatizados

Associao de capilares preenchidos com gel a um sistema de

deteco atravs de fluorescncia confocal excitada por laser




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Eliminao da montagem da placa e preparao do gel

Aplicao das amostras por eletroinjeo

Alta velocidade e resoluo na separao das amostras

Eliminao do retraqueamento


OUTRAS TOUTRAS TCNICAS DE SEQCNICAS DE SEQENCIAMENTOENCIAMENTO

Piroseqenciamento

Seqenciamento por hibridao

Colnias da polimerase

Seqenciamento por nanoporos

Espectrometria de massa

Massively Parallel Signature Seuqencing

Determinao de SNP, reseqenciamento, anlise da

expresso gnica

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Piroseqenciamento tempo real, seqenciamento por sntese

Mtodo rpido, seqncias menores, genotipagem de SNP, tipagem microbiana,

reseqenciamento de genes para doenas e determinao da seqncia de

DNA com estruturas secundrias complexas



SBH complementariedade de pares de bases da molcula de DNA

Seqenciamento de DNA, reseqenciamento de DNA, seqenciamento de novo

e anlise da expresso gnica

(4n=5) = 1024

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Colnias da polimerase colnias de DNA de 1 m de dimetro que crescem

numa lmina para microscopia

Estgio inicial, reduo de custos; genotipagem e haplotipagem

Produo das polniasDenaturao do DNA imobilizadoHibridao de um primer universalPrimeira reao de extensoMicroscpio de fluorescncia de varreduraFluorescncia removidaCiclos sucessivosSeqncia de cada polnia paralelo


Fago phiX174 (Sanger et al., 1977)

APLICAAPLICAESES

Anlise genmica

Haemophilus influenzae (1995)

Homo sapiens (2003)

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APLICAAPLICAESES

Estudo sistemtico dos genomas

Avano das tcnicas de seqnciamento

Automao

Equipamentos sofisticados e precisos

Grande quantidade de dados


APLICAAPLICAESES

Genoma completo: 28 archebactrias, 357 bactrias e

22 eucariotos

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APLICAAPLICAESES

Cincia forense

Anlise filogentica


APLICAAPLICAESES

Epidemias virais

Conservao de espcies

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DNA barcoding

Genmica comparada

Descoberta de drogas

Screening gentico

APLICAAPLICAESES


OBRIGADA!

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