separaciÓn de biomolÉculas aislamiento purificaciÓn caracterizaciÓn primer paso: solubilizaciÓn...
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SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULASAISLAMIENTO
PURIFICACIÓNCARACTERIZACIÓN
PRIMER PASO:SOLUBILIZACIÓN o EXTRACCIÓN DE LA
MOLÉCULA DE INTERÉS
RUPTURA MECÁNICA*trituración
*homogeneizador *uso de Prensa French
*Sonicador
Estrategia general de purificación
Solubilidad SALTING IN SALTING OUT
Carga Iónica Cromatografía de Intercambio Iónico
ElectroforesisIsoelectroenfoque
Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papelCromatografía de interacción
hidrofóbica
Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gelCromatografía de filtración por
gelesUltracentrifugación
Especificidad de unión Cromatografía de afinidad
La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad del solvente,
el pH y la temperatura
SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
chroma color graphein escribir
La mezcla de sustancias a fraccionar se disuelven en un fluído líquido o gaseoso denominado FASE
MÓVIL.
La solución resultante se filtra a través de una matriz sólida porosa denominada FASE ESTACIONARIA
Cromatografía de intercambio iónico
Los iones unidos en forma electrostática a una matríz insoluble y químicamente inerte se reemplazan de manera reversible por los iones de la solución
R+A- + B- R+B- + A-
Cromatografía de exclusión molecular
Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papel
Cromatografía de afinidad
ELECTROFORESIS
Migración de iones en un campo eléctrico
La migración es proporcional a su densidad de carga, tamaño y forma
MATRICES USADAS
AGAROSAPOLIACRILAMIDA
PROTEÍNA AISLADA
•ENSAYO ESPECÌFICO Enzima: medición de la velocidad de
formación de un producto es proporcional a la cantidad de enzima presente
REACCIONES COLOREADAS, FLUORESCENTES O REACCIONES ACOPLADAS
Proteínas (no enzimas): procedimientos inmunoquímicos (RIA, ELISA, WESTERN BLOT)
ULTRACENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE
Fsedimentación= m2r-Vp2r
m masa velocidad angularr distancia de un puntoVp volumen de la partícula
Densidad de la solución
Cuando
Fsedimentación= Ffricción
S= v = M (1- Vp )
2r Nfdonde s es el coeficiente de sedimentación
Por lo tanto, la masa de una partícula puede determinarse a partir de su coeficiente de sedimentación
m= M/N
