senzori electrochimici pentru evaluarea toxicitatii ... · senzori electrochimici pentru evaluarea...
TRANSCRIPT
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Senzori electrochimici pentru evaluarea toxicitatii nanomaterialelor in vitro
Szilveszter Gáspár ([email protected])
Centrul International de Biodinamica, Bucuresti
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
I. De ce metode alternative la testele pe animale?
II. Alternativa la care lucram noi (pe scurt)
III. Sistem experimental
IV. Biosenzor pentru detectia superoxidului in spatiul extracelular
V. Impedanta electrochimica pentru monitorizarea aderentei celulare
VI. Monitorizarea simultana a eliberarii de superoxid si a aderentei celulare
VII. Concluzii
Continut
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
a.) din considerente etice (54 milioane vertebrate doar pt. REACH)
b.) din cauza costurilor ridicate (250 milioane – 1.2 bilioane $ doar pt. testarea celor ~ 1000 nanoparticule deja comercializate) 1
c.) din cauza unui “throughput” limitat (34-53 ani doar pt. testarea celor ~ 1000 nanoparticule deja comercializate) 1
d.) din cauza predictivitatii limitate (20-30% din efectele adverse ale medicamentelor nu sunt detectate in testele preclinice) 2,3
I. De ce metode alternative la testele pe animale?
1. Choi, J.-Y et al. The impact of toxicity testing costs on nanomaterial regulation. Environ. Sci. Technol. (2009), 43, 3030-3034.2. Seok, J. et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. PNAS (2013). doi:10.1073/pnas.12228781103. Stevens, J. L., Future of toxicology – mechanisms of toxicity and drug safety: where do we go from here? Chem. Res. Toxicol. (2006)19, 1393-1401.
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
II. Alternativa la care lucram noi (pe scurt)
Modele celulare (culturi 2D sau 3D, co-culturi, “organ-on-a-chip”, etc.)
Metode analitice care permit monitorizarea continua si in situ a
unor procese celulare
Inlocuite cu
Inlocuite cu
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiGold
Cell
Membrane capacitance
Barrierfunction
O2•
Supe
roxi
dese
nsor
Cell
Glass
O2•
O2•
III. Sistem experimental
16 mai 2013A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
IV.1. Biosenzor pentru detectia superoxidului in spatiul extracelular
•O2-
RED
O2
OX
Hipoxantina / Xantina, O2
Acid uric, H2O2, •O2-
SH
O
NH
SH
O
NH
Electrod de Au la 150 m
V
OX
Gáspár, S., et al., Electroanalysis 25, 448–452 (2013).
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
IV.2. Calibrarea biosenzorului pentru superoxid
0 2 4 6 8
0
10
20
30
curr
ent s
igna
l /
nA
(XOD activity)1/2 / (mU/ml)1/2
y = 3.03 ± 0.10 * xR2 = 0.995
0.0 5.0x10-7 1.0x10-6
0
10
20
30y = 2.41 ± 0.08 x 107 * x
R = 0.995
curr
ent s
igna
l /
nA
superoxide conc. / M
Gáspár, S., Niculite, C., Cucu, D. & Marcu, I., Biosensors and Bioelectronics 25, 1729–1734 (2010).
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
0 2500 5000 7500 10000-101234567
159 U ml-1 SOD
curr
ent s
igna
l /
nA
time / sec
0.98 mg ml-1
0.52 mg cm-2 calcium oxalate
159 U ml-1 SOD
IV.3. Evolutia superoxidului in spatiul extracelular al celulelorrenale incubate cu cristale de oxalat de calciu
Obs.: Eliberarea de superoxid este un proces nemonoton si temporar. Astfel, el
poate trece neobservat in cazul unor masuratori clasice (de tip “end point”).
Gáspár, S., Niculite, C., Cucu, D. & Marcu, I., Biosensors and Bioelectronics 25, 1729–1734 (2010).
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Obs.: Se pot ”observa” celule care cresc si adera pe electrod in jur de
1800 Hz!
V.1. Impedanta electrochimica pentru monitorizarea aderentei celulare
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
V.2. Impedanta electrochimica pentru monitorizarea aderentei celulare
Gáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).
Zelectrod cu celule la 1800 Hz
Rp ~ rezistenta transepitelialaCp ~ capacitanta transepiteliala
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
VI.1. Monitorizarea simultana a eliberarii de superoxid si a aderentei celulare
EIS Amperometrie
1. 2. 3. 1. 2. 3.
Gáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Obs.: Celulele “tinere” (fara jonctiuni stranse) sunt mai sensibile!
VI.2. Efectul varstei celulelor asupra vulnerabilitatii acestora
Gáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
VI.3. Q:Stres mecanic sau chimic?
A: Stres mecanic + stres chimicGáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
VII. CONCLUZII
+ Senzorii sunt reversibili (pot monitoriza atat productia cat si consumul de superoxid)
+ Marcarea celulelor nu este necesara
+ Sistem experimental simplu si usor de folosit
+ Rezolutie temporala excelenta (care permite observarea dinamicii proceselor)
+ Procesele studiate sunt ne-monotone si temporare si pot trece neobservate cand se folosesc metode clasice
- Sistemul poate fi utilizat doar la evaluarea toxicitatii acute (nu si a toxicitatii cronice)
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
MULTUMIRI
Suport financiar: UEFISCDI
Irene Marcu
Cristina Niculite
Mihaela Gheorghiu
Eugen Gheorghiu
Sorin David
DanaCucu
Cristina Polonschii
DumitruBratu