Ciona intestinalis

Udfra NCBI-EST sekvenser designesprimere

↓

. 4 Udpræp af valgte væv

↓

-RNA oprensning( )total RNA

↓

Reverse transkription(mRNA→ )cDNA

↓

PCR( )amplifikation af ønskede område

Semikvatitativ Actinnormaliseret PCR

Lane1-2: Tarm, Lane 3-4 Neuralkirtel,Lane 5-6: Ovarie, Lane 7-8. Gællesæk.

A:20 cykler b:25 cykler c:30 cykler d:35 cykler

Amplificeret cDNA fra 5’UT-3’UT

↓

cDNA indsættes i vektor

↓

Vektor med insert heat shock transfekteres i . E coli

↓

/Kloner checkes v PCR

↓

Positive kloner sekvenseres på310ABI

PCR-check af positive kloner

-51 GCTCGGTACCWAGCTCGCCCTTAGCGGCCGCGGAATTTATAAGTTCTGAAA+1<————————————————————————————— Signalpeptide ——————————> <————————— N-terminal part ——————————————————-> L G M F S F K V C V V F I I S L H A T V L A G D N T Y L T C S E X A P P LATGTTTTCGTTCAAAGTGTGCGTCGTGTTCATCATCAGTCTTCATGCRACTGTGTTGGCTGGAGACAACACCTACTTAACTTGTTCCGAARGTGCGCCGCCATTG 105 A G G Y

——————————> <————————————————————————————— Collagen region —————————> <———————————— Neck —————————————— K A D R G P P G P A G P T G P K G P K G D T G A T T E L E N T V H D L 70AAAGCGGACCGAGGRCCACCTGGGCCAGCGGGGCCGACCGGTCCCAAAGGGCCAAAAGGAGACACTGGAGCCACTACTGAGCTAGAGAACACCGTGCATGATTTG 210 Y Y

————————————————————————————————————————————— Neck ————————————————————————————————————————————————— R E E R L E K A E R D I V L M T K T I N E I N S H T C Q C M E V I D G K 105GAAGAAAGGTTGGAAAAGGCCGAGAGGGATATTGTGTTGATGACAAAAACGATTAACGAAATTAACAGTCACACTTGCCAATGTATGGAAGTCATTGATGGGAAA 315 C C

——————————— Neck ————————————> <——————————————————————————— CRD ———————————————————————————————————— I D R V W Y G P G N G Y L Y L V I V S D M T Y D E A K S K C S K Y G A T L A 140GTTTGGTACGGACCCGGGAACGGTTATCTATACCTGGTTATTGTAAGCGATATGACGTACGATGAAGCTAAATCGAAATGTAGCAAATACGGAGCTACCCTTGCA 420 A TA C G

—————————————————————————————————————————————— CRD ———————————————————————————————————————————————————— V H G P K N R D I M K I L H K Q L P V I T Q E D Y W I G L T D K Q G E 175GTGCACGGACCCAAGAACAGAGATATTATGAAAATCCTTCACAAACAGTTACCGGTAATCACCCAGGAAGACTATTGGATTGGTCTTACCGATAAACAGGGCGAA 525

—————————————————————————————————————————————— CRD ———————————————————————————————————————————————————— A Y E N A G R Y V W E D G S S L K S S E A N W N P G Q P D D Y G N A E D C V G G 210GGCAGATATGTGTGGGAGGATGGCTCCTCACTGAAAAGCAGCGAAGCGAATTGGAATCCTGGTCAACCGGACGACTATGGAAATGCAGAAGATTGTGTCGGTGGC 630 C T G A C T G A GCC

—————————————————————————————————————————————— CRD ———————————————————————> Y Q N Y L D S L Q W N D W K C S D G R L Y A L C E R R E . 245AATTACCTAGACAGTCTTCAATGGAATGACTGGAAGTGCTCAGACGGACGGTTATACGCGCTTTGCGAACGTCGAGAGTAGACCTTGGCTTAATACCAAACAAAT 712 AC A A

Carp Fish

2.0 kb

Col5’ut, L, N-term, Col5’ut CRD, 3’utNeck

225 bp

2444 bp

210 bp

2740 bp

108 bp

613 bp

90 bp

839 bp

928 bp

Chicken

8.2 kb

5’ut, L, N-term, Col Col CRD, 3’utNeck

Human

7.0 kb

5’ut

106 bp

1028 bp 555 bp 736 bp1354bp

119 bp376 bp 60 bp 2.1 kb

5’ut L, N-term, Col CRD, 3’utCol

0.9 kb

67 bp562 bp

QPD/EPN-form

L, N-term, Col,Neck Neck, CRD

243bp398bp1277bp

296 bp 153 bp 259 bp

5’ut L, N-term, Col Neck, CRD, 3’utCol

133 bp77 bp

0.9 kb

67 bp 206 bp 78 bp 651 bp

QPD-form 2 isoforms

Neck

EPN-form

Neck

20 bp

CRD

2.5 kb

Ciona

10 20 30 40

M F S F K V C X V F I I X L H V T V L A G D N T - - - - - - - Y L T C S - - - - 1 Ciona MBL NCBIM F S L K V C V V F I I S L H A T V L A G D N T - - - - - - - Y L T C S - - - - 1 Ciona MBL EPNM F S F K V C V V F I I S L H A T V L A G D N T - - - - - - - Y L T C S - - - - 1 Ciona MBL QPDM A L F K L F L G T L L L L Q F A L Q L L D G A - - - - E P Q N L N C P A Y G G 1 Cyprinus MBLM T L L Q P F S A L L L C L S L M M A T S L L T T D K P E E K M Y S C - P I I Q 1 Gallus MBLM L L L P L L P - V L L C V V S V S S S G S Q T C - - - E D T L K T C - S V I A 1 Mus MBL-aM S I F T S F - - L L L C V V T V V Y A E T L T - - - - E G V Q N S C - P V V T 1 Mus MBL-cM S L F P S L P L L L L S M V A A S Y S E T V T C - - - E D A Q K T C P A V I A 1 Homo MBL-c

50 60 70 80

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E S G P P L E G N Q G P P G P A 30 Ciona MBL NCBI- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E G A P P L K A D R G P P G P A 30 Ciona MBL EPN- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E X A P P L K A D R G P P G P A 30 Ciona MBL QPDV P G T P G H N G L P G R D G R D G K D G A I G P K G E K G E S G V S V Q G P P 37 Cyprinus MBLC S - A P A V N G L P G R D G R D G - - - P K G E K G D P G E G L R G L Q G L P 40 Gallus MBLC - - - - - - - - - - G R D G R D G - - - P K G E K G E P G Q G L R G L Q G P P 36 Mus MBL-aC S - S P G L N G F P G K D G R D G - - - A K G E K G E P G Q G L R G L Q G P P 34 Mus MBL-cC S - S P G I N G F P G K D G R D G - - - T K G E K G E P G Q G L R G L Q G P P 38 Homo MBL-c

90 100 110 120

G P A G P K G P K G D T G V T T E L E H T V H N L E K R L Q K A E R D I V V M T 46 Ciona MBL NCBIG P T G P K G P K G D T G A T T E L E N T V H D L E E R L E K A E R D I V L M T 46 Ciona MBL EPNG P T G P K G P K G D T G A T T E L E N T V H D L E E R L E K A E R D I V L M T 46 Ciona MBL QPDG K A G P P G P A G E K G E R G P T G S Q G S P G - - - S E S V L E S L K - - - 77 Cyprinus MBLG K A G P Q G L K G E V G P Q G E K G Q K G E R G I V V T D D L H R Q I T D L E 76 Gallus MBLG K L G P P G S V G S P G S P G P K G Q K G D H G - - D N R A I E E K L A N M E 63 Mus MBL-aG K V G P T G P P G N P G L K G A V G P K G D R G - - D R A E F D T S E I - - D 70 Mus MBL-cG K L G P P G N P G P S G S P G P K G Q K G D P G - - K S P D G D S S L A - - A 74 Homo MBL-c

130 140 150 160

K T I N E I N S H T C Q C M X V I D G K V W Y G P G N G Y L Y L I I X S X M T Y 86 Ciona MBL NCBIK T I N E I N S H T C Q R M E V I D G K V W Y G P G N G Y L Y L I I V S D M T Y 86 Ciona MBL EPNK T I N E I N S H T C Q C M E V I D G K V W Y G P G N G Y L Y L V I V S D M T Y 86 Ciona MBL QPDS E I Q Q L K A K I A T F E K V A S V G H F R Q V G Q - K Y Y I T D G V V G T F 111 Cyprinus MBLA K I R V L E D D L S R Y K K A L S L K D V V N V G K - K M F V S T G K K Y N F 116 Gallus MBLA E I R I L K S K L Q L T N K L H A F S M G K K S G K - K L F V T N H E K M P F 101 Mus MBL-aS E I A A L R S E L R A L R N W V L F S L S E K V G K - K Y F V S S V K K M S L 106 Mus MBL-cS E R K A L Q T E M A R I K K W L T F S L G K Q V G N - K F F L T N G E I M T F 110 Homo MBL-c

170 180 190 200

D E A X S K C S K Y G A T L A V H G P K N R D X M K I L N K Q L P - - V T T Q E 126 Ciona MBL NCBID D A R S K C S K Y G A T L A V H G P K N R D I M K I L H K Q L P - - V I T Q E 126 Ciona MBL EPND E A K S K C S K Y G A T L A V H G P K N R D I M K I L H K Q L P - - V I T Q E 126 Ciona MBL QPDD Q G L K F C K D F G G T M V F - - P R T S A E N Q A L L K L V V S S G L S S K 150 Cyprinus MBLE K G K S L C A K A G S V L A S - - P R N E A E N T A L K D L I D P S - - - - S 155 Gallus MBLS K V K S L C T E L Q G T V A I - - P R N A E E N K A I Q E V A T - - - - - - G 140 Mus MBL-aD R V K A L C S E F Q G S V A T - - P R N A E E N S A I Q K V A K - - - - - - D 145 Mus MBL-cE K V K A L C V K F Q A S V A T - - P R N A A E N G A I Q N L I K - - - - - - E 149 Homo MBL-c

210 220 230 240

D Y W I G L T D K Q G E G R F V W E D G S X L K S S E A N W Y P G E P X D X E X 164 Ciona MBL NCBID Y W I G L T D K Q G E G R Y V W A D G S S L K S S E A N W Y P G E P N D A G N 164 Ciona MBL EPND Y W I G L T D K Q G E G R Y V W E D G S S L K S S E A N W N P G Q P D D Y G N 164 Ciona MBL QPDK P Y I G V T D R E T E G R F V N T E G K Q L T F T - - N W G P G Q P D D Y K G 188 Cyprinus MBLQ A Y I G I S D A Q T E G R F M Y L S G G P L T Y S - - N W K P G E P N N H K N 189 Gallus MBLI A F L G I T D E A T E G Q F M Y V T G G R L T Y S - - N W K K D E P N N H G S 172 Mus MBL-aI A Y L G I T D V R V E G S F E D L T G N R V R Y T - - N W N D G E P N N T G D 177 Mus MBL-cE A F L G I T D E K T E G Q F V D L T G N R L T Y T - - N W N E G E P N N A G S 181 Homo MBL-c

250 260 270

N E D C V G G N F R D S L Q W N D Y K C S D G Q L Y A L C E R Q E . 204 Ciona MBL NCBIA E D C V G G N Y L D S L Q W N D Y K C S D G R L Y A L C E R Q E 204 Ciona MBL EPNA E D C V G G N Y L D S L Q W N D W K C S D G R L Y A L C E R R E 204 Ciona MBL QPDL Q D C G - - V I E D X G L W D D G S C G D I - R P I M C E I D N K 226 Cyprinus MBL- E D C A - - V I E V S G K W N D L D C S N S N I F I I C E L 227 Gallus MBLG E D C V - - I I L D N G L W N D I S C Q A S - F K A V C E F P A 210 Mus MBL-aG E D C V - - V I L G N G K W N D V P C S D S - F L A I C E F S D 215 Mus MBL-cD E D C V - - L L L K N G Q W N D V P C S T S - H L A V C E F P I 219 Homo MBL-c

Nucleotide Substitutions (x100)

0

91.2

102030405060708090

7 Mus MBL-c

8 Homo MBL-c

6 Mus MBL-a

5 Gallus MBL

4 Cyprinus MBL

2 Ciona MBL EPN

3 Ciona MBL QPD

1 Ciona MBL NCBI

Fylogeni baseret på MBL aminosyre primærstruktur

Konklusion:- MBLmRNA bliver vævsspecifikttranskriberet i tarmen hos C.intestinalis- Der findes 2 isoforme MBL gener,kodende for hhv mannose og galaktosebindingsmotiv.- Intron/exonstruktur adskiller sigvæsentligt fra andre kendte MBL gener.

Perspektiver:- Er MBL dimorfien en plesiomorfkarakter?- Er der ikke selektionspres fragalaktosebakterier på landjorden??

Yderligere lys kan kastes på dette vedundersøgelser af MBL kodende gener(hvis de eksisterer) hos ex Xenopus,Amphioxus, en echinoderm og encyklostome.

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