selecciÓn de fragmentos de anticuerpo especÍficos

SELECCIÓN DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPO ESPECÍFICOS A PARTIR DE BIBLIOTECAS EN FAGOS FILAMENTOSOS 201

SELECCIÓN DE FRAGMENTOSSELECCIÓN DE FRAGMENTOSSELECCIÓN DE FRAGMENTOSSELECCIÓN DE FRAGMENTOSSELECCIÓN DE FRAGMENTOSDE ANTICUERPO ESPECÍFICOSDE ANTICUERPO ESPECÍFICOSDE ANTICUERPO ESPECÍFICOSDE ANTICUERPO ESPECÍFICOSDE ANTICUERPO ESPECÍFICOSA PARTIR DE BIBLIOTECASA PARTIR DE BIBLIOTECASA PARTIR DE BIBLIOTECASA PARTIR DE BIBLIOTECASA PARTIR DE BIBLIOTECASEN FAGOS FILAMENTOSOSEN FAGOS FILAMENTOSOSEN FAGOS FILAMENTOSOSEN FAGOS FILAMENTOSOSEN FAGOS FILAMENTOSOS

GERTRUDIS ROJAS

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNLa selección de múltiples moléculas potencialmente útiles por su capacidad dereconocimiento de antígenos de interés, se puede realizar a partir de las biblio-tecas de fragmentos de anticuerpo. En el Centro de Ingeniería Genética yBiotecnología de La Habana, Cuba, se utiliza una metodología para las biblio-tecas de fragmentos tipo Fv de simple cadena construidas sobre el vectorfagómido pHG-1m (Figura 11.1) [1].

Figura 11.1. Representación esquemática del vector pHG-1m, utilizado para la expresión defragmentos de anticuerpo tipo Fv de simple cadena fusionados a la proteína III defagos filamentosos. Sitios de restricción: Apa LI, Sfi I, Sal I y Not I. Promotorlactosa: pLac. Sitio de unión al ribosoma: RBS. Péptido señal: PS. Terminador dela transcripción: term. Gen de resistencia a la ampicillina: Ampr.

CAPÍTULO 11

1 Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.

202202202202202 CAPÍTULO 11

Se trata de procedimientos de utilidad general, pues las mismas técnicas o varian-tes muy similares se han empleado con éxito en la selección de fragmentos deanticuerpo tipo Fab y Fv de distintas bibliotecas en varios laboratorios de inves-tigación científica. La aplicabilidad de ésta metodología incluye bibliotecas uni-versales o sesgadas hacia el reconocimiento de un antígeno de interés, con tallasentre 105 y 1010 individuos, construidas a partir de donantes sanos, pacientes,animales inmunizados o secuencias sintéticas de inmunoglobulinas [2, 3].

El objetivo fundamental de este trabajo es explicar las etapas para la selec-ción de fragmentos de anticuerpo con propiedades específicas de unión a par-tir de la gran diversidad inicial de las bibliotecas, detallar los procedimientostécnicos que se realizan en cada etapa y exponer los resultados de la aplica-ción de la metodología citada en un modelo específico.

PPPPPRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓN DEDEDEDEDE MEZCLASMEZCLASMEZCLASMEZCLASMEZCLAS DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS QUEQUEQUEQUEQUE EXPONENEXPONENEXPONENEXPONENEXPONENLLLLLOSOSOSOSOS DIVERSOSDIVERSOSDIVERSOSDIVERSOSDIVERSOS FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOS DEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO

La base para encontrar moléculas con las más disímiles propiedades de unión esla enorme diversidad presente a nivel genético en las bibliotecas, que puedenestar compuestas por hasta más de 1010 secuencias diferentes de fragmentos deanticuerpo. Para explotar esta riqueza de interacciones es preciso expresar lamisma diversidad a nivel proteico. Este objetivo se consigue a través de la pro-ducción de colecciones de fagos filamentosos que exponen en su superficiedistintos fragmentos de anticuerpo. Como productoras de esas partículas seemplean bacterias transformadas con fagómidos, e infectadas por un fagofilamentoso “auxiliador”. Los fagómidos aportan la información genética para lasíntesis de los fragmentos de anticuerpo fusionados a la proteína III estructuraldel fago filamentoso. El resto de las proteínas requeridas para el ensamblaje delas partículas virales está codificado en el genoma del fago “auxiliador”. Al adquirirambas fuentes de información genética, cada bacteria fabrica partículas viralesinfectivas que incorporan al fagómido como material genético y portan el frag-mento de anticuerpo activo correspondiente en su superficie. La mezcla de fagosfilamentosos producida por todas las bacterias que componen la biblioteca exponela diversidad potencial de sitios de unión [4].

TTTTTITULACIÓNITULACIÓNITULACIÓNITULACIÓNITULACIÓN DEDEDEDEDE LALALALALA MEZCLAMEZCLAMEZCLAMEZCLAMEZCLA DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS

A lo largo de los procedimientos de selección es preciso mantener controlado elnúmero de partículas virales que se emplean como material de partida y se obtie-nen después de cada paso. De esta manera se evalúa el éxito de la selección y se


compara el efecto de las condiciones en que se están produciendo las interac-ciones entre los fragmentos de anticuerpo y sus blancos. Las partículas viralestienen la capacidad de infectar bacterias susceptibles. A partir de cada bacteriainfectada que adquiere el gen de resistencia a un antibiótico determinado pre-sente en el fagómido, se forma una colonia en presencia de dicho antibiótico.De este modo, el conteo de colonias después de un paso de infección permitedeterminar el número de partículas virales en la mezcla de fagos.

SSSSSELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓN DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS QUEQUEQUEQUEQUE EXPONENEXPONENEXPONENEXPONENEXPONEN FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOSDEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO CONTRACONTRACONTRACONTRACONTRA ELELELELEL ANTÍGENOANTÍGENOANTÍGENOANTÍGENOANTÍGENO DEDEDEDEDE INTERÉSINTERÉSINTERÉSINTERÉSINTERÉS

Esta es la etapa crucial para la obtención de los sitios de unión. Su realización serepresenta esquemáticamente en la Figura 11.2. Es preciso separar la mezclacompleta de fagos filamentosos en dos fracciones: una mayoritaria que no tienecapacidad de unión al blanco, y la fracción de interés que es minoritaria y seune al antígeno a través de los fragmentos de anticuerpo expuestos. Se pone encontacto la mezcla completa con el antígeno unido a un soporte en condicionesapropiadas para que se produzcan interacciones antígeno-anticuerpo. Los fagosque no se unen se eliminan del soporte mediante lavados exhaustivos. Final-mente se desprenden los fagos unidos en condiciones que interfieren con lainteracción antígeno-anticuerpo. Así se recuperan sólo aquellos fagos concapacidad de unión. El soporte de la separación puede ser una simple superficieplástica [4-7], perlas que son atraídas

Figura 11.2. Representación esquemática de la etapa de selección de fagos con capacidad deunión al antígeno.

204204204204204 CAPÍTULO 11

por un campo magnético [8], o incluso células intactas [9-13]. La elecciónde uno u otro soporte depende de la disponibilidad y características delantígeno. Las ventajas de cada uno se describen en los procedimientostécnicos que se detallan posteriormente. Los tiempos de interacción entreel antígeno y los fagos portadores de fragmentos de anticuerpo y las con-diciones en que esta se produce (tampones, temperatura, presencia dedetergentes,) deben ajustarse en cada caso de acuerdo a los resultados quese obtengan con los procedimientos comunes que también se describen enlas secciones siguientes. Por ejemplo, en caso de que se seleccionen fagosportadores de fragmentos de anticuerpo aparentemente polirreactivos (quereaccionan con múltiples antígenos no relacionados), es conveniente adi-cionar el detergente Tween 20 al 0,1 %, en el paso de incubación de losfagos con el antígeno para reducir las interacciones inespecíficas. Lascondiciones de elución de los fagos unidos también varían. La interacciónantígeno-anticuerpo puede romperse, por ejemplo, por cambios de pH ha-cia valores extremos [4] o en presencia de moléculas que actúen comocompetidores [14, 15].

Como la población de fagos con capacidad específica de unión suele estar pocorepresentada en las bibliotecas originales y nunca es posible eliminar con lava-dos la totalidad de los fagos que no se unen al antígeno, es necesario aumentarpaulatinamente la representación de los fagos específicos mediante rondas su-cesivas de selección con el antígeno. Los fagos desprendidos después de cadaronda se utilizan para infectar bacterias y se multiplican de modo similar aldescrito para la biblioteca original. Esta nueva población es el material de par-tida para otra ronda de selección. A medida que el proceso se repite, la pobla-ción de fagos se enriquece en aquellos que exponen fragmentos de anticuerpocon la capacidad de unión deseada, que llegan a predominar. El número derondas necesarias varía de acuerdo a la composición de la biblioteca de partida,el antígeno, y el método de selección. Usualmente son suficientes entre tres ycinco rondas. Es común disminuir la concentración de antígeno que se utiliza alavanzar hacia nuevas rondas de selección. Ese proceder garantiza que se favo-rezca la selección de fagos portadores de fragmentos de anticuerpo de alta afi-nidad, capaces de reconocer cantidades mínimas del antígeno [16].

Después de cada ronda se determina la cantidad de partículas virales en elmaterial eluido, según el procedimiento de titulación descrito. Los títulos obteni-dos en rondas consecutivas de selección deben irse incrementando, lo que indi-ca que la población se enriquece en fagos con capacidad de unión. Puedeconsiderarse que estos fagos específicos predominan cuando se observe unincremento de 1000 veces con respecto al material eluído en la primera ronda.


Es conveniente realizar en cada ronda un procedimiento de selección adicional,en las mismas condiciones y sobre el mismo soporte, pero en ausencia delantígeno de interés. El título de fagos obtenido en este caso se debe manteneraproximadamente constante. Si aumenta progresivamente es que se está produ-ciendo la selección de fagos con una alta capacidad de interacciones inespecíficas(posiblemente portadores de fragmentos de anticuerpo polirreactivos). En estecaso puede ser imprescindible ajustar las condiciones de la selección para redu-cir estas interacciones.

EEEEELIMINACIÓNLIMINACIÓNLIMINACIÓNLIMINACIÓNLIMINACIÓN DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS CONCONCONCONCON ESPECIFICIDADESESPECIFICIDADESESPECIFICIDADESESPECIFICIDADESESPECIFICIDADES NONONONONO DESEADASDESEADASDESEADASDESEADASDESEADAS

Este paso es opcional. En algunos casos resulta importante eliminar los fagosportadores de anticuerpos que reconozcan también otros antígenos de naturale-za similar al de interés, o contaminantes asociados al antígeno que se usa paraseleccionar [17]. Existen dos vías para lograrlo.

La primera es incubar simultáneamente la mezcla de fagos con el antígeno deinterés unido a un soporte y con un exceso del antígeno similar o contaminanteen solución. De este modo, los fagos que reconocen ambos antígenos son blo-queados por el componente disuelto en la solución, y no se fijan al soporte, porlo que son excluidos de la selección. Este procedimiento se denomina substrac-ción, y se logra dentro de los pasos de la selección propiamente dicha.

La otra vía es incubar previamente la mezcla de fagos de partida con elantígeno similar o contaminante unido a un soporte sólido. Los fagos quepermanecen en la solución en estas condiciones están libres de la reactividadindeseada y se emplean como material de partida para la ronda de selec-ción. Este método se conoce como depleción, e introduce un paso adicionalantes de cada ronda.

TTTTTAMAMAMAMAMIZAJEIZAJEIZAJEIZAJEIZAJE DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS SELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOS ENENENENEN PLACASPLACASPLACASPLACASPLACAS

DEDEDEDEDE MICROMICROMICROMICROMICROTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓN

Una vez que se considera terminado el proceso de selección (después de obte-ner un incremento de 1 000 veces en el título de fagos con respecto al de laprimera ronda), se procede a la caracterización de fagos individuales. Para ellose producen fagos provenientes de colonias aisladas de bacterias a pequeñaescala, en pocillos de placas de microtitulación. La inmunorreactividad de cadauno se evalúa por un ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA) u otratécnica similar, y así se detectan los fagos portadores de fragmentos de anti-cuerpo específicos para el antígeno de interés.

206206206206206 CAPÍTULO 11

EEEEEVVVVVALALALALALUUUUUACIÓNACIÓNACIÓNACIÓNACIÓN DEDEDEDEDE LALALALALA INMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADDEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOS DEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO

Para completar la selección definitiva de los fragmentos de anticuerpo poten-cialmente útiles, es preciso confirmar la inmunorreactividad de los fragmentossolubles, fuera del contexto del fago. Un fago puede presentar más de una co-pia del fragmento de anticuerpo en su superficie, lo cual aumenta artificialmentela avidez de la interacción. Para ello, se producen fragmentos de anticuerposolubles a partir de colonias individuales, también en pocillos de placas demicrotitulación, y se evalúa su inmunorreactividad.

CCCCCARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓN MOLECULARMOLECULARMOLECULARMOLECULARMOLECULAR DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS CLCLCLCLCLONESONESONESONESONES SELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOS

A menudo se obtiene un alto número de clones de fragmentos de anticuerpoespecíficos, que supera las posibilidades prácticas de realizar su caracteriza-ción completa. Como muchos clones pueden ser portadores del mismo frag-mento de anticuerpo, resulta útil reducir el número de clones a aquellos quecontengan distintas combinaciones de regiones variables. Para lograrlo se am-plifica (mediante la reacción en cadena de la polimerasa) la región de ADNcorrespondiente al fragmento de anticuerpo y se digiere con una enzima quetiene abundantes sitios de corte en las secuencias correspondientes a las regio-nes variables. Como estos sitios están localizados en distintas posiciones en lasdiferentes regiones variables, cada fragmento produce un patrón típico de di-gestión. Los clones que producen distintos patrones son portadores de frag-mentos de anticuerpo diferentes y deben caracterizarse por separado.

Este patrón se asemeja a una huella dactilar del fragmento en el nivel molecular,por lo que el método se conoce como “fingerprinting”.

En el caso en que varios fragmentos de anticuerpo solamente se diferencienpor unas pocas mutaciones puntuales que no afecten los sitios de restricción, esposible que su patrón de digestión sea el mismo. Si es preciso diferenciar inclu-so estos fragmentos muy similares, es imprescindible recurrir a la secuenciacióncompleta de varios clones, aún cuando tengan el mismo patrón de digestión.

CCCCCARACTERIARACTERIARACTERIARACTERIARACTERIZACIÓNZACIÓNZACIÓNZACIÓNZACIÓN DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOS DEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO

Para proceder a las aplicaciones prácticas de los fragmentos de anticuerpo, esnecesario completar su caracterización. Esta etapa, de la que no se ofrecen de-talles experimentales en este libro, incluye entre otros estudios:


• Secuenciación completa de las regiones variables.

• Determinación de la inmunorreactividad frente a diferentes formas del antígeno(molécula pura, fragmentos de ella, células, tejidos). Se emplean múltiplestécnicas: inmunoensayo enzimático en fase sólida, inmunoblot, inmunofluo-rescencia, inmunohistoquímica y citometría de flujo.

• Medición de las constantes de asociación y disociación con el antígeno. Elmétodo de referencia utiliza el equipo BIACORE (Pharmacia, Suecia), quemide la magnitud Resonancia Plasmónica de Superficie.

• Estudio de las posibilidades de expresión y purificación de los fragmentos deanticuerpo recombinantes a partir de distintos hospederos (bacterias, levadu-ras, células de mamífero, plantas transgénicas).

MÉTMÉTMÉTMÉTMÉTODOSODOSODOSODOSODOSA continuación se describen los métodos utilizados para la explotación de lasbibliotecas.

PPPPPREPREPREPREPREPARACIÓNARACIÓNARACIÓNARACIÓNARACIÓN DEDEDEDEDE MEDIOSMEDIOSMEDIOSMEDIOSMEDIOS YYYYY SOLSOLSOLSOLSOLUCIONESUCIONESUCIONESUCIONESUCIONES DEDEDEDEDE USOUSOUSOUSOUSO GENERALGENERALGENERALGENERALGENERAL

Medio líquido de cultivo 2xYT

Para 1L: Triptona- 16 gExtracto de levadura- 10 gCloruro de sodio- 5 gpH 7,0 - 7,5

Medio sólido de cultivo 2xYT100 mL de medio líquido + 1,2 g de agar bacteriológico

Solución salina tamponeada por fosfatos (PBS)NaCl - 0,1 mol/LNa2 HPO4 - 33 mmol/LNa H2PO4 - 17 mmol/LpH 7,4

Se describen a continuación los procedimientos técnicos que se realizanen cada etapa, el principio o fundamento de las mismas y algunas consi-deraciones generales.

208208208208208 CAPÍTULO 11

PPPPPRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓN DEDEDEDEDE LASLASLASLASLAS MEZCLASMEZCLASMEZCLASMEZCLASMEZCLAS DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS PORTPORTPORTPORTPORTADORESADORESADORESADORESADORESDEDEDEDEDE FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOS DEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO

Principio: Se ensamblan mezclas complejas de partículas virales que expo-nen en su superficie los fragmentos de anticuerpo presentes a nivel genéticoen la biblioteca o en el material ya seleccionado. La información que codi-fica para el fragmento de anticuerpo fusionado a la proteína III estructuraldel fago está contenida en el fagómido. El resto de las proteínas requeridaspara el ensamblaje de las partículas virales está codificado en el genoma delfago auxiliador M13 K07. Los fagos se purifican por precipitación conpolietilenglicol.

CCCCCONSIDERACIONESONSIDERACIONESONSIDERACIONESONSIDERACIONESONSIDERACIONES GENERALESGENERALESGENERALESGENERALESGENERALES

El material de partida es una preparación de bacterias que contienen fagómidos.Puede ser la mezcla de bacterias obtenida después de la electroporación (bi-blioteca original) o el conjunto de bacterias infectadas con los fagos ya selec-cionados (vea las secciones posteriores), que contiene un rango más limitadode diversidad.

PPPPPROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTOOOOO

1. Determinar la absorbancia a 600 nm de la preparación de bacterias de partidaconservada en glicerol. Alternativamente, se puede usar directamente unasuspensión de bacterias barridas de las placas con medio sólido.

2. Calcular la concentración de bacterias presentes. Se asume que para la cepaTG1, una absorbancia de 1,00 a 600 nm corresponde a 3 x 108 células/mL enla suspensión.

3. Inocular en 50 mL de medio 2x YT con glucosa al 2 % y ampicillina a 100 µ/mL,una cantidad de bacterias que exceda en 10 veces como mínimo la talla ori-ginal de la biblioteca o la cantidad de fagos rescatados en el paso de selec-ción anterior. Esta inoculación garantiza que todos los fragmentos de anticuerpodel material de partida estén representados. Por otra parte, la absorbancia a600 nm al inicio del cultivo no debe exceder el valor de 0,05.

4. Agitar la suspensión en zaranda hasta que la absorbancia a 600 nm alcanceun valor entre 0,4 y 0,6. Es importante no exceder los límites dados para laabsorbancia pues las bacterias pierden la expresión del pilus F y la capacidadde ser infectadas por el fago auxiliador. La temperatura debe mantenerse en


37 ºC inicialmente para propiciar el crecimiento celular y hasta la infecciónpara preservar la expresión del pilus. El tiempo de crecimiento para la cepaTG1 oscila entre1,5 y 2,5 h.

5. Traspasar 5 mL de la suspensión celular a un tubo con 4x 1010 unidadesformadoras de placas del fago auxiliador M13 K07 e incubar a 37 ºC duran-te 30 min.

6. Centrifugar a 4 000 g por 10 min. Eliminar el sobrenadante.

7. Resuspender las células en 25 mL de medio 2x YT con amplicillina a100 µg/mL y kanamicina a 25 µg/mL. El genoma del fago auxiliador con-tiene un gen que confiere resistencia a la kanamicina, por lo que sólo crece-rán las bacterias que contengan tanto la información del fagómido como ladel fago auxiliador.

8. Agitar en zaranda durante 16-24 h a 28 ºC. Durante este tiempo se ensam-blan las partículas virales y se liberan al sobrenadante.

9. Centrifugar durante 20 min las células a 4 000 g.

10. Colectar el sobrenadante en otro tubo y adiciónarle la quinta parte de suvolumen de una solución de polietlenglicol 6 000 al 20 %/ cloruro de sodio2,5 mol/L para precipitar los fagos.

11. Incubar durante 1 h en hielo.

12. Centrifugar durante 15 min a 4 000 g a 4 ºC y eliminar el sobrenadante.

13. Resuspender el botón de fagos en 1 mL de PBS y transferir la solución a untubo de 1,5 mL.

14. Centrifugar a 4 000 g durante 2 min para eliminar las bacterias remanentes.

15. Traspasar el sobrenadante a un nuevo tubo.

16. Adicionar 200 µL de la solución de polietilenglicol/cloruro de sodio descri-ta e incubar durante 20 min en hielo.

17. Centrifugar a 4 000g durante 10 min y eliminar el sobrenadante.

18. Resuspender el botón de fagos en 1 mL de PBS.

19. Centrifugar a 4 000 g durante 2 min para eliminar las bacterias.

20. Transferir a un nuevo tubo el sobrenadante que contiene los fagos. Esta pre-paración está lista para los procedimientos de selección. Se puede almacenara 4 ºC sin que los fagos pierdan infectividad. Como los fragmentos de anti-cuerpo expuestos pueden degradarse por la acción de las proteasas, es reco-mendable almacenarlos a –70 ºC en presencia de glicerol al 15 %.

210210210210210 CAPÍTULO 11

TTTTTITULACIÓNITULACIÓNITULACIÓNITULACIÓNITULACIÓN YYYYY AMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓN DEDEDEDEDE LASLASLASLASLAS MEZCLASMEZCLASMEZCLASMEZCLASMEZCLAS DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS

Principio: Se cultivan células susceptibles de ser infectadas, y se enfrentancon la preparación de fagos. Las células infectadas contienen el fagómido yforman colonias en presencia del antibiótico de selección.

CCCCCONSIONSIONSIONSIONSIDERACIONESDERACIONESDERACIONESDERACIONESDERACIONES GENERALESGENERALESGENERALESGENERALESGENERALES

A. El procedimiento es aplicable a:

• Determinación de la cantidad de fagos presente en la mezcla de par-tida para la selección, o en el material eluido después de cada paso deselección.

• Producción de bacterias infectadas con el conjunto de fagos seleccionados, parasu posterior amplificación (vea la sección anterior sobre producción de fagos).

B. Se debe sembrar siempre en medio selectivo un control negativo de bacte-rias sin infectar, para comprobar que no se ha introducido accidentalmenteen ellas un gen que confiera resistencia al antibiótico de selección.

PPPPPROROROROROCECECECECEDIMIENTODIMIENTODIMIENTODIMIENTODIMIENTO

1. Inocular 25 mL de medio 2x YT a partir de una colonia de Escherichia Colisusceptible de ser infectada, por ejemplo, de la cepa TG1.

2. Agitar en zaranda a 28 ºC entre 16 y 24 h para propiciar el crecimiento celu-lar. En el caso de la cepa TG1, esta suspensión celular puede conservarse a4 ºC hasta un mes.

3. Inocular esta suspensión, diluida 1:100, en 50 mL de medio 2x YT. Agitar enzaranda a 37 ºC hasta que el cultivo alcance una absorbancia entre 0,4 y 0,6a 600 nm. Es importante no exceder los límites dados para la absorbanciapues las bacterias pueden perder la expresión del pilus F, y la capacidad deser infectadas. Desde este momento, y hasta la infección, mantenga las cé-lulas siempre a 37 ºC, para conservar también la expresión del pilus.

A partir de este punto el procedimiento es diferente, en dependencia del objeti-vo de la infección: titulación o amplificación de la población de fagos.

PPPPPROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTOOOOO PPPPPARAARAARAARAARA LALALALALA TITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNDEDEDEDEDE LALALALALA POBLACIÓNPOBLACIÓNPOBLACIÓNPOBLACIÓNPOBLACIÓN DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS

1. Preparar una dilución de 5 µL de la mezcla de fagos de partida en 500 µL demedio 2x YT (1:100 ). A partir de ella, hacer diluciones seriadas (1:100),


siempre en un volumen final de 500 µL. El número de diluciones depende deltítulo de fagos esperado en el material.

• Para la preparación de fagos multiplicados y purificados por precipitacióncon polietilenglicol, el título esperado es de 1012 a 1013, y se preparan dilu-ciones hasta 10-10.

• Para los fagos eluídos durante las dos o tres primeras rondas de selección, seespera un título entre 106 y 108, y las diluciones seriadas deben llegar hasta 10-4.

• A partir de la tercera o cuarta ronda, el título esperado se incrementa hasta109, y las diluciones a realizar hasta10–6.

2. Adicionar a cada dilución 500 µL de la suspensión celular obtenida en elpaso del procedimiento anterior e incubar durante 30 min a 37 ºC.

3. Sembrar 100 µL de cada muestra preparada en el paso anterior en placas demedio sólido 2x YT, con ampicillina a 100 µg/mL y glucosa al 2 %. Se puedensembrar sólo aquellas muestras que deben producir un número de coloniasque puedan contarse, según el título esperado.• Para las preparaciones de fagos multiplicados y purificados, se deben sem-

brar las muestras obtenidas a partir de las diluciones entre 10-8 y 10-10.• Para los fagos eluidos hasta la segunda o tercera ronda de selección, las

diluciones útiles suelen estar entre 10-2 y 10-4.• Para los fagos eluidos después de la tercera o cuarta ronda, se siembran las

diluciones entre 10-4 y 10-6.4. Mantener a 28 ºC durante 16 a 24 h para propiciar el crecimiento celular.5. Contar las colonias para cada dilución. Calcular el título de fagos, unidades

formadoras de colonias (ufc)/volumen, según se expone a continuación. Setoma en cuenta la dilución de los fagos, el volumen de 0,5 mL preparado de cadadilución, y los 0,1 mL que se siembran de cada muestra de bacterias infectadas.

Título (ufc/mL) = # colonias x 1/dilución x 2 x 10Si se varían los volúmenes, se debe modificar adecuadamente la expresión an-terior. A partir del título y el volumen final puede calcularse la cantidad total defagos en cada paso.

PPPPPROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTROCEDIMIENTOOOOO AMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNAMPLIFICACIÓNDEDEDEDEDE POBLACIONESPOBLACIONESPOBLACIONESPOBLACIONESPOBLACIONES DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS

1. Diluir la preparación completa de fagos eluidos en los procedimientos deselección al menos 1:10 en medio 2x YT (para evitar la toxicidad de latrietilamina usada en la elución sobre las bacterias).

212212212212212 CAPÍTULO 11

2. Adicionar a esta dilución un volumen igual de la suspensión celular obtenidaen el paso 3 del primer procedimiento escrito.

3. Incubar durante 30 min a 37 ºC .

4. Centrifugar a 4 000 g 10 min para reducir el volumen y resuspender el botónde bacterias en un volumen mínimo.

5. Sembrar en placas de medio sólido 2x YT con ampicillina a 100 µg/mL yglucosa al 2 %.

6. Mantener a 28 ºC durante 16 a 24 h para favorecer el crecimiento celular.

7. Barrer la totalidad de las colonias con medio 2x YT que contenga 100 µg/mLde ampicillina y glucosa al 2 %.

A partir de esta suspensión celular pueden producirse directamente fagos (veala sección anterior). También es posible almacenarla a -70 ºC en presencia deglicerol al 15 %.

SSSSSELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓN DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS PORTPORTPORTPORTPORTADORESADORESADORESADORESADORES DEDEDEDEDE FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOSDEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO CONCONCONCONCON ANTÍGENOSANTÍGENOSANTÍGENOSANTÍGENOSANTÍGENOS INMOVILIZADOSINMOVILIZADOSINMOVILIZADOSINMOVILIZADOSINMOVILIZADOS

SOBRESOBRESOBRESOBRESOBRE UNAUNAUNAUNAUNA SUPERFICISUPERFICISUPERFICISUPERFICISUPERFICIEEEEE PLÁSTICAPLÁSTICAPLÁSTICAPLÁSTICAPLÁSTICA

Principio: El antígeno de interés se une directa o indirectamente a un soporteplástico. Uno de las más utilizados para estos fines se comercializa comoinmunotubo (Nunc, Dinamarca). Los fagos que exponen anticuerpos capacesde reconocer al antígeno en estas condiciones quedan unidos a dicha superficie.El resto de los fagos que componen la biblioteca se eliminan mediante lavadosexhaustivos del tubo. Los fagos seleccionados se eluyen de la superficie deltubo en condiciones que interfieren con la unión antígeno-anticuerpo.


A. Para cada antígeno, deben seleccionarse previamente las condiciones ópti-mas de recubrimiento de los inmunotubos. Usualmente estas son muy simila-res a las que se emplean en el recubrimiento de las placas para ELISA.

Algunas de estas condiciones son las siguientes:

• El tampón hidrógenocarbonato de sodio 50 mmol/L (pH 9,6) suele ser efi-ciente para el recubrimiento con muchos antígenos proteicos. Pueden pro-barse otros tampones, en especial si se trata de antígenos de otra naturalezaquímica.


• Las concentraciones de antígeno deben oscilar generalmente entre 1 y10 µg/mL, aunque pueden requerirse niveles de hasta 3 mg/mL en casosespeciales.

• El recubrimiento suele realizarse durante 3h a 37 ºC ó 16 h a 4 ºC.

La fijación del antígeno a los inmunotubos puede comprobarse si se disponede anticuerpos específicos.

B. Si el antígeno no se une al plástico o la estructura antigénica se modificasensiblemente debido a la interacción directa con la superficie, puedenexplorarse otras variantes como las siguientes:

• El antígeno puede conjugarse químicamente a una proteína presentadora(como la albúmina sérica bovina, BSA), y el complejo resultante se une alos inmunotubos. Este método es especialmente valioso para antígenos debajo peso molecular (péptidos y haptenos).

• Los inmunotubos pueden recubrirse con estreptavidina e incubarse des-pués con el antígeno biotinilado para su inmovilización indirecta.

• Los inmunotubos pueden también recubrirse con un anticuerpo específico,que captura al antígeno presente en cualquier solución incluso si este seencuentra formando parte de una mezcla compleja.

• En todos los casos anteriores, es recomendable realizar un paso de depleciónpor incubación sobre inmunotubos recubiertos sólo con la proteína presen-tadora (BSA, estreptavidina, anticuerpo etc). Este paso eliminaría los fagosque presentan anticuerpos dirigidos contra esas otras moléculas presentestambién en la superficie del tubo. El resto de la mezcla de fagos, que no seunen en estas condiciones, constituye el material de partida para la selec-ción en presencia del antígeno.


1. Recubrir los inmunotubos Nunc de 75 x 12 mm con 2 mL de la solución deantígeno en las condiciones seleccionadas.

2. Desechar el contenido y lavar tres veces los tubos con 2 mL de PBS.

3. Llenar completamente los tubos con una solución de leche descremada enpolvo al 2 % en PBS para bloquear las zonas libres de la superficie plástica.Taparlos e incubar durante una o dos horas a temperatura ambiente con agi-tación suave.

La solución de leche que se emplea de ahora en lo adelante, es siempre a partirde leche descremada en polvo.

214214214214214 CAPÍTULO 11

4. Preparar la mezcla de partida con una cantidad total de fagos entre 1012 y1013. Mezclar 1 mL de la preparación de fagos purificados por precipita-ción con polietilenglicol con 1 mL de una solución de leche al 4% en PBS.Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave para blo-quear la superficie de los fagos.

5. Eliminar la solución de bloqueo de los inmunotubos y lavarlos dos veces conuna solución de Tween 20 al 0,1% en PBS (PBS-T) y dos veces con PBS.

6. Traspasar la solución de fagos pre-bloqueados a los inmunotubos e incubar atemperatura ambiente, primero con agitación suave durante 30 min, y des-pués en reposo por 1,5 h.

7. Desechar el contenido de los tubos y lavarlos 20 veces con PBS-T, y otras20 veces con PBS.

8. Añadir 1 mL de una solución de trietilamina a 0,1 mol/L en agua destiladapara eluir los fagos unidos. Esta solución debe prepararse inmediatamenteantes de la elución. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con agi-tación suave. Debe asegurarse que la solución haga contacto con toda la su-perficie de las paredes del tubo.

9. Traspasar de inmediato el contenido a un tubo con 0,5 mL de tampón Tris-HCl1 mol/L, pH 7,4 para su neutralización. Mezclar por inversión.

10. Conservar esta mezcla de fagos seleccionados a 4 ºC. A partir de ella puederealizarse la titulación e infectar bacterias para multiplicar dichos fagos.

SSSSSELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓN DEDEDEDEDE FFFFFAGOAGOAGOAGOAGOSSSSS QUEQUEQUEQUEQUE EXPONENEXPONENEXPONENEXPONENEXPONEN FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOSDEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO ESPECÍFICOSESPECÍFICOSESPECÍFICOSESPECÍFICOSESPECÍFICOS CONCONCONCONCON ANTÍGENOSANTÍGENOSANTÍGENOSANTÍGENOSANTÍGENOS

BIOBIOBIOBIOBIOTINILADOSTINILADOSTINILADOSTINILADOSTINILADOS YYYYY PERLASPERLASPERLASPERLASPERLAS MAGMAGMAGMAGMAGNÉTICASNÉTICASNÉTICASNÉTICASNÉTICAS

Principio: La interacción entre los fagos que exponen anticuerpos y el antígenounido a biotina ocurre en solución. Los complejos fago-antígeno son captura-dos por perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal, Noruega). Es-tas se separan del resto de los fagos no unidos por la acción de un campomagnético. Después de lavar las perlas, se eluyen los fagos que exponenanticuerpos específicos en condiciones que afectan la unión antígeno-anticuer-po. Las ventajas de esta variante radican en que el antígeno no se modifica porunión a una superficie sólida y que con cantidades mínimas de antígeno, en elorden de los nanogramos, se obtienen buenos resultados.



A. Existen diversos métodos para el acoplamiento con biotina. Es recomenda-ble demostrar que la reacción de acoplamiento escogida no modifica sensi-blemente las propiedades antigénicas, lo cual se puede verificar si se disponede anticuerpos contra el antígeno natural.

B. Al estar las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, frecuentementese seleccionan fagos que exponen anticuerpos que se unen a dicha proteína.Para evitar este inconveniente, pueden pre-incubarse los fagos con perlasmagnéticas recubiertas, en ausencia del antígeno. El resto de los fagos, queno se unen en estas condiciones, se usa como material de partida para laselección propiamente dicha.


1. Mezclar 0,5 mL de la mezcla de fagos de partida (entre 1012 y1013 fagos entotal) con 0,5 mL de leche al 4 % en PBS en un tubo de 1,5 mL, para blo-quear la superficie de los fagos. Incubar durante 1 h a temperatura ambientecon agitación suave.

2. Tomar el volumen necesario de la suspensión de perlas magnéticas-estreptavidina (100 µL por cada tubo de selección) y depositarlo en tubos de1,5 mL en una gradilla magnética hasta que las perlas se agrupen a un ladodel tubo (aproximadamente 20 seg).

3. Eliminar el líquido y resuspender las perlas en 200 µL de leche al 2 % enPBS. Incubarlas a temperatura ambiente entre 1 y 2 h, con agitación suave,para bloquear su superficie.

4. Añadir el antígeno biotinilado a una concentración final entre 1 y 500 nmol/La la mezcla de fagos pre-bloqueados. Incubar durante1h con agitación suavea temperatura ambiente.

5. Separar las perlas magnéticas pre-bloqueadas con la gradilla magnética, eli-minar la solución y resuspenderlas en 250 mL de leche al 2 % en PBS conTween 20 al 0,1 % (PBS-T).

6. Mezclar esta suspensión de perlas magnéticas-estreptavidina con la soluciónde fagos y antígeno biotinilado. Incubar durante 15 min con agitación suave atemperatura ambiente.

7. Separar las perlas con una gradilla magnética, y eliminar la solución restante.

216216216216216 CAPÍTULO 11

8. Lavar las perlas. Para ello, resuspenderlas en 1 mL de leche al 2 % en PBS-T, separarlas en la gradilla magnética y eliminar la solución. Repetir el pro-ceso un total de 6 veces.

9. Traspasar la suspensión de perlas a tubos limpios y lavar 6 veces con lecheal 2 % en PBS-T.

10. Traspasar la suspensión a tubos limpios y lavar 2 veces con PBS.11. Añadir 1 mL de la solución de trietilamina 0,1 mol/L en agua destilada a cada

tubo con perlas magnéticas para eluir los fagos unidos. Incubar a temperaturaambiente durante 10 min con agitación suave. La solución de trietilaminadebe prepararse inmediatamente antes de su uso.

12. Eliminar las perlas con una gradilla magnética y mezclar de inmediato lasolución restante con 0,5 mL de tampón Tris-HCl 1 mol/L, pH 7,4, para suneutralización.

13. Conservar esta mezcla de fagos seleccionados a 4 ºC. A partir de ella puederealizarse la titulación e infectar bacterias para multiplicar dichos fagos.

SSSSSELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓNELECCIÓN DEDEDEDEDE FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS SOBRESOBRESOBRESOBRESOBRE CÉLCÉLCÉLCÉLCÉLULASULASULASULASULAS COMPLETCOMPLETCOMPLETCOMPLETCOMPLETASASASASAS

Principio: Los fagos que exponen anticuerpos específicos para componentespresentes en la membrana se unen a la superficie de le la célula intacta. Laspropias células se emplean como vehículo para la separación de los fagos se-leccionados del resto de la solución, por centrifugación. Después de lavarlas,se eluyen los fagos seleccionados en condiciones que interfieren con la uniónantígeno-anticuerpo. La ventaja de esta variante es que garantiza el aislamientodirecto de fragmentos de anticuerpo que se unen a blancos celulares.


A. Las condiciones de la selección deben ser cuidadosamente ajustadas paracada tipo de célula. Es preciso mantener la integridad celular durante todo elproceso, antes del paso final de elución de los fagos específicos. De lo con-trario, los fagos seleccionados pueden perderse junto con los componentesde la membrana celular dañada. En caso de que el antígeno de interés seconozca, es recomendable verificar mediante anticuerpos específicos que suexpresión en la membrana celular se mantiene en las condiciones establecidas.• La lisis celular y la internalización de las moléculas de membrana pueden

comprometer la recuperación de los fagos con capacidad de unión. Ambosinconvenientes se reducen efectuando las incubaciones a 4 ºC, y en pre-sencia de 0,01 % de azida de sodio.


B. La gran complejidad antigénica de las membranas celulares, provoca quese seleccionen muchos fagos que exponen anticuerpos contra moléculascomunes a múltiples tipos celulares. La población de anticuerpos dirigi-dos contra marcadores específicos de la célula de interés es minoritaria.La especificidad de la selección puede aumentarse si se pre-incuba la mezclade fagos con otras células que eliminen del material de partida el gruesode los anticuerpos contra componentes comunes.

C. Además de los componentes de las membranas celulares naturales, pue-de emplearse como base para la selección una molécula conocida intro-ducida por técnicas de ingeniería genética en una célula hospedera. Laventaja de este enfoque es que la molécula de interés se presenta en uncontexto fisiológico (membrana de una célula completa), y se escogecomo hospedero una línea celular de fácil manipulación (una de las másutilizadas es la CHO). Además, la depleción de los fagos que exponenanticuerpos contra otras moléculas puede hacerse fácilmente con la mis-ma línea celular original a la que no se le ha introducido el gen quecodifica para la molécula de interés.


1. Colectar las células. En el caso de las células que crecen adheridas a la super-ficie, es necesario utilizar tripsina para desprenderlas.

2. Centrifugar la suspensión celular a 1 000 g y resuspender el botón celular en3 mL de PBS/leche al 2 %/suero fetal bovino al 10 %. La concentracióncelular debe ser superior a 3 x 106 células/mL.

3. Incubar la suspensión obtenida durante 30 min a temperatura ambiente conagitación suave para bloquear su superficie y minimizar las posibilidades deinteracciones inespecíficas.

4. Bloquear la mezcla de fagos de partida (entre 1012 y 1013 partículas virales),en 3 mL de PBS/ leche al 2 %/suero fetal bovino al 10 %.

5. Centrifugar las células bloqueadas y resuspender el botón celular en la mez-cla de fagos también pre-bloqueados. Incubar durante una hora a temperatu-ra ambiente con agitación suave.

6. Lavar las células 10 veces por centrifugación y resuspensión en 5 mL de PBS/leche al 2 %/suero fetal bovino al 10 %. Las células se deben incubar duranteun minuto con agitación suave antes de cada centrifugación.

7. Lavar las células dos veces con 5 mL de PBS y transferir la suspensión a unnuevo tubo después del último lavado.

218218218218218 CAPÍTULO 11

8. Centrifugar y resuspender el botón celular en 0,6 mL de agua. Añadir gota agota, con agitación, 0,6 mL de una solución de trietilamina 200 mmol/L enagua destilada. Esta solución de trietilamina debe prepararse inmediatamen-te antes de su uso.

9. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y añadir 0,6 mL de Tris-HCl 1 mol/L, pH 7,4 gota a gota con agitación para neutralizar.

10. Conservar esta mezcla de fagos seleccionados a 4 ºC. A partir de ella sepuede realizar la titulación e infectar bacterias para multiplicar dichos fagos.

TTTTTAMIZAJEAMIZAJEAMIZAJEAMIZAJEAMIZAJE DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FFFFFAGOSAGOSAGOSAGOSAGOS SELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOSSELECCIONADOS ENENENENEN PLACASPLACASPLACASPLACASPLACAS

DEDEDEDEDE MICROMICROMICROMICROMICROTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓNTITULACIÓN

Principio: Se ensamblan partículas fágicas a partir de bacterias infectadas porfagos individuales en múltiples pozos de placas de microtitulación. Las propie-dades de reconocimiento del antígeno por los fagos producidos en el sobrena-dante se prueban por ELISA. Se identifican así clones individuales portadoresde fragmentos de anticuerpo contra el antígeno de interés.


A. Las condiciones óptimas de recubrimiento de las placas para ELISA debenseleccionarse previamente para cada antígeno.

Algunas de estas condiciones son las siguientes:

• El tampón hidrógenocarbonato de sodio 50 mmol/L ( pH 9,6) suele ser eficien-te para el recubrimiento con muchos antígenos proteicos. Pueden probarse otrostampones, especialmente en el caso de antígenos de otra naturaleza química.

• Las concentraciones de antígeno oscilan generalmente entre 1 y 10 µg/mL,aunque pueden requerirse niveles de hasta 3 mg/mL en casos especiales.

• El recubrimiento suele realizarse durante 3 h a 37 ºC ó 16 h a 4 ºC.

La fijación del antígeno a las placas puede comprobarse si se dispone deanticuerpos específicos.

B. Si el antígeno no se une al plástico o la estructura antigénica se modificasensiblemente debido a la interacción directa con la superficie, puedenexplorarse otras variantes.

• Puede unirse a las placas el complejo del antígeno con una proteína presen-tadora (frecuentemente se emplea la albúmina sérica bovina). Este método


es especialmente valioso para los antígenos de bajo peso molecular (péptidosy haptenos).

• Las placas pueden recubrirse con estreptavidina, e inmovilizarse indirecta-mente el antígeno biotinilado.

• Las placas pueden también recubrirse con un anticuerpo específico, que captu-ra al antígeno presente en cualquier solución.

C. Si se pretende evaluar la inmunorreactividad contra células completas, estasdeben cultivarse y fijarse sobre los pozos por la acción de solventes orgánicos.

D. Pueden emplearse distintas diluciones del sobrenadante que contiene losfagos para evaluar su inmunorreactividad por ELISA. La dilución 1:2 sueleser adecuada para un primer tamizaje.

E. Siempre se incluye como control negativo en el ELISA un sobrenadante quecontenga fagos que no tienen capacidad de unión al antígeno de interés.

F. Es recomendable evaluar doblemente la inmunorreactividad de los clonescon el antígeno de interés y con una proteína no relacionada (frecuentemen-te se usa la albúmina sérica bovina), para descartar los fagos portadores deanticuerpos polirreactivos.

Producción de los fagos:

PPPPPROCEDIMIENTOROCEDIMIENTOROCEDIMIENTOROCEDIMIENTOROCEDIMIENTO

1. Tomar las placas donde crecen las bacterias infectadas con los fagos resul-tantes de la selección.

2. Añadir 100 µL de medio 2x YT con 100 µg/mL de ampicillina y 2 % deglucosa a cada pocillo de las placas de cultivo celular de 96 pozos (con fon-do plano). Inocular cada pocillo a partir de una colonia. Se dejan algunospocillos sin inocular, como control de que no se produzca contaminaciónentre los pozos.

3. Agitar en zaranda durante 16-24 h a 28 ºC para favorecer el crecimientocelular.

4. Inocular a partir de cada pozo de dicha placa una nueva placa (con fondo en U)que contenga 100 µL/ pozo de medio 2x YT, con 100 µg/mL de ampicillina y2 % de glucosa. Para inocular, se pueden transferir 2 µL de la suspensióncelular de cada pocillo de las placas originales al pozo correspondiente delas nuevas placas. Alternativamente, se puede usar un dispositivo de 96 po-siciones para transferir el inóculo.

220220220220220 CAPÍTULO 11

5. Añadir 50 µL de glicerol al 60 % a cada pozo de las placas originales. Estasplacas deben conservarse selladas a -70 ºC, como fuente de los clones indi-viduales.

6. Agitar las nuevas placas en zaranda a 37 ºC hasta que los cultivos al-cancen una absorbancia a 600 nm entre 0,4 y 0,6. Este procedimientodemora alrededor de 2,5 h si se emplea la cepa TG1 de E. coli.

7. Añadir a cada pozo 50 µL de medio 2x YT con ampicillina a 100 µg/mL yglucosa al 2 %, que contenga 3 x 109 unidades formadoras de placas delfago auxiliador M13 K07 por mL. La relación entre fagos y bacteriasdebe ser de 20:1.

8. Incubar las placas durante 30 min a 37 ºC en reposo.

9. Centrifugar las placas a 1 000 g durante10 min. No se debe aumentar lavelocidad por encima de este límite, pues pueden romperse las placas.

10. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 150 µL de medio 2xYT, con 100 µg/mL de ampicillina y 25 µg/mL de kanamicina. Agitar enzaranda durante 16-24 h a 28 ºC para propiciar el crecimiento celular.

11. Centrifugar las placas a 1 000g durante 10 min. No se debe aumentar lavelocidad por encima de este límite, pues pueden romperse las placas.

12. Utilizar el sobrenadante de esta centrifugación, que contiene los fagos, para laprueba de su inmunorreactividad por ELISA.

Determinación de la inmunorreactividad de los fagos por ELISA:


1. Recubrir las placas con el antígeno en las condiciones previamente seleccio-nadas.

2. Eliminar la solución de recubrimiento y lavar dos veces con PBS.3. Bloquear la superficie libre con 150 µL/pozo de leche al 2 % en PBS e incubar

durante una hora a temperatura ambiente.4. Eliminar la solución anterior y lavar tres veces con Tween 20 al 0,1 % en PBS

(PBS-T) y tres veces con PBS.5. Añadir 50 µL de leche al 4 % en PBS a cada pocillo. Adicionar 50 µL del

sobrenadante que contiene fagos del pozo correspondiente de la placa decultivo (vea la sección anterior dedicada a la producción de fagos). Mezclarcuidadosamente con la pipeta.

6. Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente.


7. Eliminar el contenido de las placas y lavar tres veces con PBS-T y tres vecescon PBS.

8. Añadir 100 µL/pozo del anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa derábano picante (Pharmacia, Suecia) a la dilución recomendada en PBS conleche al 2 %. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.

9. Eliminar la solución y lavar tres veces con PBS-T y tres veces con PBS.

10. Adicionar 100 µL/pozo de la solución de sustrato (1mg de tetra-metilbencidina disuelta en 0,1 mL de dimetilsulfóxido para 10 mL detampón citrato de sodio 100 mmol/L, pH 5,5, con 1 µL de peróxido dehidrógeno al 30 %). Debe aparecer un color azul entre los 10-30 min.Mantener las placas en un lugar protegido de la luz.

11. Detener la reacción por adición de 50 µL/ pozo de ácido sulfúrico 2 mol/L.

12. Determinar la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación.

Se consideran portadores de fragmentos de anticuerpo específicos aquellosclones que produzcan un valor de absorbancia frente al antígeno de interés almenos dos veces superior al del control negativo (sobrenadante con fagos norelacionados); siempre que los valores de absorbancia frente al antígeno norelacionado sean similares o inferiores al del control negativo.

EEEEEVVVVVALALALALALUUUUUACIÓNACIÓNACIÓNACIÓNACIÓN DEDEDEDEDE LALALALALA INMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDAD

DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FFFFFRAGMENTRAGMENTRAGMENTRAGMENTRAGMENTOSOSOSOSOS DEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO SOLSOLSOLSOLSOLUBLESUBLESUBLESUBLESUBLES

Principio: Se induce la producción de fragmentos de anticuerpo solubles a par-tir de bacterias infectadas por fagos individuales, en múltiples pozos de placasde microtitulación. Las propiedades de reconocimiento del antígeno por losfragmentos de anticuerpo producidos en el sobrenadante se prueban por ELISA.Los fragmentos de anticuerpo que se unen al antígeno se detectan en este casocon un anticuerpo monoclonal contra el péptido c-myc, que está fusionado en laconstrucción genética al fragmento de anticuerpo. En otros casos se utilizandiversas proteínas de fusión que se detectan con otros reactivos. En esta etapase confirma la inmunorreactividad de las moléculas seleccionadas.


A. Las condiciones óptimas de recubrimiento de las placas para ELISA debenseleccionarse previamente para cada antígeno.

222222222222222 CAPÍTULO 11

Algunas de estas condiciones son las siguientes:• El tampón hidrógenocarbonato de sodio 50 mmol/L (pH 9,6) suele ser efi-

ciente para muchos antígenos proteicos. Pueden probarse otros tampones,especialmente en el caso de antígenos de otra naturaleza química.

• Las concentraciones de antígeno deben oscilar entre 1 y 10 µg/mL,aunque pueden requerirse niveles de hasta 3 mg/mL en casos especiales.

• El recubrimiento suele realizarse durante 3h a 37 ºC ó 16 h a 4 ºC.La fijación del antígeno a las placas puede comprobarse si se dispone deanticuerpos específicos.

B. Si el antígeno no se une al plástico o la estructura antigénica se modificasensiblemente producto de la interacción directa con la superficie, puedenexplorarse otras variantes como son las siguientes:• Puede unirse a las placas el complejo del antígeno con una proteína pre-

sentadora (frecuentemente se emplea la albúmina sérica bovina). Este mé-todo es especialmente valioso para los antígenos de bajo peso molecular(péptidos y haptenos).

• Las placas pueden recubrirse con estreptavidina e inmovilizarse indirecta-mente el antígeno biotinilado.

• Las placas pueden también recubrirse con un anticuerpo específico, quecaptura al antígeno presente en cualquier solución.

C. Si se pretende evaluar la inmunorreactividad contra células completas, estasdeben cultivarse y fijarse sobre los pozos por la acción de solventes orgánicos.

D. Pueden emplearse distintas diluciones del sobrenadante que contiene frag-mentos para evaluar su inmunorreactividad por ELISA. La dilución 1:2 sueleser adecuada para un primer tamizaje.

E. Se incluye como control negativo en el ELISA un sobrenadante que contengafragmentos que no tienen capacidad de unión al antígeno de interés.

F. Se recomienda evaluar doblemente la inmunorreactividad de los clones conel antígeno de interés y con una proteína no relacionada (frecuentemente seusa la albúmina sérica bovina), para descartar los fragmentos de anticuerpopolirreactivos.

PPPPPRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓNRODUCCIÓN DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOS SOLSOLSOLSOLSOLUBLESUBLESUBLESUBLESUBLES DEDEDEDEDE ANTICUERPOSANTICUERPOSANTICUERPOSANTICUERPOSANTICUERPOS


1. Tomar las placas donde crecen las bacterias infectadas con los fagos resultan-tes de la selección.


2. Añadir 100 µL de medio 2x YT con 100 µg/mL de ampicillina y 0,1 % deglucosa a cada pocillo de las placas de cultivo celular de 96 pozos (confondo plano). Inocule cada pocillo a partir de una colonia. Deje algunospocillos sin inocular, como control de que no se produzca contaminaciónentre los pozos.

3. Agitar en zaranda durante 16-24 horas a 28 ºC para favorecer el crecimientocelular.

4. Inocular a partir de cada pozo de dicha placa una nueva placa (con fondo enU) que contenga 150 µL/pozo de medio 2x YT, con 100 µg/mL de ampicillinay 2 % de glucosa. Para inocular, puede transferir 2 µL de la suspensión celularde cada pocillo de las placas originales al pozo correspondiente de las nuevasplacas. Alternativamente, se puede usar un dispositivo de 96 posiciones paratransferir el inóculo. Si el objetivo es confirmar la inmunorreactividad de losclones ya seleccionados, se puede usar como fuente de clones individuales laplaca original preparada y almacenada a partir del tamizaje de los fagos.

5. Añadir 50 µL de glicerol al 60 % a cada pozo de las placas originales, yconservarlas selladas a -70 ºC, como fuente de los clones individuales.

6. Agitar las nuevas placas en zaranda a 37 ºC hasta que los cultivos alcancenuna absorbancia a 600 nm entre 0,8 y 1,0. Este paso demora entre 3 y 4 h si seemplea la cepa TG1 de E. coli.

7. Añadir a cada pozo 50 µL de medio 2x YT con ampicillina a 100 µg/mL, con3 mmol/L del inductor isopropil beta-D tiogalactopiranósido.

8. Agitar en zaranda durante 16-24 h a 28 ºC.

9. Centrifugar las placas a 1 000g durante 10 min. No aumentar la velocidadpor encima de este límite, pues pueden romperse las placas.

10. Utilizar el sobrenadante de esta centrifugación, que contiene los fragmentosde anticuerpo, para la prueba de su inmunorreactividad por ELISA.

DDDDDETERMINACIÓNETERMINACIÓNETERMINACIÓNETERMINACIÓNETERMINACIÓN DEDEDEDEDE LALALALALA INMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDADINMUNORREACTIVIDAD

DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS FRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTFRAGMENTOSOSOSOSOS PORPORPORPORPOR ELISA ELISA ELISA ELISA ELISAPPPPPROCROCROCROCROCEDIMIENTOEDIMIENTOEDIMIENTOEDIMIENTOEDIMIENTO

1. Recubrir las placas con el antígeno en las condiciones previamente seleccio-nadas.

2. Eliminar la solución de recubrimiento y lavar dos veces con PBS.3. Bloquear la superficie libre con 150 µL/pozo de leche al 2 % en PBS e incubar

durante una hora a temperatura ambiente.

224224224224224 CAPÍTULO 11

4. Eliminar la solución anterior y lavar tres veces con Tween 20 al 0,1 % en PBS(PBS-T) y tres veces con PBS.

5. Añadir 50 µL de leche al 4 % en PBS a cada pocillo. Adicionar 50 µL delsobrenadante que contiene los fragmentos del pozo correpondiente de laplaca de cultivo, obtenido en el paso 10 de la técnica anterior. Mezclarcuidadosamente con la pipeta.

6. Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente.7. Eliminar el contenido de las placas y lavar tres veces con PBS-T y tres

veces con PBS.8. Añadir 100 µL/pozo del anticuerpo monoclonal 9E10, que reconoce al

péptido c-myc, a una concentración de 5 µg/mL en PBS/leche al 2 %. Incu-bar durante 1 h a temperatura ambiente.

9. Eliminar la solución y lavar tres veces con PBS-T y tres veces con PBS.10. Añadir 100 µL/pozo del conjugado anti-IgG de ratón-peroxidasa de rábano

picante, a la dilución recomendada en PBS/ leche al 2 %. Incubar 1 h atemperatura ambiente.

11. Eliminar la solución y lavar tres veces con PBS-T y tres veces con PBS.12. Adicionar 100 µL/pozo de la solución de sustrato (1mg de tetra-

metilbencidina disuelta en 0,1 mL de dimetilsulfóxido en 10 mL de tam-pón citrato de sodio 100 mmol/L, pH 5,5, con 1 µL de peróxido dehidrógeno al 30 %). Debe aparecer un color azul entre 10-30 min. Man-tener las placas en un lugar protegido de la luz.

13. Detener la reacción por adición de 50 µL de ácido sulfúrico 2 mol/L a cada pocillo.14. Determinar la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación.Se consideran productores de fragmentos de anticuerpo específicos aquellosclones que produzcan un valor de absorbancia frente al antígeno de interés almenos dos veces superior al del control negativo (sobrenadante con fragmen-tos no relacionados); siempre que los valores de absorbancia frente al antígenono relacionado sean similares o inferiores al del control negativo.

CCCCCARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓNARACTERIZACIÓN MOLECULARMOLECULARMOLECULARMOLECULARMOLECULAR DEDEDEDEDE LLLLLOSOSOSOSOS CLCLCLCLCLONESONESONESONESONES PRODUCPRODUCPRODUCPRODUCPRODUC-----TTTTTORESORESORESORESORES DEDEDEDEDE FRAGMENFRAGMENFRAGMENFRAGMENFRAGMENTTTTTOOOOOSSSSS DEDEDEDEDE ANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPOANTICUERPO ESPECÍFICOSESPECÍFICOSESPECÍFICOSESPECÍFICOSESPECÍFICOS

Principio: Se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa lassecuencias de nucleótidos que codifican para cada fragmento de anticuerposeleccionado, con oligonucleótidos que hibridan en las regiones del vector que


flanquean al fragmento. Los productos de cada reacción se digieren con unaenzima de restricción para la que existen abundantes sitios de corte dentro delas regiones variables de las inmunoglobulinas. Cada combinación de regionesvariables produce un patrón característico de digestión. Así puede determinar-se el número de combinaciones distintas obtenidas en la selección.


A. Es posible que los genes que codifican para dos fragmentos de anticuerpo sediferencien por la presencia de mutaciones puntuales, a pesar de compartiruna misma combinación de regiones variables. Las proteínas codificadaspueden tener diferencias de especificidad o afinidad determinadas por esoscambios. Por ese motivo, la caracterización molecular de los genes por di-gestión (“fingerprinting”) permite caracterizar detalladamente un númerolimitado de clones diferentes entre sí, pero no asegura que no existan otrasvariantes con diferencias ligeras. Si se requiere una caracterización comple-ta del repertorio de fragmentos de anticuerpo obtenidos, debe procederse ala secuenciación de los genes de múltiples clones.

B. Debe incluirse como control de la reacción en cadena de la polimerasa untubo con todos los componentes de la reacción, pero sin material provenien-te de ningún clon. Así se puede verificar que no se produce la amplificaciónde ninguna secuencia introducida accidentalmente en la mezcla.


1. Preparar una mezcla para la reacción en cadena de la polimerasa, que conten-ga la siguiente proporción de reactivos por cada clon a analizar:

Agua 15,0 µL

Tampón de reacción 10 x 2,0 µL

Mezcla de deoxinucleótidos 5 mmol/L 1,0 µL

Oligonucleótido cebador 3´ 10 mmol/L 1,0 µL

Oligonucleótido cebador 5´ 10 mmol/L 1,0 µL

Polimerasa Taq 5 u/mL 0,05 µL

2. Dividir la mezcla anterior en tubos de 0,5 mL a razón de 20 µL/tubo paracada clon a analizar.

3. Adicionar a cada tubo 1-2 µL de la suspensión de bacterias de cada clon,conservada en presencia de glicerol.

226226226226226 CAPÍTULO 11

4. Adicionar una o dos gotas de aceite mineral por tubo.

5. Calentar a 94 ºC durante 10 min, para lisar las bacterias.

6. Amplificar por reacción en cadena de la polimerasa. Utilizar 30 ciclos enlas siguientes condiciones:

94 ºC 1 min

50 ºC 1 min

72 ºC 1,5 min

7. Verificar la presencia de bandas de la talla esperada en una muestra de 5 µL delproducto de la reacción, mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 % enpresencia de bromuro de etidio (opcional).

8. Adicionar a cada tubo de reacción la mezcla de los siguientes componen-tes, para la digestión del producto de amplificación por la enzima BstNI.

Albúmina sérica bovina 10 mg/mL 0,2 µL

Tampón de reacción 10x 4 µL

Agua 15,5 µL

BstNI 10 u/µL 0,5 µL

9. Digerir las muestras a 60 ºC durante dos o tres horas.

10. Mezclar 2 µL del colorante de muestra con 8 µL de la reacción de digestióny realizar una electroforesis en gel de agarosa al 4,0 % en presencia debromuro de etidio para visualizar el patrón de bandas.

11. Agrupar los clones de acuerdo a la presencia de diferentes patrones de di-gestión.

RRRRRESULESULESULESULESULTTTTTADOSADOSADOSADOSADOS DEDEDEDEDE LALALALALA APLICACIÓNAPLICACIÓNAPLICACIÓNAPLICACIÓNAPLICACIÓN DEDEDEDEDE LALALALALA METMETMETMETMETODOLODOLODOLODOLODOLOGÍAOGÍAOGÍAOGÍAOGÍA

DESCRITDESCRITDESCRITDESCRITDESCRITAAAAA ENENENENEN UNUNUNUNUN MODELMODELMODELMODELMODELOOOOO ESPECÍFICOESPECÍFICOESPECÍFICOESPECÍFICOESPECÍFICO

El primer modelo abordado en el laboratorio especializado del Centro de Inge-niería Genética y Biotecnología para la aplicación de la metodología descritafue la selección de fragmentos de anticuerpo contra el Antígeno Específico dePróstata (PSA). Esta molécula, producida por las células del epitelio ductal dela próstata, es un candidato atractivo para la inmunoterapia y el inmun-odiagnóstico del cáncer de próstata. Los resultados constituyen un buen ejem-plo de la aplicación de la metodología. Se trata de un modelo simple en cuanto a


la complejidad de la biblioteca original, con una talla moderada (105 miembros)y sesgada hacia el reconocimiento del PSA, pues las regiones variables prove-nían de ratones inmunizados con dicha proteína. No obstante, los resultadospueden considerarse típicos de un proceso de selección. El soporte escogidofueron perlas magnéticas unidas a estreptavidina y el PSA se modificó porunión a biotina.

La Tabla 11.1 muestra las cantidades de fagos de partida y las obtenidasen la elución después de cada ronda de selección. Los títulos de fagosfueron aumentando progresivamente a través de la selección. Por el con-trario, para la selección en ausencia del antígeno, la cantidad de fagosobtenidos se mantuvo aproximadamente constante a partir de la segundaronda, lo que confirmó la especificidad de la selección. La selección seconsideró terminada después de la cuarta ronda, pues en ese momento sealcanzó el máximo de recuperación de fagos, con una cantidad superioren más de mil veces a la de la primera ronda. Además, coincidió con lamáxima diferencia entre el número de fagos específicamente selecciona-dos y el obtenido en ausencia del antígeno.

*Selección en presenia de PSA biotinilado y perlas magnéticas-estreptavidina.**Selección sobre perlas magnéticas-estreptavidina, sin antígeno.

La quinta ronda no mejoró sensiblemente ninguno de estos indicadores.Por tanto, se decidió infectar bacterias con los fagos recuperados despuésde la cuarta ronda y usarlas para la caracterización de clones individuales.

Se produjeron fagos a partir de 88 clones y se evaluó su inmunorreactividadpor ELISA. La Figura 11.3 muestra los resultados de esta evaluación parauna muestra de 22 clones. De los 88 clones, 54 fueron productores de fagosque reconocen al PSA. Doce de ellos fueron descartados, pues reacciona-ron también con el antígeno no relacionado que se empleó como controlnegativo (BSA).

TABLA 11.1. Recuperación de fagos a través de un proceso de selección

228228228228228 CAPÍTULO 11

Los 44 clones positivos específicos se sometieron al análisis por “fingerprinting”para definir los que contenían regiones variables diferentes. Se obtuvieron cincopatrones de digestión de las regiones variables (Figura 11.4). Los clones seagruparon de acuerdo a estos resultados de la siguiente forma:

Patrón a: 29 clones

Patrón b: 5 clones

Patrón c: 2 clones

Patrón d: 4 clones

Patrón e: 4 clones

A partir de los resultados anteriores fue seleccionado un conjunto de fragmentosde anticuerpo representativos de todos los grupos, que constituyen candidatospara proceder a la etapa de caracterización completa y evaluación de su utilidadpotencial en la inmunoterapia del cáncer de próstata.

Despues de este primer modelo se ha abordado en el laboratorio con buenosresultados, la obtención de fragmentos de anticuerpo provenientes de varias bi-bliotecas de origen murino y humano, dirigidos contra diversos antígenos tumoralesy mediadores de los procesos inflamatorios.

Figura 11.3. Reactividad de los fagos producidos por 22 clones seleccionados con el antígeno deinterés (PSA) y un antígeno irrelevante (BSA). Clones productores de fragmentosde anticuerpo específicos 1, 2, 4, 6, 8, 11, 15, 16, 17, 19, y 21. Clones productoresde fragmentos de anticuerpos polirreactivos: 5, 9 y 14. Clones negativos: 3, 7, 10,12, 13, 18, 20 y 22.


Los procedimientos de selección de fragmentos de anticuerpo a partir debibliotecas en fagos filamentosos permiten el aislamiento de nuevos sitios deunión contra blancos de interés científico o terapéutico, por lo que constitu-yen una herramienta poderosa en el desarrollo de nuevos productos y de lainvestigación científica. Entre sus ventajas están: la alta eficiencia de genera-ción de nuevas moléculas (menos de un mes de trabajo por blanco); la versa-tilidad que permite usar blancos diversos: desde moléculas puras hasta mezclascomplejas y células y tejidos completos; y la posibilidad de obtener y mani-pular junto con las nuevas proteínas los segmentos de información genéticacodificantes. Estas propiedades han abierto grandes perspectivas para el de-sarrollo de la ingeniería de anticuerpos.

RRRRREFERENCIASEFERENCIASEFERENCIASEFERENCIASEFERENCIAS

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Figura 12.4. Representación esuqemática de los resultados del análisis por “fingerprinting” delos clones seleccionados.

230230230230230 CAPÍTULO 11

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selecciÓn de fragmentos de anticuerpo especÍficos

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